Die Erfindung betrifft ein Messverfahren zur elektrischen spektroskopischen Impedanzmessung eines lebende Zellen enthaltenden Fluids, wobei über zumindest zwei Elektroden in dem Fluid angeordnet werden, und mehrere Messsignale in Form von Wechselspannungen nacheinander zwischen den Elektroden angelegt und der Strom und die Spannung als Messwerte zwischen den Elektroden gemessen werden, wobei dabei die Frequenzen der Wechselspannungen zumindest teilweise unterschiedlich sind.

Dabei finden solche Verfahren besonders zur Zellzahlbestimmung von biotechnologischen Proben Anwendung. Solche Messverfahren zur Bestimmung der Zellzahl von einer beliebigen mikrobiologischen Kultur mittels eines Wechselspannungssignals, indem ein definierter Frequenzbereich abgefahren wird, sind bereits bekannt. Beim Fluid handelt es sich dabei meist um das Medium, in dem die Zellen leben. Dies kann ein Nährmedium im Laborbereich sein oder im industriellen Bereich beispielsweise ein Malzextrakt mit einer Würze zur Bereitstellung der Mineralstoffe zur Bierherstellung.

Ein wichtiger Aspekt bei industriellen Fermentationsprozessen ist eine durchgängige und lückenlose Prozessüberwachung. Das vordergründige Ziel hierbei ist eine hohe Produktqualität zu garantieren bzw. zu gewährleisten . Bei Fermentationsprozessen kommen unterschiedlichste mikrobiologische Kulturen zur Anwendung. Für einen einwandfreien verfahrenstechnischen Prozess ist der physiologische Zustand der jeweiligen mikrobiologischen Kultur ein entscheidendes Kriterium . Um deren Zustand zu überwachen bzw. gegebenenfalls darauf einzuwirken, werden neben herkömmlichen Analysemethoden, wie pH-, d0 ₂ - und Produktgas- Analyse, verschiedenste Messmethoden eingesetzt, die wiederum auf unterschiedliche physikalisch-chemischen Prinzipe beruhen.

In industriellen Prozessen werden mittlerweile zur Abschätzung der Produktion der Biomasse (= Zuwachs der mikrobiologischen Kultur) sogenannte Softsensor- Anwendungen eingesetzt. Dabei handelt es sich um keinen physisch existierenden Sensor, sondern anhand von verschiedenen Messgrößen wird mit Hilfe eines Modells eine Korrelation berechnet. Damit soll ein zu überwachender Prozess gesteuert bzw. geregelt werden. Als eine Messgröße dient hier beispielsweise die Ermittlung von Stoffwechselabbauprodukten mittels Flüssig-Chromatographie. Es sind des Weiteren auch Messmethoden bekannt geworden, die entweder nur die Zellzahl oder die physiologische Aktivität einer mikrobiologische Zellkultur erfassen können, oder die zu messenden Zellen mit äußerst starken elektrischen Feldern polarisieren, und damit ungenaue Messergebnisse erzielen. Um jedoch diese entscheidenden Messgrößen zu erfassen, sind meist mehrere konventionelle Messsysteme nötig, die zum Teil außerhalb eines Prozesses positioniert sind. Derartige Prozessanalysen sind nicht prozessintegriert und finden meist nicht in Echtzeit statt.

Alternativ zu dem beschriebenen Verfahren erfolgt eine lebend-Zellbestimmung außerhalb des Prozesses mittels Fluoreszenz-markierter Zellen, die unter Zuhilfenahme der Durchflusszytometrie oder der Konfokalmikroskopie stattfindet, wie in : Microbiological Reviews, 1996, 60 (4), 641-696 und Journal of Immunological Methods, 2000, 243 (1), 191-210 beschrieben.

Die Impedanzspektroskopie ist grundsätzlich als Untersuchungsmethode von heterogenen Stoffgemengen, sogenannte„Dispersion", aus der Literatur bekannt. Hier wird im Allgemeinen ein alternierendes Strom-/Spannungssignal bei hohen Frequenzen (AC) verwendet. Da es zu großen Auslenkungen des elektrischen Feldes (Amplituden) kommt, ist hier auch die Rede von einer sogenannten ß- Dispersion. Dieses Messprinzip ist beschrieben in : IEEE Trans. Biomed. Eng., 1984, 31, 872-87 und Proc. IEEE, 1980, 68, 104-113.

Zellen mit einer ganzzahligen Zellmembrane bewirken eine„relative Permittivität" zwischen zwei Elektroden. Dieses Messsignal wird daher für eine Abschätzung der lebend-Zellkonzentration (VCC) herangezogen. Dieses Messprinzip ist wie folgt beschrieben : Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2000, 17, 3-36; Bioprocess Biosyst. Eng., 2009, 32, 161-173; J. Biotechnol ., 2005, 118, 398-405 und Cytotechnology, 2006, 50, 35-48. Bei dieser Messmethode hat der physikalische Prozess einen großen Einfluss auf die Messergebnisse. Besonders kritisch wirken sich hierbei die Prozessparameter, wie die Belüftung, Blasenbildung durch Rührung, Temperatursprünge und pH-Gefälle aus.

Aus der US 7 930 1 10 B2 ist ein Verfahren bekannt, welches zur impedanz- spektroskopischen Erfassung von Informationen über die Menge oder/und Größe von lebenden Zellen in einer Biomasse mittels eines elektrischen Feldes dient.

