Die Therapie von Erkrankungen des ZNS wird durch die Blut-Hirn- Schranke, einer der wichtigsten und undurchlässigsten physiolo- gischen Barrieren im Organismus, erschwert. Als morphologisches Substrat der Blut-Hirn-Schranke wird in erster Linie das Gefäß- endothel der Hirnkapillaren angesehen, da die Interzellulärspal- ten zwischen den Endothelzellen durch dichte Zell-Zell-Verbin- dungen ("tight junctions") überbrückt sind. Die Endothelzellen sind darüber hinaus von einer lückenlosen Basalmembran umschlos- sen. Typisch für das Gewebe sind die fehlende Fenestrierung, die Abwesenheit von Poren und eine geringe pinozytotische Aktivität. Hinzu kommt, daß die Blutgefäße im Bereich des ZNS von einer dicht anliegenden Schicht von Gliazellen eingehüllt sind (Thews, G., Mutschler, E., Vaupel, P., Anatomie, Physiologie und Patho- physiologie des Menschen, 3. Aufl., Wissenschaftliche Verlags- gesellschaft, Stuttgart, 1989 ; Borchard, G., in : Müller, R. H., Hildebrand, G. (Hrsg.), Pharmazeutische Technologie : Moderne Arzneiformen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1997,291-296). Das Gehirn kann daher vom Blut aus in der Regel nur von lipophilen Pharmaka mit einem geringen Molekulargewicht (MG < 500) erreicht werden (Pardridge, W. M., J. Control. Rel., 39,281-286,1996).

Für sehr viele Wirkstoffe wie z. B. Peptide, Proteine und Oligo- nukleotide als mögliche Therapeutika für Krankheiten des ZNS ist die Blut-Hirn-Schranke normalerweise nicht permeabel.

Nach Pardridge (J. Control. Rel., 39,281-286,1996) können die Strategien für einen Arzneistofftransport ins Gehirn eingeteilt werden in a) invasive, b) pharmakologische und c) physiologische Verfahren.

Mit invasiven Techniken kann die Blut-Hirn-Schranke physikalisch umgangen werden, indem z. B. ein Arzneistoffträgersystem ins Gehirn implantiert wird (Domb, A. J., Ringel, I., in : Flanagan, T. R., Emerich, D. F., Winn, S. R. (Hrsg.), Providing Pharmaco- logical Access to the Brain. Academic Press, Inc., New York, 1994,169-187 ; Friden, P. M., J. Control. Rel., 46,117-128, 1996). Nachteilig bei diesen Techniken ist, daß sie mit einem chirurgischen Eingriff verbunden sind und sich deshalb nicht als gängige Behandlungsmethode etabliert haben.

Die pharmakologischen Strategien für einen Arzneistofftransport durch die Blut-Hirn-Schranke umfassen Maßnahmen zur Erhöhung der Lipophilie von Arzneistoffen (Chekhonin, V. P., Kabanov, A. V., Zhirkov, Y. A., Morozov, G. V., FEBS Lett., 287,149-152,1991).

Nachteile dieser Verfahren sind, daß"new drug entities"ent- stehen, für die umfangreiche kostenintensive toxikologische Untersuchungen gemacht werden müssen, daß diese Verfahren nur für relativ kleine Moleküle praktikabel sind und daß sie eine geringe Effizienz besitzt (Friden, P. M., J. Control. Rel., 46, 117-128,1996 ; Pardridge, W. M., J. Control. Rel., 39,281-286, 1996).

Physiologische Strategien für einen Arzneistofftransport ins Gehirn basieren auf der Kenntnis spezieller aktiver spezifischer Transportmechanismen an der Blut-Hirn-Schranke z. B. für Nähr- stoffe (u. a. Glucose und Aminosäuren), Peptide oder Proteine (Pardridge, W. M., Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York, 1991 ; Pardridge, W. M., J. Control. Rel., 39, 281-286,1996 ; Friden, P. M., J. Control. Rel., 46,117-128, 1996). Ein Beispiel ist L-Dopa als Vorstufe des Neurotransmit- ters Dopamin, welcher die Blut-Hirn-Schranke nicht zu überwinden vermag. L-Dopa hingegen wird durch einen aktiven Transportweg für neutrale Aminosäuren ("Neutrale Aminosäuren-Carrier") durch die Blut-Hirn-Schranke in die Zellen des Gehirns transportiert, wo die eigentliche Wirkform Dopamin gebildet wird (Mutschler, E., Arzneimittelwirkungen, Lehrbuch der Pharmakologie und Toxi- kologie, 7. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stutt- gart, 1996 ; Borchard, G., in : Müller, R. H., Hildebrand, G.

(Hrsg.), Pharmazeutische Technologie : Moderne Arzneiformen.

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1997,291- 296). Aber auch dieser Ansatz hat sich aufgrund folgender Nach- teile nicht auf breiter Ebene durchgesetzt : 1. die aktiven Transportmechanismen sind sehr Substrat-spezi- fisch, d. h., nur wenige Arzneistoffe mit großer Ähnlichkeit zum Substrat werden transportiert, was die Einsatzfähigkeit dieser Strategie sehr limitiert.

2. Konjugate aus natürlichem Substrat und Arzneistoff werden wegen der großen Spezifität des Transporters (chemische Struktur und dreidimensionale Struktur und Größe des zu transportierenden Substrats) nicht oder wenig effizient transportiert.

Ein weiterer Ansatz für die gewebespezifische Arzneistoffappli- kation, z. B. ins ZNS, ist die Einarbeitung von Arzneistoffen in partikuläre Arzneistoffträger wie Nanopartikel, Mikropartikel, Emulsionen und Liposomen sowie Verarbeitung zu partikulären Arzneiformen wie Hydrosole, Nanokristalle und Nanosuspensionen. Generell ist für intravenös injizierte Partikel die Überwindung von Endothelien aufgrund ihrer Größe (in der Regel >> 30 nm) noch schwieriger als für Arzneistoffmoleküle (Größe im Angström- Bereich). So wird beispielsweise für Liposomen generell eine sehr begrenzte Fähigkeit zur Penetration durch die Blut-Hirn- Schranke beschrieben (Gennuso, R., Spigelman, M. K., Chinol, M., Zappulla, R. A., Nieves, J., Vallabhajosula, S., Paciucci, P.

A., Goldsmith, S. J., Holland, J. F., Cancer Invest., 11,118- <BR> <BR> <BR> <BR> 128,1993 ; Boado, R. J., Adv. Drug Deliv. Rev., 15,73-107, 1995 ; Boado, R. J., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact.

Mater., 24,223-224,1997 ; Pardridge, W. M., J. Control. Rel., 39,281-286,1996).

