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Patent Searching and Data


Title:
METAL COMPLEXES WITH CHARGED LINKER
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1996/003409
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention concerns novel metal complexes with charged linker and the use of such complexes as luminescent marker groups in immunoassays.

Inventors:
Josel
Hans-peter, H�ss
Eva, Ofenloch-h�hnle
Beatus, Seidel
Christoph, Upmeier
Barbara, Wienhues
Ursula-henrike
Application Number:
PCT/EP1995/002920
Publication Date:
February 08, 1996
Filing Date:
July 24, 1995
Export Citation:
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Assignee:
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH JOSEL
Hans-peter, H�ss
Eva, Ofenloch-h�hnle
Beatus, Seidel
Christoph, Upmeier
Barbara, Wienhues
Ursula-henrike
International Classes:
G01N33/532; C07F11/00; C07F13/00; C07F15/00; C07F19/00; C07K14/00; C07K14/16; C07K14/18; C09K11/06; C12Q1/68; G01N33/533; G01N33/543; G01N33/58; G01N33/68; G01N33/92; (IPC1-7): C07F15/00; C12Q1/68; G01N33/58; C07F19/00
Domestic Patent References:
WO1986002734A11986-05-09
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Claims:
Patentansprüche
1. Metallkomplexe mit der allgemeinen Formel (I) : worin M ein zwei oder dreiwertiges Metallkation ausgewählt aus Seltenerde oder Übergangmetallionen ist, L1# L2 und L3 gleich oder verschieden sind und Ligan¬ den mit mindestens zwei stickstoffhaltigen Hetero¬ cyclen bedeuten, wobei Llf L2 und L3 über Stickstoff¬ atome an das Metallkation gebunden sind, X eine reaktive funktioneile Gruppe ist, die an min¬ destens einen der Liganden L1 L2, L3 kovalent über einen Linker gebunden ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und A die gegebenenfalls zum Ladungsausgleich erforderli¬ chen Gegenionen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker mindestens einen positiven oder/und negativen Ladungsträger enthält.
2. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallkation M ein Ruthenium, Rhenium, Osmium, Chrom¬ oder Iridiumion ist.
3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallkation M ein Rutheniumion ist.
4. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Liganden L, L2, L3 Bipyridin oder/und PhenanthrolinRingsysteme enthalten.
5. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die reaktive funktioneile Gruppe X ein Carbonsäurehalogenid, ein Carbonsäureanhydrid, Aktiv¬ ester, ein Maleimid oder eine photoaktivierbare Gruppe ist.
6. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Gegenionen A Hexafluorophosphat, Trifluoracetat oder TetrafluoroboratGruppen sind.
7. Komplex nach einem der Ansprüche 16, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker mindestens einen negativen Ladungsträger, ausgewählt aus Phosphat, Phosphonat, Sulfonat und Carboxylatgruppen enthält.
8. Komplex nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker mindestens eine Carboxylatgruppe enthält.
9. Komplex nach einem der Ansprüche 16, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker mindestens einen positiven Ladungsträger, ausgewählt aus Amino und substituierten Aminogruppen enthält.
10. Komplex nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Amino und substituierten Aminogruppen als Elektronendonor für den Metallkomplex dienen können.
11. Komplex nach einem der Ansprüche 110, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker bis zu 10 Ladungsträger enthält.
12. Komplex nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker 28 Ladungsträger enthält.
13. Komplex nach einem der Ansprüche 112, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker zumindest teilweise aus Aminocarbonsäure Einheiten aufgebaut ist, die über Peptidbindungen mit¬ einander verknüpft sind.
14. 1Komplex nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Ladungsträger von polyfunktionellen Aminocarbon¬ säuren stammen, die nach Einbau in den Linker noch mindestens einen freien Ladungsträger enthalten.
15. Komplex nach Anspruch 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Ladungsträger von trifunktionellen Aminocarbon¬ säuren stammen, die (a) eine Aminogruppe und zwei Carboxylatgruppen oder (b) zwei Aminogruppen und eine Carboxylatgruppe ent¬ halten.