In der US 6,596,507 B2 wird ein für eine derartige Messung einsetzbarer Biomassesensor beschrieben. Zur Bestimmung der lebend-Zelldichte (engl. Viable Cell Density) wurden im Stand der Technik Messsonden auf Basis der Permittivität (physikalische Einheit: As/Vm) entwickelt. Ein derartiges Messsystem ist von der Anmelderin unter dem Handelsnamen "Incyte" vertriebener Sensor bekannt. Hierbei wird das gesamte Volumen, indem sich die lebenden Zellen befinden, alternierend polarisiert und depolarisiert. Dabei wird das elektrische Feld gemessen.

In der WO2017149005A1 wird ein Verfahren zur Kalibration von impedanz-spek- troskopischen Biomassesensoren zur Erfassung von Information über die Menge oder/und Größe von lebenden Zellen in einer Biomasse mittels eines elektrischen Feldes beschrieben.

Die oben beschriebenen Messsysteme sind jedoch nicht ausgereift oder nicht praktikabel, insbesondere ist die Messgenauigkeit und die für den Betrieb erforderliche Zuverlässigkeit gering, dies betrifft insbesondere die Beeinflussung des lebend- Zellvolumens durch die äußerst hohen elektrischen Felder.

Es wurden also bereits Verfahren beschrieben, die in einen Frequenzbereich von 40 Hz bis 110 MHz Messungen vornehmen. Bei diesen Verfahren wird der Frequenzbereich abgefahren, bei dem hauptsächlich der Effekt der ß-Dispersion auftritt. Die gemessenen Impedanzwerte können mit der Zellkonzentration von lebenden Zellen korreliert werden. Damit können solche Verfahren zur Bestimmung der Lebend-Zellzahl und der Zellkonzentration verwendet werden. Nachteilig ist jedoch, dass die gewonnenen Werte stark von anderen Parametern wie beispielsweise der Nährstoffmenge im Fluid beeinflusst werden. Demnach ist es für die industrielle Verwendung schlecht geeignet bzw. nicht zuverlässig genug.

Aufgabe der Erfindung ist damit, ein Verfahren der beschriebenen Art bereitzustellen, mit der die Leben-Zellkonzentration genauer bestimmt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die spektroskopische Impedanzmessung einen Frequenzbereich von 0,1 Hz bis 10 ⁶ Hz umfasst.

Durch die Gewinnung der Messwerte in diesem Bereich sind die Werte überraschenderweise wesentlich besser mit der Zellkonzentration korrelierbar. Dies kann zumindest teilweise dadurch erklärt werden, dass im Bereich der besonders niedrigen Frequenzen der Effekt der α-Dispersion auftritt.

Die Messwerte werden vorzugsweise über den gesamten Frequenzbereich verteilt, besonders vorzugsweise im Wesentlichen gleichmäßig. Es kann auch vorgesehen sein, dass besonders interessante, bzw. charakteristische Frequenzbereiche mit mehr Messwerten näher untersucht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich zum Stand der Technik darin, dass die lebend-Zellbestimmung sehr nahe an den Elektroden stattfindet, und da- her sehr kleine Polarisierungsspannungen verwendet werden, um die zu bestimmende mikrobiologische Zellkultur über das Spannungsmesssignal nicht zu beeinflussen. Im Gegensatz zum Stand der Technik wird dort das gesamte Messvolumen um die Elektroden herum mit einem Spannungssignal polarisiert, was dazu führt, dass teils große elektrische Felder auf die zu bestimmende mikrobiologische Kultur wirken .

Somit weist das Verfahren eine höhere Messgenauigkeit gegenüber den bekannt gewordenen Systemen auf.

Vorteilhaft ist, wenn metallische Elektroden in/ oder außerhalb eines Gehäuses vorgesehen sind, welche in ein Medium eines zu untersuchenden mikrobiologischen Fluides wie einer Zellkultur eintauchen bzw. berühren.

Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, dass die gemessene Doppelschichtkapazität als Funktion für die Vitalität oder die Lebend-Zellkonzentration einer Zellkultur und für die Zellzahl korreliert werden kann. Das gemessene Signal steigt mit der Zellvitalität. Zudem hat sich gezeigt, dass sich das Messsignal sehr stark mit der Temperatur ändert.

Unter„lebend-Zellbestimmung" wird im Rahmen dieser Offenbarung die Ermittlung der Vitalität einer mikrobiologischen Zellkultur, der Zellzahl der lebenden Zellen in einem definierten Volumen und damit die Zellkonzentration verstanden.

Hierbei hat sich gezeigt, dass während einer Messung die Temperatur konstant gehalten werden muss. Die Messung findet üblicherweise bei einer Temperatur statt, bei der eine mikrobiologische Zellkultur sinnvoll fermentiert bzw. kultiviert werden kann. Je niedriger die Temperatur, umso langsamer findet der Biomassezuwachs (= Wachstum bzw. Zellvermehrung) statt. Im Gegensatz dazu erhöht sich der Biomassezuwachs mit zunehmender Temperatur. Im gegenständlichen Fall wurde eine Temperatur von 28 °C gewählt.

