La présente invention concerne un nouveau milieu de culture des mycobactérîes, en particulier des mycobactérîes du complexe Mycobacterium tuberculosis, permettant de réduire de façon significative les délais d'isolement par culture et donc le délai de diagnostic des mycobactérioses, en particulier de ia tuberculose.

Les mycobactérîes sont des bactéries classées dans le phylum des Actinobacteria par le séquençage du gène 16S ARNr et par les analyses dites "multilocus phylogeny" [Mîgnard 5, Flandrois JP. A seven-gene, multilocus, genus-wide approach to the phylogeny of mycobacteria using supertrees. înt J Syst Evol Microbiol. 2008;58:1432-41] et caractérisées par la présence d'acides mycoiiques dans leur paroi, ce qui leur confère une affinité tinctoriale particulière mise en évidence notamment par la coloration de ZiehI-Neelsen, et par un chromosome à haut G + C % > 60 % [Pfyffer GE. Mycobacterium : gênerai characteristics, laboratory détection, in staning procédures. In : Murray Pr, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. Manual of C!inical Microbiology 9ème Eds. Amercian Society for Microbiology, Washington DC; 2007, pp. 543-572]. Le genre bactérien Mycobacterium comporte plus de cent espèces, dont des espèces environnementales isolées d'environnements inertes (sol, eau), des espèces associées aux animaux et une espèce essentiellement associée à l'homme, Mycobacterium leprae, agent de la lèpre [Cole S et ai. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409:1007-11]. Certaines espèces environnementales sont responsables d'infections opportunistes chez l'homme (les espèces du complexe Mycobacterium avium et du complexe Mycobacterium abscessus par exemple) et certaines espèces sont responsables de zoonoses, en particulier certaines espèces de complexe Mycobacterium tuberculosis, responsables de la tuberculose [Ghodbane , Drancourt M. Non-human sources of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2013 Nov;93(6):589-95],

Le diagnostic des mycobactérioses repose sur l'isolement et la culture de l'une des espèces du genre Mycobacterium à partir d'un prélèvement clinique réalisé chez l'homme ou chez l'animal. De ce point de vue, le genre Mycobacterium comporte une espèce non- cultivable en milieu axénique {Mycobacterium leprae), des espèces de croissance rapide {Mycobacterium fortultum, Mycobacterium abscessus) donnant des colonies visibles en moins de sept jours de culture et des espèces à croissance lente donnant des colonies visibles en plus de sept jours de culture, soit en pratique de routine, entre 3 et 8 semaines de culture, notamment avec des milieux Middlebrook. En médecine humaine, les espèces du complexe Mycobacterium avium sont détectables après 10-20 jours de culture et les espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis requièrent 10-100 organismes viables par ml de prélèvement et 6-8 semaines de culture pour obtenir 100% de prélèvements positifs [Colebunders R, Bastian I. A review of the dîagnosis and treatment of smear-negative pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2000;4:97-107]. Etant donné l'importance numérique et la gravité des cas de tuberculose humaine, c'est sur le diagnostic de la tuberculose que les améliorations des techniques de laboratoire sont particulièrement sensibles. En effet, la tuberculose est une maladie infectieuse de l'homme et des animaux due à l'une des neuf espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovîs (et les souches BCG qui en sont dérivées), Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium mlcrotl, Mycobacterium pinnipedti [Dye C. et al. Prospects for worlw ^' ide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy. Lancet 1998; 352:1886-91; Bos Kl, Harkins KM, Herbig A, Coscolla M, Weber N, Comas I, Forrest SA, Bryant M, Harris SR, Schuenemann Vj, Campbell Ύ2, Majander K, Wilbur AK, Guichon RA, Wolfe Steadman DL, Cook DC, Ntemann S, Behr MA, Zumarraga M, Basttda R, Huson D, Nieselt K, Young D, Parkhill J, Buikstra JE, Gagneux S, Stone AC, Krause X Pre-Columbian mycobacteriai génomes reveal seals as a source of New World human tuberculosis. Nature 201 ; 514: 494-7] , Mycobacterium mungl [Alexander KA, Laver PN, Michel AL, Williams M, van Helden PD, Warren RM, Gey van Pittius NC. Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M. mungi. Emerg Infect Dis. 2Q10;16;1296- 9] et Mycobacterium suricattae [Parsons SD, Drewe 3A, Gey van Pittius NC, Warren RM, van Helden PD. Novel cause of tuberculosis in meerkats, South Africa. Emerg Infect Dis. 2013;19:2004-7]. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé que la tuberculose a été responsable de 9 millions de nouveaux cas et de 1,5 millions de décès en 2013 [World Health Organization. 2014. Global tuberculosis report 2014: Geneva : World Health Organization]. Ces chiffres soulignent (Importance qu'il y a à optimiser le diagnostic microbiologique de la tuberculose afin d'améliorer la prise en charge médicale des patients et de leur entourage.

L'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis sont réalisées à partir de prélèvements cliniques obtenus chez un patient présentant des signes et des symptômes évocateurs de la tuberculose. La forme clinique la plus fréquente, qui est aussi la seule forme clinique contagieuse, est la tuberculose pulmonaire qui est diagnostiquée par l'isolement et la culture d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis à partir d'un prélèvement respiratoire tel que l'expectoration, l'aspiration bronchique, le liquide de lavage broncho-alvéolaire obtenu sur bronchoscopie, voire la biopsie pulmonaire. Chez les patients ne produisant pas d'expectoration, les selles peuvent être utilisées comme une alternative pour l'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en cas de tuberculose pulmonaire [El Khéchine A, Henry M, Raoult D, Drancourt M. Détection of Mycobacterium tuberculosis complex organisms in the stools of patients with putmonary tuberculosis. Microbiology 2009;155:2384-9], Il existe d'autres formes cliniques de tuberculose, en particulier la tuberculose ganglionnaire, mais également les tuberculoses osseuses (Mal de Pott) ainsi que les tuberculoses digestives. En fonction de la forme clinique, différents prélèvements cliniques peuvent être adressés au laboratoire pour isoler et cultiver les mycobactéries du complexe Myœbacterium tuberculosis ^' et diagnostiquer les formes extrapulmonaires.

Pour l'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Myœbacterium tuberculosis, on dispose de milieux solides, de milieux liquides, et de milieux biphasiques comportant une phase liquide et une phase solide, Les milieux solides sont fabriqués à base de gélose ou d'agar. Les milieux contenant de l'œuf entier sont l'utilisation très courante et le milieu le plus utilisé est le milieu de Lôwenstein Jensen. Ce milieu, comme les autres milieux contenant de l'œuf, contient du vert malachite qui participe à inhiber la croissance des microorganîsmes contaminants. Plusieurs formulations contenant des concentrations variables de vert malachite ont été proposées avec comme résultat constant qu'une diminution de la concentration de vert malachite augmente îe ratio de contamination du milieu et une augmentation de la concentration de vert malachite tend à diminuer l'isolement et la culture des mycobactéries du groupe tuberculeux. Une deuxième catégorie de milieux solides sont les milieux à l'agar en particulier le milieu Middlebrook 7H10 et le milieu 7H11 (milieu 7H10 plus 0,1% de caséine hydrolysée). Le milieu de Middlebrook contient 2% de gtycérol, qui facilite la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium avium. Les milieux liquides correspondent essentiellement au milieu Middlebrook 7H9.

Cependant, l'isolement des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis est lent puisque la totalité des souches des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis est isolée dans un délai compris entre 6 et 8 semaines. Tout gain de temps sur ce délai représente donc une amélioration significative du diagnostic de laboratoire de la tuberculose et les autres infections à mycobactérie.

Dans le brevet EP 2 364 357, on a décrit une formulation de milieux de culture permettant l'isolement plus rapide des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis et des autres mycobactéries, notamment permettant une détection et identification détectable visuellement à l'oeil nu en moins de 15 jours, votre même en 10 jours, à partir d'échantillons de prélèvement cliniques. Cette formulation de EP 2 364 357 permet l'Isolement des mycobactéries avec la capacité de détecter visuellement à l'œil nu les mycobactéries en croissance, aussi bien en milieu liquide adapté aux automates de détection qu'en milieu solide pour une détection manuelle, (notamment les compositions des exemples 1B (milieu liquide) et 2B (milieu solide) cette dernière étant ci-après dénommée MOD4). Ces formulations du fait de la présence de lécithine, sont, de surcroît, compatibles avec une décontamination à la chforhexidine dans le cas de prélèvements cliniques pouvant comprendre des bactéries de la flore commensale risquant d'inhiber la croissance des mycobactéries [Ghodbane , Raoult D, Drancourt M. Dramatic réduction of culture time of Mycobacterium tuberculosis. Sci Rep. 20Ί4;4:4236].

