Hintergrund der Erfindung Viren aus der Familie der Herpesviridae sind weltweit verbreitete Pathogene, für welche die meisten Vertebraten anfällig sind. Die wichtigsten humanen Herpesviren sind Herpes Simplex Virus 1 und 2 (HSV-1, HSV-2), Varicella Zoster Virus (VZV) und Humaner Cytomegalovirus (HCMV). HSV ruft in immunokompetenten Individuen Läsionen der Haut oder Schleimhäute hervor, die als Rezidive mit unterschiedlicher Häufigkeit immer wiederkehren können. Man unterscheidet verschiedene Herpesviren nach der Lokalität der Läsionen, z. B. Herpes labialis oder Herpes genitalis etc.

Die bisherigen Behandlungsmethoden für solche Viren zielen hauptsächlich auf eine Hemmung der viralen Replikation ab, z. B. mit Acyclovir, als bekannter Inhibitor der viralen DNA-Polymerase. Allerdings kann das Virus mit der Zeit resistent gegen Acyclovir werden, dies trifft insbesondere für Herpes Simplex zu. Zudem verschaffen herkömmliche Mittel zwar Linderung bei akuten Läsionen, können jedoch Rezidive nicht wirksam verhindern.

Ende der 60er und anfangs der 70er Jahre fand man im Rahmen der Transplantationsforschung, daß mit xenogenen heterogenen Nukleinsäuren vorbehandeltes Gewebe oder schwache Antigene in verschiedenen immunologischen Untersuchungsmethoden wesentlich erhöhte Antititer

aufwiesen. Diese Ergebnisse wurden mit einer Anzahl verschiedener Antigene in in vitro und in vivo Untersuchungen weiter bestätigt. Es gab jedoch keine Hinweise, daß Nukleinsäuren und insbesondere Oligo-oder/und Polyribonukleotide xenogenen Ursprungs zur Bekämpfung von viralen Infektionen geeignet sein könnten.

Vor allem in den USA wurden zur gleichen Zeit Versuche mit definierten synthetischen Poly-und Oligonukleotiden, besonders Ribonukleotiden angestellt, die aber wegen der hohen Toxizität in vivo nicht weiter verfolgt wurden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung von Herpesviridae-Infektionen, sowie von malignen Hauterkrankungen geeignet ist. Weiterhin war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Arzneimittel bereitzustellen, welches die Rezidivrate bei Läsionen der Haut senkt, insbesondere bei viral verursachten Läsionen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Arzneimittel, welches als Wirkstoff xenogene Oligo-oder/und Polyribonukleotide umfaßt.

Xenogen bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß die Ribonukleinsäure aus einem anderen als dem damit zu behandelnden Organismus stammt, also solche Oligo-oder/und Polyribonukleotide, welche nicht aus demselben Organismus stammen, dem das Arzneimittel verabreicht werden soll. Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten xenogenen Oligo-oder/und Polyribonukleotiden um solche aus Tiergeweben (z. B. Rindergewebe, fötales Kälbergewebe), Pflanzen und Einzellern, vorzugsweise aus Hefezellen (insbesondere Saccharomyces cerevisiae). Es werden bevorzugt Oligo-oder/und Polyribonukleotide aus Organismen verwendet, die entwicklungsgeschichtlich dem zu behandelnden Organismus möglichst fernstehen. Bei Arzneimitteln für den

Menschen wird somit vorzugsweise RNA aus Tiergeweben oder besonders bevorzugt aus Pflanzen oder Einzellern, wie etwa Hefe, verwendet.

Der Erfindung liegen Untersuchungen mit RNA-Präparationen bei Herpes- Infektionen zugrunde. Dabei stellte sich heraus, daß das Auftragen von isolierter xenogener RNA auf Hautläsionen von Patienten mit Herpes Simplex labialis, Herpes Simplex cruris disseminata und Herpes Simplex genitalis, abgesehen von der immediaten Wirkung auf die Läsionen selbst, darüberhinaus überraschenderweise auch die Rezidivrate bei Patienten, die während des Jahres unter häufig wiederkehrenden Rezidiven litten, signifikant senkte. Dann wurde gefunden, daß die genannte RNA auch bei Hauttumoren z. B. Basaliomen ähnlich wirksam ist.