Unter„Online" und„Inline" Messsystem wird im Rahmen dieser Offenbarung die Ausführungsarten des Messsystems verstanden. Wird ein Messsystem beziehungsweise eine Sonde im Bypass eines Hauptgefäßes zur Lagerung oder Bearbeitung des Fluids wie eines Fermenters betrieben, spricht man von einer Online- Sonde, dabei befinden sich die Elektroden vorzugsweise abgekapselt und abgedichtet in einem Gehäuse. Die Elektroden können dabei zur Messung als Online-Elektroden in einem Bypass-Kanal eines Hauptgefäßes des Fluids angeordnet werden. Das über den Bypass-Kanal geführte Fluid kann entweder in das Hauptgefäß rückgeführt werden, verworfen oder anderweitig verwendet werden. Unter Bypass wird dabei ein Strömungsweg abseits des Hauptströmungsweges oder des Hauptge- fäßes verstanden, über den kleine Mengen des Fluids beispielsweise zur Untersuchung abgeführt werden können. Befindet sich hingegen die Messsonde direkt in einem Fermenter, so handelt es sich hierbei um ein Inline-Messsystem, dabei ragen die Elektroden in die zu analysierende Umgebung und werden umströmt. Dabei können die Elektroden zur Messung als Inline-Elektroden in einem Hauptgefäß des Fluids angeordnet werden.

Unter„makroskopischer Aufbau" wird im Rahmen dieser Offenbarung die Ausführungsart der Elektroden verstanden, die einen größer flächigen Aufbau aufweisen.

Unter„mikroskopische Struktur" wird im Rahmen dieser Offenbarung die Ausführungsart der Elektroden verstanden, die einen mikrostrukturierten Aufbau aufweisen.

Bei einer ersten bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass bei einem makroskopischen Aufbau die metallischen Elektroden aus einem hochlegierten, nicht rostendem Edelstahl ausgeführt werden. Diese Elektroden haben sich außerordentlich geeignet für die Messung der „Doppelschicht-Kapazität" von verschiedenen mikrobiologischen Kulturen. In einer weiteren Ausführung der Erfindung ist vorgesehen, dass diese Edelstahl-Elektroden eine Beschichtung aus Edelmetallen, vorzugsweise aus Gold oder Platin, aufweisen.

Eine weitere Ausführungsvariante sieht vor, dass die Elektroden eine mikroskopische Struktur bestehend aus sehr kleinen punktförmigen Edelstahl-Elektroden, besonders bevorzugt aus Fingerelektroden, vorzugsweise mit/ohne Beschichtung aus Gold oder Platin vorliegen. Dieser Aufbau ist außerordentlich geeignet für eine lebend-Zellbestimmung von sehr geringen Zelldichten.

Mit der erfindungsgemäßen Messsonde werden dieselben Vorteile wie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt, so dass zwecks Vermeidungen von Wiederholungen auf vorstehende Ausführungen verwiesen werden kann.

Unter„Doppelschicht-Kapazität" wird im Rahmen dieser Offenbarung eine elektrochemische Kapazität verstanden, die auftritt sobald eine Zelle aus einer mikrobiologischen Kultur polarisiert wird.

Unter„polarisieren" beziehungsweise„Polarisation" wird im Rahmen dieser Offenbarung das Anlegen eines Spannungssignals zwischen den Elektroden verstanden.

Die Messung der Doppelschicht-Kapazität und die Polarisation der Elektroden erfolgt vorzugsweise mittels eines spektroskopischen Impedanzmessgerätes. Dabei werden die komplexen Widerstandswerten, bestehend aus einem Realteil und einem Imaginärteil, in einem Frequenzbereich von 10 ⁶ bis 10 ¹ Hertz (Hz) und einer Amplitude von vorzugsweise 100 bis 250 mV aufgezeichnet. Mit einem Rechenalgorithmus eines mathematischen Modells wird aus den gemessenen Strom- und Spannungswerten die Doppelschicht-Kapazität ermittelt. Daraus werden schließlich die Anzahl der lebenden Zellen abgeleitet.

Das Verfahren kann in unterschiedlichen Zellkulturen zur Bestimmung der verschiedensten Zelltypen verwendet werden, insbesondere aber in der Lebensmittelindustrie wie der Bierbrauerei für Saccharomyces cerevisiae oder im labortechnischen Bereich für Escherichia coli oder Tumorzellen.

Grundsätzlich eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs erwähnten Art zur lebend-Zellbestimmung für sämtliche Zellkulturen.

Zudem haben Untersuchungen der Anmelderin gezeigt, dass im aus den Messwerten berechneten Impedanzsignal der Doppelschichtkapazität Änderungen im Stoffwechsel von S. cerevisiae bei einer aeroben und anaeroben Kultivierung sichtbar gemacht werden können. Ein Abfall im Impedanzsignal ist sichtbar nachdem die Maltose verbraucht, d.h. aerob verstoffwechselt bzw. metabolisiert, worden war. Im Verlauf des Impedanzsignals können weitere Änderungen im Stoffwechsel abgeleitet werden, die mit der Konzentrationsänderung von Glukose/Ethanol während einer anaeroben Kultivierung einhergeht.

Vorzugsweise wird das Verfahren mit einem geeigneten Messgerät durchgeführt, dass ein Hochleistungs-Impedanzgerät aufweist. In einer preisgünstigeren Alternative der Erfindung ist vorgesehen, dass anstelle eines Hochleistungs-Impedanz- messgerätes eine Messelektronik, bestehend aus einem Frequenzgenerator inklusive Software zur Anwendung kommt. Erfindungsgemäß ist hierbei vorgesehen, dass diese Messelektronik mit dem Algorithmus des zugrunde liegenden biochemisch-physikalischen Modells die Auswertung des Messsignals übernimmt.