Le délai diagnostique basé sur la culture dépend non seulement des qualités propres du milieu de culture -ici la présence de sérum d'agneau dans le milieu de culture selon l'invention, mais également, de la capacité à détecter les mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en croissance. Plus particulièrement lors de l'utilisation des milieux solides, il s'agit de la capacité à détecter le plus rapidement possible l'apparition des colonies de Mycobacterium tuberculosis. En routine, les colonies sont détectées par l'observation macroscopique du milieu de culture à l'oeil nu correspondant à la détection de colonies de Mycobacterium tuberculosis de quelques millimètres ce qui requiert la présence d'un contraste entre la couleur des colonies et celle du milieu de culture. Plus précisément, dans EP 2 364 357, les milieux de culture de mycobactéries, comprennent des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, des antibiotiques sans activité à l'égard des mycobactéries, caractérisés en ce qu'ils comprennent les composants additionnels suivants :

- de la lécithine, et - du sang défibriné, et

- du sérum de veau f tal décomplémenté.

Cependant, la mise en œuvre de sang, rend ces formulations difficiles à manipuler lors de sa fabrication industrielle et limite le délai de péremption dudit milieu car le sang doit être mis en œuvre dans un délai inférieur à 24h et conservé à 4°C pour rester frais. En outre, le sang doit être prélevé en présence d'anticoagulants pour éviter sa coagulation ces anticoagulants pouvant avoir un effet négatif sur la croissance des mycobactéries.

C'est pourquoi, il existe un intérêt à mettre au point un milieu conservant les caractéristiques et performances des milieux décrit ci-dessus, mais ne comportant pas de sang selon le but de la présente invention. Les inventeurs ont découvert qu'en remplaçant le sérum de veau fœtal par du sérum d'agneau combiné à un colorant synthétique sans activité contre les mycobactéries, on obtient, en l'absence de sang, des résultats de croissance détectable à l'œil nu, au moins identique voire amélioré permettant l'isolement rapide des mycobactéries du complexe Myœbacterium tuberculosis et des autres mycobactéries, notamment permettant une détection et identification détectable visuellement à l'œil nu en moins de 15 jours, voire même en 10 jours, à partir d'échantillons de prélèvement cliniques. Cette combinaison sérum d'agneau combiné à un colorant synthétique compense les propriétés du sang en termes d'élément nutritif pour la croissance des mycobactéries et d'agent contrastant pour la capacité de détection visuelle à l'œil nu. Cet agent contrastant permet de repérer les colonies à l'œil nu pour ensuite les isoler et analyser le cas échéant par coloration de Ziehl-Neelsen ou de inyoun ou par spectrométrie de masse de type maldi tof comme décrit ci-après. Plus précisément, la présente invention fournit un milieu de culture de mycobactéries apte à permettre la culture de mycobactéries à partir d'un échantillon de prélèvement clinique, comprenant de la lécithine, des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, au moins un composé antibiotique sans activité à l'égard des mycobactéries, et au moins un colorant sans activité antimycobactérienne, quil ne comprend pas de sang et comprend en outre au moins les composants additionnels suivants :

- du sérum d'agneau, de préférence décomplémenté, et

- au moins un colorant rouge sans activité contre les mycobactéries, permettant de contraster la couleur du milieu de culture par rapport aux colonies de mycobactéries.

Le sérum d'agneau contient moins dlmmunoglobuline (d'anticorps et de facteurs inflammatoires) qu'un sérum de mouton et est plus performant en termes de culture de mycobactéries dans le cadre d'un procédé selon la présente invention à partir d'un prélèvement clinique. Il y a lieu de noter que la mise en œuvre d'un milieu de culture pour l'isolement et la culture d'une souche de mycobactéries à partir d'un prélèvement clinique requière des propriétés plus exigeantes que les propriétés requises d'un milieu de culture pour des souches déjà isolées et établies en culture notamment dans le cadre des tests de susceptibilité aux antibiotiques pour antibiogramme, dans la mesure où la population bactérienne hétérogène présente dans un prélèvement clinique implique un processus de sélection de souches qui doivent s'adapter au milieu de culture.

De préférence, le sérum d'agneau est compris dans une proportion en volume de 2,5 à 25%, de préférence d'au moins 15%.

Le sérum d'agneau est de préférence décomplémenté, c'est-à-dire qu'on iui a retiré, de façon connue, l'ensemble des protéines appelées "complément sérique" par chauffage, notamment à 56°C pendant une heure, ce complément sérique pouvant avoir une activité antibactérienne.

Dans le milieu selon l'invention, en l'absence d'agent contrastant on différentie très difficilement la couleur crème des colonies par rapport à la couleur jaune clair du milieu de par la présence de lécithine et autres. En l'absence d'agent contrastant, il est nécessaire d'utiliser un instrument de type microscope inversé à faible grossissement permettant d'observer des colonies d'une taille d'environ un millimètre. Avantageusement encore, la détection des colonies peut se faire par autofiuorescence des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis éclairées sous une lumière ultraviolette et d'une longueur appropriée, permet de détecter des colonies d'une taille comprise entre 0,25 et 1 mm.

De préférence, le colorant est un colorant de couleur rouge à une concentration de 10 à 100 mg/L.

De préférence, le colorant de couleur rouge est choisi parmi l'azorubine et le rouge de Ponceau 4R de préférence encore à une concentration de 30 à 50 mg/L. Comme montré plus loin dans les exemples, ces colorants n'affectent pas la croissance des mycobactéries et présentent une grande stabilité dans le temps, notamment d'au moins 5 semaines.

De préférence encore, le colorant est un mélange d'azurobine et de rouge de Ponceau 4R de préférence encore dans une proportion en concentrations de 50/30.

De préférence encore, le colorant est un mélange d'azorubine à 50 mg/L et rouge Ponceau 4R à 30 mg/L.

Plus particulièrement, le milieu de culture de mycobactéries selon l'invention est constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture des mycobactéries, comprenant notamment des sels minéraux, sucres, acides aminés, protéines et vitamines, ledit milieu de culture de base étant supplémenté par lesdits composants additionnels mentionnés ci-dessus.

De préférence, le milieu de culture de mycobactéries selon l'invention contient au moins un composé antioxydant, de préférence l'acide ascorbique de préférence à une concentration d'au moins 0.1 g/L. Ce composé antioxydant permet de s'affranchir du contrôle de la tension en oxygène inférieure à 5% et de réaliser une culture en atmosphère de 5%C02 voire à l'air libre et atmosphère ambiante à la même température de 37°C.

Plus particulièrement, la lécithine est comprise dans une proportion pondérale de 0,1 à 5%, de préférence 0,5 à 1%. Plus particulièrement encore, la lécithine est de la lécithine de jaune d'œuf.

Plus particulièrement, un milieu de culture de mycobacteries selon l'invention comprend un milieu de culture de mycobacteries de base comprenant, outre de l'eau distillée, les composants suivants : sulfate d'ammonium, sulfate de magnésium, sulfate de cuivre, sulfate de zinc, citrate de sodium, citrate d'ammonium ferrique, chlorure de sodium, chlorure de calcium, phosphate monopotassique, phosphate disodique, acide L-glutamique, biotine et pyridoxine. Ces composants sont, notamment, les composants contenus dans les milieux de culture de mycobactéries dénommés milieux Middlebrook.

En pratique, ce milieu de culture se présente initialement sous forme d'un lyophilisât desdits composants listés ci-dessus, destiné à être dilué dans de l'eau distillée pour former le milieu de culture selon l'invention.

Plus particulièrement encore, le composé antibiotique sans activité antimycobactérienne est pris dans le groupe consistué par les polymyxines, l'acide nalidixique, le triméthoprîme, l'azîocilline et la vancomycine. Avantageusement, le milieu de culture comporte, en outre, un antifongique qui est de préférence l'amphotéricine B.

L'ensemble constitué des antibiotiques et antifungiques cités ci-dessus, à l'exception de la vancomycine, constitue l'ensemble dénommé, connu de l'homme de l'art sous l'appellation PANTA.

