Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Bekämpfung von Schadtieren, insbesondere Schadnagern. Bereitgestellt wird ein Zona pellucida (ZP) Protein oder Peptid zur Verwendung beim Verhindern des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines ZP Proteins oder Peptids zur Verhinderung des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Verhinderung des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation umfassend die Verabreichung eines ZP Proteins oder Peptids an zumindest ein weibliches Tier der Tierpopulation und ein Futtermittel enthaltend ein ZP Protein oder Peptid.

Bei wachsender Erdbevölkerung bleiben die zur Verfügung stehenden Flächen gleich oder nehmen sogar ab. Diese Diskrepanz wird seit Jahrzehnten durch Ertragssteigerungen abgefangen ((GFP) GzFdpdPeV: Geschäftsbericht 2013; Grain Club Homepage: Weltklimagipfel in Lima, http://www.grainclub.de/presse/2014). Für viele Kulturarten (gerade Weizen) flacht die Ertragssteigerungskurve aber immer mehr ab. Daher ist es ein wichtiger Ansatz in der Bioökonomiestrategie der Bundesregierung, Nachernteverluste, die über 20 % des Ertrags ausmachen können, zu verhindern (BMBF-Homepage: http://www.bmbf.de/arcWv/newsletter/de/biooekonornie.php).

Schadnager tragen neben den großen Schäden die sie bereits auf dem Feld verursachen, in hohem Maße zu Nachernteverlusten bei, zum einen durch den Verzehr von Getreide, zum anderen durch Verunreinigung des Ernteguts mit Fäkalien während der Lagerung (Jacob J: Andere Länder - andere Sitten, Julius Kühn-Institut, Institut für Pflanzenschutz in Gartenbau und Forst, Wirbeltierforschung 2013). Darüber hinaus können Mäuse auch in Tierzuchtbetrieben erheblichen Schaden und wirtschaftliche Verluste verursachen, da sie viele verschiedene Krankheiten (bis 120 Krankheiten sind bekannt), wie bspw. Maul- und Klauenseuche oder Toxoplasmose, übertragen können, die ganze Tierbestände gefährden (Jacob J: Andere Länder - andere Sitten, Julius Kühn-Institut, Institut für Pflanzenschutz in Gartenbau und Forst, Wirbeltierforschung 2013). Vor allem in Landwirtschaftsbetrieben sowie bei Saatgutherstellern und allen Umschlagplätzen für Getreide können enorme Ausfälle und Schäden durch Kleinnager verursacht werden. Die Fördergemeinschaft Nachhaltige Landwirtschaft e.V. (FNL) beziffert die jährlichen deutschlandweiten Schäden durch Kleinnager auf 107 Millionen Euro (Greenfacts, Infodienst, Julius Kühn Institut, Food and Agriculture Organization (FAO), Eurostat, Berechnungen der FNL, 2010).

Mäusepopulationen sind auf Grund der hohen Reproduktionsrate (Zyklusdauer 5-6 Tage, Tragezeit 3 Wochen) kaum einzudämmen (Jacob J: Andere Länder - andere Sitten, Julius Kühn-Institut, Institut für Pflanzenschutz in Gartenbau und Forst, Wirbeltierforschung 2013). Derzeitige Ansätze beruhen auf der Ausbringung toxischer Fressköder für die Schadnager. Die meisten Fressköder bestehen aus Gerinnungshemmern (Antikoagulantien), die ein inneres Verbluten der Tiere verursachen. Diese Art der Tötung ist tierethisch bedenklich. Die Stoffe werden nur langsam im Körper abgebaut und sind hoch toxisch und somit auch eine Gefahr für potenzielle Beutegreifer, wie Eulen und Greifvögel, Katzen sowie für Aasfresser. Problematisch ist auch der Verbleib der verstorbenen Tiere z.B. in den Lagereinrichtungen für Getreide, die durch den Verwesungsprozess belastet werden.

Bei der Eindämmung unkontrolliert wachsender Populationen von Wild- oder Zootieren wurde ein Ansatz verfolgt, der auf der Immunkontrazeption basiert. Eingesetzt werden vollständige Zona pellucida Proteine, die zu einer reversiblen Sterilisation führen (Clydesdale, Reproduction 2004, 128:737-745; Hardy et al., Development 2002, 14:151-155; Lou et al., 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715-2720; Bertschinger et al., Wits University Press; 2008; Dunbar, APHIS Technical Bulletin No. 1853 1993). Diese haben aber zwei Nachteile: (1) Sie müssen durch parenterale Injektion verabreicht werden. (2) Die entsprechenden Proteine zur Immunisierung werden aufwändig aus den Oocyten von Hausschweinen isoliert, daher sind diese Präparate für den großflächigen Einsatz ungeeignet.

Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht daher in der Bereitstellung von Maßnahmen und Verfahren, die die zuvor genannten Anforderungen erfüllen. Die Aufgabe wird durch die Ausführungsformen, die in den Ansprüchen und in der folgenden Beschreibung beschrieben werden gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein ZP Protein oder Peptid zur Verwendung beim Verhindern des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation, wobei das ZP Protein oder Peptid zur oralen Verabreichung formuliert ist. Bevorzugt wird die Verhinderung durch Empfängnisverhütung bei den weiblichen Tieren erreicht wird.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines ZP Proteins oder Peptids zur Verhinderung des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation, wobei das ZP Protein oder Peptid zur oralen Verabreichung formuliert ist.

Das Zona pellucida (ZP) Protein oder Peptid stimuliert im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt eine Immunantwort gegen Eizellen wodurch die Empfängnisverhütung bei weiblichen Tieren erzielt wird.

