本发明是关于增加 SIRT 1 mRNA表现量及 I 或降低 SOCS3 mRNA表现量的药剂， 尤其关于调节血糖以及该调节血糖用的药剂 的提供，特别是使用可以由例如管花肉苁蓉萃 取物取得的活性成分 于制造供前述应用的药剂的用途。 背景技术 糖尿病 （diabetes mellitus ) 是一种慢性新陈代谢失调疾病， 主 要病因是胰岛素分泌不足或生物体的组织无法 有效利用葡萄糖， 而 造成血液中葡萄糖含量过高。 已知胰岛素是由胰脏内的 β细胞所分 泌， 其具有调节血糖的功效， 可剌激脂肪及肌肉细胞进行葡萄糖运 输 （glucose transport )。 当生物体由于肥胖、 老化等因素而造成体 内胰岛素分泌量不足或对胰岛素敏感性不佳时 ， 血糖浓度会升高， 造成糖尿病。 糖尿病患者可能会出现例如口渴、 多尿、 视力模糊、 体重减轻等症状， 且长期高血糖可能导致各种器官的功能障碍及 衰 竭。

根据致病原因， 糖尿病主要可分为第一型糖尿病 （ Type 1 diabetes ) 及第二型糖尿病 （Type 2 diabetes ) ₀ 第一型糖尿病又称 胰岛素依赖型糖尿病 ( insulin dependent diabetes mellitus )， 其可能 病因是因感染或环境毒素引发患者自身免疫系 统攻击胰脏 β细胞， 使患者的胰脏 β细胞受到损坏， 造成绝对性的胰岛素不足， 致使患 者血糖上升。 第一型糖尿病占所有糖尿病患的约 5%至 10%。 大部分 患者会在 30岁前被诊断出来， 故又被称为少年型糖尿病 （juvenile diabetes mellitus )。

第二型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病 （ non-insulin dependent diabetes mellitus ) , 一般发病年龄在 40岁以后， 故又称为 成年型糖尿病 （adult-onset diabetes )。 第二型糖尿病占所有糖尿病 人口约 90%至 95%， 其病因是病患体内细胞对胰岛素发生阻抗 ( insulin resistance ) , 因而逐渐造成胰脏 β细胞的胰岛素分泌量变 少， 接着出现糖尿病代谢异常， 这类患者经常会合并高脂血症、 肥 胖等病征。 第二型糖尿病的危险因子包括， 基因异常、 糖尿病家族 史、 老年人、 肥胖 （特别是腹部肥胖）、 身体活动量少、 曾患有妊 娠糖尿病、 及葡萄糖恒定异常 ( impaired glucose homeostasis ) 等。

近年来，随着人类生活型态改变，糖尿病的盛 行率也逐年增加。 根据 2008年世界卫生组织的预测， 预计在 2030年， 全球糖尿病人口 将超过 3亿人。 目前临床上对于糖尿病的治疗方式主要包括运 动、 饮食控制、 及药物治疗等方式， 其中药物治疗包括胰岛素注射、 口 服降血糖药物， 例如磺酰尿素类药物 （sufonylureas )、 双胍类药物

( biguanides )、 α-葡萄糖苷酶抑制齐 (J ( alpha-glucosidase inhibitors 胰岛素增敏齐 ¹ J ( insulin sensitizer ) 等。

本发明人研究发现， 下式 （I ) 化合物可增加 SIRT 1 mRNA表现 量及 /或降低 SOCS3 mRNA表现量， 且具有优异的降血糖功效， 故 可用于调节血糖， 且尤其可用于治疗第一型糖尿病及 /或第二型糖 尿病： 其中， X 另一者为 H、 OH或 时， Z为 以及 Rl至 R13是各自独立为 H或 0H， 且其中， R1至 R3不同时为 H; R8及 R9不同时为 11。 较佳地， 该 式 （I) 化合物为以下化合物 （1) 或 （2) 的至少一者， 可取自植 物萃取物中， 如管花肉苁蓉萃取物，

( 1)

管花肉苁蓉来源于肉苁蓉属植物， 其活性成分主要为苯乙醇苷 类化合物 （phenylethanoid glycosides ) , 包含松果菊苷、 类叶升麻 苷及异类叶升麻苷。 其中， 由上海中医药大学研究团队利用肝细胞 体外葡萄萄消耗试验及不同药物诱导的第一型 糖尿病或第二型糖 尿病小鼠模型进行体内降糖药效试验， 结果发现来源于车前子的类 叶升麻苷具有促进葡萄消耗作用并可藉由提高 血清胰岛素含量能 降低空腹血糖量 （参见中国专利申请案公开号第 CN 102283854 A 号， 该文献全文并于此处以供参考）。 故本研究是利用糖尿病动物 模型以及肝细胞葡萄糖消耗试验， 以确认管花肉苁蓉萃取物的主要 作用成分。

发明内容 本发明的一个目的，在于提供一种使用一活性 成分于制备药剂 的用途， 其中该药剂是用于增加 SIRT 1 ( sirtuin 1 ) mRNA表现量及 I或降低 SOCS3 ( suppressor of cytokine signaling 3 ) mRNA表现量， 且可用于调节血糖， 且该活性成分是选自以下群组： 式 （I ) 化合 物、 式 （I ) 组合，