Ledit milieu de culture est avantageusement un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.

De manière préférentielle, il s'agit d'un milieu solide de type Middlebrook de référence 7H10, additionné avec ledit produit gélifiant et des facteurs de croissance de mycobactéries additionnels suivants : acide oléique, albumine bovine, de préférence la fraction V de l'albumine bovine, dextrose, catalase et glycéroi. Le vert de malachite, contenu dans le milieu 7H10, est un inhibiteur de croissance des bactéries autres que mycobactéries. Les facteurs de croissance de mycobactéries additionnels ci-dessus, autres que le glycéroi, sont connus sous la dénomination facteurs OADC.

La présente invention fournit également un procédé de détection par culture d'une mycobactérie à l'aide d'un milieu de culture de mycobactéries selon l'invention consistant à incuber un échantillon de prélèvement clinique pouvant contenir une mycobactérie, dans ledit milieu de culture de mycobactéries, à une température de 30 à 37°C, appropriée pour la culture de l'espèce de mycobactérie contenue dans ledit échantillon. La présente invention fournit par ailleurs un procédé de détermination de la viabilité d'une mycobactérie préalablement détectée dans un échantillon de prélèvement clinique par un procédé approprié te! que, de façon non exhaustive, un procédé d'observation microscopique, un procédé de détection d'une séquence d'ADN, ou un procédé de détection antigénique.

La présente invention fournit enfin un procédé de détermination de la sensibilité et de la résistance d'une mycobactérie à des antibiotiques ou de façon plus générale, toute substance pouvant être mise en contact avec la mycobactérie en culture dans le milieu selon l'invention. La plupart des mycobactéries est cultivée à 37°C. Toutefois, certaines mycobactéries, telles que Mycobacterium marinum, Mycobacterium haemophitum, Mycobacterium ulcerans, sont cultivées à une température de 28°C à 3Q°C Mycobacterium szulgai peut être cultivée entre 25°C et 37°C, Mycobacterium conspicuum est cultivée entre 22°C et 31°C. La température optimale de croissance de Mycobacterium xenopi et de Mycobacterium shimoidei est de 45°C. Les bactéries Mycobacterium genavense, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, les bactéries du complexe Mycobacterium avium, à savoir Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium chimaera et Mycobacterium colombtense sont cultivées à 37°C.

Plus particulièrement, dans un procédé de culture d'une mycobactérie selon l'invention, on cultive un échantillon de prélèvement clinique contenant une bactérie du complexe Mycobacterium tubercuiosis à une température de 37°C dans un dit milieu de culture de mycobactéries.

Un procédé de culture de mycobactéries selon l'invention peut également concerner des mycobactéries hors complexe Mycobacterium tubercuiosis, telles que celles citées ci- dessus, notamment Mycobacterium marinum, les espèces du complexe Mycobacterium avium, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium xenopi, les espèces du complexe Mycobacterium abscessus, Mycobacterium genavense, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium ulcerans et Mycobacterium fortuitum.

On entend ici par "bactéries du complexe Mycobacterium tubercuiosis", les bactéries des espèces Mycobacterium tubercuiosis, Mycobacterium bovis et ses clones ou sous- espèces BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinniped/ ^' i, Mycobacterium mungi et Mycobacterium suricattae. g

Avantageusement, dans un procédé de culture d'une rnycobactérie selon l'invention, on réalise les quatre étapes suivantes:

- on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement clinique pouvant contenir des mycobactéries jusqu'à ce qu'une croissance de bactéries soit détectable, et - on identifie que la bactérie détectée est une bactérie du genre rnycobactérie par un test de coloration, de préférence un test de coloration de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, et

- le cas échéant, on identifie l'espèce de ladite rnycobactérie par des moyens d'analyse moléculaire, de préférence par analyse de la masse moléculaire des protéines bactériennes par spectrométrie de masse. Les moyens d'analyse moléculaire peuvent être des moyens d'analyse des protéines bactériennes, notamment par détermination de leur masse moléculaire par spectrométrie de masse. Toutefois, alternativement, on pourra avoir recours aux méthodes classiques d'identification moléculaire du génome (ADN ou AR ) avec des sondes et/ou amorces d'amplification spécifiques des différentes espèces de mycobactéries, notamment telles que décrites dans la demande WO 2008/050064. En particulier, pour la détection de mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, on peut avoir recours à un système appelé multi spacer séquence typing (abrégé ci-après en MST) constitué d'une série de fragments d'acides nucléiques de zones intergéniques non codantes du génome des bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, lesdits fragments constituant des marqueurs génétiques permettant l'identification des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis et le génotypage des isolais d'une même espèce du complexe Mycobacterium tuberculosis et, notamment de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, par l'analyse des séquences desdits fragments de zones appelés MST.

Avantageusement, on détecte une croissance de bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis en moins de 15 jours, de préférence en 10 jours au plus.

Les milieux de culture selon l'invention permettent en outre la détection de 50% de l'ensemble des différentes principales espèces de mycobactéries en moins d'une semaine, à savoir Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, les bactéries des espèces Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis et ses clones ou sous-espèces BCG, Mycobacterium afrtcanum,. Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium mungi et Mycobacterium suricattae.

Plus particulièrement, ledit prélèvement clinique est choisi parmi des prélèvements respiratoires tels qu'expectoration, liquide de lavage broncho alvéolaire, et des prélèvements de biopsie cutanée, de biopsie ganglionnaire, de biopsie pulmonaire et de biopsie osseuse, et des prélèvements de selles.

Dans un mode préféré de réalisation dans lequel on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement clinique pouvant contenir une mycobactérie et des bactéries contaminantes dont la croissance peut inhiber la croissance des mycobactéries, le procédé est caractérisé en ce que :

1/ on réalise une étape préalable de décontamination initiale dudit échantillon dans ledit milieu de culture avec de la chlorhexidine pendant une période limitée, afin de limiter l'action de la chlorhexidine à une activité contre les bactéries autres que mycobactéries, de préférence environ 15 minutes de traitement dans une solution de chlorhexidine à 1% sous agitation, et

2/ on élimine ia chlorhexidine en lavant l'échantillon ainsi traité de l'étape 1/ avec un tampon neutre, et on centrifuge et récupère le cuiot bactérien contenant les bactéries contaminantes ainsi inactivées et les mycobactéries non inactivées, que l'on inocule sur un dit milieu de culture de mycobactéries.

L'utilisation de chlorhexidine comme décontaminant était limitée, précédemment, à la décontamination d'échantillons dans des milieux de culture solides, car la chlorhexidine entraîne une précipitation des milieux de culture liquides. En outre, la chlorhexidine est, en principe, connue pour être toxique sur les mycobactéries. Toutefois, on avait découvert précédemment que la présence de lécithine d'oeuf (mais pas la lé ithine de soja) dans le milieu de culture permettait d'éviter ou de différer la précipitation du milieu de culture liquide, d'une part, et, d'autre part, l'action limitée dans le temps de la chlorhexidine, par la mise en œuvre de ladite étape de lavage 2/, permet d'inhiber l'activité postérieure de la chlorhexidine à l'égard des mycobactéries. La chlorhexidine conserve toutefois son activité première contre les bactéries de la flore commensale dont la croissance peut inhiber la croissance des mycobactéries, appelées ci-dessus bactéries contaminantes.

On procède, en particulier, à cette étape de décontamination préalable pour les prélèvements cliniques connus pour être porteurs d'une flore commensale, tels que des prélèvements d'expectoration, de biopsie cutanée ou de selles, lesquels représentent 95% des prélèvements biologiques disponibles pour une analyse de mycobactéries. En revanche, pour des prélèvements biologiques tels que provenant d'hémoculture ou de biopsie ganglionnaire ou de biopsie pulmonaire ou de biopsie osseuse, une telle décontamination n'est pas requise. Le procédé ci-dessus est aussi particulièrement avantageux lorsque ledit prélèvement clinique est effectué à partir de selles.

Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide et on détecte une croissance de dites mycobactéries à l' il nu lorsque l'on peut apercevoir la formation d'une colonie de bactéries sur ledit milieu de culture solide.

En général, l'observation de la formation d'une colonie bactérienne correspondant à une concentration en bactéries de 10 ⁶ bactéries/ml.