16. Komplex nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die trifunktionellen Aminocarbonsäuren ausgewählt sind aus Lysin, Ornithin, Hydroxylysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure.
17. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 16 mit der all¬ X (III) worin M, X und A wie in Anspruch 1 definiert sind, R1# R2, R3, R4, R5 und R6 gleich oder verschieden sind und jeweils einen oder mehrere Substituenten bedeuten, unter der Voraussetzung, daß X über einen der Substituenten Ri/ R2' R3 R4 R5 °der R6 als Linker an einen der Ligan¬ den gebunden ist.
18. Komplex nach Anspruch 17 mit der allgemeinen Formel (lila) : worin M, X und A wie in Anspruch 1 definiert sind, R1 , R2, R3, R4 und R5 wie in Anspruch 16 definiert sind, s eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und Y den Linker bedeutet.
19. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 16 mit der all¬ gemeinen Formel (IV) : worin M, X, n und A wie in Anspruch 1 definiert sind, R , R2 und R3 gleich oder verschieden sind und jeweils einen oder mehrere Substituenten bedeuten und Y jeweils einen Linker mit mindestens einem Ladungsträger bedeu¬ tet.
20. Konjugat, umfassend eine biologische Substanz, an die mindestens ein Metallkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 19 gekoppelt ist.
21. Konjugat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Substanz Biotin, ein Antikörper oder Antikörperfragment, eine Nukleinsäure, ein Polypeptidan tigen, ein immunologisch reaktives Peptid oder ein Hapten ist.
22. Verwendung von Metallkomplexen nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder Konjugaten nach Anspruch 20 oder 21 in einem immunologischen Nachweisverfahren oder in einem NukleinsäureHybridisierungsverfahren.
23. Verwendung nach Anspruch 22 in einem Lumineszenzver¬ fahren.
24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23 in einem Elektroche milumineszenzverfahren.
25. Markierungs oder/und Festphasenbindungsgruppen mit einer kovalent über einen Linker gebundenen, reaktiven funktioneilen Gruppe X, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker mindestens einen positiven oder/und negativen Ladungsträger enthält.
26. Markierungs oder/und Festphasenbindungsgruppen nach Anspruch 25, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Linker zumindest teilweise aus Aminocarbonsäure Einheiten aufgebaut ist, die über Peptidbindungen mit¬ einander verknüpft sind.
27. Gruppen nach Anspruch 25 oder 26, ausgewählt aus Fluo¬ reszenzMarkierungsgruppen.
28. Gruppen nach Anspruch 25 oder 26, ausgewählt aus Fluo rescein, Cumarin, Rhodamin, Resorufin, Cyanin und Deri¬ vaten davon.
29. Gruppen nach Anspruch 25 oder 26, ausgewählt aus Biotin und Biotinanaloga.
30. Konjugat, umfassend eine biologische Substanz, an die mindestens eine Markierungs oder/und Festphasenbin dungsgruppe nach einem der Ansprüche 25 bis 29 gekoppelt ist.
31. Verwendung von Markierungs oder/und Festphasenbindungs¬ gruppen nach einem der Ansprüche 25 bis 29 oder Kon jugaten nach Anspruch 30 in einem immunologischen Nach¬ weisverfahren oder in einem NukleinsäureHybridisie rungsverfahre .
32. Verwendung nach Anspruch 31 zur Verbesserung der Lös¬ lichkeit von Markierungs oder Festphasenbindungsgruppen bzw. deren Konjugaten.
33. Verwendung nach Anspruch 31 zur Verringerung eines Signalquenching aufgrund der Bildung von Aggregaten.
34. Verfahren zur Einführung einer NHydroxysuccinimidester gruppe in Peptide oder Peptidderivate, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man ein Peptid oder PeptidDerivat, das eine freie Aminofunktion aufweist, mti Korksäurebishydroxysuccin imidester umsetzt, wobei die Aminofunktion in einen N Hydroxysuccinimidester überführt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Peptid oder Peptidderivat mindestens eine freie Säurefunktion aufweist.
36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man ein Peptidderivat umsetzt, das mindestens eine Markierungs oder/und Festphasenbindungsgruppe trägt.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base durchführt.
Description:
Metallkomplexe mit geladenem Linker