其中， X为 H或 C 1 -C3垸基； Y及 Z的 另一者为 H、 OH或 其中当 Y为 时， Z为 ^ ； 以及 Rl至 R13是各自独立为 H或 OH， 且其中，

R1至 R3不同时为 H ; R8及 R9不同时为11。

本发明的又一目的， 在于提供一种于一个体中增加 SIRT1 mRNA表现量及 I或降低 S0CS3 mRNA表现量， 或者用于调节血糖 的方法， 其是包含对该个体施用一有效量的活性成分， 其中该活性 成分是选自以下群组： 式 （I ) 化合物、 式 （I ) 化合物的医药可接 受盐、 及前述的组合。

本发明的技术及较佳实施态样， 将描述于以下内容中， 以供本 发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的 特征。

附图说明

图 1所示为经不同药物处理后， SD大鼠的体重曲线图；

图 2所示为经不同药物处理后， SD大鼠的摄食热量曲线图； 图 3为经不同药物处理后， SD: 鼠血浆葡萄糖浓度的曲线图； 图 4为经不同药物处理后， SD:：鼠血浆葡萄糖浓度的曲线下面积的 长条图；

图 5为经不同药物处理后， SD: 鼠血浆一氧化氮浓度的曲线图； 图 6为经不同药物处理后， SD: 鼠血浆 TNF-α浓度的曲线图； 图 7为经不同药物处理后， SD: 鼠血浆 IL-6浓度的曲线图；

图 8为经不同药物处理后， SD: 鼠大脑下视丘组织的 SIRT1 mRNA 图 9为经不同药物处理后， SD大鼠大脑下视丘组织的 SOCS3 m NA 表现量的曲线图；

图 10所示为经不同条件处理的肝细胞的醣类消耗� ��验结果； 以及 图 11所示为经不同条件处理 （浓度依存） 的肝细胞的醣类消耗试验 结果。

具体实施方式 以下将描述根据本发明的部分具体实施态样； 但是， 在不背离 本发明精神下， 本发明尚可以多种不同形式的态样来实践， 不应将 本发明保护范围解释为限于说明书所陈述者。 此外， 除非文中有另 外说明， 于本申请文件中所使用的 「一」、 「该」 及类似用语应理解 为包含单数及复数形式； 所谓 「有效量」 或 「治疗有效量」， 是指 投予至个体时， 可有效至少部分改善怀疑个体的病情的化合物 数 量； 所谓 「个体」 是指哺乳动物， 哺乳动物可为人类或非人动物； 所谓「治疗」是包括预防特定疾病或症状、减 轻特定的疾病或症状、 及 /或防止或消除该病症； 所谓 「调节血糖」 乙语是指朝正常值的 方向改变血中葡萄糖浓度； 单位 「毫克 /千克体重」 是指每千克体 重个体所须的投药量。

本发明提供一种使用活性成分于制备药剂的用 途， 其中该药剂 是用于增加 SIRT 1 mRNA表现量及 I或降低 SOCS3 mRNA表现量， 或者用于调节血糖， 且该活性成分是选自以下群组： 式 （I ) 化合 物、 式 （I ) 化合物的医药可接受盐、 及前述的组合， 其中， X为 H或 C1-C3垸基； Y及 Z的一者为

时， Z为 ； 以及 Rl至 R13是各自独立为 H或 OH, 且其中， R1至 R3不同时为 H; R8及 R9不同时为 11。

于式 （I) 中， 较佳地， X为 C1-C3垸基 （例如： 甲基、 乙基、 直链或支链丙基）； Y及 Z皆不为 H; 及 /或 R1至 R3中的二者为 OH, 更佳地， X为甲基。

于 是具下式 （A)

其中， Xa为 H或 C1-C3垸基； Rla至 R13a是各自独立为 H 或 OH， 且其中， Rla至 R3a不同时为 H; R8a及 R9a不同时为 H ₍ 于式 （A) 中， 较佳地， Xa为 C1-C3垸基 （例如： 甲基、 乙基、 直链或支链丙基）， 且 Rla至 R3a的二者为 OH; 更佳地， Xa为甲基； 特别较佳为 Xa为甲基， Rla至 R3a的二者为 OH， 且 R8a及 R9a皆为 OH。 于一具体实施态样中， 该式 （A) 化合物是如下化合物 （1) (即， 松果菊苷 （echinacoside)):

于本发明另一较佳实施态样中，该式（I)化合� ��是具下式（C)

其中 ， Xc为 H或 C1-C3垸基； Yc为 H、 OH或

以及 Rlc至 R13c是各自独立为 H或 OH， 且其中， Rlc至 R3c不 同时为 H; R8c及 R9c不同时为 H。 于式 （C) 中， 较佳地， Xc为 C1-C3垸基 （例如： 甲基、 乙基、 直链或支链丙基）， 且 Rlc至 R3c的二者为 OH; 更佳地， Xc为甲基； 特别较佳为， Xc为甲基， Rlc至 R3c的二者为 OH， 且 R8c至 R9c皆为 OH。 于一具体实施态样中， 该式 （C) 化合物是如下化合物 （2) (即， 异类叶升麻苷 （isoacteoside)):