Ein weiterer vielversprechender Ansatz ist daher die Möglichkeit zur prozessintegrierten Überwachung einer mikrobiologischen Kultur zur Herstellung von Lebensmitteln, pharmazeutischen Produkten und der Produktion von chemischen Grundstoffen. Ein weiterer Anwendungsbereich liegt in der Abfallverwertung („waste to value"). Zur Steuerung und Überwachung der Produktqualität werden in derartigen Prozessen nach dem derzeitigen Stand der Technik bspw. pH-, d0 ₂ - Produktgasanalyse eingesetzt.

Vorteilhaft ist, dass somit ein prozessintegriertes Messsystem bereitgestellt wird, das kostengünstig herzustellen ist, und mit sehr kleinen Polarisierungsspannungen die Zellzahl einer Zellkultur ermittelt, und über eine verbesserte Messgenauigkeit und Zuverlässigkeit verfügt.

Eine erste bevorzugte Ausführungsvariante der Erfindung sieht vor, dass das gegenständliche Messverfahren zur lebend-Zellbestimmung von Saccharomyces ce- revisiae, kurz S. cerevisiae, bei aeroben- und anaeroben Prozessen eingesetzt wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsvariante der Erfindung sieht vor, dass das gegenständliche Messverfahren zur lebend-Zellbestimmung und zur diagnostischen Charakterisierung von Tumorzellen eingesetzt wird.

Das oben beschriebene Messsystem zur lebend-Zellbestimmung mit einem makroskopischen oder mikroskopischen Aufbau als Elektroden ist als Online- oder Inline Messsystem ausgeführt und weist bei sämtlichen mikrobiologischen Kulturen mit sehr kleinen Polarisierungsspannungen eine hohe Messgenauigkeit auf. In einer Weiterentwicklung wird dieses Messsystem mit einer zusätzlichen Analyse- und Auswerteelektronik kombiniert.

Der Sensorteil weist hierbei ein Online- oder Inline Gehäuse auf, besonders bevorzugt ein hochlegierter nichtrostender Edelstahl, vorzugsweise beschichtet mit Gold oder Platin. Diese Gehäuse sind insbesondere in der Lage die Elektroden in einem definierten Abstand zu halten.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Elektroden elektrisch isoliert, gas- und flüssigkeitsdicht in ein Online-Gehäuse eingebracht. Das Gehäuse besteht hierbei besonders bevorzugt aus einem Mantel zur Temperierung. Diese Messsonde hat sich aufgrund der laminaren Durchströmung als besonders geeignet erwiesen.

Um die Messtemperatur konstant möglichst konstant zu halten, ist es günstig, wenn die Temperatur im flüssigkeitsdurchströmten Kühlmantel gemessen und auf einen festgelegten Wert geregelt wird.

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Elektroden elektrisch isoliert, gas- und flüssigkeitsdicht nach außen geführt und in das Messmedium eingetaucht. Der gegenüberliegende Teil dieser Inline-Messsonde führt die elektrischen Kontakte zur Messauswertung. Diese Messsonde hat sich besonders zur lebend-Zellbestimmung im Inneren von Behältern geeignet.

Unter„Gesamtzellzahl" wird im Rahmen dieser Offenbarung die gesamte Anzahl der lebend- und tot- Zellen im Messvolumen einer mikrobiologischen Kultur verstanden. Um die lebend-Zellbestimmung auch bei wechselnden Bedingungen möglichst exakt zu halten, ist es günstig, wenn die Gesamtzellzahl dem Messystem aus Eingangsgröße zur Verfügung gestellt wird .

Vorzugsweise wird demnach nahe der Elektroden eine optische Sonde zur Gesamtzellzahl angeordnet, die die momentane Gesamtzellzahl erfasst und als Eingangsgröße an das Mess- und Auswertesystem zur lebend-Zellbestimmung übermittelt.

Zur mathematischen Modellierung der Doppelschicht-Kapazität der Elektroden wird zunächst die Beschreibung eines idealen Plattenkondensators angewendet und ist für die erste Betrachtung ausreichend :

„ ε *A

C =— ( i )

C stellt hierbei die Kapazität in Farad [F] dar, der Abstand d entspricht der Distanz zwischen den Platten; ε ist die dielektrische Konstante (ER*£O) und A ist die Fläche der Elektroden . Für eine Elektrode mit der Hälfte des Durchmessers sollte sich der Messwert der Kapazität um den Faktor vier verringern . Das Rühren in einem Behälter beziehungsweise in einem Fermenter hat einen Einfluss einen Einfluss auf die Elektrodenfläche. Somit reduziert sich das Messsignal der Kapazität.