Einen ersten Erfolg hinsichtlich der Applikation eines Arznei- stoffs zum ZNS mit partikulären Trägern publizierten Alyautdin et al. (Alyautdin, R. N., Gothier, D., Petrov, V. E., Kharke- vich, D. A., Kreuter, J., Eur. J. Pharm. Biopharm., 41,44-48, 1995). Sie demonstrierten für i. v. applizierte Polybutylcyano- acrylat (PBCA)-Nanopartikel, auf deren Oberfläche die analgetisch wirksame Substanz Dalargin durch Adsorption gebunden wurde, einen dosisabhängigen analgetischen Effekt im"tail-flick-Test" an Mäusen. Das Hexapeptid Dalargin (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) ist ein Leu-Enkephalin-Analogon und besitzt als Opioid-Rezeptor- Agonist eine zentral analgetische Wirkung. Dalargin kann norma- lerweise die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden.

Eine i. v. Applikation von Dalargin führt trotz der Stabilität im Blut auch in hoher Dosierung (20 mg/kg) zu keinem analgetischen Effekt (Kalenikova, E. I., Dmitrieva, 0. F., Korobov, N. N., Zhukova, S. V., Tischenko, V. A., Vopr. Med. Khim., 34,75-83, 1988).

In einer anderen Studie konnte im Rattenmodell nach intravenöser Injektion von oberflächenmodifizierten Polymethylmethacrylat- (PMMA)-Nanopartikeln eine Anreicherung der Partikel im Gehirnbe- reich detektiert werden (Tröster, S. D., Müller, U., Kreuter, J., Int. J. Pharm., 61,85-100,1990). Die Autoren hielten es aber für ausgeschlossen, daß die Partikel in Gehirnzellen aufge- nommen werden, was eine Applikation von Arzneistoff ins Gehirn ausschließt. <BR> <BR> <P>Nachteilig ist, daß das von Alyautdin et al. (Eur. J. Pharm. Biopharm., 41,44-48,1995) und von Schröder und Sabel (Brain Res., 710,121-124,1996) berichtete Phänomen nicht für eine gezielte und kontrollierte Arzneistoffapplikation benutzt werden kann. Der Mechanismus ist nicht bekannt. Es bleibt nur die "Trial-und-Error-Vorgehensweise", um zu detektieren, ob eine Zumischung eines Tensids zu einem partikulären Träger vielleicht zufällig eine Anreicherung im Gehirn erzeugt. Die Wahrschein- lichkeit daß es dazu kommt ist gering, da Tenside oft in Par- tikelpräparationen eingesetzt wurden (Couvreur, P., Dubernet, C., Puisieux, F., Eur. J. Pharm. Biopharm., 41,2-13,1995) und bisher die obigen Berichte die ersten Daten über eine Aufnahme eines Arzneistoffes in das Gehirn sind.

Für einen Arzneistofftransport spezifisch in das gewünschte Zielgewebe, insbesondere auch ins Gehirn, wäre eine Arzneiform optimal, die 1. die Spezifität eines Transportweges beispielsweise über Rezeptor-vermittelte Transzytose (physiologische Strategie) mit der hohen Transportkapazität partikulärer Arzneistoff- träger, z. B. Liposomen, Emulsionen oder Nanopartikel, ver- bindet, 2. die Aufnahme des Arzneistoffes in das Gewebe-z. B. das Gehirn-über ein generell einsetzbares Erkennungsmölekül ermöglicht und 3. eine kontrollierte Befestigung des Erkennungsmoleküls an die Oberfläche von Partikeln erlaubt.

Der Vorteil von partikulären Arzneistoffträgern-im Gegensatz zu z. B. Molekülkonjugaten-liegt neben der hohen Transportkapa- zität in der Möglichkeit, über die Wahl der Trägermatrix (z. B. Polymer, Lipid, Phospholipid) und der Herstellungsbedingungen der Partikel viele in ihren physikochemischen Eigenschaften und ihrem Molekulargewicht unterschiedliche Arzneistoffe transpor- tieren zu können (Borchard, G., in : Müller, R. H., Hildebrand, G. (Hrsg.), Pharmazeutische Technologie : Moderne Arzneiformen.

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1997,291- 296).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Arzneistoffträ- gerpartikel zu schaffen, die in der Lage sind, die Blut-Hirn- Schranke zu überwinden und gewünschte Arzneiwirkstoffe in das ZNS einzuführen.

Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch Arzneistoffträger- partikel, in Wirkstoff-beladener oder Wirkstoff-freier Form, gelöst, bei denen an die Partikeloberfläche mindestens ein Er- kennungsprotein oder zumindest der den Rezeptor erkennende An- teil davon gebunden ist.

Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Als Partikelmaterial sind insbesondere Polymere, der Arzneistoff selbst (Nanosuspensionen, Hydrosole), feste Lipide, flüssige Lipide, o/w-Emulsionen, w/o/w-Emulsionen oder Phospholipidvesi- kel geeignet.

Arzneistoffträgerpartikel, die durch Bindung eines (auch natür- lich im Blut vorkommenden) Erkennungsproteins an die Partikel- oberfläche, vorzugsweise Apolipoprotein E, oder durch Bindung mehrerer Erkennungsproteine, modifiziert sind, können Arznei- stoffe spezifisch zum Zielgewebe transportieren, insbesondere zum Zentralen Nervensystem (ZNS). Die Erkennungsproteine werden an die Partikeloberfläche adsorbiert, kovalent daran gebunden oder durch gezielte Modifikation der Partikeloberfläche (che- misch, physikalisch, Adsorption von die Adsorption des Erken- nungsproteins vermittelnden Molekülen) präferentiell adsorbiert. Die Adsorption der Erkennungsproteine kann vor Applikation der Arzneistoffträger erfolgen oder-nach entsprechender Modifika- tion der Oberfläche der Arzneistoffträger-auch in vivo im Körper. Im Körper vorhandene, physiologische Erkennungsproteine, insbesondere Apolipoprotein E, adsorbieren präferentiell auf applizierten Arzneistoffträgern, insbesondere auf mit speziellen Tensiden oder Polymeren modifizierten Trägern, die beispiels- weise durch intravenöse Applikation in den Körper eingebracht worden sein können.

Das Erkennungsprotein kann durch unspezifische oder spezifische Adsorption an die Oberfläche der Partikel gebunden sein.

