Beschreibung

Zum Nachweis der Einnahme illegaler Substanzen wird am häufigsten eine Urinprobe verwendet. Diese Tests finden Anwendung in vielen Bereichen, z.B. Suchttherapie, Substitutionstherapie, Fahreignungsprüfung, Sport, Arbeitnehmer-Screening usw.

Diagnostische Verfahren, Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer therapeutischen Maßnahme, prophylaktische Routineuntersuchungen sowie gerichtsmedizinische Untersuchungen am Menschen beinhalten in der Regel die laboranalytische Untersuchung von Proben, wie z. B. Haar, Blut- oder Serumproben, die dem Probanden entnommenen wurden, als auch die Untersuchung von Ausscheidungen des Probanden, wie z. B. Urin.

Von allen Analyseverfahren eignet sich Urin am besten, da die illegalen Substanzen im Urin länger nachweisbar sind als in den anderen z.B. in Blut.

Allerdings ist Urin anfällig für Manipulationen. Durch Zugabe von Flüssigkeit oder Chemikalien, wie z.B. Spülmittel, wird versucht, die illegale Einnahme nicht erlaubter Substanzen zu verschleiern. Es wird ebenfalls oft versucht, die „belastete" Probe gegen eine unbelastete Probe auszutauschen. Zum Ausschluss solcher Manipulationen wird die Urinprobe immer noch unter direkter Sichtkontrolle mit Blick auf das Genital des Probanden/der Probandin gewonnen.

Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das einerseits auf die Aufsicht bei der Probenentnahme verzichtet, aber andererseits sicherstellt, dass keine Täuschung möglich ist. Ein solches Verfahren ist die so genannten „endogene Markierung", bei der dem Probanden/der Probandin vor der Probeentnahme mindestens eine nicht metabolisierbare Substanz verabreicht wird, die später in der Urinprobe identifiziert werden kann.

Ein Beispiel für die nicht metabolisierbaren Substanzen sind z.B. Polyethylenglycole. Durch das Trinken einer mit Polyethylenglycolen versetzten Lösung wird der Urin des Probanden/der Probandin markiert, d.h. die verabreichten Polyethylenglycole sind im Urin nachweisbar.

In EP 1 410 014 werden ein Diagnoseverfahren und hierfür eingesetzte Polyethylenglycole als Marker-Substanzen beschrieben, durch welche sich Täuschung im Rahmen der endogenen Markierung aufdecken lassen sollen, und welches ohne die Sichtkontrolle auf das Genital des Probanden/der Probandin auskommt. Als Marker-Substanzen wurden in 1 410 014 Polyethylenglycole besonders bevorzugt. Um die Täuschungssicherheit zu gewährleisten, werden als Marker-Substanzen entweder ein Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht, oder eine Kombination von Polyethylenglycolen verschiedener Molekulargewichte verwendet. Polyethylenglycole können poly- oder monodispers sein.

Bei der Verwendung von Marker-Substanzen muss aber sichergestellt werden, dass die Marker-Substanzen tatsächlich von der Person eingenommen wurden, die getestet werden soll.

Eine offensichtliche Täuschung besteht darin, dass der Proband die Trinklösung mit den Marker-Substanzen, die ihm ausgehändigt wurde, einer anderen Person gibt, die die Marker- Substanzen einnimmt, sodass der Proband/die Probandin den von dieser dritten Person produzierten Urin als seinen/ihren eigenen Urin ausgeben kann. Diese Täuschung kann dadurch verhindert werden, dass die Einnahme der Lösung unter Aufsicht erfolgt.

Eine weitere mögliche Täuschung besteht darin, dass ein im Mundraum verstecktes Schwämmchen während der Einnahme der Trinklösung die Marker-Substanzen aufsaugt und anschließend in den sauberen Urin einer anderen Person ausgedrückt wird.