Die erfindungsgemäß verwendeten Oligo-oder/und Polyribonukleotide sind untoxisch und allein nicht antigen.

Es können Präparationen der Gesamt-RNA und deren Salze und Verbindungen wirksam eingesetzt werden. Besonders ist tRNA bevorzugt.

Als Art der Gewinnung von erfindungsgemäß verwendbaren RNAs ist insbesondere die Phenolextraktion bevorzugt, speziell die hierin als Methode I und 11 bezeichneten Verfahren.

Die wirksame Menge der xenogenen Oligo-oder/und Polyribonukleotide per Dosierung ist bei jedem Patienten von verschiedenen Faktoren abhängig, z. B Lokalisation der Läsionen oder Größe und Ausdehnung der betroffenen Flanche, sowie der Art der Verabreichung. Die Dosierbreite liegt ab 0,1 mg aufwärts pro Dosiseinheit. Die untere Mengengrenze pro Dosiseinheit liegt bevorzugt bei mindestens 0,5 mg, stärker bevorzugt bei mindestens 2 mg, noch stärker bevorzugt bei mindestens 5 mg ; und die obere Grenze liegt bevorzugt bei 5 mg, stärker bevorzugt bei 20 mg, noch stärker bevorzugt bei 10 mg.

Bevorzugt enthält das Arzneimittel der Erfindung die xenogenen Oligo- oder/und Polyribonukleotide in wesentlich wasserfreier Form, beispielsweise als Flocken, Pulver, Granulat, Salbe oder dgl. Die Oligo-oder/und Polyribonukleotide können jedoch auch als Lösung in Wasser oder einem anderen Lösungsmittel vorliegen.

Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Arzneimittel physiologisch annehmbare Träger-, Hilfs-, Verdünnungs-oder/und Zusatzstoffe oder/und Adjuvantien umfassen.

Die galenischen Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen xenogenen Oligo-oder/und Polyribonukleotide enthalten, können für eine orale Anwendung als Tabletten, Lutsch-und Kautabletten, flüssige Suspensionen, in Pulverform oder Granulaten, Emulsionen, in harten oder weichen Kapseln, in Syrup oder Elixier, als Retardform oder als osmotische Kapsel für eine langsame Freigabe konfektioniert sein.

Eine andere galenische Form mit besonders vorteilhafter Wirkung sind wasserfreie Salben aus PEG-Mischungen.

Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise topisch, aber auch oral, parenteral, rektal oder durch Inhalation. Der Ausdruck parenteral bezieht sich hier auf subkutane, intravenöse, intramuskuläre und intrasternale Injektionen oder Infusionstechniken.

Für die topische Anwendung wird die angewendete Gesamt-RNA oder tRNA bevorzugt als Pulver oder PEG-Salbe (also in wasserfreier Form) auf die betroffene Stelle aufgebracht, bei Pulver gegebenenfalls kann die Haut leicht angefeuchtet werden. Diese läßt man bevorzugt an der Luft offen austrocknen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Arzneimittelformulierung zur Behandlung von durch Herpesviridae verursachten Krankheiten, das auch die Häufigkeit von Rezidiven bei diesen Krankheiten vermindert. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von durch Herpes Simplex Viren und Herpes Zoster (VZV) hervorgerufenen Läsionen, z. B. bei Läsionen und Rezidiven, die von Herpes Simplex labialis (Lippenbläschen) und genitalis verursacht werden.

Ebenfalls sind xenogene Oligo-oder/und Polyribonukleotide und das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von Hautmalignitäten, wie etwa Basaliomen, geeignet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der genannten xenogenen Oligo-oder/und Polyribonukleotide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herpesviridae-Erkrankungen und Hauttumoren.