B e s c h r e i b u n g

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Metallkomplexe mit geladenem Linker und deren Verwendung als lumineszierende Markierungsgruppen im Immunoassays.

Lumineszierende Metallkomplexe sind aus dem Stand der Technik bekannt. EP-A-0 178 450 offenbart Rutheniumkomplexe, die an ein immunologisch aktives Material gekoppelt sind, wobei die Rutheniumkomplexe drei gleiche oder verschiedene bi- oder polycyclische Liganden mit mindestens zwei stickstoffhaltigen Heterocyclen enthalten, wobei mindestens einer dieser Ligan¬ den mit mindestens einer wasserlöslich machenden Gruppe, wie -S0 3 H oder -COOH substituiert ist, und wobei mindestens einer dieser Liganden mit mindestens einer reaktiven Gruppe wie -COOH direkt oder über eine Spacergruppe substituiert ist und wobei die Liganden über Stickstoffatome an das Ruthenium gebunden sind.

Die Einführung der kopplungsfähigen Gruppen erfolgt sehr umständlich durch Aktivierungs- und Folgereaktionen an den löslich machenden Gruppen der Liganden. Als besonders um¬ ständlich erweist sich auch die Herstellung monoaktivierter Verbindungen, die eine Kopplung mit biologischen Substanzen, z.B. Antikörpern ohne Vernetzung erlauben.

EP-A-0 580 979 offenbart die Verwendung von Osmium- oder Rutheniumkomplexen als Markierungsgruppen für die Elektroche- ilumineszenz. Als Liganden für diese Komplexe werden stick¬ stoffhaltige Heterocyclen, beispielsweise. Bipyridine, ge¬ nannt. WO 87/06706 offenbart weitere Metallkomplexe, die sich als Markierungsgruppen für Elektrochemilumineszenzmessungen eignen.

Weitere Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Metallkomplexe bestehen in einer schlechten Quantenausbeute bei Elektrochemilumineszenzmessungen durch Sauerstoff- Quenching und Photodissoziation oder/und in einer hohen unspezifischen Bindung an Proteine.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise zu beseitigen.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Einführung von freien positiven oder/und negativen Ladungsträgern in den Linker, der die reaktive kopplungsfähige Gruppe des Metall- komplexes mit einem der Liganden verbindet, die Adsorption von Konjugaten dieser Komplexe mit einer immunologisch reak¬ tiven Substanz verringert und damit auch die Stabilität und Wiederfindung der Konjugate in Immunoassays verbessert. Überdies kann eine erhöhte Quantenausbeute erzielt werden.

Weiterhin wurde gefunden, daß lumineszierende Metallkomplexe mit geladenem Linker auf überraschend einfache Weise herge¬ stellt werden können.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Metallkomplex mit der allgemeinen Formel (I) :

[M(L-L 2 I. 3 )] n - X m A (I)

worin M ein zwei- oder dreiwertiges Metallkation ausgewählt aus Seltenerde- oder Übergangmetallionen ist, L 1# L 2 und L 3 gleich oder verschieden sind und Liganden mit mindestens zwei stickstoffhaltigen Heterocyclen bedeuten, wobei L x , L 2 und L 3 über Stickstoffatome an das Metallkation gebunden sind, X eine reaktive funktioneile Gruppe ist, die an mindestens einen der Liganden L- . , L 2 , L 3 kovalent gebunden ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, m eine ganze Zahl von 1 bis 6 und vorzugsweise von 1 bis 3 ist und A die gegebenenfalls zum

Ladungsausgleich erforderlichen Gegenionen bedeutet, wobei der Linker mindestens einen positiven oder/und negativen Ladungsträger enthält.