Dans un mode préféré de réalisation d'un procédé selon l'invention, l'on identifie l'espèce de bactéries du genre mycobactérie par des moyens d'analyse moléculaire consistant dans une analyse du proRi protéique obtenu par spectrométrie de masse, en le comparant à une série de spectres de profil protéique obtenus avec des échantillons de souche de mycobactéries de référence de différentes espèces cultivées dans les mêmes conditions de culture.

On entend ici par "mêmes conditions de culture" que l'on a recours au même milieu de culture, même température de culture pour une même espèce de mycobactérie.

Un milieu de culture solide selon la présente invention permet de réduire le délai de croissance des colonies de M. tuberculosis en présence d'antibiotique et donc obtenir rapidement des résultats d'antibiogramme. Par ailleurs, on a découvert selon la présente invention qull était possible d'utiliser avantageusement le procédé E-test pour la réalisation des antibiogrammes de M. tuberculosis. Le E-test (AB Biodisk, Solna, Suède ; bïoMérieux, Marcy-l'Etoile, France) consiste en une bande de papier imprégné d'un gradient de concentration d'un antibiotique étudié, permettant une lecture directe de la concentration provoquant l'inhibition de croissance de la bactérie (Concentration Minimale Inhibitrice, CMI). Le E-test a été validé pour M. tuberculosis sur des milieux de référence différente de ceiui selon l'invention [Esteban X et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005 ; 24: 856-857] et les caractéristiques du milieu de culture solide selon l'invention ne permettaient pas prévoir s'il serait approprié à la réalisation des E-tests.

On a démontré selon la présente invention que te milieu de culture solide selon l'invention permet également une réalisation plus rapide et une lecture plus facile d'un test phénotypique de sensibilité et résistance aux antibiotiques du complexe Mycobacterium tuberculosis que les milieux standards.

La présente invention permet donc de mettre à profit (Invention d'un milieu permettant l'isolement et la croissance rapide du complexe Mycobacterium tuberculosis, pour la réalisation rapide de tests phenotypiques de sensibilité du complexe Mycobacterîum tuberculosis aux antibiotiques antituberculeux comme illustré dans l'exemple.

Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de culture permettant la détermination phénotypique rapide de ia sensibilité d'une mycobactérie aux antibiotiques, selon laquelle on réalise les étapes dans lesquelles : i/- on réalise une culture d'une dite mycobactérie, de préférence du complexe Mycobacterîum tuberculosis, sur dit un milieu de culture solide en présence d'au moins un antibiotique donné, à différentes concentrations connues, et ii/- on détermine la plus petite concentration d'antibiotique, de préférence choisi parmi la rifampi ine, isoniazide, éthambutol, pyrazînamide et la streptomycine, qui inhibe toute croissance visible de ladite bactérie (C I ; concentration minimale inhibitrice).

Ainsi, de façon connue, pour chaque couple de mycobactérie-antibiotique, on peut déterminer une concentration minimale inhibitrice ou CMI et ia comparer aux concentrations critiques d'antibiotiques qu'un malade peut recevoir sans danger et qui bloque la croissance de la souche bactérienne en cause. On détermine alors la sensibilité ou la résistance de la bactérie à l'antibiotique comme suit :

- si la CMI est inférieure à la concentration critique inférieure, la bactérie est sensible à l'antibiotique, et

- si la CMI est supérieure à la concentration critique supérieure, la bactérie est résistante à l'antibiotique en cause.

Dans un mode préféré de réalisation selon l'invention, à l'étape i/-, on dépose, sur ledit milieu de culture solide, au moins une bandelette de papier imprégné d'un dit antibiotique, à différentes concentrations selon un gradient de concentration le long de ladite bandelette. Plus particulièrement, on ensemence une boite de Pétri comprenant ledit milieu de culture solide selon l'invention à une concentration d'au moins ÎO ⁴ colonîes/ml, de préférence 10 ⁶ colonies/mi, puis on dépose une dite bandelette sur ledit milieu de culture solide, notamment une bandelette de type E-test qui comprend un gradient continu en concentrations croissantes d'antibiotique d'une extrémité à l'autre de ladite bandelette, lesdites concentrations d'antibiotique étant écrites directement sur ia bandelette, et on met en incubation la boite sur laquelle repose la bandelette et on lit la CMI à l'intersection du disque d'inhibition de la croissance bactérienne avec la bandelette. Selon d'autres modes de réalisation connus, on peut remplacer la bandelette par un disque de papier buvard imprégné de la concentration critique d'antibiotique, afin de vérifier l'existence d'une zone d'inhibition autour du disque pour établir que la souche est sensible à l'antibiotique. Selon une autre variante de réalisation connue, on peut incorporer l'antibiotique directement dans la masse dudit milieu de culture solide à ladite concentration critique et comparer ia croissance de la souche sur ledit milieu de culture soiide imprégné dudit antibiotique, avec la croissance d'une même souche sur un même milieu de culture solide ne contenant pas d'antibiotique, pour vérifier la présence ou l'absence d'une croissance bactérienne dans le milieu de culture avec et, respectivement, sans antibiotique et en déduire que la souche est sensible à l'antibiotique si l'on observe une croissance moindre de la souche dans le milieu de culture solide contenant ledit antibiotique.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention rassortiront mieux à la lecture des exemples non limitatifs qui suivent en lien avec les dessins dans lesquelles : La figure 1 est une représentation graphique du délai de détection t (en heures) de

Mycobacterium tubercu!osis sur le milieu selon l'invention par comparaison avec le milieu Colestos, en utilisant des inocula de différentes concentrations inoculées de 10 ² , 10 ³ , 10 ⁴ cfu/ml.

La figure 2 est une représentation graphique du délai de détection t (en heures) de Mycobacterium tubercu/osis sur le milieu selon l'invention par comparaison avec le milieu Lowenstein-Jensen (« L-J »), en utilisant des inocuia de différentes concentrations inoculées de ÎO ² , 10 ³ , 10" cfu/ml.

EXEMPLE 1 : DETERMINATION DE LA COMPOSITION DU MILIEU SELON L'INVENTION 1) Dans le but d'éliminer le sang présent dans le milieu solide MOD-5% similaire à celui de de l'exemple 2C de EP 2 364 357, les inventeurs - après de nombreuses tentatives infructueuses- ont substitué avec succès au sang du mouton une concentration équivalente (5%) de sérum d'agneau pour définir un milieu MOD-LS (MOD-Lamb Sérum). Les performances de ce milieu MOD-LS ont été comparées à celles du milieu MOD et d'un milieu MOD sans sang de mouton MOD4-WB (MOD-without blood).

La composition dudit milieu MOD-5% est donnée ci-dessous pour 1000 mL:

Eau distillée stérile: 841.3 mL

1- Milieu de Middlebrook 7H10 : Sulfate d'ammonium : 0,50 g

Phosphate monopotassique : 1,50 g

Phosphate disodique : 1,50 g

Citrate de sodium : 0,4 g

Sulfate de magnésium : 0,05 g

Chlorure de caicium : 0,00050 g

Sulfate de zinc : 0,0010 g

Sulfate de cuivre : 0,0010 g

Acide L-glutamique : 0,50 g

Citrate d'ammonium ferrique : 0,04 g

Chlorhydrate de pyridoxine : 0,0010 g

Biotîne : 0,00050 g

Vert malachite : 0,000250 g

Gélose (Agar): 13.5 g

2- Facteurs de croissance additionnels:

Albumine bovine : 7,5 g

Dextrose : 3 g

Catalase : 0.0045 g

Acide oléique : 0.09 g

Bovine sérum albumin : 1.65 g

Nicotinamide Adenine Dinudeotide (NAD) : 0.022 g

Vinylpyrrolidine Copolymer : 1.67 mi- Acide citrique : 0.0842 g

Hemin 330 pg 0.00033 g

Tween 80 : 2 mi- Extrait de levure : lg

Pancreatic digest of casein: lg

Glucose: 2g

Glycéroi: 5 ml

3- Antibiotiques sans activité antimycobacterienne et antifungique : Poiymyxine : 20.000 unités

Amphothéricine B : 0.002 g

Acide nalidixique : 0.008 g

Triméthoprime : 0.002 g

Aziocilline : 0.002 g

Vancomycine : 0.005 g

4- Eléments additionnels: Sérum de veau fœtal: 50 ml

Sang de mouton déftbriné : 50 ml

Lécithine : 5 g Pour MÛD-LS-5%, la composition est identique pour les composants des points 1 à 3 et présente les dits éléments additionnels suivants:

4- Eléments additionnels:

Sérum d'agneau: 50 ml

Lécithine : 5 g.