Vorzugsweise wird jeweils bei einer Läsion oder einer Rezidive eine Behandlung so früh wie möglich durchgeführt, wobei eine einmalige Anwendung bereits die Häufigkeit des Wiederauftretens vermindert.

Zusätzlich zur Therapierung von Menschen mit den xenogenen Oligo- oder/und Polyribonukleotide dieser Erfindung können auch Warmblütler wie z. B. Pferde, Rinder, Schafe etc. so behandelt werden.

Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele und Versuchsergebnisse erläutert.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung der erfindungsgemäß verwendbaren Oligo-oder/und Polyribonukleotide Die einschlägige Literatur beschreibt zahlreiche Methoden zur Gewinnung von Nucleinsäuren, Nukleotiden und Nukleosiden, die jedem einschlägig Erfahrenen bekanntsind. Zwei Methoden mitgeringen Modifikationen, beide auf Phenolisierung beruhend, kommen hier vorzugsweise zur Anwendung, Methode I zur Gewinnung der Gesamt-RNA (Georgiev, G. P. und Mantieva, V. L., Biochim. Biophys. Acta 61,153 (1962)) und Methode II zur Gewinnung der tRNA (Bauer, S. et al., Biotechnology and Bioengineering 15,1081 (1 973)). Beide Methoden dienen der Extraktion größerer Mengen.

Methode I Eine 1 5 % Suspension von Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde in Puffer (A) [0,001 M EDTA, 0,01 M Tris-HCI Puffer, pH 5-6,25 % Sucrose, 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,3% Na-Desoxycholat] wurde in einem Waring Blendor bei 10 °C mit 3000 UPM 3 Minuten lang homogenisiert.

Das Homogenat wurde mit dem gleichen Volumen der Lösung (B) [80% rekristallisiertes Phenol in Puffer (A), 0,1 % 8-Hydroxychinolin, 1,2 % Diethylpyrocarbonat] versetzt und dann 30 Minuten bei 60 °C langsam gerührt. Aile Pufferlösungen wurden mit deionisiertem Wasser hergestellt, das vorher mit Bentonit aufgeschüttelt worden war. Danach wurde das phenolisierte Homogenat bei Raumtemperatur, ca. 20 °C, 15 Minuten mit 10.000 g zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde abgezogen, die Phenol- und die Zwischenphase wurden verworfen. Die wäßrige Phase wurde mit dem gleichen Volumen eines 1 : 1 Gemisches der Lösung (B) und Chloroform- Isoamylalkohol (96 : 4) versetzt und wie oben beschrieben extrahiert. Die

wäßrige Phase wurde 3 Mal mit einem halben Volumen Diethylether ausgeschuttelt, um das retliche Phenol zu entfernen. Die Lösung wurde auf 2% Natriumacetat gebracht und die RNA mit 2,5 Volumina absoluten Ethanols ausgefällt.

Die gefällte RNA wurde bei 0°C und 5000 UPM abzentrifugiert und in einem eiskalten 0,01 M Tris-HCI Puffer, pH 7,0, und 0,001 M MgCI2 aufgenommen. Zum Abbau eventueller DNA wurde die Lösung mit elektrophoretisch reiner pankreatischer DNase (4 Ng/ml) versetzt und während 3 Stunden bei 22°C inkubiert. Dann wurden Proteinreste, die DNase und die RNasen mit Pronase (1 0, ug/ml) während 3 Stunden bei 37°C verdaut. Während dieser Zeit wurde auch die Pronase durch Selbstverdauung zerstört. Die RNA-Lösung wurde wie oben beschrieben mit der Lösung (B) 20 Minuten bei 60°C unter sanftem Rühren extrahiert, die Phasen durch Zentrifugation getrennt, die wäßrige Phase abgezogen und mit Diethylether ausgeschüttelt. Nach Zusatz von Natriumacetat (Endkonzentration 2%) wurde die RNA mit 2,5 Volumina Ethanol gefallt und abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in kaltem 2 %-igen Natriumacetat aufgenommen, mit 2,5 Volumina Ethylalkohol gefällt und über Nacht bei -20°C im Alkoholgemisch stehen gelassen. Dann wurde das Präzipitat abzentrifugiert, zweimal mit 75 %-igem, zweimal mit absolutem Ethanol und zweimal mit Diethylether gewaschen. Nach Trocknen im Wärmeschrank wurde eine lockere, trockene RNA erhalten, die in einem dunklen Glasgefäß bei Raumtemperatur gelagert wurde.