(2)。 因此， 于本发明的部分具体实施态样中， 是使用选自以下群组 的活性成分以制备该用以增加 SIRT1 mRNA表现量及 / 或降低 SOCS3 mRNA表现量， 或者用以调节血糖的药剂： 化合物 （1)、 化 合物 （1) 的医药可接受盐、 化合物 （2)、 化合物 （2) 的医药可接 受盐、 及前述的组合，

适用于本发明的上述活性成分的医药可接受盐 的例子包括，但 不限于， 碱金属盐， 如钠盐、 钾盐。

于本发明中， 可使用选自以下群组的活性成分， 以制备该用以 增加 SIRT 1 mRNA表现量及 I或降低 SOCS3 mRNA表现量， 或者用 于调节血糖的药剂： 化合物 （1 )、 化合物 （2 )、 及前述的组合。 于 此等态样中， 该等活性成分可由例如管花肉苁蓉的植物萃取 而提 供， 因此， 可以萃取物的形式使用。

可使用包含如下歩骤的方法， 以提供含有化合物 （1 ) 及 /或 化合物 （2 ) 的管花肉苁蓉萃取物： （a ) 使用一极性溶剂以萃取管 花肉苁蓉， 获得一萃取液； 以及 （b ) 视需要干燥该萃取液。 其中， 该极性溶剂可为水及 /或 C1 -C4醇类， 例如甲醇、 乙醇、 乙二醇、 丙醇、 异丙醇、 丙二醇、 正丁醇、 异丁醇、 叔丁醇、 丁二醇及前述 的组合。

较佳地， 该极性溶剂是选自以下群组： 水、 甲醇、 乙醇、 及前 述的组合。 更佳地， 是使用水、 乙醇、 或其组合作为该极性溶剂。 可视需要调整用于萃取的极性溶剂与管花肉苁 蓉的用量比率， 一般 而言， 极性溶剂与管花肉苁蓉的体积比可为约 1 : 1至约 50 : 1， 较 佳是约 5 : 1至 20 : 1。

可使用管花肉苁蓉的任何部位作为制备管花肉 苁蓉萃取物的 原料。 举例言之， 可使用管花肉苁蓉的茎部、 花、 或全株植物作为 萃取原料。 根据本发明的一实施态样， 是使用管花肉苁蓉的肉质茎 部分作为萃取原料。

于上述歩骤 （a ) 中， 是进行该萃取一段时间以达到所欲的萃 取程度。 以采用水作为该极性溶剂为例， 通常为至少 15分钟， 较佳 为至少 30分钟， 更佳为至少 60分钟， 且可视需要辅以其它合适的萃 取手段， 例如煎煮、 冷却、 过滤、 减压浓缩、 树脂管柱层析等方式， 以提高萃取效果。 另外， 可视需要于歩骤 （b ) 之前， 以相同或不 同极性溶剂重复进行多次萃取歩骤 （a )， 并合并该多次萃取所得的 萃取液以进行歩骤 （b )， 从而尽可能萃得全部有效成分。 此外， 可 重复萃取歩骤（a)与萃取歩骤 (b)的循环， 以尽可能纯化分离移除无 效成分。

于根据本发明的一实施态样中， 是将管花肉苁蓉以水进行浸泡 及煎煮， 过滤收集滤液， 重复前述歩骤三次。 接着， 进行减压浓缩 至比重 1 .10后， 添加乙醇至浓度为 60%， 冷藏 12小时， 倾出上淸液， 减压浓缩并回收乙醇至比重 1 .10， 以获得一粗萃取物。 接着， 以 1 倍重量的水加热溶解粗萃取物， 以大孔吸附树脂柱进行纯化， 依序 以水及 40%乙醇进行洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥后即可获得 管花肉苁蓉萃取物。所提供的管花肉苁蓉萃取 物是包含相对大量的 化合物 （1 ) 以及相对少量的化合物 （2 )。 本发明使用式 （I ) 化合物、 其医药可接受盐、 或前述的组合 所制备的药剂， 是可用于增加 SIRT l mRNA表现量及 / 或降低 SOCS3 mRNA表现量， 且尤其可用于调节血糖 （例如， 治疗第一型 糖尿病及 I或第二型糖尿病）。 已知 SIRT 1可促进胰脏 β细胞分泌胰 岛素， 且能调控造成胰岛素阻抗的相关因子， 如自由基及发炎因子 等， 进而改善胰岛素阻抗的情形； 此外， SOCS-3表现量可作为瘦 素阻抗指标。 因此， 于不受理论限制下， 咸信本发明所提供的药剂 可透过增加 SIRT l mRNA表现量及 I或降低 SOCS3 mRNA表现量而 调节血糖， 且可进一歩用于治疗其他与 SIRT1表现量相关的疾病， 例如神经病变 （例如阿尔兹海默氏症 （Alzheimer's disease , AD )、 巴金森氏症 ( Parkinson's Disease , PD )、 亨廷顿氏症 ( Huntinton's disease， HD )、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis , ALS ) 等）、 心血管疾病 （例如心脏病、 低血压、 高血压、 高血糖症、 中风、 心肌梗塞、 血栓、 动脉硬化等）、 以及肥胖。

可以任何合宜的用量施用本发明所提供的药剂 ，端视投予个体 的需求而异。举例言之， 当使用于人体以调节血糖时， 药剂的用量， 以式 （I ) 化合物计， 为每天约 0.5毫克 /千克体重至约 100毫克 /千克 体重， 较佳为每天约 1毫克 /千克体重至约 55毫克 /千克体重。 惟， 对 于急性患者而言， 其用量可视实际需要而酌增， 例如增加至数倍或 数十倍。