Der Begriff„Zona pellucida (ZP) Protein oder Peptid" wie hier verwendet betrifft Proteine und daraus abgeleitete Peptide, die die Glykoprotein Matrix um Eizellen bilden. Je nach Spezies gibt es 3 bis 4 verschiedene ZP Proteine, die als ZP-1 bis ZP-3 bzw. ZP-4 bezeichnet werden. Die Proteine werden von der Eizelle synthetisiert und nach Abspaltung eines C- terminalen Aminosäureanteils aus der Zelle abgegeben. Die Proteine ZP-2, ZP-3 und ZP-4 bilden dann lange Filament-Ketten, die vorwiegend durch ZP-1 und/oder ZP-4 miteinander verbunden werden.

ZP-3 bindet im Rahmen der Befruchtung an die Samenzelle. Dadurch wird die Akrosom- Reaktion eingeleitet. Dabei werden hydrolisierenden Enzyme, wie Akrosin, freigesetzt, was zu einer punktuellen Auflösung der Zona pellucida führt. Dies ermöglicht die sekundäre Bindung der Samenzelle an das ZP-2 und damit den Eintritt der Samenzelle in die Eizelle.

Durch die erste Bindung der Samenzelle an ZP-2 wird jedoch auch die Struktur der Zona pellucida geändert. Dabei treten strukturelle Veränderungen der spezifischen Membranrezeptoren der Zona pellucida auf. Zudem werden aus Vesikeln in der Eizelle Proteasen in den perivitellinen Raum zwischen Eizelle und Zona pellucida entleert. Die Enzyme spalten ZP-2 und bewirken dadurch dessen Inaktivierung. Als Konsequenz der Inaktivierung des ZP-2 kann kein weiteres Spermium in die Eizelle gelangen.

Die Aminosäuresequenzen und die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen für ZP Proteine sind im Stand der Technik für verschiedene Tierspezies bekannt. Bevorzugte Sequenzen sind offenbart in Hinsch 1999, Andrologia 31(5): 320-322; Gupta 2012, Cell Tissue Res 349(3): 665-678. Bevorzugte Aminosäuresequenzen für Nager ZP Proteine sind zudem hinterlegt in der Datenbank GenBank, insbesondere NM 011776.1 und GI:6756082 für murines ZP-3, U24228.1 und GI:1113790 für murines ZP-1, NM_011775.6 GI:14613439 für murines ZP-2 oder NM_053762.1 und GI:16758595 für Ratten ZP-3. Weitere Informationen zu Strukturen der ZP Proteine sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (siehe z.B. (Clydesdale, Reproduction 2004, 128:737-745; Hardy et al., Development 2002, 14:151-155; Lou et al., 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715-2720).

Neben den oben genannten ZP Proteinen mit spezifischer Aminosäuresequenz sind von dem Begriff im Sinne der Erfindung ebenfalls Varianten umfasst, die sich durch den Austausch, die Deletion oder die Addition von einer oder mehreren Aminosäuren unterscheiden. Dabei handelt es sich bevorzugt immer noch um ZP Proteine, d.h. abhängig davon, ob es sich um eine Variante des ZP-1, ZP-2, ZP-3 oder ZP-4 handelt, sollen die entsprechenden Varianten Proteine immer noch dieselben biologischen und/oder immunologischen Eigenschaften wie ZP-1, ZP-2, ZP-3 oder ZP-4 aufweisen. Bei den Varianten kann es sich um Ortho löge, Paraloge oder allgemein Homologe von ZP-1, ZP-2, ZP-3 oder ZP-4 handeln.

Besonders bevorzugt weisen die Varianten eine Aminosäuresequenz auf, die zumindest 40%, zumindest 50%, zumindest 60%, zumindest 70%, zumindest 80%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch ist mit einer der spezifischen Aminosäuresequenzen für ZP-1, ZP-2, ZP-3 oder ZP-4 wie oben beschrieben. Die Aminosäuresequenzidentität wird hierbei typischerweise mit einem Sequenzvergleichsalgorithmus bestimmt. Hierzu werden zwei Sequenzen miteinander entweder über ihre gesamte Länge oder über die Länge eines zuvor definierten Segmentes verglichen, das mindestens die Hälfte der Aminosäuren einer der beiden Sequenzen ausmacht. Innerhalb des Vergleichsfensters, d.h. des Bereiches der beiden Sequenzen, der verglichen werden soll, wird die Zahl an identischen Aminosäuren an identischen oder vergleichbaren Positionen bestimmt. Hierzu kann es nötig sein, Lücken in eine Sequenz einzuführen. Im Rahmen der Erfindung soll ein Aminsäuresequenz besonders bevorzugt mit einem im Stand der Technik bekannten Algorithmus durchgeführt werden, insbesondere mit einem der folgenden Algorithmen, die auf der Homepage des NCBI zur Verfügung gestellt werden: BLASTp, PSI-BLAST, PHI-BLAST oder DELTA-BLAST (siehe auch Johnson 2008, Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue):W5-9; Boratyn 2012, Biol Direct. 17(7): 12; Ye 2012, BMC Bioinformatics 13:134; Ye 2013, Nucleic Acids Res 41 : (Web Server issue):W34-40; Marchler-Bauer 2009, Nucleic Acids Res 37 (Database issue):D205-10; und Papadopoulos 2007, Bioinformatics 23(9): 1073-9.) Bevorzugt sind hierbei die vorgegebenen Standard-Einstellungen zu verwenden. Besonders bevorzugt werden die Varianten im Sinne der Erfindung durch Nukleinsäuresequenzen kodiert, die mit den für die spezifischen Aminosäuresequenzen kodierenden Nukleinsäuresequenzen in der Lage sind, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindungen sind beschrieben in Southern 1975, J. Mol. Biol. 98(3): 503-517.