Methode II Diese Methode dient auch zur Extraktion großer Hefemengen (Kilogrammengen).

Ein gegebenes Gewicht Hefe wurde in der vierfachen Menge Puffer (A) (s. oben Methode I) im Kälteraum homogenisiert. Dem Homogenat wurden

40% Vol./Vol. der Phenollösung (B) und 5 % Gew./Vol. Eiswürfel aus deionisiertem Wasser zugesetzt und 30 Minuten lang gerührt. Der Überstand wurde abgesaugt und noch zweimal, wie unter Methode I beschrieben, phenolisiert. Die wäßrigen Überstände wurden in einem Gefäß gesammelt, in dem sich eine DEAE-Cellulose-Aufschwemmung (ca. 10 % Gew./Vol., Whatman DE-22), entsprechend dem halben Volumen der gesammelten Überstände, befand. Die DEAE Aufschwemmung wurde 30 Minuten durch Rühren in Suspension gehalten. Dann ließ man die DEAE während einer Stunde sedimentieren. Der Überstand wurde abgesaugt. Inzwischen wurden die Zwischen-und die Phenolphase noch zweimal mit der aliquoten Menge der Lösung (C) (83 % deionisiertes Wasser, 15 % Gew./Vol. Eiswürfel, 2 % Mg-acetat-Konzentrat [0,5M Mg-acetat in 0,25 Mercaptoethanol] 30 Minuten lang gerührt und dann 70-80 Minuten separieren gelassen. Die wäßrigen Überstände wurden in das Gefäß mit der DEAE übertragen, wieder gerührt und sedimentieren gelassen. Der Überstand wurde abgesaugt und die DEAE, wie oben, erst mit Lösung C zweimal, dann nochmals mit Lösung (D) (2 Volumen Mg-azetat Konzentrat, 2 Volumen NaCI-Konzentrat [3,75 M NaCl in Wasser], 0,2 Volumen Tris-HCI Konzentrat [2,5 M Tris-HCI, pH 7,5 in Wasser, 96 Volumen Wasser]) gewaschen.

Die DEAE-Cellulose wurde dann in eine Säule gepackt, die unten abgeschlossen war. Alle weiteren Schritte wurden im Kaltraum bei 4°C ausgeführt. Die Saute wurde mit der 12-fachen Menge des Säuleninhalts der Lösung (D), Flußgeschwindigkeit 1,4 1/h, (nur durch Schwerkraft) gewaschen. Dann wurde die tRNA mit Lösung E [2 Volumen Mg-acetat- Konzentrat, 0,2 Volumen Tris-HCI-Konzentrat, 14 Volumen Na-CI- Konzentrat, und 84 Volumen Wasser, Endkonzentration von NaCI 0,525 M, mit einem Fluß von 3 I/h eluiert. Die Fraktionen, die mehr als 35 A260nm Einheiten/ml enthielten, wurden vereint und mit 1,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Der weitere Vorgang entsprach Methode I.

Alternativ kann das letzte Präzipitat in Wasser aufgenommen und lyophilisiert werden.

Eine Variante dieser Methode ist die übliche Phenolisierung des Ausgangsmaterials : Aus der Oberphase wird die Roh-tRNA mit Isopropanol gefällt. Der Niederschlag wird nach der Zentrifugation mit dem Natriumacetatpuffer extrahiert und an der DEAE-Zellulose <BR> <BR> <BR> <BR> chromatographiert. Die Elution erfolgt mit dem Natriumacetat/Natriumchlorid-Gradienten, wie sie den in der Materie bewanderten Biochemikern bekannt ist. Die geeigneten Fraktionen, s. oben, werden mittels Quotientenmessung bestimmt und vereinigt. Die tRNA wird mit Ethanol gefällt, der Niederschlag wie oben aufgenommen und vorzugsweise lyophilisiert.