于本发明中， 所提供的药剂可呈任何形式， 并以任何合宜的方 式施用。 举例言之， 但不以此为限， 可经由口服、 鼻腔给药、 静脉 注射、 腹腔注射、 及 /或皮下注射等方式施用至一需要的个体。 其 中， 由于口服投药剂型便于病人按时自行服用， 故于本发明的一较 佳实施态样中， 是以口服剂型提供该药剂， 例如： 锭剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 散剂、 流浸膏剂、 溶液剂、 糖浆剂、 悬液剂、 乳剂、 及酊 剂等。 视使用形式及用途而定， 该药剂可更包含一医药可接受的载 剂。

以制备适于口服投药的剂型为例， 该药剂中可含有任何不会不 利影响所含活性成分 （即， 式 （I ) 化合物及 /或其医药可接受盐） 的活性的医药可接受载剂， 例如： 溶剂、 油性溶剂、 稀释剂、 安定 剂、 吸收延迟剂、 崩散剂、 乳化剂、 抗氧化剂、 粘合剂、 润滑剂、 吸湿剂等。 可利用任何合宜的方法， 将该组合物制成适于口服投药 的剂型。

至于制备适于静脉注射或皮下注射的剂型， 该药剂可例如包含 一或多种等张溶液、 盐类缓冲液 （如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲 液）、 助溶剂 （solubilizer 乳化剂、 以及其他载剂等成分， 以制 成一静脉输注液、 乳剂静脉输注液、 干粉注射剂、 悬液注射剂、 或 干粉悬液注射剂等。

除了上述佐剂外， 该药剂可视需要另含有调味剂、 调色剂、 着 色剂等添加剂， 以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受； 另可 添加合宜用量的保存剂、 防腐剂、 抗菌剂、 抗真菌剂等， 以改善药 剂的储存性。 此外， 视需要地， 可于本发明所提供的药剂中并含一 或多种其他活性成分， 例如抗氧化剂 （如维他命 E )、 胰岛素增敏剂 等， 以进一歩加强本发明药剂的功效或增加制剂配 方的运用灵活性 与调配度， 只要该其他活性成分对药剂内所含的式 （I ) 化合物及

/或其医药可接受盐的所欲功效没有不利的� �响即可。

此外， 可以一日一次、 一日多次、 或数日一次等不同投药频率 施用本发明所提供的药剂， 端视投予个体的需求而异。

本发明亦提供一种于一个体中调节血糖的方法 ，其是包含对该 个体施用一有效量的活性成分， 其中该活性成分是选自以下群组： 式 （I ) 化合物、 其医药可接受的盐、 及前述的组合。 其中， 有关 该活性成分的选用以及其性质、施用型态与剂 量，均如上述的说明。

兹以下列实施例进一歩例示说明本发明。其中 该等实施例仅提 供作为说明， 而非用以限制本发明的保护范围。 本发明保护范围是 如后附申请专利范围所示。

实施例 1 : 管花肉苁蓉萃取物的制备

取管花肉苁蓉的肉质茎部分 10千克， 切片后浸泡于 8倍体积的 水中 1小时后， 煎煮 2小时， 过滤收集滤液。 力口 6倍体积的水煎煮药 渣二次， 每次 1小时， 并过滤。 合并三次滤液， 于 50°C减压浓缩至 比重 1.10， 添加乙醇至浓度 60%， 冷藏 12小时， 倾出上淸液， 于 50°C 减压浓缩并回收乙醇至比重 1 .10， 获得粗萃取物 6千克。 接着， 以 1 倍体积的水加热溶解粗萃取物， 注入大孔吸附树脂柱内， 依序以 4 倍体积的水及 5倍体积的 40%乙醇进行洗脱， 再将水洗脱液注入大 孔吸附树脂柱中， 先用 3倍体积的水洗脱， 弃去水洗脱液， 再以 4 倍体积的 40%乙醇洗脱， 收集两次 40%乙醇洗脱液， 浓缩干燥后， 即可获得管花肉苁蓉萃取物 1107克。

实施例 2: 管花肉苁蓉萃取物的活性试验

(1) 实验动物饲养

训养 4周龄雄性 SD (Sprague-Dawley) 大鼠 1周后， 将大鼠随机 分成 6个实验组， 每组 10只， 其中 5组为实验组， 进行腹腔注射 230 毫克 /千克体重的烟碱酰胺（nicotinamide), 再进行腹腔注射 65毫克 /千克体重链脲佐菌素（streptozocin), 以诱导大鼠罹患糖尿病（DM 组）； 而控制组则施打同体积柠檬酸缓冲液 （pH4.5)。 一周后， 测 定经诱导成糖尿病的实验组别的大鼠的禁食血 糖， 确认禁食血 糖>126毫克 /公升后， 再投予糖尿病大鼠 45%高脂肪饮食 （high fat diet, HFD) 6周， 接着以如下表 1所示的剂量， 口服投予 0.571毫克 /千克体重罗格列酮 （rosiglitazone, 为一糖尿病药物， 属于胰岛素 增敏剂 （insulin sensitizer)) ( DMR组） 或 80毫克 /千克体重的管花 肉苁蓉萃取物（CTE) (DME1组）、 160毫克 /千克体重的 CTE(DME2 组）、 或 320毫克 /千克体重的 CTE (DME4组）， 而控制组与 DM组则 投予二次水， 每日一次， 投药 6周， 每周测量大鼠体重并计算摄食 热量， 测定结果显示于图 1 (体重） 及图 2 (摄食热量）， 结果显示， 各实验组之间的体重及摄食热量并无显著差异 。