Peptide von ZP Proteinen sind Fragmente, die Aminosäuresequenzabschnitte aus den Aminosäuresequenzen der ZP Proteine aufweisen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen die Peptide einzigartig für das jeweilige ZP Protein, von dem sie abgeleitet wurden, sein, d.h. ihre Aminosäuresequenz sollte nur in diesem ZP Protein vorkommen und, insbesondere, Spezies-spezifisch sein. Die Peptide sollte zudem genügend lang und im ZP Protein so positioniert sein, dass sie von einem Antikörper erkannt und gebunden werden können. Ebenso sollten sie bevorzugt geeignet sein, um als Immunogen nach Verabreichung an einen tierischen Organismus zu wirken, also in der Lage sein, eine Immunantwort im Organismus auch gegen das jeweilige ZP Protein hervorzurufen. Weiterhin muss diese Immunantwort die Befruchtungsfähigkeit des Eis so beeinflussen, dass es zu einer Verminderung oder Verhinderung der Feritiltät kommt. Ob die Fertilität nur für einen bestimmten Zeitraum oder permanent reduziert ist, hängt von der Immunantwort des Tieres ab, die wiederum durch Anpassung (z.B. Aminosäureaustausch) der Antigensequenz (Lou et al., 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715-2720; Lou et al., 1996, J. Immunol. 156 (9), 3535-3540) oder einem irnmunstimulierenden/irnmunsuppressiven Hilfstoff (Adjuvant) reguliert werden kann. Zur Sterilisierung geeignete Peptide oder Proteine, die in die Blutbahn oder peritoneal appliziert wurden, wurden vielfach in der Literatur beschrieben. Dabei unterscheidet man Antikörper gegen diese Peptide oder Proteine, welche die Zona pellucida Proteine (ZP1, ZP2, ZP3 oder ZP4) als Ziel haben, und welche die sich allgemein gegen die Eizelle/Follikel (z.B. OGP), das Spermium (z.B. FA-1, YLPi ₂ , Izumo, SP56 (Choudhury et al., 2009, Vaccine 27 (22), 2948-2953; Hardy and Mobbs, 1999, Reprod. Dev. 52 (2), 216-224; Naz, 2002, Biology of Reproduction 67 (2), 674-680; Naz, 2008, Molecular reproduction and development 75 (2), 336-344) oder die befruchtungs-assoziierte Hormonausschüttung (z.B. GnRH (Miller, 1997, Vaccine 15 (17-18), 1858-1862) richten. Eine Kombination aus ZP Peptiden/Proteinen und anderen sterilisierenden Peptiden/Proteinen führte häufig zu einer Verringerung der Fertilität (Choudhury et al., 2009, Vaccine 27 (22), 2948-2953; Hardy et al., 2008, Mol. Reprod. Dev. 75 (1), 126-135; Hardy et al, 2004, Reproduction 128 (4), 395- 407). Es kann aber davon ausgeganen werden, dass mit der Fusion von im Säugetierreich allgemein vorkommenden Proteinen Peptiden damit die angestrebte Spezienspezifität verloren geht (Miller, 1997, Vaccine 15 (17-18), 1858-1862). Geeignete Peptide kann der Fachmann generieren. Besonders bevorzugt ist ein ZP Peptid im Sinne der Erfindung ein Peptid, das die Aminosäuren 328 bis 342 des murinen ZP-3 Proteins aufweist. Für dieses 14 Aminosäure umfassende Peptid des ZP3 Proteins konnte bereits parenteral eine spezifische sterilisierende Wirkung auf Mäuse (Clydesdale, 2004, Reproduction 128 (6), 737-745; Fitchen, 1995, Vaccine 13 (12), 1051-1057; Hinsch et al., 1999, Hum Reprod 14 (2), 419-428.; Lou et al., 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715-2720.; LOU et al., 1996, J. Immunol. 156 (9), 3535-3540; LOU and TUNG, 1993, J. Immunol. 151 (10), 5790-5799; Miliar et al., 1989, Science 246 (4932), 935-938.; Rhim et al., 1992, J. Clin. Invest. 89 (1), 28-35.) und Ratten (Miller, 1997, Vaccine 15 (17-18), 1858-1862) durch Kontrazeption gezeigt werden CNaz and Alee, Nottingham University Press, 2007; Naz and Chauhan, Biology of Reproduction 2002, 67:674-680; Hardy et al., Development 2002, 14:151-155; Lou et al., 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715-2720; Hardy et al., Molecular Reproduction and Development 2008, 75:126-135; Naz, Molecular reproduction and development 2008, 75:336-344). Eben diese Peptidregion dient der artenspezifischen Befruchtung (Chen et al., 1998, PNAS 95 (11), 6193-6197; Kinloch et al., 1995, PNAS 92 (1), 263-267; Litscher et al., 2009, Mol. Reprod. Dev. 76 (10), 933-941; Swanson et al., 2001, PNAS 98 (5), 2509-2514; Wassarman, 2008, Journal of Biological Chemistry 283 (36), 24285-24289) und ist dadurch besonders für einen artenspezifische Sterilisierung geeignet. Gerade das murine ZP3 gehört zu den 10 % der Proteine, die sich phylogenetisch am weitesten von Menschen entfernt haben (Aagaard et al., 2006, PNAS 103 (46), 17302-17307; Makalowski and Boguski, 1998, PNAS 95 (16), 9407- 9412). Antikörper gegen das murine ZP3-Peptide (Miliar et al., 1989, Science 246 (4932), 935-938) 328-342aa binden extrem schlecht an humanen Eizellen (Hinsch et al., 1999, Hum Reprod 14 (2), 419-428). Eine hundertprozentige Reduzierung der Fruchtbarkeit konnte nach intraperitonealer Verabreichung mit diesem Peptid alleine aber nie erreicht werden. Nur eine über 50 % reduzierte Fertilität konnte bei Wild-Mäusen (mit Verabreichung eines Adjuvants) durch intraperitoneale Wirkstoffapplikation erreicht werden (Hardy et al., 2002, Reprod. Fertil. Dev. 14 (3), 151-155.). Dieser Wert ist aber sehr nahe an den 60 % Reduktion, die notwendig sind, eine Wildmauspopulation im Feld zu kontrollieren (Chambers et al., 1997, Belg. J. Zool. 127, 145-156)