Um die o.g. Täuschung zu erfassen, wird der mit den Marker-Substanzen versetzten Trinklösung eine geringfügige Menge einer metabolisierbaren Substanz zugesetzt, im Nachfolgenden „Kontroll-Marker-Substanz" genannt, und dem Probanden/der Probandin zu Trinken gegeben, so dass im Urin nur die nicht metabolisierbaren Marker-Substanzen vorhanden sind, aber nicht der Kontroll-Marker. Wenn also die Trinklösung, die sowohl Marker-Substanzen als auch die Kontroll-Marker- Substanzen enthält, einem fremden Urin zugemischt wird, lässt sich der Nachweis der Marker-Substanzen zusammen mit der Kontroll-Marker-Substanz in dem Urin als sicherer Täuschungsversuch erkennen.

In EP 1 563 311 wurde als Kontroll-Marker-Substanz Methyl-4-hydroxybenzoat vorgeschlagen. Diese Substanz ist wegen der geringen Toxizität in bestimmten Mengen lediglich als Lebensmittel- und Arzneimittelzusatzstoff zugelassen.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin der Trinklösung mit Polyethylenglycolen einen metabolisierbaren Zucker, z.B. Saccharose, zuzugeben. Der zugegebene Zucker wird idealerweise vollständig metabolisiert und wird im Urin nicht gefunden.

Die Saccharose hat den aber Nachteil, dass sie zwar mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine Manipulation durch Zuspucken der Markerlösung hinweist, aber letzten Endes nicht zwingend beweisend dafür ist. Es gibt noch andere Quellen, die eine erhöhte Saccharosekonzentration im Urin verursachen können. Das ist zum einen die Injektion von Saccharose haltiger Lösung, wie bei der missbräuchlichen Verwendung von Methadon, aber auch bei einigen Magen/Darmerkrankungen können leicht erhöhte Saccharosewerte im Urin gemessen werden. Das können zum Beispiel Magengeschwüre sein, bei denen die Magenwand durchlässig für Saccharose ist. Saccharose wird nur im Magen/Darmtrakt gespalten. Gelangt Saccharose auf irgendeinen Weg ins Blut, wird sie über den Urin ausgeschieden. Der Grenzwert für einen verdächtigen Saccarosebefund (Manipulation durch Zuspucken des Markers), muss daher etwas höher gewählt werden, als eigentlich nötig wäre, um Manipulationen zu erkennen, bei denen Marker im unteren Konzentrationsbereich zugegeben wurde.

Bei der Verwendung von Saccharose ist es ebenfalls nötig, dass sich der Einsender der urinprobe streng an die Anleitung hält. Die zugegebene Saccharosemenge muss exakt stimmen und es dürfen keine Fruchtsäfte oder Limonaden für die Verabreichung verwendet werden, da sonst die Bewertung der Befunde erschwert wird. Weiterhin ist die Saccharose z.B. durch Hefen abbaubar. Werden Hefen zu einem manipulierten Urin, der Saccharose enthält gegeben, so wird die Saccharose abgebaut. Hefen oder Bakterien können auch ohne Manipulation im Urin vorkommen, durch Blasenerkrankungen oder durch die nicht sterile Urinabgabe, daher ist der direkte Nachweis von Hefen oder Bakterien im Urin nicht hilfreich. (Die "natürlichen Hefen oder Bakterien würden unter normalen Bedingungen kaum ausreichen, um die Saccharose ab zu bauen.) Der indirekte Nachweis von Hefen durch die Messung des Abbaus einer zugesetzten Saccharosemenge vor der Analyse im Labor, hat sich nicht als zuverlässig erwiesen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Substanz als Kontroll-Marker vorzuschlagen, die nicht toxisch, in sehr kleinen Mengen nachweisbar, durch Hefe nicht abbaubar und einfach zu handhaben ist.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass Curcumin als Kontroll-Marker-Substanz hervorragend geeignet ist, Saccharose zu ersetzen oder zusätzlich zur Saccharose verwendet werden kann.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Trinklösung zur endogenen Markierung von Urin, wobei die Lösung neben einem oder mehreren Polyethylenglycolen auch Curcumin enthält. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Urinprobe auf die Anwesenheit von mindestens einem bestimmten Analyten durch Verwendung der vorgenannten Trinklösung. Analyten können Rauschmittel, Arzneimittel, Dopingsubstanzen, oder Metabolite der vorgenannten Substanzen sein, deren Nachweis in der Probe über das Verhalten oder eine Behandlung der Probanden zulässt. Beispielsweise kann der Analyt Heroin, Methadon, Kokain, THC, Barbituratem Nikotin, Alkohol oder ein auf der Liste der Dopingmittel stehendes Dopingmittel sein.