Der Metallkomplex ist vorzugsweise ein lumineszierender Metallkomplex, d.h. ein Metallkomplex, der eine nachweisbare Lumineszenzreaktion erzeugen kann. Der Nachweis dieser Lumi¬ neszenzreaktion kann beispielsweise durch Fluoreszenz- oder durch Elektrochemilumineszenzmessung erfolgen. Das Metall- kation in diesem Komplex ist beispielsweise ein Übergangs¬ metall oder ein Seltenerdenmetall. Vorzugsweise ist das Metall Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdän, Techneticum, Kupfer, Chrom oder Wolfram. Besonders bevorzugt sind Ruthenium, Iridium, Rhenium, Chrom und Osmium. Am meisten bevorzugt ist Ruthenium.

Die Liganden L 1# L 2 und L 3 sind Liganden mit mindestens zwei stickstoffhaltigen Heterocyclen. Bevorzugt sind aromatische Heterocyclen wie z.B. Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenanthrolyl. Besonders bevorzugt werden die Liganden L x , L 2 und L 3 aus Bipyridin- und Phenanthrolin-Ringsyste en ausge¬ wählt.

Die reaktive funktioneile Gruppe X des Komplexes ist eine reaktive Gruppe, die mit einer immunologisch aktiven Substanz gekoppelt werden kann. Vorzugsweise ist die Gruppe X eine aktivierte Carbonsäuregruppe wie etwa ein Carbonsäurehaloge- nid, ein Carbonsäureanhydrid oder ein Aktivester, z.B. ein N-Hydroxysuccinimid-, ein p-Nitrophenyl-, Pentafluorphenyl-, Imidazolyl- oder N-Hydroxybenzotriazolylester, ein Maleimid oder eine photoaktivierbare Gruppe, z.B. ein Azid. Vorzugs¬ weise enthält der Komplex nur eine einzige funktioneile Gruppe X.

Weiterhin kann der Komplex gegebenenfalls eine oder mehrere zum Ladungsausgleich erforderliche Gegenionen A enthalten.

Beispiele für geeignete negativ geladene Gegenionen sind Halogenide, OH " , Carbonat, Alkylcarboxylat, z. B. Trifluor- acetat, Sulfat, Hexafluorophosphat- und Tetrafluoroborat- Gruppen. Hexafluorophosphat-, Trifluoracetat- und Tetrafluo- roborat-Gruppen sind besonders bevorzugt. Beispiele für geeignete positiv geladene Gegenionen sind monovalente Kationen wie etwa Alkalimetall- und Ammoniumionen.

Der erfindungsgemäße Metallkomplex unterscheidet sich von den aus dem Stand der Technik bekannten Metallkomplexen dadurch, daß er im Linker zwischen dem Liganden und der reaktiven kopplungsfähigen Gruppe X mindestens einen Ladungsträger enthält. Der Begriff "Ladungsträger" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Gruppe, die bei einem pH-Wert im Bereich von 6 - 8 überwiegend in ionischer Form vorliegt. Der Linker enthält vorzugsweise bis zu 10, besonders bevor¬ zugt 2-8 und am meisten bevorzugt 2-4 solcher Ladungsträger.

Besonders bevorzugt enthält der Linker mindestens einen negativen Ladungsträger. Beispiele für geeignete negative Ladungsträger sind Phosphat-, Phosphonat-, Sulfonat- und Carboxylatgruppen, wobei Carboxylatgruppen am meisten bevor¬ zugt sind.