Die ZP Proteine oder Peptide im Sinne der vorliegenden Erfindung können zusätzlich mit weiteren Proteinen oder Peptiden, insbesondere mit Protein- oder Peptiddomänen fusioniert sein, die zusätzliche Eigenschaften vermitteln. Dies können bevorzugt Protein- oder Peptiddomänen sein, die erstens, andere Ziele für eine sterilisierende Autoimmunreaktion vermitteln, oder zweitens, die Immunantwort steuern (z.B. Tetanus Toxoid, bovine RNase 4. io4aa) oder drittens, die Aufnahme des Zielorganismus verbessern/ermöglichen (siehe nächsten Absatz). Zum ersten Punkt gibt es zahlreiche Bespiele wie die sterilisierende Wirkung durch Aneinanderreihung von befhichtungs-assoziierten Peptiden Insbesondere bevorzugt sind Proteine, Peptide oder Domänen davon, die die orale Aufnahme von ZP Proteinen oder Peptiden verbessern oder ermöglichen und/oder die die Produktion oder galenische Formulierung verbessern.

Oral verabreichte Peptide müssen besonders vor Proteasen im Verdauungstrakt geschützt werden, zudem sollte der Transfer über die Darmschleimhaut und die Immunogenität gesteigert werden. Dazu können die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide bevorzugt mit der Untereinheit B des Choleratoxins und/oder Transferrin fusioniert werden. Die nicht-toxische Untereinheit B des Choleratoxins (CTB) (Liu et al., Marine Drugs 2014, 12:1512-1529; McKenzie et al., The Journal of Immunology 1984, 133:1818-1824; Naz and Aleem, Nottingham University Press; 2007; Clydesdale, Reproduction 2004, 128:737-745; Hardy et al, Development 2002, 14:151-155; Lou et al, 1995, J. Immunol. 155 (5), 2715- 2720; Hardy et al., Molecular Reproduction and Development 2008, 75:126-135; Naz, Molecular reproduction and development 2008, 75:336-344) hat sich bereits als Immunogenitäts-steigernd erwiesen hat (Mikschofsky et al., Plant Science 2009, 177: 35-42). Transferrin (Tf) hat einen stabilisierenden Effekt (Castilho et al., Glycobiology 2011, 21:813- 823; Choi et al., Plant Biotechnol J 2014, 12:425-435). CTB wird als pathogenes Protein durch in der Darmschleimhaut befindliche Zellen des Immunsystems, den sog. M-Zellen, erkannt, die eine CTB-spezifische Immunreaktion induzieren. Transferrin vermittelt die Aufnahme durch die Darmepithelzellen, den sog. Enterozyten, sowie anschließend den Transport in die Blutbahn. Beide Fusionspartner kommen alleine oder in Kombination bevorzugt für eine Fusion am N-Terminus des ZP Proteins oder Peptids in Betracht. Darüber hinaus gibt es eine Reihe weiterer potentieller Fusionspartner, die auf Grund ihrer immunomodulatorischen Eigenschaften die Aufnahme und Wirkung der ZP- Vaccine nach oraler Applikation begünstigen können. Beispielsweise erwies sich das in seiner Struktur und seinem Wirkmechanismus dem CTB stark ähnelnd sog. heat-labile enterotoxin B (LTB), das aus Escherichia coli (ETEC) stammt, als genauso effektiv (da Hora et al., 2011, Vaccine 29(8):1538-1544; Fingerut et al., 2005, Vaccine 23(38):4685-4696). Analog zu CTB und LTB, die aus bakteriellen Pathogenen isoliert wurden, können die ZP-Komponenten mit viralen Proteinen fusioniert werden. Als besonders wirksam erwies sich dabei die Fusion mit Hüllproteinen des Hepatitis B Virus. Durch die Fusion bilden sich Virushüllen, auf deren Oberfläche das Zielprotein präsentiert wird, wodurch eine effektive Immunantwort induziert wird. Auf der anderen Seiten bewirkt der Einbau in die Virushülle einen effektiven Schutz vor im Darm befindlichen Proteasen (Peyret, 2015, PloS one 10(4):e0120751). Pflanzliche Lektine vermitteln ebenfalls die Bindung an M-Zellen. So z.B. das Lektin Agglutinin-1 aus Ulex europeaus (UEA-1) und ArtinM aus Artocarpus heterophyllus (Souza et al., 2013, Glycoconj J 30(7):641-657), die bereits in ersten Studien erfolgreich eingesetzt wurde (Azizi et al., 2010, PLoS Pathog 6(ll):el001147). Ein anderer Ansatz besteht darin, Proteine des körpereigenen Immunsystems als Immunostimulantien einzusetzen, die aus dem Zielorganismus selbst stammen und zusätzlich eine Artspezifität des Wirkstoffs gewährleisten. Die Artspezifität wird dadurch erreicht, dass sie von Rezeptoren auf der Oberfläche der M-Zellen gebunden werden, die allein körpereigene Immunomodulatoren erkennen (Zhang and Wu, 2014, Drug Discovery Today 19(7):898-904). Zu diesen körpereigenen Immunomodulatoren gehören das Interferon delta (IFN-δ) (Permyakova, 2015, BioMed Research International 2015:11), sowie die vom Komplementfaktor C5a abgeleiteten Peptide EP67 (Karuturi et al., 2015, Clinical Immunology 161(2):251-259) und Col (Kim et al., 2013, International Immunology 25(11):623-632).