表 1

(2) 葡萄糖耐受性试验

大鼠经如上述投药 6周后， 进行口服葡萄糖耐受试验 （oral glucose tolerance test, OGTT),对大鼠投予 2克 /千克体重的葡萄糖， 并在 0、 30、 90及 120分钟后分别测定血浆葡萄糖浓度， 以分析 CTE 对于对于大鼠在摄取葡萄糖后， 对于葡萄糖的耐受性情况。 实验数 据显示于图 3。 进一歩针对图 3所示数据计算各取线的曲线下面积 (Area Under Curve, AUC), 结果显示于图 4。

如图 3及图 4所示，相较于 DM组，经 CTE喂食 6周的大鼠（ DME1、 DME2、 及 DME4组） 以及 DMR的大鼠， 在 0、 30、 90及 120分钟的 血浆葡萄糖浓度皆较低。 此实验结果显示 CTE可有效增加大鼠对于 血糖的摄取率， 调降血糖。

(3) 血浆样品分析

在上述葡萄糖耐受性试验结束后，牺牲大鼠， 由腹腔动脉抽血， 于 3000 rpm在 4°C下离心 15分钟， 收集上层液， 即为血浆， 并同时 取出大鼠组织， 称重后保存于 -80°C， 以进行以下生化数据分析。

(3-1) 葡萄糖含量测定

取 20微升血浆， 利用葡萄糖酵素套组 （glucose enzymatic kit, 极东 GL-V, 极东制药， 日本） 分析血浆中禁食葡萄糖含量。 以如 下公式计算血浆禁食葡萄糖含量：

血浆禁食葡萄糖含量 （毫克 /分升）

= (Es—空白值） I (Estd—空白值） X 200 其中， Es: 血液样品的吸光值； 空白值： 未加样品的套组溶剂 的吸光值； Estd: 标准试剂的吸光值； 200: 标准试剂浓度为 200毫 克 /分升。 实验结果显示于表 2。

(3-2) 总三酸甘油酯 (total triglyceride) 浓度测定

取 10微升血浆， 利用三酸甘油酯酵素套组 （ triglyceride enzymatic kit, Audit Diagnostics, Cork, 爱尔兰） 分析血衆中总三 酸甘油酯含量。 以如下公式计算血浆总三酸甘油酯含量：

血浆中总三酸甘油酯含量 （毫克 /分升）

= (Es—空白值） I (Estd—空白值） X 200 其中， Es: 血液样品的吸光值； 空白值： 未加样品的套组溶剂 的吸光值； Estd: 标准试剂的吸光值； 200: 标准试剂浓度为 200毫 克 /分升。 实验结果显示于表 2。

(3-3) 总胆固醇 （total cholesterol) 浓度测定

取 10微升血浆， 利用胆固醇酵素套组 （cholesterol enzymatic kit, Audit Diagnostics, Cork, 爱尔兰） 分析血浆中总胆固醇含量。 以如下公式计算血浆总胆固醇含量：

血浆中总胆固醇含量 （毫克 /分升）

= (Es—空白值） I (Estd—空白值） X 200 其中， Es: 血液样品的吸光值； 空白值： 未加样品的套组溶剂 的吸光值； Estd: 标准试剂的吸光值； 200: 标准试剂浓度为 200毫 克 /分升。 实验结果显示于表 2。 表 2

*0ne way ANOVA以 P <0.05为显著值， 经过事后比较

Dunnett's test检定， 「a」、 「b」、 「ab」 不同英文字母代表各组间统 计量达显著差异。 如表 2所示， 相较于 DM组， 经 CTE喂食 6周后的大鼠 （DME1、 DME2、 DME4组） 的禁食血糖皆有显著下降， 且 DMR组及 DME4 组的三酸甘油酯皆有显著下降的现象。 已知糖尿病患者会因胰岛素 浓度不足或胰岛素敏感性不佳而使周边脂肪组 织内的激素敏感脂 酶（hormone sensitive lipase ) 调控异常， 导致脂肪细胞内的三酸甘 油酯大量分解， 使血液中游离脂肪酸浓度升高， 导致周边组织对胰 岛素敏感性降低； 另一方面， 胰岛素阻抗亦会导致脂肪组织对三酸 甘油酯的利用减少， 造成三酸甘油酯堆积在血液中。 本实验结果显 示， CTE具有调降糖尿病大鼠的禁食血糖以及三酸甘 油酯含量的功 效。

( 3-4) 胰岛素含量测定 取 25微升血浆， 利用胰岛素 ELISA套组 （Mercodia AB Inc. , Sylveniusgatan 8A, 瑞典） 分析， 并以 ELISA分析仪于波长 450纳米 测吸光值， 并对照标准曲线换算其浓度。 实验结果显示于表 3。 (3-5) 瘦素含量测定