Pour MOD-WS-5%, la composition est identique pour les composants des points 1 à 3 et présente les dits éléments additionnels suivants:

4- Eléments additionnels:

Sérum de veau f tal: 50 ml

Lécithine : 5 g Cinq souches de Mycobacterium tubercutosis ont été utilisées, la souche de référence

Mycobacterium tuberculosis H37Rv et quatre souches cliniques dont une souche de la famille Beijîng. Des suspensions de concentration égale à 10 ⁵ CFU/mL ont été préparées à partir de ces souches et 100 μΐ de chaque suspension ont été inoculés en trîplicate sur les trois milieux. Les milieux ont été incubés en parallèle à 37°C sous une atmosphère contenant 5% de C02 et sous micro aérophile (tension oxygène entre 2,5% et 5%).

Le délai moyen d'apparition des premières colonies était 4 ± 0,3 jour sur MOD, 3.8 ± 0,4 jours sur MOD-LS et 5.1 ± 0,6 jours sur MOD-WS. Il y avait pas de différence significative quant au délai d'apparition des colonies sur milieu MOD comparé au milieu MOD-LS (P = 0.1413). En revanche, en comparant le milieu MOD-WS au milieu MOD et au milieu MOD-LS, la différence était plus significative (P < 0,05). Ces résultats indiquent qu'il est avantageux de substituer du sérum d'agneau, au sang pour obtenir des résultats de croissance légèrement améliorés.

Dans un deuxième temps, les inventeurs ont optimisé la concentration et le type de sérum d'agneau à introduire dans le milieu. Une variété de milieux a été préparée:

> MOD-15%-HIBS idem à MOD-WB-5% mais avec 15% (150mL) sérum bovin décomplémenté au lieu de 5% de sérum bovin non décomplémenté

> MOD-15%-B5: 15%(150mL) sérum bovin non décomplémenté

> MOD-15%-HÏLS: 15% (150mL) sérum d'agneau décomplémenté > MOD-15%-LS: 15% (150mL) sérum d'agneau non décomplementé

> MOD-10%-LS: 10%(100mL) sérum d'agneau non décomplementé

> OD-5%-LS: 5% (50mL) sérum d'agneau non décomplementé

> MOD-15 -HIBS-5%-LS: 15% (ISOmL) sérum bovin décomplementé et 5% (50mL) sérum d'agneau non décomplementé

> MOD-15%-HIB5-5%-HILS: 15% (150mL) sérum bovin décomplementé et 5% (50mL) sérum d'agneau décomplementé

MOD-15%-BS~5%-LS: 15% (150mL) sérum bovin non décomplementé et 5% (50mL) sérum d'agneau non décomplementé

Les performances de ces milieux ont été mesurées en cultivant cinq souches de Mycobacterium tuberculosis dont la souche de référence Mycobacterium tuberculosis H37Rv et quatre souches cliniques dont une souche de la famille Beijing. Des suspensions de concentration égale à 105 CFU/mL ont été préparées à partir de ces souches et 100 μΐ de chaque suspension ont été inoculés en triplicata sur les différents milieux.

Deux critères ont été pris comme base pour la comparaison des performances de ces différents milieux de culture:

> Délai de détection des premières colonies,

> Densité et richesse des colonies après 7 jours d'incubation. Suite à une inspection visuelle, un gradient de 1 (plus faible) à 5 (plus fort) est donné à chaque boite de Pétri pour mesurer la richesse de la culture.

Les résultats sont reproduits dans le tableau 1 ci-dessous (en boîtes de Pétri).

Tableau 1

En comparant les milieux contenant 15% de sérum bovin et 5% de sérum d'agneau décomplementé ou non décomplémenté (MOD-15%-HIBS-5%-HILS, OD-15%HIB5-5%-LS et MOD-15%-BS-5%-LS), aucune différence significative n'est observée quant au délai de détection des colonies ou la richesse des colonies.

Par ailleurs, on n'observe pas d'effet significatif de la décomplémentation du sérum bovin (MOD-15%-HIBS versus MOD-15%-BS) sur le délai de détection (P = 0,8321), ni sur la richesse des colonies (P = 0,6030). ïî n'existe pas non plus d'effet significatif de la décomplémentation du sérum d'agneau (MOD-15%-HILS versus MOD-15%-LS) sur le délai de détection (P = 0,8649) des colonies. En revanche, on observe un score de richesse le plus élevé sur milieu MOD-15%- HILS. On observe un délai de détection des colonies significativement inférieur sur milieux incorporant du sérum d'agneau (MOD-15%-HILS et MOD-15%-LS) à celui observé sur milieux incorporant du sérum bovin (P < 0.05).

Plus particulièrement, le milieu MOD-15%-HILS présente un score de densité et de richesse significativement supérieure à ceux présentés par les milieux à base de sérum bovin.

Il n'y a pas de différence statistiquement significative quant au délai de détection des colonies ou au score de richesse des colonies en comparant le milieu MOD-15%-HIL5 et le OD-15%HIBS-5 HILS.

En diminuant progressivement la concentration du sérum d'agneau (MOD-15 -LS, OD-10%-LS et MOD-5%-LS), on observe une augmentation progressive du délai de détection et une diminution progressive du score de densité et de richesse des colonies.

Les colonies ont été détectées en parallèle par œil nu ou par auto fluorescence utilisant une binoculaire équipée de fluorescence et une caméra monochrome (MZ10F stéréomicroscope, Leica Microsystèmes SAS, Nanterre, France) équipée d'un filtre GF1, A partir de ces résultats, les inventeurs ont décidé d'utiliser le milieu MOD-15%-HILS pour la suite des travaux de mise au point de la capacité de détection visuelle des colonies à l'oeil nu.

2) Les inventeurs ont ensuite travaillé à contraster la couleur blanc-beige des colonies de Mycobacterium tubercuiosis sur le fond jaune des milieux de culture MOD ci-dessus pour augmenter la capacité de détection visuelle à l'œil nu de la croissance des mycobactéries. Différents iots de milieu MOD-15%-HILS ont été préparés et colorés en utilisant différents colorants neutres de différentes couleurs et à différentes concentrations.

Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé dans un premier temps des colorants alimentaires pour leur innocuité et leur disponibilité afin d'apprécier lequel ou lesquels de ces colorants permettraient d'obtenir un contraste satisfaisant entre les colonies de mycobactéries et le fond de la gélose. Les colorants alimentaires suivants ont été Incorporés dans le milieu selon l'invention pour obtenir une gamme de couleurs.

Bleu-ciel : 0.4% colorant bleu

Bleu-pale : 0.2% colorant bleu

Jaune : 0.4% colorant jaune

Saumon : 0.04% colorant rouge

Orange : 0.3% colorant jaune + 0.1% colorant rouge

Orange-rougeatre : 0.2% colorant rouge + 0.2% colorant jaune

Rouge clair : 0.3% colorant rouge + 0.1% colorant jaune

Rouge : 0.4% colorant rouge (Couleur choisie pour MOD9)

Rouge-bordeaux : 0.3% colorant rouge + 0.1% colorant bleu

Violet-rougeatre : 0.2% colorant rouge + 0.2% colorant bleu

Violet : 0.3% colorant rouge + 0.1% colorant jaune

Vert-jaunatre : 0.3% colorant jaune + 0.1% colorant bleu

Vert-pistache : 0.2% colorant jaune + 0.2% colorant bleu

Vert : 0.3% colorant bleu + 0.1% colorant jaune

Maron : 0.2% colorant bleu + 0.1% colorant jaune + 0.1% colorant rouge

Finalement, c'est la couleur rouge qui a été retenue. Les inventeurs ont alors déterminé que ce colorant alimentaire contenait de l'azorubine et du Rouge Ponceau. L'azorubine ou carmoisine est un colorant alimentaire rouge identifié sous le numéro

E122. Ce composé azoté est un sel disodique de l'acide hydroxy-1 (sulfo-4 naphty!azo)-2 naphtaIènesuîfonîque-4.

Le rouge de Ponceau est un colorant azoïque de synthèse (C ₂ oH nN _z a ₃ 0 ₁ iS ₃ ) dénommé aussi CI. 16255, Rouge cochenille A, utilisé comme colorant alimentaire (E124 ² aussi dénommé additif E124.