Hierbei werden die gemessenen Rohdaten aus der Impedanzmessung analysiert. Das zur Anwendung kommende physikalisch-mathematische Modell, in weiterer Folge bezeichnet als mathematischer Algorithmus, besteht aus einem elektrischen Widerstand RL, der parallel zu einer nicht-idealen Kapazität CPEDL, mit den Parametern Q, n, verbunden ist. Dieses Äquivalentschaltbild bildet die naturgemäßen Vorgänge der Ausbildung des Doppelschichtbereichs nahe an den Elektroden ab, und kann damit in guter Näherung wie folgt beschrieben werden :

^DL ⁼ l , ,. _Λη _ ( ² )

— +(_io ) ⁿ *Q _DL

KDL ω ist die Kreisfrequenz und i ist der Imaginärteil, n und Q werden als Parameter im physikalisch-mathematischen Modell bestimmt und mit den experimentellen Daten verglichen . M it diesen Parametern kann in weiterer Folge die Doppelschicht- Kapazität CDL mit folgender Gleichung errechnet werden :

C _DL = (Rll ⁿ * Q _DL ) ^1/71 (3)

Vorteilhaft ist, wenn die Wechselspannungen im Bereich von 100 mV bis 250mV liegen . Diese Spannung reicht aus, um Messwerte ausreichender Genauigkeit zu erhalten, ohne zu große Ströme fließen zu lassen . Weiters kann vorgesehen sein, dass zunächst aus den Messwerten ein ohmscher Doppelschichtwiderstand RDL und eine Ladung QDL aus einer gemessenen Doppelschichtimpedanz ZDL nach der Formel :

ZDL = ViRöl + QDL (4) errechnet wird und danach eine Doppelschicht-Kapazität CDL über die Multiplikation des ohmschen Doppelschichtwiderstandes RDL mit der Ladung QDL berechnet wird. Es wird also folgende Formel verwendet:

Mit anderen Worten wird n = l angenommen, wodurch der Kondensator des Ersatzschaltbildes als idealer Kondensator angenommen wird . Dies führt zu einer Vereinfachung der Berechnung. Die so errechnete Doppelschichtkapazität CDL ist in weiten Bereichen sehr gut mit der Lebendzellkonzentration korrelierbar. Über einen weiten Bereich verhält sich die Doppelschicht-Kapazität CDL unter Umständen sogar proportional zur Lebendzellkonzentration . Damit wird der komplexe Widerstand (also die Impedanz) gemessen . In einem weiteren Schritt wird der Imaginärteil über Realteil aufgetragen . Daraus wird die Doppelschichtkapazität CDL ermittelt. Die Formel entspricht einer seriellen Schaltung aus ohmschen und kapazitiven Widerstand.

Weiters kann vorgesehen sein, dass von der Doppelschicht-Kapazität CDL eine Grenzwertkapazität Cthreshoid abgezogen wird. Die Leitfähigkeit ist abhängig vom Medium und wird vorzugsweise mit einer Sonde - besonders vorzugsweise mit der gleichen Sonde, mit der auch die Messung stattfindet - als Kehrwert des Widerstands in Siemens pro Längeneinheit [S/cm] ermittelt. Dadurch können Verzerrungen und Verschiebungen durch Begleitstoffe im Fluid wie verschiedene Zucker oder Alkohole verhindert werden . Dabei kann die Grenzwertkapazität Cthreshoid von davor gemessenen Parametern des Fluids wie beispielsweise der Maltose- oder Glukosekonzentration oder ähnlichem abhängig gemacht werden .

Weiters kann die Genauigkeit der Abschätzung der Lebendzellkonzentration verbessert werden, wenn die Doppelschicht-Kapazität CDL geglättet wird, vorzugsweise über eine Fast Fourier Transformation-Glättung (FFT-Glättung), besonders vorzugsweise über eine 5-Punkt-FFT-Glättung. Dazu können Doppelschicht-Kapazitäten CDL von vorherigen Zeitpunkten in die Berechnung miteingezogen werden und so eine verbesserte Aussage gemacht werden .

Wenn der Frequenzbereich die den Bereich umfasst, in dem α-Dispersion auftritt, so ist dies besonders vorteilhaft, da dies eine besonders gute Korrelation begünstigt. Vorzugsweise wird eine Messsonde zur lebend-Zellbestimmung einer mikrobiologischen Zellkultur, vorzugsweise von Saccharomyces cerevisiae oder Tumorzellen, verwendet, mit einer Zuführung für die mikrobiologischen Zellkultur, mit Elektroden, die über elektrische Anschlussstellen mit einem Mess- und Auswertesystem, zur Generierung eines hoch- und niederfrequenten Messsignals verbunden sind, wobei für die Belegung der Analysespannung und zur Detektion des Messsignals zwei gegenüberliegende Elektroden vorgesehen sind .

Vorzugsweise bestehen die Elektroden aus einem metallischen Werkstoff, insbesondere aus einem nichtrostenden Edelstahl, vorzugsweise hochlegierten Chrom-Nickel- Edelstahlen .

Vorteilig ist, wenn die metallischen Elektroden beschichtet, insbesondere mit Edelmetallen oder N ichtedelmetallen, vorzugsweise Gold beschichtet sind .

Besonders vorteilhaft ist, wenn die Elektroden in einem Abstand von etwa 2 mm angeordnet werden . Dadurch wird nur ein kleiner Teil des Fluids gemessen, der sich sehr nahe an den Elektroden befindet. Dies verbessert die Korrelierbarkeit der Messwerte. Außerdem ist das Risiko von Temperaturschwankungen verringert.

Mit dieser Messsonde kann mittels Impedanzmessung die zellbiologische Doppelschicht-Kapazität nahe der Elektrode ermittelt werden .