瘦素 （leptm) 是由脂肪细胞分泌的蛋白质类激素， 已知在生 物体内瘦素浓度失衡的情况下，会引发肥胖、 以及造成胰岛素失衡。 本实验取 100微升血浆， 利用瘦素酶免疫分析套组 （Assay Designs, Ins., Ann Arbor, 美国 USA) 分析， 并以 ELISA分析仪于波长 450 纳米测吸光值， 并对照标准曲线换算其浓度。 实验结果显示于表 3。

(3-6) 胰岛素阻抗指标值计算

以如下公式计算胰 岛素阻抗指标 （ homeostasis model assessment equation, HOMA-I ), 实验结果显示于表 3:

HOMA-IR = 禁食血浆胰岛素浓度 （毫单位 /毫升） X禁食血浆 葡萄糖浓度 （毫莫耳 /公升） ÷22.5。

表 3

*One way ANOVA以 P <0.05为显著值， 经过事后比较

Dunnett's test检定， 「a」 、 「b」 不同英文字母代表各组间统计量 达显著差异。

如表 3所示， 相较于控制组， DM组的大鼠具有较高的血浆胰岛 素、 血浆瘦素含量、 及 HOMA-IR。 相较于 DM组， 经 CTE喂食 6周后 的大鼠血浆内胰岛素、 瘦素、 及 HOMA-IR皆有显著回复 （下降） 的效果， 且在 DME4组浓度与控制组相当。 此实验结果显示 CTE 可提高大鼠对于胰岛素的敏感性、 减少瘦素及胰岛素阻抗。

(3-7) 尿素、 肌酸酐、 丙氨酸基转移酶、 及天冬氨酸氨基转 移酶含量测定

已知糖尿病会导致许多并发症， 本实验以尿素 （urea) 检测套 组（UR221, Randox, UK)、 肌酸酐（creatinine)检测套组（CR510, Randox, UK)、 天冬氨酸氨基转移酶 （AST) 检测套组 （AS 1267， Randox, UK)、 及丙氨酸基转移酶 （ALT) 检测套组 （ AL 1268， Randox, UK) 分别测定大鼠的血浆中的尿素、 肌酸酐、 丙氨酸基 转移酶、 及天冬氨酸氨基转移酶等肝肾功能指标的含量 。 实验结果 如表 4所示。

表 4

*0ne way ANOVA以 P <0.05为显著值， 经过

Dimnett's test检定， 「a」 、 「b」 fab J 「c」 不同英文字母 代表各组间统计量达显著差异。 如表 4所示， 相较于控制组， DM组的大鼠具有较高的尿素、 肌 酸酐、 及 ALT / AST比值。 相较于 DM组， 经 CTE喂食 6周后的大鼠 血浆内尿素、 肌酸酐、 ALT / AST比值皆有显著改善 （下降） 的效 果。

( 3-8 ) 血浆抗氧化酵素含量测定

5 已知第一型糖尿病及第二型糖尿病皆会引起会 造成体内抗氧 化酵素的表现量降低， 提高氧化压力。 本实验分别以超氧化歧化酶

( superoxide dismutase , SOD )、 过氧化氢酶 ( catalase ) 及麸胱甘 过氧化酶（ glutathione peroxidase , GPx )检测套组（ Eugene-Chen CO., LTD , 台湾） 验检测大鼠血浆内超氧化歧化酶、 过氧化氢酶及麸胱 0 甘过氧化酶的活性， 以分析检测 CTE对于抗氧化酵素表现量的影 响。 实验结果如表 5所示。

*One way ANOVA 以 P <0.05 为显著值， 经过事后比较 Dunnett' s test检定， 「a」 、 「b」 、 「ab」 、 「c」 不同英文字母 5 代表各组间统计量达显著差异。 如表 5所示，相较于控制组， DM组的大鼠血浆内超氧化歧化酶、 过氧化氢酶、及麸胱甘过氧化酶的活性皆降低 。相较于 DM组， DMR 以及经 CTE喂食 6周后的大鼠血浆内的超氧化歧化酶、 过氧化氢酶、 及麸胱甘过氧化酶的活性提高， 显示 CTE具有抗氧化酵素表现量的 功效， 可改善糖尿病所引起的氧化压力。

(3-9) 血浆的脂质过氧化测定

已知糖尿病会引起会增加血浆的脂质过氧的程 度， 而丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 的浓度可作为脂质过氧化指标， 本实验 测定血浆中丙二醛， 以分析 CTE对于脂质过氧化的影响。 取 0.5毫升 血浆， 加入 1毫升反应试剂 （15重量/体积％三氯乙酸， 溶于 0.25 N HC1; 以及及 0.375重量 /体积％硫代巴比妥酸， 溶于 0.25 NHC1) 混 合均匀， 置于 100°C水浴 15分钟， 冷却后再加入 1毫升的正丁醇， 剧 烈震荡混合， 离心 （ 1500 x g， 10分钟）， 取上层液以分光光度计测 量 532纳米的吸光值， 以 PBS作为空白值， 并利用标准品 （5纳莫耳 浓度 1,1,3,3-四甲氧基丙垸）的吸光值以下式计算血� ��浆丙二醛的浓 度， 结果显示于表 6:

血浆中丙二醛浓度 （纳莫耳浓度 /毫升）

= [ (样品吸光值-空白值） / (标准品吸光值-空白值） ] X 5 表 6

*One way ANOVA以 P <0.05为显著值， 经过事后比较

Dunnett'stest检定， 「a」 、 「b」 、 「c」 不同英文字母代表各组 间统计量达显著差异。 如表 6所示， 相较于控制组， DM组的大鼠血浆内丙二醛浓度升 高。 相较于 DM组， 经 CTE喂食 6周后的大鼠血浆内的丙二醛浓度浓 度下降， 显示 CTE具有降低糖尿病引起的脂质过氧化程度的功 效。

( 3-10 ) 血浆发炎指标测定

已知糖尿病患者体内的最终糖化蛋白 （Advanced Glycation End-products , AGE ) 浓度会上升， 当游离的 AGEs与其受体 RAGE 结合， 会产生超氧自由基 （superoxide radicals ) , 并引发下游的 NF-κΒ转录因子活化， 导致一连串的发炎反应。 本实验检测大鼠血 浆内发炎指标， 一氧化氮 （NO )、 TNF-o 及 IL-6的浓度， 以分析 CTE对于糖尿病引起的发炎反应的影响。 取 100微升不同浓度的标 准液或待测血清样本， 分别加入经捕捉抗体 （capture antibody ) 涂 覆的微量盘孔洞中， 于室温培养 2小时， 去除溶液并添加 400微升清 洗缓冲液（ 1倍 PB S、 0.05% Tween 20 )冲洗 5次。添加 100微升的 NO、 TNF-o IL-6检测抗体， 置于室温培养 1小时。 接着， 吸掉上清液， 以清洗缓冲液冲洗 5次， 添加 480微升卵白素-辣根过氧化物酶

( enzyme avidan-H P ) 至每个孔洞， 置于室温培养 30分钟后， 吸 掉上清液， 以清洗缓冲液冲洗 5次， 再添加 100微升基质溶液

( substrate solution ) 至每个孔洞， 室温培养 15分钟。 添加 50微升 终止溶液 （stop solution ) 至每个孔洞， 以微量盘分析仪测定波长 450纳米的读值， 并换算浓度。 实验结果显示于图 5至图 7。 其中， 图 5至图 7中的 「a」、 「b」、 「 _c 」表示经过事后比较 Dunnett's test检定， 不同英文字母代表各组间统计量达显著差异。

如图 5至图 7所示， 相较于控制组， DM组的大鼠血浆内 NO (图 5)、 TNF-a (图 6)、 及 IL-6 (图 7) 的浓度皆升高， 显示发炎情况较 严重。相较于 DM组， 经 CTE喂食 6周后的大鼠血浆内的 NO、 TNF-a、 及 IL-6浓度皆会下降， 显示 CTE具有降低糖尿病引起的发炎反应的 功效。

(4) 大鼠肝脏、 肾脏、 心脏、 及腹部脂肪重量测定

本实验测定经如上述投药 6周后， 各实验组别的大鼠的肝脏、 肾脏、 心脏、 及腹部脂肪重量。 结果如表 7所示， 各实验组别的 鼠其肝脏、 肾脏、 心脏、 及腹部脂肪的重量并无明显差异

表 7

*0ne way ANOVA以 P <0.05为显著值， 经过

Dimnett's test检定， 「a」 「b」 f ab J 不同英文字母代表各组 间统计量达显著差异。

(5) SIRT1及 SOCS-3的表现量测定

如前述， 已知 SIRT1可改善胰岛素阻抗的情形， 且已知 S0CS-3 ( suppressor of cytokine signaling 3 ) 表现量可作为瘦素阻抗指标。 本实验进一歩探讨 CTE对于大鼠体内 SIRT1 mRNA及 S0CS-3 mRNA的表现量的影响。 禾 1J用 RNeasy Lipid Tissue Mini套组 ( QIAGEN ) 萃取大鼠大脑下视丘组织的总 RNA。 混合 1微克总 RNA、 1微升 0.5微克 /微升的寡聚核苷酸 （dT )， 及 DEPC-H ₂ 0定量 到 12微升， 于 65°C作用 5分钟， 随后置于冰上 5分钟， 加入 4微升 5X 第一标准缓冲液 （ First- Strand Buffer )、 1微升 10毫莫耳浓度 dNTP、 及 1微升 HiScript I反转录酶， 于 30°C下反应 10分钟， 再于 48°C反应 60分钟， 70°C反应 15分钟。 接着， 取 1微升 DNA、 0.5微升 10毫莫耳 浓度 dNTPs、 2.5微升 10X PCR缓冲液、 各 0.5微升专一性引子 （gene specific primer , GSP ) 及 0.25微升 Taq聚合酶、 二次水至总体积 25 微升。 以下列条件进行聚合酶链反应（PCR ) : 94°C解离 5分钟； 94°C 解离 30秒； 55°C黏合 30秒； 72°C合成 30秒； 重复 40个循环。 实验结 果显示于图 8及图 9。