Ferner kann das Erkennungsprotein kovalent an die Oberfläche der Partikel gebunden sein. Dabei wird worzugsweise eine Bindung an Partikel mit reaktiven Oberflächengruppen, insbesondere Epoxy- oder Aldehydgruppen, oder nach Aktivierung der Partikeloberflä- che mit Aktivatoren, insbesondere Carbodiimid, N-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin, Glutardialdehyd, Bromzyan, meta- Perjodat (Na-Salz oder K-Salz), Tosylchlorid und Chlorameisen- säureester bewirkt. Dabei kann die Bindung der Erkennungspro- teine über ihre Aminogruppen bewirkt werden.

Außerdem kann das Erkennungsprotein durch präferentielle Adsorp- tion an die Oberfläche der Partikel gebunden sein. Dabei kann die präferentielle Adsorption aus Proteinlösungen oder durch Kontakt der Partikel mit Plasma, Serum oder Blut erfolgen, wobei letzteres auch ex vivo oder in vivo erfolgen kann.

Die Oberfläche der Partikel kann vorzugsweise vor der präferen- tiellen Adsorption durch Einführung funktioneller Gruppen, ins- besondere Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Hydroxyethyl, Epoxy oder Aldehydgruppen und deren Derivate chemisch modifiziert werden oder durch physikalische Behandlung mit Plasma, insbesondere plasma etching, zur Einführung von Hydroxylgruppen in den Eigen- schaften verändert werden.

Ferner kann die Oberfläche durch Adsorption von Substanzen modi- fiziert werden, die zu einer präferentiellen Adsorption des Er- kennungsproteins führen, wobei die modifizierende Substanz im Verhältnis zum Arzneistoffpartikel in einer gewichtsbezogenen Menge von 0.01 Teile bis 10 modifizierende Substanz pro 1 Teil Partikel, vorzugsweise 0,1 bis 10 Teile modifizierende Substanz pro 1 Teil Partikel, und insbesondere 1 Teil modifizierende Substanz pro 1 Teil Partikel eingesetzt wird.

Geeignete Substanzen umfassen insbesondere Tenside, speziell ethoxylierten Tenside, vorzugsweise Polyethylenglykol-Fettsäu- reester und Polyethylenglykol-Fettalkoholether, bevorzugt Po- lyetylenglykol-Sorbitanfettsäureester und Polyethylenglykol- Fettsäureglyceride, bevorzugter Tween 20,40,60 und 80 oder Cremophor"EL und RH40.

Geeignet sind beispielsweise auch Polymere, insbesondere Poly- mere aus den Poloxameren und Poloxaminen, Cellulosen und ihren Derivaten, vorzugsweise Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxy- methylcellulose-Natrium sowie Xanthan, Polyvinylalkohol, Polyvi- nylpyrrolidon, Polyacrylsäuren, Polyethylenglykolen, Polyethy- lenglykol-enthaltenden Block-Copolymeren, Stärke und-derivaten, Dextran und-derivaten, Polyethylenimin und Gelatine.

Das Erkennungsprotein ist vorzugsweise ein im Blut natürlich vorkommendes Erkennungsprotein. Bevorzugte Erkennungsproteine sind Apolipoprotein E, Apolipoprotein A-I, A-II, A-IV, B, C-II, C-III, D, H und/oder J. Das Erkennungsprotein ist vorzugsweise Apolipoprotein E, das in Kombination mit einem oder mehreren anderen Erkennungsproteinen vorliegen kann, insbesondere mit Apolipoprotein A-I, A-II, A-IV, B, C-II, C-III, D, H und/oder J, und/oder mit Albumin. Apo C-II, Apo C-III, Apo A-IV, Apo-E werden vorzugsweise einzeln oder in Kombinationen von 2 oder 3 oder 4 Apolipoproteinen ein- gesetzt.

Das Erkennungsprotein wird, bezogen auf den Arzneistoffträger, im allgemeinen in einer Menge von 0,001 bis 40 Gew.-%, insbeson- dere von 0,01 bis 30 Gew.-% und bevorzugt von 0,1 bis 15 Gew.-% eingesetzt.

Für Apolipoprotein (Apo) E existieren verschiedene Rezeptoren, die zu der Familie der LDL-Rezeptoren gehören (Schneider, W. J., Nimpf, J., Curr. Opin. Lipid., 4,205-209,1993).

ApoE-Rezeptoren finden sich ebenfalls an der Blut-Hirn-Schranke. Im Liquor cerebrospinalis wird die Aufnahme von Lipoproteinen über zelluläre LDL-Rezeptoren nach bisherigen Erkenntnissen ausschließlich von ApoE vermittelt. ApoE wird vorwiegend in den Astrozyten synthetisiert und abgesondert. Diese Zellen exprimie- ren auch LDL-Rezeptoren (Boyles, J. K., Pitas, R. E., Wilson, E., Mahley, R. W., Taylor, J. M., J. Clin. Invest., 76,1501- 1513,1985 ; Weisgraber, K. H., Roses, A. D., Strittmatter, J., Curr. Opin. Lipid., 5,110-116,1994).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß in Bereichen des Gehirns und der Blut-Hirn-Schranke verschiedene Rezeptor-Systeme existieren, die einen Transport von ApoE bzw. ApoE-haltigen Partikeln ins Gehirn ermöglichen könnten.

Um die Rolle des Proteins nachzuweisen, war zu zeigen, daß eine Anreicherung eines Partikels in einem Gewebe erfolgt, nachdem Bindung des für die Anreicherung als ursächlich angesehenen Apolipoproteins E an die Oberfläche des Partikels vorgenommen wurde.

Für den Nachweis der Funktion von ApoE wurden Partikel einge- setzt, an deren Oberfläche ApoE aus Plasma nicht adsorbiert.

Verwendet wurden daher unmodifizierte Polybutylcyanoacrylat- (PBCA)-Partikel aus Beispiel 1, für welche die Abwesenheit von ApoE auf der Oberfläche nach Inkubation mit Plasma nachgewiesen wurde. Inkubation der Partikel mit einer Lösung von ApoE führte zu einer Adsorption auf der Oberfläche (Beispiel 2). Es ist somit möglich ApoE durch einen einfachen Adsorptionsprozeß an die Oberflächen partikulärer Träger zu binden.

Überraschend ist mit ApoE somit ein Protein identifiziert wor- den, das aleichzeitig a) in relativ großer Menge auf gewebespezifischen Parti- keln vorhanden war, b) bei dessen Anwesenheit eine ZNS-Wirksamkeit auftrat (Beispiel 1), c) bei dessen Abwesenheit eine ZNS-Wirksamkeit fehlte (Beispiel 4), d) und mit dem aufgrund der in der Literatur beschriebe- nen Rezeptoren ein Erkennungs-und Vermittlungseffekt auch theoretisch möglich ist.