Vorteilhaft ist auch, wenn die Temperatur des Fluids im Bereich der Elektroden zum indest während den Messungen eingestellt wird. Dies kann beispielsweise durch eine Temperiervorrichtung im Bereich der Elektroden, beispielsweise in einem Mantel erfolgen . Dadurch wird jener Teil des Fluids, der für die Messung am Wesentlichsten ist, nämlich jenes das sich direkt an den Elektroden und zwischen den Elektroden befindet, auf eine bestimmte, bekannte Temperatur gebracht werden und damit die Korrelation des Messwerte zur Lebend-Zellkonzentration verbessert werden . Dies kann durch Heiz- und/oder Kühlsysteme erfolgen .

Besonders vorteilhaft ist, wenn zunächst aus den Messwerten ein ohmscher Doppelschichtwiderstandes RDL und eine Ladung QDL aus einer gemessenen Doppelschichtimpedanz ZDL nach der Formel

ZDL = ViRit + berechnet wird und danach nach der Formel

CDL(CPE) - (RDL ¹ * QDL) ^1/U eine nichtidealisierte Doppelschicht-Kapazität CDL(CPE) errechnet wird, die charakteristisch für den physiologischen Zustand der Zellen ist. Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die nichte-idealisierte Doppelschicht-Kapazität CDL(CPE), in wei ^¬ terer Folge auch Doppelschichtkapazität CPE-Q genannt, gut mit dem physiologischen Zustand und damit mit der Zellvitalität korrelierbar ist. Im einfachsten Fall verhält sich die Doppelschicht-Kapazität CDL(CPE) direkt proportional zur Stoffwechselaktivität oder das Wachstum der Zellen . Die Vitalität kann insbesondere über die Beobachtung der Doppelschicht- Kapazität CDL(CPE) über einen längeren Zeitraum bestimmt werden . Werden die berechneten Werte über die Zeit aufgetragen und eine Kurve für diese Werte generiert, so kann anhand der Steigung der Kurve die Vitalität bestimmt werden .

Im Folgenden wird anhand von nicht einschränkenden Ausführungsbeispielen mit zugehörigen Figuren die Erfindung näher erläutert. Darin zeigen :

Figur 1 eine schematische Ansicht einer Online-Sonde zur lebend-Zell- bestimmung;

Figur 2 eine schematische Ansicht einer Inline-Sonde zur lebend-Zell- bestimmung;

Figur 3A, 3B eine schematische Darstellung eines mikrostrukturierten Elektrodensystems zur lebend-Zellestimmung einer Zellkultur mit sehr geringer Zellzahl;

Figuren 4A, 4B Ergebnisse der Impedanzmessungen bei unterschiedlichen

Verdünnungen und Zelldichten;

Figuren 5A, 5B Messwerte zur Biomassebestimmung von optischer Dichte

(O D _Ö IO) und dem Trockenzellgewicht (DCW) bei aerober Kultivierung bezogen auf die Kapazität (Gdeai) ;

Figuren 6 Diagramm zur anaeroben Zellkultivierung bei verschiedenen

Zuckerarten und Zuckerkonzentrationen;

Figuren 7A, 7B, 7C Zeitverlauf im Biomassezuwachs bei einer aeroben und anaeroben Zellkultivierung von S. cerevisiae, Impedanzsignal und Maltose-/Ethanol- Konzentrationen über die Zeit, Impedanzsignal und Glukose-/Ethanol- Konzentrationen über die Zeit;

Figuren 8A, 8B Rohdaten von der Impedanzmessung in der Nyquist-Darstel- lung bei aeroben Zellkultivierung im Vergleich von Online- Sonde zur Inline-Sonde; Figur 9 ein Vergleich des errechneten Zellgewichts beziehungsweise der Biomasse aus den Rohdaten der Impedanzmessung mit dem gemessenen Zellgewicht; und

Figur 10 ein schematisches Blockschaltbild über den Aufbau des Mess- und Auswertesystems zur lebend-Zellbestimmung.

In der Figur 1 ist schematisch eine erste Ausführungsvariante einer Messsonde 1 dargestellt, die für eine Online-Anwendung vorgesehen ist, mit metallischen Elektroden 2 als Messelemente, wobei die Elektroden 2 bei dieser Ausführungsform als nichtrostender hochlegierter Nickel-Chrom- Edelstahl ausgeführt sind. Die aktiven Oberflächen der Elektroden 2 ragen in den mit einer mikrobiologischen Kultur 14 als Fluid durchströmten Messkanal 3, die an der Messfläche eine Edelmetallbe- schichtung 4, vorzugsweise mit Gold, aufweisen können.

Die metallischen Elektroden 2 sind beispielsweise mit O-Ringen 5 in einem zylindrischen Gehäuse 6 vom durchströmten Messkanal 3 abgedichtet. Das Sensorgehäuse 6 besteht beispielsweise aus Glas, kann aber selbstverständlich auch aus anderen Materialien, wie beispielsweise aus Edelstahl bestehen, die den lebensmitteltechnischen Vorgaben, oder den biotechnologischen Anforderungen genügen.

Auf den abgewandten Elektrodenflächen 7 sind jeweils zwei elektrische Messkontakte 8 angebracht, und gas- und flüssigkeitsdicht nach außen geführt.