Die Formulierung (Galenik) bestimmt im Wesentlichen den Erfolg eines Medikaments und ist ein entscheidender Bestandteil der Entwicklung pharmazeutischer Produkte. So können Applikationsform und Wirkort bestimmt, sowie die Wirksamkeit des Pharmakons beeinflusst werden. Das ZP Protein oder Peptid soll durch eine Formulierung für die orale Applikation bevorzugt vor dem sauren Milieu im Magen geschützt werden, so dass es erst im Dünndarm freigesetzt wird (Bhatla et al, Biotechnology Advances 2010, 28:293-300; Guillen et al., 2013, Appl Microbiol Biotechnol 97(9):4141-4148; Guillen et al., 2014, Carbohydrate Polymers 112(0):210-21; Pelosi et al., PLoS ONE 2012, 7:e52907; Pelosi et al., Current Drug Delivery 2011, 8:612-621). Hierfür haben sich Fett-basierte Formulierungen als vielversprechend und kostengünstig erwiesen (Bhatla et al., Biotechnology Advances 2010, 28:293-300; Pelosi et al., PLoS ONE 2012, 7:e52907; Pelosi et al., Current Drug Delivery 2011, 8:612-621). Durch die Fusion von Oleosin an den C -Terminus erfolgt Formulierung bereits während der Reinigung durch die Bindung der Fusionsproteine an Fette (Bhatla et al., Biotechnology Advances 2010, 28:293-300). Ebenso wirksam erwiesen sich Stärke-haltige Formulierungen, wobei das Zielprotein mit einer Stärke-Bindenden Domäne fusioniert wird (Guillen et al., 2013, Appl Microbiol Biotechnol 97(9):4141-4148; Guillen et al., 2014, Carbohydrate Polymers 112(0) :210-215. Bei der Domäne handelt es sich um Proteinabschnitte von Amylasen, die die Bindung des Stärke-abbauende Enzyms an das wasserunlösliche Substrat vermitteln. Analog zur Bindung des Zielproteins an öl und Stärke, kann das Zielprotein ebenfalls in die Speicherproteine des Samens, in dem sie gebildet werden, eingebaut bzw. verpackt werden. So. z.B. wurde erwies sich bereits ein Fusionsproteins bestehend aus dem Speicherprotein Glutelin aus Reis, nach oraler Applikation als therapeutisch wirksam (Iizuka et al., 2014, Plant biotechnology journal 12(8):1143-1152). Das ZP Protein oder Peptid im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist zur oralen Verabreichung formuliert. Dies wird besonders bevorzugt durch Fusion mit Fusionspartnern wie oben beschrieben erreicht.

Unter dem Begriff „Verhinderung des Anwachsens der Anzahl" ist eine statistisch signifikante Reduktion des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation zu verstehen. Ob eine statistisch signifikante Reduktion vorliegt, kann der Fachmann mit gängigen Verfahren aus der Statistik beurteilen. Es versteht sich jedoch, dass eine statistisch signifikante Reduktion nicht notwendigerweise, auch wenn dies bevorzugt ist, zu einem Verharren der Anzahl der Tiere der Tierpopulation oder gar zu einer Reduktion in Folge der natürlichen Sterblichkeitsrate innerhalb der Tierpopulation führt. Durch die statistisch signifikante Reduktion des Anwachsens wird die Tierpopulation jedoch auf jeden Fall so weit am Anwachsen gehindert, dass eine durch sie hervorgerufene Schädigung, z.B. an Erntegut, tolerierbar wird.

Der Begriff „Tier" wie hier verwendet bezieht sich auf nicht-menschliche Säugetiere, insbesondere auf Säugetiere, deren Population kontrolliert werden muss, z.B. auf Schadtiere, wie Nager, aber auch auf Katzen oder Hunde aus z.B. wildlebende Katzen oder Hundepopulationen oder Wildtiere, wie Wildschweine, Rehe, Hirsche, Hase oder Kaninchen. Besonders bevorzugt im Rahmen der Erfindung sind jedoch Schadnager, insbesondere Mäuse oder Ratten.

Zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide können Zellkulturen von eukaryotische Zellen und insbesondere Nagerzellen verwendet werden. Besonders geeignet sind hierbei Zellkulturen von murinen Mäuse- Adipozyten als zelluläres Produktionssystem, da sie einen hohen Fettanteil haben und daher große Mengen Impfstoff bereits intern binden könnten. Neben Zellkulturen von Nagerzellen können auch Hefezellkulturen eingesetzt werden. Als Hefen kommen bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, Pichia Arten, wie Pichia pastoris, in Frage.

Neben eukaryotische Zellen und Zellkulturen davon kommen aber auch pflanzliche Expressionssysteme einschließlich transgener Pflanzen in Frage.

Bevorzugt können die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide in Nutzpflanzen hergestellt werden, besonders bevorzugt in Nutzpflanzen, die Eiweiß- oder Öl- reiche Samen oder stärkereiche generative oder vegetative Vermehrungsorgane produzieren. Zu den Pflanzen mit Eiweiß-reichen Samen gehören Leguminosen, wie Erbsen, Bohnen, Kichererbsen, Linsen, Sojabohnen, Erdnüsse oder Lupinen. Zu den Pflanzen mit Öl-reichen Samen gehören Raps, Soja, Sonnenblumen, Erdnuss, Canola, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Borretsch oder Bäume wie Ölpalme oder Kokosnuss. Zu den Stärke-haltigen Vermehrungsorganen gehören z.B. Samen wie Weizen, Mais, Reis, und Gerste, Früchte wie Kastanien und Knollen wie Kartoffel oder Maniok. Daneben können aber auch weitere Nutzpflanzen wie Tabak zur Produktion der erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide verwendet werden.

Die Expression der erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide kann mittels Samen-spezifischer Promotoren gezielt im Samen erfolgen, sodass die Proteine oder Peptide über ihre Fett-bindenden Domänen gezielt mit den Fetten im Samen interagieren und an diese gebunden werden können. Alternativ können die ZP Proteine oder Peptide auch unter der Kontrolle eines ubiquitär exprimier enden Promotors exprimiert werden. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt, ebenso wie Plasmide oder andere Vektoren, die zur Herstellung transgener Pflanzen eingesetzt werden können. Geeignete Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.