Die richtige Konformation des adsorbierten Erkennungsproteins (an den Rezeptor bindendes Molekülsegment in der zum Rezeptor passenden Molekülanordnung exponiert) ist von essentieller Be- deutung für den Transport zum Zielgewebe, hier das ZNS. Unter Zulassungsgesichtspunkten für Arzneimittel (Vermeidung einer "new entity") sollte das Erkennungsprotein-wenn möglich-an die Partikel nicht kovalent gebunden werden, da dies für jede Arzneiform bei der Zulassung eine neue Toxizitätsstudie erfor- derlich macht. Technologisch einfacher ist die Bindung durch Adsorption an die Oberfläche.

Probleme dabei sind : 1. Adsorbiert das ApoE an die Partikeloberfläche auch ohne Gegenwart eines Tensids wie z. B. Tween"80, welches zur automatischen Anreicherung von ApoE führt ? 2. Verbleibt ApoE bei Bindung durch Adsorption nach intraven- öser Injektion auf der Partikeloberfläche ? 3. Ist ApoE in der richtigen Konformation adsorbiert, so daß es an das Zielgewebe binden kann und eine ZNS-Wirksamkeit vermittelt ? Besonders die mögliche Verdrängung von ApoE von der Oberfläche (siehe 2.) und die Notwendigkeit der richtigen Konformation des adsorbierten ApoE (siehe 3.) ließen es unwahrscheinlich erschei- nen, daß ein Arzneistofftransport zum Gehirn erfolgen wurde.

Präadsorbiertes ApoE könnte nach einer intravenösen Applikation möglicherweise von anderen Plasmaproteinen von der Partikelober- fläche verdrängt werden. Um diesen möglichen Verdrängungsprozeß zu simulieren und zu analysieren, wurden die Plasmaproteinad- sorptionsmuster von PBCA-Partikeln bestimmt, an deren Oberfläche zuvor ApoE durch Adsorption gebunden worden war. Präadsorbiertes ApoE blieb auch nach nachträglicher Inkubation in Plasma auf der Oberfläche erhalten (Beispiel 3).

Der beobachtete analgetische Effekt resultiert aus einem Rezep- tor-vermittelten Prozeß an der Blut-Hirn-Schranke. Daher muß auf der Oberfläche adsorbiertes ApoE in einer Konformation vorlie- gen, die eine Bindung an einen ApoE-Rezeptor zuläßt. Dies gilt für präadsorbiertes oder kovalent gebundenes ApoE ebenso wie fur für ApoE-Moleküle, die durch Adsorption aus Plasma auf die Par- tikeloberfläche gelangen.

Tensidfreie PBCA-Partikel mit präadsorbiertem ApoE wurden im "tail-flick-Test"an Mäusen hinsichtlich ihres Potentials unter- sucht, Dalargin durch die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren und einen analgetischen Effekt hervorzurufen. Unmodifizierte PBCA-Partikel waren nicht in der Lage, nach i. v. Applikation die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden (Alyautdin, R. N., Gothier, D., Petrov, V. E., Kharkevich, D. A., Kreuter, J., Eur. J. Pharm.

Biopharm., 41,44-48,1995 ; Kreuter, J., Alyautdin, R. A., Khar- kevich, D. A., Ivanov, A., Brain Res., 674,171-174,1995 ; Schröder, U., Sabel, B. A., Brain Res., 710,121-124,1996 ; Alyautdin, R. N., Petrov, V. E., Langer, K., Berthold, A., Khar- kevich, D. A., Kreuter, J., Pharm. Res., 14,325-328,1997). Die i. v. Applikation der PBCA-Nanopartikel mit präadsorbiertem ApoE führte jedoch zu einer analgetische Wirkung. 15 Minuten nach Injektion der Partikel wurde ein Effekt beobachtet, der 44% des maximal möglichen Effektes ausmachte (Beispiel 1). Entgegen den Erwartungen adsorbierte ApoE in der richtigen Konformation und blieb auch nach i. v. Injektion ausreichend stabil auf der Ober- fläche adsorbiert, um Darlagin in das ZNS zu transportieren.

Die Tatsache, daß unmodifizierte Partikel, an die vor der i. v.

Applikation ApoE gebunden wurde, einen analgetischen Effekt erzeugen, belegt die Beteiligung von ApoE an dem erhöhten Trans- port der Dalargin-beladenen PBCA-Partikel durch die Blut-Hirn- Schranke.

Für ApoE wird ein Modell beschrieben, nach dem das Protein aus zwei strukturell verschiedenen Domänen besteht (Weisgraber, K.

H., Adv. Prot. Chem., 45,249-303,1994 ; Weisgraber, K. H., Roses, A. D., Strittmatter, J., Curr. Opin. Lipid., 5,110-116, 1994). Demnach besitzt ApoE eine amino-terminale globuläre (d. h. strukturell stabile) Domäne und eine carboxy-terminale labilere Domäne, die stärker zur Entfaltung ihrer Struktur neigt. Die N- terminale Domäne enthält den Teil des Proteins, der mit poten- tiellen Rezeptoren interagiert, die C-terminale Domäne ist für die Bindung an Lipide (z. B. in HDL) verantwortlich (Weisgraber, K. H., Adv. Prot. Chem., 45,249-303,1994). Überraschenderweise reichte die Affinität dieser C-terminalen Domäne zu Oberflächen aus, daß a) eine ausreichende Bindung von ApoE an die Partikelober- fläche stattfand, b) die Adsorption ausreichend stabil war um ApoE auch bei Kontakt mit Plasmaproteinen auf der Oberfläche präsent zu halten, c) die C-terminale Domäne und nicht die N-terminale Domäne auf der Oberfläche band und d) dadurch die Struktur der stabileren N-terminalen Domäne und damit die Affinität zu potentiellen Rezeptoren er- halten blieb.

Überraschend ist mit ApoE somit ein Protein identifiziert wor- den, das gleichzeitig an die Oberfläche eines Partikels adsorbiert, an die Oberfläche stabil gebunden bleibt und nicht voll- ständig durch andere Plasmaproteine verdrängt wird (z. B. nach intravenöser Injektion) und in der richtigen Konformation adsorbiert, so daß es an das Zielgewebe (in diesem Fall Blut-Hirn-Schranke und ZNS) binden kann und eine ZNS-Wirksamkeit des Arzneistoffes vermittelt.

Das oder die Erkennungsproteine können auf die Oberfläche unmo- difizierter Partikel adsorbiert werden (Beispiel 2, PBCA-Parti- kel) oder alternativ nach vorheriger Modifikation der Oberfläche (Beispiel 2, PBCA-Partikel modifiziert durch adsorbiertes Ten- sid). Für die gewebespezifische anreicherung im Gehirn müssen dafür gezielt Tenside ausgewählt werden, die beispielsweise ApoE an der Oberfläche anreichern (z. B. Tween, Beispiel 2), damit in vivo eine ZNS-Wirkung auftritt (Tabelle 1). Tenside, die dies nicht bewirken, wie Poloxamer 407 (Beispiel 4) ergeben in vivo auch keine Arzneistoffwirkung im ZNS (Tabelle 1).