Curcumin ist nicht toxisch und ist der Hauptbestandteil des Würz-, Heil- und Färbemittels Kurkuma, das zusammen mit anderen Gewürzen im Currypulver verwendet wird (https://de.wikipedia.org/wiki/Curcumin).

Es wurde festgestellt, dass Curcumin in sehr geringen Mengen nachweisbar ist, aber im Körper vollkommen verstoffwechselt wird und dadurch als Kontroll-Marker-Substanz gut geeignet ist. Durch die Zugabe von Curcumin in die Trinklösung mit einem Polyethylenglycol oder mit einer Kombination von Polyethylenglycolen als Marker-Substanzen kann eine Täuschung durch Zugabe von der Trinklösung in den fremden Urin sehr leicht ermittelt werden, da schon sehr kleine Mengen an Curcumin leicht nachweisbar sind.

Durch die Messung mehrerer tausend nativer Urine der Drogenabhängigen und Messung - auch nach hoher eingenommener Menge Curcumin - konnte man Curcumin im Urin nicht finden. Die Nachweisgrenze für Curcumin liegt bei der eingesetzten flüssig/flüssig Extraktion bei ca. 10 ng/ml. Die Nachweisgrenze bei alternativ getesteten Shoot- und Dilute-Verfahren lag bei ca. 50-100 ng/ml.

Beispiel

Die Probe wird vor der Extraktion hydrolysiert, um vorhandene Analyt-Glucuronide in den freien Analyten zu überführen. Vor der Hydrolyse wird der interne Standard IS zugegeben. Bei der Flüssig-Extraktion werden 10 pl IS zugegeben.

Pro Probe werden zur Hydrolyse der Glucuronide 10 pl Acetatpuffer und 10 pl einer ß- Glucuronidase-Lösung und 40 pl Methanol zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht oder 1 Stunde bei 60°C inkubiert und erst dann extrahiert.

Die Hydrolyse ist für den Nachweis von Curcumin und den PEGs nicht erforderlich, wird aber durchgeführt, da unter Umständen simultan auch die Drogen bestimmt werden können.

Flüssig-EXtraktion

100 pl Urinprobe werden wie oben beschrieben hydrolysiert.

Nach der Hydrolyse wird die Probe mit 1,6 ml gesättigter NaCI-Lösung und 25 pl 3 M NH3 in ein verschraubbares Glasröhrchen gegeben und mit 2 ml Ethylacetat/Dichlormethan (1:1) versetzt. Die Probe wird 10 min. am Überkopfschüttler vermischt. Dann wird zentrifugiert und der Überstand in ein Glasröhrchen gegeben. Anschließend wird die Probe bis zur Trocknung im Stickstoffstrom oder mit Luft abgedampft. Der Rückstand wird zuerst mit 25 pl Methanol und dann mit 75 pl H2O gelöst. Die gelösten Proben werden in Vials mit Mikroinsert gefüllt und verschlossen. 5 pl Probe werden in die LCMS/MS injiziert.

Kontrollmaterial

Da keine kommerziellen Kontrollen mit Curcumin erhältlich sind, wird eine eigene Kontrolle hergestellt, die neben den Drogen, Suchtstoffen und PEGs auch Curcumin in einer Konzentration von 20 - 50 ng/ml enthält. Der Nachweis des Curcumins ist qualitativ, daher wird keine Kalibration durchgeführt. Es steht aber jedem Labor frei, Curcumin zu quantifizieren.

Ergebnisse

Proben, in denen kein Marker gefunden wurde, werden aus dem original Urinröhrchen wiederholt. Ein bestätigtes negatives Markerergebnis wird als negativ befundet mit dem Hinweis, dass auch bei zu kurzer Wartezeit zwischen Einnahme der Markersubstanzen und Urinabgabe ein negativer Befund die Folge sein kann. Ebenso werden positive Curcumin- Urine erneut aus dem Originalgefäß gemessen. Ein bestätigtes positives Curcuminergebnis wird als Manipulation durch Zuspucken der Markerlösung zu einem anderen Urin bewertet.