Über dem Sensorgehäuse 6 ist ein Mantel 9 angebracht, der zur Temperierung fungiert. Hierzu kann die exakte Messtemperatur eingestellt werden, sodass die Temperatur in der zu analysierenden Zellkultur während der Messung konstant gehalten werden kann. Als Medium zur Temperierung kann beispielsweise Wasser verwendet werden. Selbstverständlich können auch andere geeignete Medien zur Temperierung eingesetzt werden. Das Temperiermedium wird über einen Ein- und Auslass in einen extern geführten Kreislauf geführt.

Die lebend-Zellbestimmung erfolgt mittels einer 4-Punkt Impedanzmessung, bei der in einem Frequenzbereich von 10 ⁶ bis 10 ¹ Hz eine Amplitude von 100 bis 500 mV an den Elektroden 2 angelegt wird. An jeder Elektrode 2 wird ein elektrisches Leitungspaar 11, 1 elektrisch isoliert und gas- und flüssigkeitsdicht nach außen geführt.

An einem Leitungspaar 11 wird die Polarisierungsspannung angelegt, am zweiten Leitungspaar 1 wird das Messsignal erfasst und im Messsystem analysiert und ausgewertet. Figur 2 und 3 zeigen jeweils schematisch die Anwendung der in Figur 1 gezeigten Messsonde 1 zur lebend-Zellbestimmung.

In Figur 2 ist schematisch eine zweite Ausführungsart der erfindungsgemäßen Messsonde 1 dargestellt, die für eine Inline-Anwendung vorgesehen ist. Die Messsonde 1 besteht wie in Figur 1 beschrieben aus zwei gegenüberliegend angeordneten nichtrostenden hochlegierten Nickel-Chrom- Edelstahlelektroden 2. Die Elektroden, können beispielsweise auf der einander zugewandten Seite eine Edel- metallbeschichtung 4, vorzugsweise aus Gold, aufweisen. Selbstverständlich können auch andere Edelmetallbeschichtung angewendet werden.

Das stab- oder rohrförmige Gehäuse 12 besteht ebenfalls aus einem nichtrostenden hochlegierten Nickel-Chrom- Edelstahl, welches im Inneren die elektrischen Anschlussleitungen 8 für die Elektroden 2 elektrisch isoliert, und entsprechend abgedichtet, zu den elektrischen Anschlussstellen 11, 1 führt.

Eine Überwurfverschraubung 13 fungiert für eine gas- und flüssigkeitsdichte Ver- schraubung in einem Behälter beziehungsweise Gefäß.

In Figur 3 ist eine weitere Ausführungsvariante einer Messzelle 1 dargestellt. Bei dieser Variante sind die beiden Elektroden 2 mikrostrukturiert ausgeführt. Die Elektroden 2 sind bei dieser Ausführung der Erfindung, ohne sich direkt zu berühren, ineinandergreifend als Fingerelektroden ausgeführt. Selbstverständlich ist hier vorgesehen auch beliebige mikrostrukturierte Elektrodengeometrien zu verwenden, um die spezifische Oberfläche zu erhöhen.

Die mikrostrukturierten Elektroden sind mit Edelmetallen, vorzugsweise mit Gold beschichtet. Der Abstand zwischen den Elektroden 2 beträgt zwischen 100-500 μηι . Die Messsonde 1 kann beispielsweise aktiv mit einem Medium einer mikrobiologischen Zellkultur 14 mittels einer Pumpe durchströmt werden.

Diese Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Messzelle 1 eignet sich besonders bevorzugt für mikrobiologischen Zellkulturen mit einer geringeren Zelldichte beziehungsweise kleineren Zellzahlen .

In den Figuren 4A und 4B sind die komplexen Widerstände T und Z" aus der Impedanzmessung in der sogenannten„Nyquist-Darstellung" abgebildet. In Figur 4A sind die Impedanzmessdaten einer Zellkultur bei unterschiedlichen Verdünnungen abgebildet. In der Figur 4A sind die Ergebnisse aus der Impedanzmessung bei verschiedenen Zelldichten zu sehen. Weiters sind in der Figur 4B die mathematisch modellierten Funktionen für die Zelldichten als sogenannter„Datenfit" abgebildet. In den Figuren 5A und 5B sind die Messergebnisse von einer aeroben Zellkultivierung auf Glukose und Maltose abgebildet. Es wird die Biomassebestimmung anhand zweier Messmethoden in Abhängigkeit der idealen Kapazität Cideai zusammen- gefasst. In der Figur 5A wird die optische Dichtemessung O D _Ö IO angewendet und in der Figur 5B ist das Trockenzellgewicht DCW bestimmt worden .

In beiden Fällen wurde die ideale Kapazität Cideai aus dem gemessenen Impedanzsignal m ittels des physikalischen Gleichungssystems, siehe Gleichung 4 und Gleichung 5, extrahiert. Hier zeigt sich eine gute Übereinstimmung, sowohl bei der Zellkultivierung in Glukose als auch bei jener in Maltose.

In der Figur 6 sind die Ergebnisse von unterschiedlichen anaeroben Zellkultivierungen bei verschiedenen Zuckerarten und Zuckerkonzentrationen grafisch dargestellt. Bei ANA1 sind 32,7 g/L Glukose, bei ANA2 sind 44,4 g/L Maltose und 54,2 g/L Glukose, und bei ANA3 sind 22,5 g/L Glukose zugegeben worden .