Die Adsorption der Erkennungsproteine kann dabei ex vivo erfol- gen (z. B. aus ApoE-Lösung, Plasma, Serum, Blut), um in vivo eine ZNS-Wirkung zu erzeugen (Beispiel 1). Nach gezielter Modifika- tion der Partikeloberfläche zur präferentiellen Adsorption von ApoE kann dies jedoch auch in vivo nach Kontakt mit Blut erfol- gen (Tabelle 1).

Bei Arzneistoffträgern mit sehr hydrophiler Oberfläche kann es sein, daß die Affinität des Erkennungsproteins nicht ausreicht, um an die Oberfläche im ausreichenden Maß zu adsorbieren. Ebenso ist es möglich, daß das zur Bindung an den Rezeptor benötigte Molekülsegment adsorbiert (im Fall von ApoE z. B. die N-terminale Domäne). In diesen Fall können die Erkennungsproteine an funk- tionelle Gruppen der Oberfläche kovalent gebunden werden, wobei die Bindung an die Oberfläche über Molekülsegmente erfolgt, die für die Bindung an den Rezeptor des Zielgewebes nicht benötigt werden (im Fall von ApoE z. B. die C-terminale Domäne). Beispiele 5 und 6 zeigen die kovalente Bindung eines Erkennungsproteins an die Oberfläche eines Polymernanopartikels. Alternativ zur Anbin- dung des gesamten Erkennungsproteins können auch Teile des Mole- küls verwandt werden, die den an den Rezeptor bindnenden Mole- külteil enthalten.

In nachfolgender Tabelle sind Beispiele von relevanten Aktivie- rungs-und Kopplungsreagentien für eine chemisch-kovalente Kopp- lung des Proteins an die Trägermatrix aufgelistet.

Folgende Substanzen werden für die chemische Aktivierung, als Vorstufe einer kovalenten Verknüpfung von funktionellen Gruppen eines Biomoleküls mit denen auf einem festen Träger, eingesetzt.

Partikcl Biomulckül Substanz * -COOH-NH2 Carbodiimid (wasscrleislich) (1-Ethyl-3-(3-dimethyl- aminopropyl)-carbodiimid- hydrochlorid) -COOH-NH2 EEDQ (N-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin) -NH2-NH2 Gtutardiatdehyd -OH (in aq.)-NH2 Bromzyan (BrOCN) meta-Perjodat(Na/K)JO4--CH2-CH2-OH-NH2 -OH (in Tosylchlorid-NH2 -OH (in org. LM) -NH2 Chloramcisensäureester touse'-PartikelmitreaktivenOberflächengruppenbenötigenkein echemischeAktivierungatsKopplungsvorstufe:Sogenannte"ready <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> -OH-COOH------CH(O)-CH2-NH2 <BR> Epoxy-<BR> -CHO -NH2 ----- Aldehyd Im allgemeinen können die Träger folgende chemische Wirkstoff- gruppen enthalten : hydroxylierte Kohlenwasserstoffe Carbonylverbindungen wie Ketone (z. B. Haloperidol), Mono- saccharide, Disaccharide und Aminozucker Carbonsäuren wie aliphatische Carbonsäuren, Ester alipha- tischer und aromatischer Carbonsäuren, basisch substitu- ierte Ester aliphatischer und aromatischer Carbonsäuren (z. B. Atropin, Scopolamin), Lactone (z. B. Erythromycin), Amide und Imide aliphatischer Carbonsäuren, Aminosäuren, aliphatische Aminocarbonsäuren, Peptide (z. B. Ciclospo- rin), Polypeptide, ß-Lactamderivate, Penicilline, Cepha- losporine, aromatische Carbonsäuren (z. B. Acetylsalicyl- säure) Amide aromatischer Carbonsäuren, vinyloge Carbon- säuren und vinyloge Carbonsäureester Kohlensäurederivate wie Urethane und Thiourethane, Harn- stoff und Harnstoffderivate, Guanidinderivate, Hydantoi- ne, Barbitursäurederivate und Thiobarbitursäurederivate Nitroverbindungen wie aromatische Nitroverbindungen und heteroaromatische Nitroverbindungen Amine wie aliphatische Amine, Aminoglykoside, Phenylal- kylamine, Ephedrinderivate, Hydroxyphenylethanolamine, Adrenalinderivate, Amfetaminderivate, aromatische Amine und Derivate, quartäre Ammmoniumverbindungen schwefelhaltige Verbindungen wie Thiole und Disulfane Sulfone, Sulfonsäureester und Sulfonsäureamide Polycarbocyclen wie Tetracycline, Steroide mit aromati- schem Ring A, Steroide mit alpha, beta-ungesättigter Car- bonylfunktion im Ring A und alpha Ketol-Gruppe (oder Me- thylketo-Gruppe) am C-17, Steroide mit einem Butenolid- Ring am C-17, Steroide mit einem Pentadienolid-Ring am C- 17 und Seco-Steroide 0-haltige Heterocyclen wie Chromanderivate (z. B. Cromo- glicinsäure) N-haltige Heterocyclen wie Pyrazolderivate (z. B. Propy- phenazon, Phenylbutazon) Imidazolderivate (z. B. Histamin, Pilocarpin), Pyridinde- rivate (z. B. Pyridoxin, Nicotinsäure), Pyrimidinderivate (z. B. Trimetoprim), Indolderivate (z. B. Indometacin), Lysergsäurederivate (z. B. Ergotamin), Yohimbanderivate, Pyrrolidinderivate, Purinderivate (z. B. Allopurinol), Xanthinderivate, 8-Hydroxychinolin-derivate, Amino-hy- droxy-alkylierte Chinoline, Aminochinoline, Isochinolin- derivate (z. B. Morphin, Codein), Chinazolinderivate, Ben- zopyridazinderivate, Pteridinderivate (z. B. Methotrexat), 1,4-Benzodiazepinderivate, tricyclische N-haltige Hetero- cyclen, Acridinderivate (z. B. Ethacridin) und Dibenzaze- pinderivate (z. B. Trimipramin) S-haltige Heterocyclen wie Thioxanthenderivate (z. B Chlorprothixen) N, 0-und N, S-haltige Heterocyclen wie monocyclische N, 0- haltige Heterocyclen, monocyclische N, S-haltige Heterocy- clen, Thiadiazinderivate, bicyclische N, S-haltige Hetero- cyclen, Benzothiadiazinderivate, tricyclische N, S-haltige Heterocyclen und Phenothiazinderivate 0, P, N-haltige Heterocyclen (z. B. Cyclophosphamid).