La combinaison d'azorubine 50mg/L et de Ponceau 4R 30rng/L colorant en rouge le milieu MOD-15%-HILS a présenté le meilleur contraste colonie/gélose. Le milieu MOD-15%-HILS dans lequel le sang de mouton (5%) et le sérum bovin décompiémenté (15%) ont été substitués par le sérum d'agneau décompiémenté (15%) et te mélange d'azorubine (50mg/L) et Ponceau 4R (30mg/L) est appefé "MOD9".

La composition dudit milieu MOD9 selon llnvention est donnée ci-dessous :

Milieu solide MOD9 pour 1000 mL:

Eau distillée stérile: 841.3 mL

1- Milieu de Middlebrook 7H10 :

Sulfate d'ammonium : 0,50 g

Phosphate monopotassîque : 1,50 g

Phosphate disodique : 1,50 g

Citrate de sodium : 0,4 g

Sulfate de magnésium : 0,05 g

Chlorure de calcium : 0,00050 g

Sulfate de zinc : 0,0010 g

Sulfate de cuivre : 0,0010 g

Acide L-glutamique : 0,50 g

Citrate d'ammonium ferrique : 0,04 g

Chlorhydrate de pyridoxine : 0,0010 g

Biotine : 0,00050 g

Vert malachite : 0,000250 g

Gélose (Agar): 13.5 g

2- Facteurs de croissance additionnels:

Albumine bovine : 7.5 g

Dextrose : 3 g

Catalase : 0.0045 g

Acide oléique : 0.09 g

Bovine sérum albumin : 1,65 g

Nicotinamide Adenine Dinucteotîde (NAD) : 0.022g

Vinylpyrrolidine Copolymer : 1.67 mL

Acide citrique : 0.0842 g

Hemin 0.00033 gT een 80 : 2 mL

Extrait de levure : 1g

Pancreatic digest of casein: lg

Glucose: 2g

Giycérol: 5 mL 3- Antibiotiques sans activité antimycobactérienne et antifungique :

Polymyxine : 20.000 unités

Amphothéricine B : 0.002 g

Acide nalidixique : 0.008 g

Triméthoprime : 0.002 g

Azlocilline : 0.002g

Vancomycine : 0.005g

4- Eléments additionnels de ïïnventîon :

Sérum d'agneau décomplémenté: 150 mL

Lécithine : 5 g

Azorubine : 0.050 g

Ponceau 4R : 0.030 g

Dans une variante de réalisation, on a ajouté 0.1g d'acide ascorbique ce qui a permis de s'affranchir du contrôle de la tension en oxygène inférieure à 5% et de réaliser une culture en atmopshère de 5% de C02 voire à l'air libre et atmosphère ambiante à la même température de 37°C.

Exempte 2 : INFLUENCE DE LA COULEUR ROUGE DU MILIEU MOD9 SUR LA CROISSANCE DE M. TUBERCULOSIS A L'AIDE DE COLORANTS CHIMIQUEMENT DEFINIS. Dans cet exemple, les inventeurs ont comparé la couleur rouge du milieu 10D9 obtenue par addition d'azorubine seule, de rouge Ponceau seul, ou d'un mélange des deux colorants ; et l'Influence de ces trois formulations sur la croissance de M. tuberculosis a) Milieux:

- OD9-A: Le colorant est de l'azorubine 50mg/L

-MOD9-P: Le colorant est du Ponceau 4R 30mg/L

-MQD9-A/P: Le colorant est un mélange d'azorubine 50mg/L et de rouge Ponceau 4R (30mg/L)

Deux expérimentations ont été menées :

-Sur les différents milieux coulés en boite de Pétri (P-MOD9)

-Sur les différents milieux coulés en tubes (bioMérieux) (T-MOD9) b) Souches:

Les tests effectués sur les milieux en format boite de Pétri sont réalisés avec cinq souches de Mycobacterium tuberculosis, la souche de référence H37Rv et 4 souches cliniques, sensibles aux antituberculeux dont une est Beijing ; alors que les tests effectués sur Ses milieux en format tube sont réalisés avec deux souches de M. tuberculosis, la souche de référence H37Rv et une souche Beijing. c) Protocole: Les souches maintenues en culture sur milieu MOD9 sont calibrées à 10 ⁶ cfu/mL par observation microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen.

De plus des suspensions plus diluées, 10 ⁴ cfu/mL et 10 ² cfu/mL sont préparées.

Les expérimentations sont réalisées en triplicata pour les tests lancés sur format boite de Pétri et en duplicata sur format tubes (Limité par rapport au nombre des tubes). Les suspensions préparées sont inoculées à raison de 100 il pour les boites de Pétri et 200 μΐ pour les tubes et incubées dans un incubateur 37°C, 5% C02 (avec ies bouchons semi-ouverts pour le format tube).

Après inoculation, les tubes sont mis en position horizontale pendant 3 jours, puis redressés en position verticale jusqu'à la fin du test. Des milieux non ensemencés utilisés comme témoins négatifs sont incubés en parallèle.

Une lecture à l'œil nu des milieux est réalisée toutes les 12 heures pour la détection des colonies. L'identification des colonies est confirmée ultérieurement par coloration Ziehl- Neelsen. d) Résultats

- Couleur : les inventeurs ont observé une différence de l'intensité de ia couleur rouge du milieu de culture MOD9, avec une intensité croissante en allant du milieu coloré par la rouge Ponceau seul, l'azorubine seule, et le mélange rouge Ponceau plus azorubine.

- Croissance de M. tuberculosis : Les résultats (moyenne et écart type) du délai de détection de la première colonie des différentes souches de M. tuberculosis sur les différente milieux est présentés dans les tableaux 2 et 3 ci-dessous. Délai de détection

ÎO ⁵ CFU/rnL 10 ⁴ CFU/mL 10 ² CFU/mL

(heures)

P-MOD9-A/P 32 ± 8.7 82.4 ± 20.2 125.6 ± 21.2

P-MOD9-A 32.8 ± 10.6 79.2 ± 22.1 124.8 ± 23.9

P-MOD9-P 33.6 ± 11.3 81.6 ± 20.8 136 ± 19.6

Tableau 2 : Temps de détection de la première colonie des différentes souches de M. tuberculosis sur les différents milieux en boite de Pétri

Tableau 3 î Temps de détection de la première colonie des différentes souches de M. tuberculosis r les différents milieux en tube

Les inventeurs n'ont pas observé de différence significative quant au délai de détection entre les différents colorants et combinaisons utilisés pour colorer le milieu MOD9 en rouge. Au total, l'ensemble des résultats indique qui! convient de colorer le milieu MOD9 en rouge par un mélange azorubine à 50 mg/L plus rouge Ponceau à 30 mg/L.

Exemple 3 : STABILITE DE LA COULEUR ROUGE DU MILIEU MOD9

Dans cet exemple, les inventeurs se sont attachés à vérifier la stabilité dans le temps de la couleur rouge framboise du milieu MOD9 sur gélose, appréciée par son apparence à l'œil dans les conditions habituelles de stockage à 4°C et d'utilisation.

Pour cela, les inventeurs ont préparé un premier lot 6 géloses MOD9 en boîte de Pétri de 55 mm, laissées dans un chambre froide à température contrôlée à 4°C correspondant à la température habituelle de stockage des milieux contenant des composés organiques. La couleur des boîtes a été observée le jour JO, puis à Ώ, J14, J21, ,330, J45 puis deux mois, trois mois et six mois après incubation. Une photographie numérique du groupe de gélose a été enregistrée à chaque observation. Dans ces conditions, les inventeurs n'ont pas observé de modification de la couleur rouge du milieu MOD9 dans aucune des conditions expérimentales, indiquant la grande stabilité de coloration du milieu MOD9 dans la composition indiquée dans l'exemple l, conservé à 4°C.

Un deuxième lot de 6 boîtes de Pétri contenant du MOD9 a été incubé en air ambiant à température du laboratoire comprise entre 18°C et 22°C pendant 45 jours et observé dans les mêmes conditions. Dans ces conditions, les inventeurs n'ont observé aucune modification de la couleur rouge, indiquant la possibilité d'un stockage dans l'ambiance d'un laboratoire, plus particulièrement dans des laboratoires ne disposant pas de ressources suffisantes en froid.