Geeignete Klonierungsvektoren sind insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilze gewährleisten, und die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und kointegrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium- vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei kointegrierten Vektor- Systemen vir-Gene und T -DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Binl9, pBHOl, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA und pLH9000 sowie pLH7000. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens 2000, Trends in Plant Science 5:446-451. Die Vektoren mit den für die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide kodierenden Nukleinsäuren lassen sich in Mikroorganismen, insbesondere E. coli und Agrobacterium turne faciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen. Mittels der Klonierungsvektoren können die ZP Proteine oder Peptide in Organismen wie Mikroorganismen oder Pflanzen eingebracht werden und damit zur Pflanzentransformation verwendet werden. Geeignete Vektoren dafür sind veröffentlicht in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71 -1 19 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ), 205-225)).

Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor. Diese können neben Promotoren auch noch weitere Expressionskontrollsequenzen enthalten, z.B. Enhancer, RNA stabilisierende Elemente oder Polyadenylierungselemente. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methode in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methode in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin.

Besonders vorteilhaft können als samenspezifische Promotoren Promotoren wie der USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, Bce4-, DC3, Phaseolin-, Oleosin- oder Napin-Promotor verwendet werden (siehe z.B. US 5,608,152, W098/45461, US 5,504,200, WO91/13980).

Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erreichen, z.B. chemisch induzierbare Promotoren wie ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz 1992, Plant J. 2, 397-404) oder ein Ethanol-induzierbarer Promotor.

Besonders bevorzugt können die erfindungsgemäßen ZP Proteine oder Peptide stabil in transgenen Pflanzen exprimiert werden. Um eine stabile Integration der ZP Protein oder Peptid kodierenden Nukleinsäure in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollten sich wiederholende Sequenzmotive, die zur Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen fuhren können, vermieden werden. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt (vorteilhaft in einem Polylinker), und anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker hegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Nukleinsäuren werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle, beispielsweise im Polylinker, hinter den Promoter inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäure ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator.

Derartige vorteilhafte Konstrukte werden beispielsweise in DE 10102337 oder DE 10102338 offenbart. Es ist aber auch möglich mehrere Nukleinsäuren hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäure kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden.

Besonders bevorzugt werden Erbsensamen als Produktionssystem eingesetzt. Pflanzensamen erlauben ohne Trocknung und Kühlung eine stabile Lagerung der Proteine. Die Erbse hat sich hier als besonders geeignet erwiesen.

In allen Herstellungssystemen kann die Reinigung und Formulierung der Proteine über Fett als Bindematrix in einem Prozessschritt erfolgen. Bei einer sehr hohen Proteinexpression kann das Zellmaterial nach einem kurzen Zellaufschluss und Fettzusatz ohne Reinigung des Fusionsproteins direkt zu Fresspellets verarbeiten werden. Aber auch eine Anreicherung der ZP Proteine oder Peptide durch den Öl-bindenden Fusionspartner ist möglich. So ist eine effektive Immunisierung auch dann möglich, wenn die Konzentration der Peptide im ungereinigten Zellmaterial nicht ausreichen sollte. Grundsätzlich können die ZP Proteine oder Peptide jedoch auch durch andere Reinigungsverfahren ganz oder teilweise gereinigt werden, wie Ionenaustausch- Chromatographie, Molekularsieb- Chromatographie, Affinitätschromatographie oder Kombinationen davon.

Die Nutzung verschiedener Produktionssysteme bietet die Möglichkeit, die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Proteine mit unterschiedlichen Glykosylierungsmustern zu versehen. Diese variieren in Abhängigkeit vom genutzten Herstellungssystem. So findet man bei in Hefezellen produzierten Proteinen eine Glykosylierung mit hohem Mannose-Anteil, während Pflanzen komplexere Zucker an die Proteine hängen, die sich jedoch deutlich von den komplexen Zuckern der Säugerzellen unterscheiden. In vielen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass bei Antigenen das Abweichen vom ursprünglichen Glykosylierungsmuster eine höhere Immunogenität bewirkt (Shaaltiel et al., Plant Biotechnology Journal, vol. 5, no. 5, pp. 579-590, 2007; Rademacher et al., Plant Biotechnology Journal, vol. 6, no. 2, pp. 189-201, 2008). Generell haben sich Pflanz en-produzierte Antigenen häufig als immunogener erwiesen (Pelosi et al., Current Drug Delivery 2011, 8:612-621).

Die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide können nach Herstellung durch geeignete Maßnahmen gereinigt werden. Die gereinigten ZP Proteine oder Peptide können dann in geeigneter Weise für eine orale Verabreichung formuliert werden. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass die Proteine oder Peptide vor Magensäure geschützt werden müssen, falls dies nicht schon durch geeignete Maßnahmen während der Herstellung (siehe oben) geschehen ist. Zudem müssen sie in einer Form vorliegen, die die Resorption im Darm erlaubt. Geeignete pharmazeutische Formulierungen hierfür sind dem Fachmann bekannt. Ebenso ist dem Fachmann bekannt, dass die immunisierende Wirkung der ZP Proteine oder Peptide von der verabreichten Dosis abhängt. Eine geeignete Dosis kann vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden.

Hefen oder andere Zellkulturzellen, z.B. auch murine Adipozyten, können auch abgetötet und als zelluläres Material in Fressködern, Futterpellets oder Futtermitteln verarbeitet werden. In diesem Fall ist keine Reinigung der ZP Proteine oder Peptide notwendig. Vielmehr werden die Zellen lediglich vom Kulturmedium abgetrennt und als Zellpellet weiter verarbeitet.