Die folgenden Tests wurden zur Untersuchung der Reinheit der Gesamt-RNA und der tRNA und zu deren Charakterisierungen angewendet : Eiweiß wurde nach Lowry, O. H. et al. (J. Biol. Chem. 193,265 (1951)) und durch A260/A2802, DNA nach Dische (Mikrochemie 8,4 (1930), Gesamt- RNA nach Mejbaum (Physiol. Chem. 258,117 (1939)), quantitative Bestimmung der tRNA und des Aminosäureneinbaus nach Sprinzl und Sternbach (Methods in Enzymology 59,182 (1979)), Toxizität nach M.

Nöldner (persönliche Mitteilung), Pyrogenfreiheit in vitro nach DAB 1997 (LAL-Test) und in vivo nach Ph. Eur./DAB 1997 bestimmt.

Ergebnisse der Untersuchungen : (Eigenschaften der Gesamt-RNA und der tRNA, Durchschnittswerte aus zehn Testungen) Absorption A260/A280 1, 94-2,0

C, H, N Analyse C 32,67 32,42 H 5,22 5,20 N 2,29 2,00 mit korrespondierenden Werten verschiedener Gesamt-und tRNAs.

UV und IR Spektren Die UV-und IR-Spektren variieren, sie sind fast gleich, aber nicht identisch, entsprechend biologischen Substanzen.

Molekularqewicht Gesamt-und tRNA aus Hefe-22000-27000 Dalton Durchschnittswert, variierend bei veschiedenen Präparationen ; Protein DNA (Gesamtinhalt) 2,3 % neg. Gesamt-RNA Saccharomyces cerevisiae 1,9 % neg. tRNA Saccharomyces cerevisiae 0,9 % neg. Gesamt-RNA bovinen Ursprungs Durchschnittliche, aligemein übliche Qualität. Verbessete Reinheit brachte bei unverhältnismäßigem höheren Aufwand keine signifikant verbesserte therapeutische Wirkung.

Aminosäureneinbau bei tRNA, Mittelwert von 10 Untersuchungen Lysin 69-85 pMol/A260 Einheit Phe 41-55 Ser 39-50 Val 77-90 Diese Mittelwerte ändern sich bei Hefen verschiedener Lots im angegebenen Rahmen.

Toxizität Prüfung auf akute Toxizität an der Maus : Tiere : NMRI Mäuse, männlich, Fa. Janvier, Frankreich Applikation : intravenös in eine Schwanzvene Beobachtungsdauer : 24 Stunden Stichprobenumfang : n = 10 in der höchsten Konzentration Testsubstanz : a. bovine Gesamt RNA b. tRNA aus Biehefe (Saccharomyces cerevisiae) Lösungsmittel : 0,9% NaCI in Wasser p. i.

Ergebnis : Bis zu einer maximalen Dosierung von 1 g/kg/1 Oml i. v. zeigten die Versuchstiere innerhalb des Beobachtungszeitraums von 24 Stunden keinerlei Auffälligkeiten.

Pyroqenfreiheit A. Der Pyrogengehalt der Gesamt-RNA sowie der t-RNA, beide wie bisher beschrieben, wurde mit dem In-vitro-Test auf Endotoxine nach DAB 1997 (LAL TEST) und an Kaninchen nach Ph. Eur./DAB 1997 bestimmt.

1. Gesamt-RNA Endotoxin Standard EC 5 Amoebozytenlysat -Deklarierte Empfindlichkeit : 0,06 EU/ml -Gefundene Empfindlichkeit : 0,06 EU/ml Prüflösung : 100mg RNA gelöst in 20ml Wasser-LAL (0,5%) Ergebnis : Der Endotoxingehalt der Prüflösung 0,5% 1 : 5 mit Wasser-LAL verdünnt : < 0,03 EU/ml.