Beispiele für speziell in die Träger einzuarbeitende Arznei- stoffgruppen und Arzneistoffe (als Salz, Ester, Ether oder in freier Form) sind : Analgetika/Antirheumatika BTM Basen wie Morphin, Codein, Heroin, Piritamid, Diamor- phin, Dihydrocodein, Hydromorphon, Hydrocodon, Pethidin, Fenpipramid, Piritramid, Clofedanol, Pentazocin, Buprenorp- hin, Nalbuphin, Tilidin, Fentanyl und Fentanylderivate, Levomethadon, Tramadol, Diclofenac, Ibuprofen, Indometacin, Naproxen, Piroxicam, Penicillamin, Ademetionin, Flupirtin, Acetylsalicylsäure Antiallergika Pheniramin, Dimetinden, Terfenadin, Astemizol, Loratidin, Doxylamin, Meclozin, Bamipin, Clemastin Antiasthmatika Terbutalin, Beclomethason, Cromoglycinsäure, Reproterol, Salbutamol, Nedocromil Antibiotika/Chemotherapeutika hiervon : Rifampicin, Amoxicillin, Azlocillin, Bacampicillin, Benzylpenicillin, Amikacin, Azithromycin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Polypeptidantibiotika wie Colistin, Polymy- xin B, Teicplanin, Vancomycin ; Malariamittel wie Chinin, Halofantrin, Mefloquin, Chloroquin, Virustatika wie Ganci- clovir, Foscarnet, Zidovudin, Aciclovir und andere wie Bri- vudin, Dapson, Fosfomycin, Fusafungin, Trimetoprim, Amphote- ricin Antidota Mesna Antiemetka Tropisetron, Scopolamin, Thiethylperazin Antiepileptika Phenytoin, Mesuximid, Ethosuximid, Primidon, Phenobarbital, Valproinsäure, Carbamazepin, Clonazepam, Diazepam, Nitraze- pam, Vigabatrin, Lamotrigin, Trimethadion, Sultiam Antifibrinolytika Aminomethylbenzoesäure Antihypertonika/Betarezeptorenblocker/Calciumantagonisten/AC E- Hemmer Bupranolol, Captopril, Fosinopril, Nitroprussidnatrium, Isradipin, Mepindolol Antihypotonika Cafedrin, Dihydroergotamin Antikoagulantien Heparin, Certoparin Antimykotika Nystatin, Natamycin, Amphotericin B, Flucytosin, Miconazol, Fluconazol, Itraconazol, Clotrimazol, Econazol, Tioconazol, Fenticonazol, Bifonazol, Oxiconazol, Ketoconazol, Isocona- zol, Tolnaftat, Amorolfin, Terbinafin Corticoide Aldosteron, Fludrocortison, Betametason, Dexametason, Tri- amcinolon, Fluocortolon, Hydroxycortison, Prednisolon, Pred- nyliden, Cloprednol, Methylpredinsolon Diagnostika a) radioaktive Isotope wie Te99m, Inlll oder 1131, kovalent gebunden an Lipide oder Lipoide oder andere Moleküle oder in Komplexen b) hochsubstituiertre iodhaltige Verbindungen wie z. B. Lipi- de c) Megluminamidotrizoat, Iotroxinsäure, Natriumiopodat Diuretika Hydrochlorothiazid Erythropoetin Fibrinolytika Urokinase Hämostyptika/Antihämorrhagika Blutgerinnungsfaktoren VIII, IX Hypnotika, Sedativa Cyclobarbital, Pentobarbital, Phenobarbital, Methaqualon (BTM), Benzodiazepine (Flurazepam, Midazolam, Nitrazepam, Lormetazepam, Flunitrazepam, Triazolam, Brotizolam, Temaze- pam, Loprazolam), Thalidomid, Zolpidem, Zopiclon, Diphenhy- dramin, Doxylamin, Temazepam Hypophysen-, Hypothalamushormone, regulatorische Peptide und ihre Hemmstoffe Corticotrophin, Tetracosactid, Choriongonadotropin, Urofol- litropin, Urogonadotropin, Somatropin, Metergolin, Bromo- criptin, Terlipressin, Desmopressin, Oxytocin, Argipressin, Ornipressin, Leuprorelin, Triptorelin, Gonadorelin, Busere- lin, Nafarelin, Goselerin, Somatostatin, Quinagolid, Octreo- tidacetat, Lypressin Immuntherapeutika und Zytokine Dimepranol-4-acetatamidobenzoat, Thymopentin, a-Interferon, ß-Interferon, g-Interferon, Filgrastim, Interleukine, Aza- thioprin, Ciclosporin, Molgramostim, GM-CSF Koronarmittel Glyceroltrinitrat, Isosorbiddinitrat, Oxyfedrin Lebertherapeutika Sylimarin Lipidsenkert Pravaststin, Fluvastatin Lokalanaesthetika Butanilicain, Mepivacain, Bupivacain, Etidocain, Lidocain, Articain, Prilocain, Propipocain, Oxybuprocain, Tetracain, Benzocain Migränemittel Proxibarbal, Lisurid, Methysergid, Dihydroergotamin, Cloni- din, Ergotamin, Pizotifen, Sumatriptan Muskelrelaxantien Tubocurarin, Alcuronium, Pancuronium, Vecuronium, Atracuri- um, Suxamethonium, Dantrolen, Baclofen, Carisoprodol, Chlor- mezanon, Memantin, Tizanidin Narkosemittel Methohexital, Propofol, Etomidat, Ketamin, Alfentanil, Thio- pental, Droperidol, Fentanyl, Alfentanil, Sufentanil Nebenschilddrüsenhormone, Calciumstoffwechselregulatoren Dihydrotachysterol, Calcitonin, Clodronsäure, Etidronsäure, Pamidronsäure Neuropathiepräparate a-Liponsäure Prostaglandine Alprostadil Psychopharmaka Benzodiazepine (Lorazepam, Diazepam), Clomethiazol, Schilddrüsentherapeutika 1-Thyroxin, Carbimazol, Thiamazol, Propylthiouracil Sera, Immunglobuline, Impfstoffe a) Immunglobuline allgemein und spezifisch wie Hepatitis- Typen, Röteln, Cytomegalie, Tollwut, FSME, Varicella- Zoster, Tetanus, Rhesusfaktoren b) Immunsera wie Botulismus-Antitoxin, Diphterie, Gasbrand, Schlangengift, Skorpiongift c) Impfstoffe wie Influenza, Tuberkulose, Cholera, Diphte- rie, Hepatitis-Typen, FSME, Röteln, Hämophilus influen- zae, Masern, Neisseria, Mumps, Poliomyelitis, Tetanus, Tollwut, Typhus Sexualhormone und ihre Hemmstoffe Anabolika, Androgene, Antiandrogene, Gestagene, Estrogene, Antiestrogene (Tamoxifen etc.), Flutamid, Fosfestrol, Cy- proteron, Formestan, Aminoglutethimid Toxoplasmosemittel Atovaquon Urologika Trospiumchlorid Vitamine Alfacalcidol, Vitamin A und-derivate, Vitamin E und-deri- vate, Ascorbinsäure ZNS-Therapeutika a) Neuroleptika wie Perazin, Promazin, Sulpirid, Thiorida- zin, Chlorprothixen, Levomepromazin, Prothipendyl, Chlor- promazin, Clopenthixol, Triflupromazin, Perphenazin, Trifluperazin, Pimozid, Reserpin, Fluphenazin, Haloperi- dol, Trifluperidol, Benperidol, Alimemazin, Fluphenazin, Flupentixol, Melperon, Bromperidol, Pipamperon, Clozapin, Risperidon, b) Antidepressiva wie Imipramin, Desipramin, Trimipramin, Lofepramin, Clomipramin, Opipramol, Amitriptylin, Amit- riptylinoxid, Nortriptylin, Dibenzepin, Doxepin, Maproti- lin, Mianserin, Fluoxetin, Fluvoxamin, Paroxetin, Trazo- don, Moclobemid, Tranylcypromin, Oxitriptan, Viloxazin, Hypericin, Lithiumsalze c) Tranquillantien wie Meprobamat, Hydroxyzin, Benzodiazepi- ne wie Chlordiazepoxid, Diazepam, Prazepam, Oxazepam, Dikalium-clorazepat, Lorazepam, Clonazepam, Bromazepam, Clotiazepam, Alprazolam, Clobazam, Buspiron d) Psychostimulantien wie Coffein, Theophyllin, Theobromin, Amphetamine und verwandte Substantzen e) Stoffe zur Behandlung dementieller Syndrome wie Meclofe- noxat, Nicergolin, Piracetam, Pyritinol, Tacrin, Meman- tin, Dihydroergotoxinmethansulfonat f) Appetitzügler wie Nor-pseudoephedrin, Amfepramon, Mefeno- rex, Levopropylhexedrin, Fenfluramin, Dexfenfluramin g) Analeptika wie Doxapram, Fenetyllin h) Nervenwachstumsfaktor (Nerve growth factor), Naloxon, Dalargin i) Antiparkinsonmittel wie L-Dopa, Selegilin, Bromocriptin, Amantadin, Tiaprid, Biperiden, Trihexylphenidyl, Procy- clidin, Benzatropin, Orphenadrin, Bornaprin, Metixen, a- Dihydroergocryptin, Carbidopa Zystostatika und Metastasenhemmer a) Alkylantien wie Nimustin, Melphalan, Carmustin, Lomustin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Trofosfamid, Chlorambucil, Busulfan, Treosulfan, Prednimustin, Thiotepa, b) Antimetabolite wie Cytarabin, Fluorouracil, Methotrexat, Mercaptopurin, Tioguanin c) Alkaloide wie Vinblastin, Vincristin, Vindesin d) Antibiotika wie Aclarubicin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mito- mycin, Plicamycin e) Komplexe von Nebengruppenelementen (z. B. Ti, Zr, V, Nb, Ta, Mo, W, Ru, Pt) wie Carboplatin, Cisplatin und Metal- locenverbindungen wie Titanocendichlorid f) Amsacrin, Dacarbazin, Estramustin, Etoposid, Hydroxycarb- amid, Mitoxanthron, Procarbazin, Temiposid g) Alkylamidophospholipide (beschrieben in J. M. Zeidler, F. Emling, W. Zimmermann und Roth, H. J., Archiv der Pharmazie, 324,687,1991) h) Etherlipide wie Hexadecylphosphocholin, Ilmofosin und Analoga, (beschrieben in Zeisig, R., Arndt, D., Brach- witz, H., Pharmazie 45 809-818 1990) i) Taxane wie Paclitaxel und Docetaxel j) Altretamin, Aminoglutethimid, Asparaginase, Hydroxycarba- mid, Miltefosin Beispiele Beispiel 1 : Unmodifizierte, Dalargin-beladene PBCA-Nanopartikel waren nicht in der Lage, nach i. v. Applikation die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Die i. v. Applikation dieser Nanopartikel mit präad- sorbiertem ApoE an Mäuse führte jedoch in dem von Alyautdin et al. beschriebenen"tail-flick-Test" (Alyautdin, R. N., Gothier, D., Petrov, V. E., Kharkevich, D. A., Kreuter, J., Eur. J.