Sofern Pflanzen als Herstellungssysteme eingesetzt werden, können aber auch Pflanzen oder Teile davon wie Blätter, Stängel, Früchte, Samen oder Wurzeln direkt als orale Verabreichungsformulierung verwendet werden. Insbesondere ist hierbei die Verwendung von Samen bevorzugt, die die erfindungsgemäß einzusetzenden ZP Proteine oder Peptide enthalten. Diese Samen können leicht verteilt werden und als Futtermittel für die einzudämmende Tierpopulation dienen, z.B. als Fressköder für eine Schadnagerpopulation. Die Pflanzen oder Pflanzenteile können natürlich auch zu anderen Arten von Futtermitteln weiterverarbeitet werden, z.B. zu Futterpellets. Verfahren zur Herstellung von Futterpellets aus Pflanzen oder Pflanzenteilen sind im Stand der Technik bekannt.

Vorteilhafterweise wurde im Rahmen der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Studie festgestellt, dass die Immunkontrazeption durch orale Verabreichung von ZP Proteinen oder Peptiden eine geeignete Maßnahme darstellt, um Populationen von Schadtieren, wie Schadnager, einzudämmen. Anders als bei im Stand der Technik bekannten Verfahren für Wild- oder Zootiere ist keine individuelle Verabreichung der ZP Proteine oder Peptide nötig. Dies wird dadurch erreicht, dass die ZP Proteine oder Peptide, die erfindungsgemäß eingesetzt werden sollen für die orale Verabreichung formuliert werden. Zudem kann bevorzugt durch die Verwendung von Spezies spezifischen Peptiden die Wirkung auf eine bestimmte Spezies, wie Schadnager, eingeschränkt werden.

Eine Senkung der Fruchtbarkeit durch Fressköder ist eine erfolgversprechende Möglichkeit zur effizienten Eindämmung von Schadnagerpopulationen. Vorteilhafterweise wird durch diese Maßnahme nicht das gesamte Ökosystem eliminiert. Des Weiteren sind die Tiere in diesem Fall nicht in der Lage, die Wirkung mit der Ursache zu verbinden, was sonst häufig zu einer Meidung der Fressköder führt. Auch die Erhöhung der Vermehrungsrate in Populationen, die bei erhöhter Mortalität beobachtet werden kann, wird so vermieden. Verunreinigungen von z.B. von Schadnagern befallenen Erntegutvorräten durch Kadaver werden ebenfalls drastisch reduziert. Gleichzeitig ist aus tierethischen Gründen eine Sterilisierung gegenüber einer zumeist qualvollen Verblutung durch die eingesetzten Antikoagulantien zu bevorzugen.

Die zuvor getroffenen Definitionen und gemachten Erklärungen der Begriffe gelten für die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen entsprechend.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verhinderung des Anwachsens der Anzahl von Tieren in einer Tierpopulation umfassend die Verabreichung eines ZP Proteins oder Peptids an zumindest ein weibliches Tier der Tierpopulation, wobei das ZP Protein oder Peptid zur oralen Verabreichung formuliert ist

Bevorzugt ist das Tier im erfindungsgemäßen Verfahren ein Nager.

Bevorzugt ist das ZP Protein oder Peptid im erfindungsgemäßen Verfahren zur oralen Verabreichung formuliert, wie oben beschrieben.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Futtermittel enthaltend ein ZP Protein oder Peptid, wobei das ZP Protein oder Peptid zur oralen Verabreichung formuliert ist

Ein„Futtermittel" im Sinne der Erfindung kann hierbei jedes Futtermittel sein, in dem das ZP Protein oder Peptid in geeigneter Weise verarbeitet sein kann. Die Art und Ausgestaltung des Futtermittels ist abhängig von den zu fütternden Tieren. Bei Pflanzenfressern kann das Futtermittel eine Pflanze, ein Pflanzenteil, wie Blatt, Stängel, Wurzel oder Samen sein, oder ein daraus hergestelltes Futterpellet. Bei Fleischfressern kann es zusätzlich notwendig sein Fleisch oder Fleischprodukte mit zu verarbeiten, um das Futtermittel als Fressköder attraktiv zu machen.

Bevorzugt ist das Futtermittel ein Futterpellet, ein Fressköder, eine Pflanze oder ein Pflanzenteil.

Besonders bevorzugt ist das Futtermittel ein Futterpellet oder ein Fressköder, der Hefezellen oder Säugerzellen wie oben definiert, und bevorzugt murine Adipozyten, aufweist, die ZP Protein oder Peptid exprimieren.

Besonders bevorzugt liegt das ZP Protein oder Peptid im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendungen oder der erfindungsgemäßen Verfahren in Form des erfindungsgemäßen Futtermittels wie zuvor beschrieben vor.

Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt und in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

ABBILDUNGEN

Fig. 1: Preparation von bioabbaubaren Mikrokapseln (Multi-Core Kapsel) Fig.2: Freisetzungsmechanismus von Proteinen aus Mehrschichtkapseln

BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Sie dürfen im Hinblick auf den Schutzumfang nicht in einschränkender Weise ausgelegt werden.

Beispiel 1: Klonierung des ZP3 Peptids in Expressionsvektoren zur Expression eines Fusionspeptids in Erbsen Das ZP3 Peptid in einfacher oder mehrfacher Wiederholung wird N-Terminal mit Transferrin oder CTB über eine geeignete Linkersequenz fusioniert sowie am C-Terminus mit der entsprechenden Stärke oder Öl bindenden Domäne. Anschließend wird die digital erstellte Nukleotidsequenz an die Kodonnutzung der jeweiligen Kulturpflanze (bspw. Erbse) angepasst und das Fusionsprotein synthetisch durch eine Firma hergestellt. Bei der Synthese werden geeignete Restriktionsstellen am 5' und 3 '-Ende der Nukleotidsequenz angehängt um die Klonierung hinter einen samenspezifischen Promotor (bspw. phas oder arc) und vor einen geeigneten Terminator vornehmen zu können. Als geeigneter Transformationsvektor kann z.B. der pLH9000 oder pLH7000 dienen.