2. tRNA Endotoxin Standard EC 5 Amoebozytenlysat -Deklarierte Empfindlichkeit : 0,06 EU/ml -Gefundene Empfindlichkeit : 0,06 EU/ml Prüflösung : 100mg RNA gelöst in 20ml Wasser-LAL (0,5%) Ergebnis : Der Endotoxingehalt der Prüflösung 0,5% 1 : 10 mit Wasser-LAL verdünnt : < 0,03 EU/ml.

B. In Vivo Prüfung auf Pyrogenfreiheit nach Ph. Eur./DAB 1997 1. Gesamt-RNA Prüflösung 1 % der Testsubstanz in pyrogenfreiem Wasser p. i.

Dosis : 1,0 ml/Tier Tiere : 3 Kaninchen, entsprechend DAB 1997 Ergebnis : Summe der Temperaturdifferenzen von 3 Kaninchen war 1,05 °C, Pyrogene sind somit nicht nachweisbar.

2. tRNA Prüflösung 1 % der Testsubstanz in pyrogenfreiem Wasser p. i.

Dosis : 1,0 ml/Tier Tiere : 2 mal 6 Kaninchen, entsprechend DAB 1997 Ergebnis : a. Summe der Temperaturdifferenzen von 6 Kaninchen : 5,40 °C b. Summe der Temperaturdifferenzen von 6 Kaninchen : 4,10 °C, Pyrogene nachweisbar.

Beispiel 2 Nachweise der Wirksamkeit der Substanzen dieser Erfindung 70 Patienten, davon 40 mit Herpes Simplex I (H. labialis und 30 Patienten mit Herpes Simplex II (H. genitalis), alle mit häufigen Rezidiven wurden mit Gesamt-RNA behandelt. Die RNA entstammte aus Extraktionen von bovinem fötalem Gewebe, ausgenommen Leber. Die pulverförmige RNA wurde auf die leicht angefeuchteten Läsionen, 5 bis 10 mg je nach Größe der Läsion, aufgebracht und trocknen gelassen. Alle Patienten wurden über 1 Jahr beobachtet.

5 Patienten waren in Bezug auf Rezidiven Non-Responder, 7 Patienten konnten wegen mangelnder Compliance nicht ausgewertet werden. Der Rest der Patienten, die sonst jährlich mehrere Rezidiven hatten, wiesen einen signifikanten Rückgang der Rezidiven auf. Die Auswertung erfoigte mittels des non-parametrischen Mann-Whitney U Tests. Die Signifikanz der Ergebnisse war p < 0,001. (SPSS, Npar, Mann-Whitney U-Test) In einer Doppelblindstudie mit einer Beobachtungszeit von 1 Jahr wurden zwei Gruppen von je 100 Patienten mit Herpes Simplex labialis und Herpes Simplex genitalis mit mehr als 4 Rezidiven pro Jahr mit boviner Gesamt-RNA wie oben oder mit tRNA aus Bierhefe behandelt. Die Auswertung erfolgte nach einem Jahr mit dem Programm SPSS, Npar TEST : Mann-Whitney und x2-Test.

Im Vergleich mit den Placebopatienten war war der Rückgang der Rezidiven hochsignifikant : bei beiden war p < 0,001. Der Unterschied zwischen den beiden RNA war nicht groß.

Diese Ergebnisse rechtfertigen den Einsatz der RNA bei Patienten, besonders da keinerlei Nebenwirkungen oder toxische Erscheinungen über mehrere Jahre zu beobachten waren.

Bei Anwendung der beschriebenen Substanzen bei facialem Herpes Simplex bei Patienten, die auch ein faciales Basaliom hatten, wurde festgestellt, daß dieses zurückging. Daher umfaßt die Indikation des erfindungsgemäßen Mittels auch Malignitäten.