Pharm. Biopharm., 41,44-48,1995) zu einer analgetische Wir- kung. 15 Minuten nach Injektion der Partikel wurde ein Effekt beobachtet, der 44% des maximal möglichen Effektes ausmachte (Berechnung des Effektes nach einer von Alyautdin et al. (Aly- autdin, R. N., Gothier, D., Petrov, V. E., Kharkevich, D. A., Kreuter, J., Eur. J. Pharm. Biopharm., 41,44-48,1995) angege- benen Formel).

Beispiel 2 : Es wurden ApoE-Lösungen (50 mg ApoE in 160 ul NH4HC03-Puffer (10 mM), pH 7,5, Calbiochem-Novabiochem, Nottingham, UK) in jeweils 500 p1 einer 6prozentigen Suspension (m/V) von unmodifizierten und mit Tween 80 modifizierten PBCA-Partikeln für 3 h bei 37°C (Tamada und Ikada, 1993) inkubiert. Die Partikel wurden durch Zentrifugation vom Dispersionsmedium separiert und viermal gewa- schen. Das adsorbierte ApoE wurde mit von Hochstrasser et al.

(Hochstrasse, D. F., Harrington, M. G., Hochstrasser, A.-C., Miller, M. J., Merril, C. R., Anal. Biochem., 173,424-435, 1988) beschriebenen solubilisierenden Lösungen von der Partikel- oberfläche desorbiert. Jeweils 80 u. l der proteinhaitigen Lösun- gen wurden auf die Röhrchengele der 1. Dimension der 2-DE ap- pliziert. Der Nachweis des adsorbierten ApoE erfolgte mit zwei- dimensionaler Elektrophorese (2-DE) nach Blunk (Blunk, T., Hoch- strasser, D. F., Sanchez, J.-C., Müller, B. W., Müller, R. H., Electrophoresis, 14,1382-1387,1994).