Dabei zeigen sich unterschiedliche Werte in verschiedenen Zellkultivierungen . Es kann jedoch ebenfalls entnommen werden, dass die Zunahme des Impedanzsignals mit dem Trockenzellgewicht DCW sehr ähnlich verlaufen . Derartige Verschiebungen können durch die Subtraktion einer Grenzwertkapazität Cthreshoid ausgeglichen werden .

Die obigen Ergebnisse wurden in der Messsonde 1 gemäß Figur 1 erzielt. Wie aus der Figur 6 zu entnehmen ist, liegt die Nachweisgrenze bei einem Grenzwert von etwa 0,3 g/L des Zelltrockengewichts. Für Messungen unterhalb dieses Grenzwertes beziehungsweise sehr geringen Zelldichten eignet sich eine Messsonde 1 gemäß Figur 3 mit einer mikrostrukturierten Elektrodengeometrie.

In den Figuren 7A und 7B ist der Zeitverlauf von über zwanzig Stunden einer aeroben und anaeroben mikrobiologischen Zellkultivierung am Beispiel von S.cerevisiae dargestellt.

In der Figur 7A kann der Wachstumsverlauf, im speziellen die Zu- und Abnahme, in der mikrobiologischen Kultur beobachtet werden .

In der Figur 7B ist der zeitliche Verlauf des Impedanzsignals als errechnete Doppelschicht-Kapazität CPE-Q (die nichtideale Doppelschicht-Kapazität CCL(CPE)) und die Maltose-/Ethanol- Konzentration während der aeroben Kultivierung dargestellt.

Es kann darin ein Abfall im Impedanzsignal, nachdem die Maltose von der mikrobiologischen Kultur aufgebraucht wurde, beobachtet werden . Ein weiterer kleiner Anstieg im Impedanzsignal ist beim Abbau von Ethanol zu beobachten, bis schließlich die zweite Kohlenstoffquelle verbraucht wurde. In der Figur 7C ist der zeitliche Verlauf des Impedanzsignals als errechnete Doppelschicht-Kapazität CPE-Q und die Glukose-/Ethanol- Konzentration während der anaeroben Kultivierung dargestellt.

Hierbei ist keine plötzliche Abnahme im Impedanzsignal nach dem Verbrauch von Glukose im Zellmedium beobachtbar. Es lässt sich vielmehr eine leicht konstante Abnahme im Impedanzsignal beobachten.

Es zeigt sich also, dass hierbei ebenfalls eine Aussage über den physiologischen Zustand anhand des Zell-Stoffwechsels von einer mikrobiologischen Kultur, am Beispiel von S.cerevisiae erbracht beziehungsweise getroffen werden kann.

In der Figur 8A sind die Rohdaten aus der Impedanzmessung bei einer aeroben Kultivierung mittels der Messsonde 1 gemäß Figur 2 abgebildet. Die Kapazität ist hierbei um eine Größenordnung kleiner als jene bei Messsonde 1 gemäß Figur 1. Dies ist darauf zurückzuführen, dass bei der Messsonde 1 gemäß Figur 2 kleinere Elektrodenflächen vorhanden sind.

In der Figur 8B sind der Verlauf des Impedanzsignals, sowie der Glukose-Verbrauch und die Ethanol-Produktion bei einer aeroben Kultivierung unter der Verwendung der Messsonde 1 gemäß Figur 2 abgebildet.

In der Figur 9 ist die errechnete Biomasse von der Zellkultur aus dem Impedanzsignal von Figur 6, einschließlich des gemessenen Zelltrockengewichts DCW dargestellt. Die Durchfluss-Zytometrie- Messung hat hierbei bestätigt, dass keine Tot- Population vorhanden war. Das Zelltrockengewicht DCW kann somit mit lebend- Zellkonzentration geleichgesetzt werden .

Figur 10 zeigt in einem schematischen Blockschaltbild den Aufbau 15 des Mess- und Auswertesystems 25 zur lebend-Zellbestimmung.

Wie aus Figur 10 ersichtlich, beinhaltet das Mess- und Auswertesystems 25 einen mathematischen Algorithmus 16 zur Ermittlung der zellbiologischen Doppelschicht-Kapazität, einen Mikrokontroller 17 zur Ausführung Rechenoperationen, einer Strom-und Spannungsquelle 26 zur Generierung eines frequenzabhängigen Messsignals, einer Visualisierungs- und Bedienungseinheit 18 zur Darstellung und Handhabung des Messprozesses, und einer Messprozesssteuerung 19.

Des Weiteren verfügt das Mess- und Auswertesystem 25 eine Anbindung bzw. Datenschnittstelle 22 zu einem Prozessleitsystem, um die Messdaten zu übertragen. Um den Messprozess optimal zu steuern dient bei Verwendung der Messsonde 1 gemäß Figur 1 eine Messprozesssteuerung 19 zur Überwachung der Analysetemperatur 20; die Temperierung erfolgt über eine Ansteuerung einer Umwälzpumpe 23. Eine gleichmäßige Durchströmung des Messkanals 3 mit einer mikrobiologischen Kultur 14 erfolgt mittels einer Pumpe 24. Die Pumpe 24 stellt hierbei eine schonende Förderung der mikrobiologischen Kultur 14 sicher.

Der Aufbau 15 weist eine Kalibrierung der Zellzahl 21 auf, die von der Messprozesssteuerung 19 angefordert wird und vom mathematischen Algorithmus 16 zur Ermittlung lebend-Zellbestimmung herangezogen wird.