Un troisième lot de 6 boîtes de Pétri contenant du MOD9 a été incubé à 37°C dans un incubateur contenant 5% de C02 pendant 45 jours et observé dans les mêmes conditions. Dans ces conditions, les inventeurs n'ont observé aucune modification de la couleur rouge, indiquant la possibilité d'incuber le milieu MOD9 en suivant les recommandations internationales pour la détection des colonies de mycobactéries, plus particulièrement des colonies de Mycobacterium tuberculosis. En parallèle, les inventeurs ont mené une deuxième série d'expériences dans un deuxième laboratoire aux mêmes températures et pendant 5 semaines au cours desquelles ils ont observé une même coloration rouge framboise et la stérilité du milieu MOD9. Ces résultats sont concordants avec ceux menés dans le premier laboratoire.

Exemple 4: PERFORMANCES COMPAREES DU MILIEU MOD9 ET DU MILIEU COLETSOS POUR LA CROISSANCE DES SOUCHES DE M. TUBERCULOSIS

Dans cet exemple, les inventeurs ont comparé la performance du milieu MOD9 dans des boites de Pétri 55 mm à celles du milieu Coletsos en tubes de verre. Le milieu Coletsos est un milieu à l'œuf comprenant du pyruvate de sodium.

On a utilisé des suspensions de 15 souches de Mycobacterium tuberculosis préparées à différentes concentrations. Les 15 souches de Mycobacterium tuberculosis utilisées comprennent la souche de référence Mycobacterium tuberculosis H37Rv et 14 isolais cliniques dont deux îsolats de la famille Beijing.

Des suspensions de ÎO ¹ *, 10 ³ et 10* CFU/mL ont été préparées à partir de ces souches. Les 2 milieux ont été inoculés en triplicata avec 100pL de chaque suspension, puis incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% C02, la lecture des résultats était faite toutes les 12h afin de déterminer le délai de détection des premières colonies de M. tuberculosis. Les délais de détection des premières colonies sur chacun des milieux sont repris dans le tableau 4 ci-dessous :

TABLEAU 4

On observe un délai de détection des colonies sîgnificativement inférieur sur milieu MOD9en boîtes de Pétri par rapport au milieu Coletsos en tubes, quelle que soit ia concentration testée. Ces résultats sont illustrés dans la Figure 1.

Exemple 5 ; PERFORMANCES COMPAREES DU MILIEU MOD9 ET DU MILIEU LOWENSTEIN-JENSEN POUR LA CROISSANCE DES SOUCHES DE M. TUBERCULOSIS Les performances du milieu MOD9 en boite de Pétri 55 mm ont été comparées à celles du milieu Lôwenstein-Jensen (bioMérieux, La Bal m e-l es-Grottes, France) en tubes en verre. Un total de 21 souches de Mycobacterium tuberculosis ont été utilisées, comprenant la souche de référence Mycobacterium tuberculosis H37Rv et 20 isoiats cliniques dont deux appartenant à la famille Beijing. Des suspensions de 10 ⁶ , 10 ⁴ et 10 ² CFU/mL ont été préparées à partir de ces souches. Les 2 milieux ont été inoculés en triplicata avec ΙΟΟμί de chaque suspension, puis incubés à 37 ^Q C dans une atmosphère contenant 5% C02. L'observation des milieux de culture est faite toutes les 12 h afin de déterminer le délai de détection des premières colonies de Mycobacterium tuberculosis.

Les délais de détection des premières colonies sur chacun des milieux sont repris dans le tableau 5 ci-dessous :

TABLEAU 5 On observe un délai de détection des colonies significativement inférieur sur milieu MOD9 en boîtes de Pétri par rapport au milieu Lôwenstein-Jensen en tube, quelle que soit la concentration testée. Ces résultats sont illustrés dans la Figure 2.

Exemple 6; PERFORMANCES COMPAREES DU MILIEU MOD9 ET DU MILIEU DE LOWENSTEIN-3ENSEN POUR L'ISOLEMENT DES SOUCHES DE MYCOBACTE IES

Dans cet exemple, les inventeurs ont observé les performances du milieu MOD9 dans l'isolement des mycobactéries des échantillons cliniques. Un total de 250 échantillons dont 203 (81.2%) échantillons respiratoires [(173 crachats (69.2%), 27 aspirab ^' ons bronchiques (10.8%) et trois lavages broncho-alvéolaires (1.2%)] et 47 (18.8%) échantillons non- respiratoires [36 selles (14.4%) et 11 urines (4.4%)] collectés chez 145 patients ont été décontaminés en utilisant la chlorhexidine (0.7%) (Asmar, 2014) et puis cultivés (ΙΟΟμί d'inoculum) en parallèle sur MOD9 (boite de Pétri 55 mm) et tubes Lôwenstein-Jensen (bioMérieux, FRANCE). Un total 40 mycobactéries ont été isolées à partir des échantillons collectés chez 13 patients différents, Ces isolats ont été identifiés comme 38 M. tuberculosis et 2 M. absœssus. Le nombre d'isolats obtenus sur MOD9 [38 isolats (36 M. tuberculosis et 2 M. abscessus)] à partir de 26 échantillons de crachats, 11 échantillons de selles et un échantillon d'aspiration bronchique était supérieur aux 32 isolats obtenus sur milieu Lôwenstein-Jensen (30 M, tuberculosis et 2 M. abscessus) à partir de 27 crachats et 5 échantillons de selles (cette différence est significative, Test statistique de Fisher avec une valeur P < 0.5195 ). Au total, 8 isolats de M. tuberculosis ont été obtenus seulement sur milieu MOD9 et 2 îsolats de M. tuberculosis ont été obtenus seulement sur milieu Lôwenstein-Jensen. Le délai moyen de détection est de 9.9 ± 4 (4-16) jours pour MOD9 versus 17.5 ±

6.6 (8-35) jours pour Lôwenstein-Jensen (P < 0,05). Le délai moyen de détection des colonies de Mycobacterlum tuberculosis est de 10.3 ± 3.9 (5-18) jours sur MOD9 versus 18.1 ± 6.4 (10-35) jours sur Lôwenstein-Jensen (P < 0,05). Le délai moyen de détection des colonies isolées sur les deux milieux est de 9,6 ± 4 (4-18) jours sur MOD9 versus 16.8 ± 6.2 (8-35) jours sur Lôwenstein-Jensen (P < 0.05). Le délai moyen de détection des colonies de Mycobacterlum tuberculosis isolées sur les deux milieux est 9.5 ± 3.9 (5-18) jours sur MOD9 versus 17.4 ± 5.9 (10-35) jours sur Lôwenstein-Jensen (P < 0.05). Le taux de contamination sur MOD9 est 1.6% (3 selles et 1 crachat) et de 4.4% (8 selles, 2 crachats et 1 aspiration bronchique) sur Lôwenstein-Jensen (P = 0.1129). Exemple 7: PERFORMANCES COMPAREES DU MILIEU MOD9 ET DU MILIEU BACTEC™ POUR L'ISOLEMENT DES SOUCHES DE MYCOBACTERIES

Les inventeurs ont comparé un protocole combinant une décontamination des échantillons cliniques contaminés, par chiorhexidine (0,7%) et ensemencement du milieu MOD9 versus le protocole de référence combinant la décontamination des échantillons cliniques contaminés par NALG-NaOH et ensemencement en milieu liquide BACTEC™-MGIT™ (Becton Dickinson) pour l'isolement des mycobactéries à partir d'échantillons cliniques.