Abb. 1 zeigt die resultierenden ApoE-Spots auf den 2-DE-Gelen der unmodifizierten und mit Tween 80 modifizierten PBCA-Parti- kel. Die Anreicherung von ApoE ist dabei auf den unmodifizierten Partileln am höchsten.

Beispiel 3 : Um zu zeigen, daß andere Proteine das auf den PBCA-Partikeln präadsorbierte ApoE nach einer i. v. Applikation von der Parti- keloberfläche nicht vollständig verdrängen, wurden die Partikel mit präadsorbiertem ApoE (vgl. Beispiel 2) gemäß dem Standard- protokoll für die 2-DE in Plasma inkubiert (5 min bei 37°C, nach Blunk, siehe Beispiel 2) und die resultierenden Adsorptionsmu- ster bestimmt. Abb. 2 zeigt Ausschnitte aus dem 2-DE-Gel, die die ApoE-Spots enthalten.

Beispiel 4 : Es wurden die Plasmaproteinadsorptionsmuster von PBCA-Partikeln bestimmt, die keine analgetische Wirkung von Darlagin im ZNS vermittelten. Abb. 3 zeigt das mit unmodifizierten PBCA-Parti- keln erhaltene Gel. Es wurde kein ApoE detektiert. Abb. 4 zeigt das mit Poloxamer 407 modifizierten PBCA-Partikeln erhaltene Gel. Es wurde ebenfalls kein ApoE detektiert und somit gezeigt, daß es in Abwesenheit von ApoE zu keiner ZNS-Wirksamkeit kommt.

Beispiel 5 Chemische Kopplung von Apolipoprotein E an carboxylierte Polyme- thyl-methacrylat-Nanopartikel : Ein mit Carboxylgruppen auf der Oberfläche funktionalisierter Polymethylmethacrylat-Latex (Partikeldurchmesser 65nm 10%) wird nach 2 Waschschritten (30.000 rpm/10 min, 4°C) mit 0.01M Phosphat-Pufferlösung pH 6.5 auf 0.5% eingestellt. Bei 4°C werden 0.5 ml des Latex mit 300u1 Proteinlösung versetzt und 60 min inkubiert. Jetzt erfolgt die Zugabe von 10mg wasserlöslichem Carbodiimid(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydro- chlorid). Das Gemisch wird über Nacht (16h) auf einem Schüttler mit niedriger Frequenz bewegt. Durch Zentrifugation (30.000 rpm /10 min, 4°C) werden die Partikel vom Medium getrennt und in 0.1 M Glyzinpuffer pH 8.55 zu einem Feststoffgehalt von 0.5% aufge- nommen.

Beispiel 6 Chemische Kopplung von Apolipoprotein E an durch Einführung von Epoxy-Grupen oberflächenfunktionalisierten Polymethylmethacry- lat-Latex : Ein Kern-Schale-Latex (K : Polymethylmethacrylat ; S : Polyglyci- dylmethacrylat) mit einem Partikeldurchmesser von 70nm 10% wird nach 2 Waschschritten (30.000 rpm/10 min, 4°C) mit 0.0025M Phosphatpuffer pH 8.0 auf 2% Feststoffgehalt eingestellt. Glei- che Volumina des Latex und einer 0.2% igen Proteinlösung werden für 3h bei 28°C auf einem Schüttler bewegt. Anschließend wird zentrifugiert (30. 000 rpm/10 min, 4°C) und das Sediment in GBS- Puffer pH 8.0 aufgenommen, so daß der Latex einen Feststoffge- halt von 0.5% aufweist.

Tabelle 1 : ZNS-Wirksamkeit von unmodifizierten und mit ver- schiedenen Tensiden oberflächenmodifizierten, mit Darlagin beladenen PBCA-Nanopartikeln nach intra- venöser Gabe an Mäuse (Dalargin-Dosis : 10 mg/kg).

Angegeben sind die analgetischen Effekte ausge- drückt als Prozentsatz vom maximal möglichen Ef- fekt (% MME) (S : Standardabweichung, n=4) (Berech- nungsformel nach Alyautdin, R. N., Gothier, D., Petrov, V. E., Kharkevich, D. A., Kreuter, J., Eur. J. Pharm. Biopharm., 41,44-48,1995) oberflächen-% MME % MME S modifizierendes (nach 15 (nach 45 Tensid min) min) Tween 20 79, 7 52, 9 21,3 20,9 Tween 40 87, 5 60, 8 16,1 38,0 Tween 60*-7,1 45,5 24,2 36,6 Tween ~010,5100 14,9 Poloxamer 407 4,4 ~ 3,9 9,5 ~ 5,8 Poloxamer 908-1,3 3, 6 4, 2 5,5 Poloxamer ~5,93,3~3,48,1 Poloxamer ~1,0~2,30,9 0,28 Poloxamer 338 0, 2 0, 5 1, 4 3,9 Cremophor ~8,6~8,710,9 13,1 2,3~1,63,7unmodifiziertePar- tikel 11,7 Dalargin-Dosis : 7,5mg/kg Abb. 1 : Ausschnitte mit ApoE-Spots aus 2-DE-Gelen von unmodi- fizierten PBCA-Partikeln (links) und von mit Tween 80 modifizierten PBCA-Partikeln (rechts) jeweils nach Präadsorption von ApoE. Durch das adsorbierte ApoE besaßen auch die unmodifizierten Partikel eine ZNS- Wirksamkeit (Beispiel 2).

Abb. 2 : Ausschnitt aus dem 2-DE-Gel von unmodifizierten PBCA- Partikeln mit präadsorbiertem ApoE nach Inkubation in Plasma (Beispiel 3).

Abszisse : nicht linearer Gradient pI 4,5-6,0 Ordinate : nicht linearer Gradient MG 25.000-46.000 Abb. 3 : 2-DE-Gel von unmodifizierten PBCA-Partikeln ohne ZNS- Wirksamkeit (Beispiel 4).

(1) Albumin, (2) al-Antitrypsin, (3) Fibrinogen y, (4) ApoA-IV, (5) ApoJ, (7) ApoA-I Abszisse : nicht linearer Gradient pI 4,5-6,5 Ordinate : nicht linearer Gradient MG 25.000-75.000 Abb. 4 : 2-DE-Gel von mit Poloxamer 407 modifizierten PBCA- Partikeln ohne ZNS-Wirksamkeit (Beispiel 4) (1) Albumin, (2) al-Antitrypsin, (4) ApoA-IV, (5) ApoJ, (7) ApoA-I Abszisse : nicht linearer Gradient pI 4,5-6,5 Ordinate : nicht linearer Gradient MG 25.000-75.000