如图 8所示，相较于控制组，糖尿病大鼠（DM组）的 SIRT 1 mRNA 表现量明显降低， 而相较于 DM组， 经 CTE喂食的 DME1、 DME2、 及 DME4的 SIRT 1 mRNA表现量增加， 显示 CTE可增加大鼠的 SIRT 1 mRNA的表现量， 进而改善胰岛素阻抗的情形。 此外， 如图 9所示， 相较于控制组， 糖尿病大鼠 （DM组） 的 SOCS-3 mRNA表现量显著 增加， 显示瘦素阻抗的情况较为严重， 而相较于 DM组， 经 CTE喂 食的 DME1、 DME2、 及 DME4的 SOCS-3 mRNA表现量较低， 显示 CTE可降低大鼠的 SOCS-3 mRNA的表现量，改善糖尿病所引起的瘦 素阻抗。

实施例 3 : 管花肉苁蓉萃取物成分分析 以高效液相色谱法 ( high performance liquid chromatography, HPLC) 测定管花肉苁蓉萃取物所含成分， 实验条件如下： 管柱为 Agilent Zorbax SB-C18柱， 2.1 x 150 毫米， 5微米； 流动相为溶剂 A: 含 0.1%甲酸的乙腈（acetonitrile, ACN)、 溶剂 B: 含 0.1%甲酸的 MQ-H ₂ 0; 流速为 0.3毫升 /分钟； 检测波长为 333纳米。 分别吸取松果 菊苷 （ChromaDex, 美国）、 类叶升麻苷 （ChromaDex, 美国）、 以及 异类叶升麻苷 （ChromaDex, 美国） 标准品及管花肉苁蓉萃取物溶液 各 5微升 （溶于 50%甲醇）， 注入液相色谱仪， 分别测定各个样本的峰 面积， 并以峰面积计算管花肉苁蓉萃取物所含的松果 菊苷、 类叶升 麻苷、 以及异类叶升麻苷的含量。 分析结果显示于下表 8。

表 8

如表 8所示， 管花肉苁蓉萃取物中包含约 26.2重量％的松果菊 苷、 2.6重量％的类叶升麻苷、 以及约 4.4重量％异类叶升麻苷。

根据表 8结果， 换算实施例 2中 DME1、 DME2、 DME4组别所投 予的 CTE剂量中所含各活性成分的含量如下表 9所示：

表 9

实施例 4: 松果菊苷及异类叶升麻苷的活性试验 苷、 类叶升麻苷、 以及异类叶升麻苷。 本实验进一歩确认松果菊苷、 类叶升麻苷、 以及异类叶升麻苷于调节血糖的功效。

(1) 细胞试验

本实验以肝细胞进行醣类消耗试验， 以 1000微克 /毫升的葡萄 糖处理肝细胞（人类肝癌细胞（Human hepatocellular liver carcinoma cell line ) HepG2， 购自生物资源保存及研究中心 （ Bioresource Collection and Research Center, BCRC); BCRC号码： 60025)， 再 分别以 100纳莫耳浓度的胰岛素、 50微克 /毫升管花肉苁蓉萃取物 (CTE)、 以及依照各活性成分在萃取物中的含量， 以对应量的活 性成分（即， 12.5微克 /毫升的松果菊苷、 1.25微克 /毫升的类叶升麻 苷、 以及 2.25微克 /毫升的异类叶升麻苷） 处理细胞， 经 1小时后， 测定肝细胞的葡萄糖消耗程度。 结果显示于图 10。 其中， 图中数值 为平均值±标准差 （n=3); ***P <0.001 (相较于控制组）。

如图 10所示， 相较于控制组， 50微克 /毫升管花肉苁蓉萃取物、 12.5微克 /毫升的松果菊苷、以及 2.25微克 /毫升的异类叶升麻苷均可 有效提高肝细胞的葡萄糖消耗量，而 1.25微克 /毫升的类叶升麻苷处 理的功效则不明显， 推测可能是因比例过低所致。

(2) 浓度依存试验

为进一歩了解管花肉苁蓉萃取物中的活性成分 是否具有加速 肝细胞汲取血糖的效果， 本实验分别以不同浓度的管花肉苁蓉萃取 物、 松果菊苷、 类叶升麻苷、 以及异类叶升麻苷进行如上述的醣类 消耗试验。 结果显示于图 11。 其中， 图中数值为平均值 ±标准差 ( 11=3 ) ; * *P < 0.01； * * *P <0.001 compared to control ; #P < 0.05

(相较于胰岛素处理组）。

如图 11所示， 相较于控制组， 5微克 /毫升、 及 50微克 /毫升的管 花肉苁蓉萃取物 （CTE )、 松果菊苷、 类叶升麻苷、 以及异类叶升 麻苷皆可有效提高肝细胞的葡萄糖消耗量， 且实验结果呈现浓度依 存性 （dose dependence ) ; 其中类叶升麻苷与先前的研究结果类似， 具有提高肝细胞的葡萄糖消耗量的功效。 同时， 发现松果菊苷及异 类叶升麻苷在极低浓度 （5微克 /毫升） 对于提高肝细胞的葡萄糖消 耗量有显著功效。 此实验结果显示， 管花肉苁蓉萃取物可提高肝细 胞的葡萄糖消耗量， 具有降低血糖的功效， 主要是所含的活性成分 松果菊苷及异类叶升麻苷的贡献， 而非由类叶升麻苷所致。

以上实验结果显示， 管花肉苁蓉萃取物及其所含的松果菊苷及 异类叶升麻苷， 具可降低糖尿病大鼠的血糖的作用， 可用于调节血 糖， 且尤其可治疗第一型及第二型糖尿病。