Au total, 300 échantillons comprenant 238 (79.3%) échantillons respiratoires [(203 crachats (67.6%), 31 aspirations bronchiques (10.3%) et 4 lavages broncho-alvéolaires (1.3%)3 et 62 (20.6%) échantillons non-respiratoires [43 selles (14.3%), 14 urines (4.6%) et 5 ganglions] collectés chez 161 patients ont été utilisés dans cette étude. Toutes les échantillons (sauf les ganglions) ont été décontaminés en utilisant la méthode de référence NALC-NaOH et puis mis en culture (500 pL d'inocuium) dans un flacon MGIT™ (Becton Dickinson) après ajout de 800 pL du supplément OADC et 500 pL de mélange d'antibiotiques PANTA, puis incubés dans l'automate BACTEC™ (Becton Dickinson). Une quantité comprise entre 0,1 mL et 1 mL de matière biologique restante (selon la disponibilité) ont été décontaminés par la chiorhexidine (0.7%) (Asmar, 2014) puis inoculés (100pL d'inocuium) sur milieu MOD9 (boite de Pétri de 55 mm). Les ganglions ont été homogénéisés et mis en culture directement sans décontamination sur OD9 et MGIT™. Au total, 46 mycobactéries ont été isolées à partir des échantillons cliniques collectés chez 17 patients différents, ces souches ont été identifiées comme 44 Mycobacterium tuberculosis et 2 Mycobacterium abscessus. Le nombre d'isolats obtenus sur MOD9 [43 isolats (41 M. tuberculosis et 2 M. abscessus)] à partir de 29 échantillons de crachats, 11 échantillons de selles, 1 échantillon d'aspiration bronchique et 3 ganglions, était sîgnificativement supérieur aux 31 isolats obtenus sur MGIT™ (30 M. tuberculosis et 1 M. abscessus) à partir de 23 crachats, 3 selles, 1 aspiration bronchique et 5 ganglions (P < 0.05). Au total, 15 isolats (14 M. tuberculosis et 1 M. abscessus) étaient obtenus seulement sur MOD9 versus 3 souches de M. tuberculosis obtenues uniquement sur MGIT™.

Le délai moyen de détection est de 9.8 ± 3.8 (4-18) jours pour MOD9 versus 14 ± 8 (3-32) jours pour MGIT™ (P < 0.05). Le délai moyen de détection des colonies de Mycobacterium tuberculosis est 10 ± 3.7 (5-18) jours sur MOD9 versus 14.2 ± 8 (4-32) jours sur MGIT™ (P < 0.05). Le délai moyen de détection des colonies qui ont cultivé sur les deux milieux est de 8.7 ± 3.5 (4-18) jours sur MOD9 versus 13.3 ± 7 (4-25) jours sur MGIT™ (P < 0.05). Le délai moyen de détection des colonies de Mycobacterium tuberculosis qui ont cultivé sur les deux milieux est de 8.9 ± 3.5 (5-18) jours sur MOD9 versus 13.6 ± 7 (4-25) jours sur MGIT™ (P < 0.05). Le taux de contamination observé par le protocole ch!orhexidine-0.7%/MOD9 était de 1.33% (3 selles et 1 crachat) et significativement inférieur à celui observé par NALC-NaOH/MGIT™ (4.67% ; 7 selles, 6 crachats et 1 aspiration bronchique) (P < 0.05). EXEMPLE 8 : DETERMINATION PHENOTYPIQUE DE LA SENSIBILITE DE M.

TUBERCULOSIS AUX ANTIBIOTIQUES a/- Méthodes :

Les inventeurs ont testé six souches cliniques de i'espèce Mycobacten ^' um tuberculosis isolées de prélèvements respiratoires au cours du diagnostic de routine dans leur laboratoire de microbiologie clinique. Ces six souches ont été identifiées de l'espèce Mycobacten ^' um tuberculosis par leur morphologie caractéristique en cordons après coloration de Ziehl, puis par amplification PC et séquençage de spacers intergéniques [Djelouadji Z et al. A Single- Step Sequencing Method for the Identification of Mycobacten ^' um tuberculosis Complex Species. PLoS Negl Trop Dis. 2008 Jun 18;2{6):e253]. Ces six souches ont été testées sensibles aux antibiotiques antituberculeux de première ligne en utilisant un test phénotypique de référence en milieu solide ne testant que les concentrations dites critiques pour chacun des quatre antibiotiques testés : îsoniazide, 0,2 pg/ml ; rifampicine, 1 pg/ml ; ethambutol, 5 pg/ml et streptomycine, 5 pg/ml, [Woods GL, Warren NG, Inderlînd CB. Susceptibility test methods ; Mycobacteria, Nocardia, and other Actinomycetes ^' : Manual of Clinical Microbiology, 9ème édition (Nurray PR, Baren E3, Jorgensen JH, Bry NL, Pfalîer MA. American Society for Microbiology, 2007, page 1223- 1247].

On a testé en parallèle une souche clinique résistante aux antituberculeux (concentration minimale inhibitrice de la rifampicine > 1 g/ml) comme déterminé par la méthode de référence en milieu solide [Woods GL, Warren NG, Inderiind CB. Susceptibility test methods : Mycobacteria, Nocardia, and over actinomycetes in: Manual of Clinical Microbiology, 9ème édition (Nurray PR, Baren El, Jorgensen JH, Bry NL, Pfaller MA. American Society for Microbiology, 2007, page 1223-1247). Ces souches ont été mises en suspension dans du tampon phosphate stérile à la concentration de 10 ^s colonies/ml. Cette suspension a servi à inonder en parallèle une boite de Pétri stérile contenant le milieu standard de référence : Middlebrook 7H10 complémenté par un mélange d'acide oléîque, albumine, dextrose, et catalase (OADC), une boîte de Pétri stérile contenant le milieu MOD-15 HIBS et une boîte de Pétri stérile contenant ie milieu solide MOD9 selon l'invention de l'exemple 1 ci-dessus.

Les inventeurs ont utilisé le système appelé E-test® (Biomérîeux, France) pour déterminer la sensibilité des souches aux différents antibiotiques. Ce système est composé d'une bandelette en papier imprégnée d'antibiotique (isoniazide ou éthambutol) selon un gradient de concentration continu au long de la bandelette. Ce dispositif permet une lecture à l'œil nu de la concentration à partir de laquelle il n'est plus observé de croissance de Mycobacterium tuberculosis définissant ainsi de la concentration minimum inhibitrice de l'antibiotique (isoniazide ou éthambutol) vis-à-vis de la souche de Mycobacterium tuberculosis qui est testée. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 37°C sous une atmosphère contenant 5% de C02 pendant deux semaines avec une observation quotidienne à partir du sixième jour d'incubation. Les colonies ont été confirmées comme étant Mycobacterium tuberculosis sur la base de leur aspect et après coloration de Ziehl montrant des cordons de bacilles alcoolo-acido-résîstants. Il se forme un disque d'inhibition de la croissance bactérienne autour de la bandelette dans les zones contenant une concentration d'antibiotique supérieure à la concentration minimum inhibitrice, étant entendu que celle-ci est déterminée par l'intersection du disque d'inhibition avec la bandelette. b/- Résultats :

Les inventeurs ont observé que : - (1) les colonies de Mycobacterium tuberculosis apparaissaient après 7 jours d'incubation sur le milieu MOD9 selon l'invention comme sur le milieu comparatif OD- 15 HIBS.

- (2) ta lecture du E-test est possible dans ces conditions après 7 jours d'incubation sur le milieu selon l'invention car il y a un nombre suffisant de colonies permettant la lecture et un très bon contraste entre les colonies qui apparaissent grises sur le fond rouge du milieu MOD 9 selon l'invention; comme sur le milieu MOD-15% HIBS et meilleur que sur ie milieu de référence, du fait de la croissance incomplète des colonies sur le milieu de référence et d'un mauvais contraste entre la couleur de la colonie (translucide) et le milieu de référence, - (3) les résultats des E-tests isoniazide et éthambutol obtenus sur le milieu MOD9 selon l'invention sont similaires à ceux obtenus au préalable avec MOD-15%HIBS-et sont plus précis que ceux des tests de référence, permettant la détermination d'une véritable concentration minimale inhibitrice. Cette expérience démontre que, par utilisation d'un milieu solide selon l'invention, la réalisation de tests phénotypiques de sensibilité de Mycobacterium tuberculosis aux antituberculeux selon la méthode E-test, est aussi rapide et plus facile que la réalisation de E-test sur un milieu solide de référence. Une boîte de Pétri contenant le milieu de référence et le milieu selon l'invention incubée après inoculation d'une même souche de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, montre la présence de colonies de Mycobacterium tuberculosis facilement visibles après 7 jours sur le milieu selon l'invention et difficilement visibles sur le milieu de référence après 11 jours, permettant une lecture facile de la concentration inhibitrice de isaniazide (IZ) sur une première bandelette et éthambuto! (ET) sur une deuxième bandelette.

On voit, autour des bandelettes, des zones d'inhibition de la croissance bactérienne en forme de disque ovoïde autour des parties de la bandelette contenant une concentration inhibitrice d'antibiotique, de sorte que l'intersection de la limite inférieure desdites zones inhibitrices avec les bandelettes permet de lire sur la bandelette graduée la concentration inhibitrice minimale de l'antibiotique.