Beispiel 2: Herstellung transgener Erbsenpflanzen

Die Transformation der Erbsen sowie die Regeneration transgener Erbsensprosse erfolgt nach einem modifizierten Protokoll von Polowick (Polowick et al., 2000, Plant Science 153.2, 161- 170). Getrocknete Samen der zu transformierenden Erbsensorte werden für 24 h über Nacht in ausreichen Wasser vorgequollen. Zur Oberflächensterilisation der Samen wird das restliche Wasser entfernt und die gequollenen Samen mit 70 %igem Alkohol für 5 min vollständig bedeckt. Zur weiteren Sterilisation der Samen wird der Alkohol abgegossen, die Erbsen mit einer 2 % Hypochloridlösung bedeckt und für 20 min bei 150 rpm geschüttelt. Die Hypochloridlösung wird anschließend verworfen und die Erbsen sechs Mal mit autoklaviertem Atfert. gewaschen. Die Erbsen verbleiben bis zur Transformation im Wasser. Transformiert werden bei der Erbse Stücke(Scheiben des Embryos. Hierzu wird unter dem Binokular die Testa des Samen mit Pinzette und Skalpell abpräpariert, ein Kotyledone entfernt und die Wurzelspitze des freiliegenden Embryos mit dem Skalpell gekappt. Der verbleibende Embryo wird nun in dünne Scheiben zerlegt (3-5), die anschließend auf das B5H-Medium aufgelegt werden. Jede Embryoscheiben wird mit 2-5 μΐ Agrobokterien- suspension (OD=0,06) überschichtet und für vier Tage bei 21 °C im Licht Dunkel Rhythmus für vier Tage im Pflanzenschrank kokultiviert. Die Agrobakterien tragen auf ihrer t-DNA das synthetische Gen zur samenspezifischen Expression sowie den Selektionsmarker. Nach vier Tagen werden die Explantate vom B5H-Medium abgenommen und 45 min in Timentin gespült und auf Kallusinduktionsmedium (PI) überführt. Nach 14 Tagen werden diese Explantate auf Sprossinduktionsmedium (P2) überführt und sich entwickelnde Sprosse bei einer Länge von ca. 1 cm abgeschnitten und auf Wurzelinduktionsmedium gesteckt. Dass Sprossinduktionsmedium wird nach vier Wochen erneuert. Bewurzelte Sprosse werden analysiert, in vitro vermehrt und in Erde in das Gewächshaus überführt.

Beispiel 3: Herstellung eines magensaftresistenten Futtermittels aus transgenen Erbsen ZP3 Peptide exprimierende Erbsen weiden vermählen. Das entstandene Erbsenmehl wird in 0,9 %iger NaCl-Lösung unter Rühren aufgeschlemmt. Der nicht gelöste Kohlenhydratanteil des Erbsenmehls wird durch Zentrifugation bei 5.000 g von der flüssigen Phase abgetrennt. Die im Überstand enthaltenen Proteine werden anschließend durch Präzipitation mittels Ammoniumsulfat (60 % Sättigung) ausgefällt. Die nach Zentrifugation (5.000 g) erhaltenen Präzipitate werden in PBS gelöst, gegen die 10 fache Menge PBS dialysiert und final einer Sprühtrocknung unterzogen. Das vorliegende Proteinpulver wird in einem nächsten Schritt zur Herstellung eines mikroverkapselten, magensaftresistenten Futtermittels (Eudragithülle) eingesetzt. Das zur Anwendung kommende Prinzip ist in Abbildung 1 gezeigt.

Im Ergebnis des Verkapselungsverfahrens steht ein frei fließendes Futterpulver zur Verfügung. Die Freisetzung der Proteine erfolgt nach Magenpassage im Dünndarm. Dabei kommt das in Abbildung 2 dargestellte Prinzip zum Einsatz:

Bei Freisetzungsprüfungen in-vitro werden Freisetzungsraten (1 h, 37° C, PBS-Puffer) von 70 bis 80 % ermittelt.

Die In-vivo-Prüfung ergibt die im Weiteren dargestellten Resultate:

1. Herstellung von Immunisierungsfutter

- Mischen von pulverisiertem Mäusezuchtpulver (ssniff Spezialdiäten GmbH, 59494 Soest) mit 20 % Mikrokapseln

- Zugabe von Trinkwasser bis eine teigige Konsistenz erreicht ist

- Ausstreichen des Teigs in einer Stärke von etwa 1 cm

- Schneiden des plattierten Teigs in ca. 4 cm ² (2 x 2 cm) große Quadrate

- Trocknen des Teigs

2. Durchführung des Immunisierungsversuchs

- 20 weibliche BalbC-Mäuse werden 6 Wochen ad libitum mit Versuchsfutter behandelt

- 20 weitere weibliche Mäuse erhalten Kontrollfutter ohne Mikrokapseln.

3. Nach Abschluss der experimentellen Fütterungsperiode erhalten alle Tiere normales Mäusezuchtfutter. Die Tiere werden in jeweils 10 2er Gruppen randomisiert. Jeder 2er Gruppe wird für 15 d 1 Bock zugesetzt, um mögliche unterschiedliche Fertilitätsraten bei den männlichen Tieren auszugleichen. Nach einer Tragezeit von 20-22 d werden folgende Resultate ermittelt:

Das bedeutet, dass 80 % der Versuchstiere gegenüber lediglich 10 % der Kontrolltiergruppe keine Trächtigkeit ausbilden. Die Zahl der geworfenen Tiere reduziert sich von 106 bei der Kontrollgruppen auf 16 bei den Versuchsgruppen (=ca. 85 % Nachkommenreduktion).