Beispiele für positive Ladungsträger sind Amino- und ein- oder mehrfach substituierte Aminogruppen, wie etwa Mono-, Di¬ oder Trialkylaminogruppen, wobei Alkyl einen geraden oder verzweigten Alkylrest von 1-6 C-Atomen oder einen zyklischen Alkylrest von 3-6 C-Atomen bedeutet. Besonders bevorzugt werden die positiven Ladungsträger aus basischen Aminosäuren wie etwa Lysin oder substituierten Aminosäuren wie etwa Diethyllysin ausgewählt. Amine und substituierte Amine können auch als Elektronendonoren beim Nachweis der Metallkomplexe durch Elektrochemilumineszenz dienen.

Der Linker hat eine Kettenlänge von vorzugsweise 4-40 Atomen und ist eine durch Einbau von Heteroatomen, z.B. Amidfunktio-

nen, modifizierte Alkylenkette. Die Ladungsträger sind im Linker vorzugsweise derart angeordnet, daß ein H-Atom einer Alkyleneinheit durch eine geladene Gruppe, z.B. NH 2 * oder C0 : ersetzt ist.

Vorzugsweise ist der Linker, der die freien Ladungsträger enthält, zumindest teilweise aus Aminocarbonsäure-Einheiten aufgebaut, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Bei einem derartigen Linker können die Ladungsträger aus freien Amino- oder/und Carboxylatgruppen von polyfunktio- nellen Aminocarbonsäuren stammen, die insgesamt mindestens 3 geladene Gruppen (Amino- plus Carboxylat) enthalten, so daß nach Einbau in den Linker und damit verbundener Reaktion von 2 der geladenen Gruppen noch mindestens ein freier Ladungs¬ träger vorhanden ist. Beispielsweise können die Ladungsträger von trifunktionellen Aminocarbonsäuren stammen, die (a) eine Aminogruppe und 2 Carboxylatgruppen oder (b) 2 Aminogruppen und eine Carboxylatgruppe enthalten. Beispiele für derartige trifunktionelle Aminocarbonsäuren sind Lysin, Omithin, Hydroxylysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Der erfindungsgemäße Metallkomplex kann weiterhin mindestens eine hydrophile Gruppe ausgewählt aus C 2 -C 3 -Alkylenoxy-Ein- heiten, C 2 -C 3 -Alkylenthio-Einheiten, C 2 -C 3 -Alkylenamino-Ein- heiten und Polyhydroxy-Einheiten enthalten.

Die Polyhydroxy-Einheiten werden vorzugsweise aus Gruppen der Formeln (Ha) oder (Ilb) ausgewählt:

-NR-W (Ha) -O-W (Ilb)

worin W einen organischen Rest mit mindestens zwei Hydroxy- gruppen und R Wasserstoff oder C 1 -C 5 -Alkyl bedeutet. Der organische Rest W enthält vorzugsweise 2 bis 6 und besonders bevorzugt 2 bis 4 Hydroxygruppen. Weiterhin sollte W gün¬ stigerweise 2 bis 10 und insbesondere 3-6 Kohlenstoffatome

enthalten. Spezifische Beispiele für geeignete Polyhydroxy- Einheiten sind Reste von Polyalkoholen wie etwa Glycerin oder Aminopolyalkoholen. Ein bevorzugter Aminopolyalkohol ist Tris (2-Amino-2- (hydroxymethyl) -1, 3-propantriol) . In diesem Fall weist die Polyhydroxy-Einheit die Formel NH-C(CH 2 OH) 3 auf. Die Polyalkohole bzw. Aminopolyalkohole sind an dem Metallkomplex vorzugsweise in Form von Estern bzw. Amiden gekoppelt. Die OH-Gruppen der Polyalkohole bzw. Aminopolyalkohole können gegebenenfalls durch hydrophile Gruppen, z.B. durch dendri- mere Gruppen substituiert sein.

Die C 2 -C 3 -Alkylenoxy-, C 2 -C 3 -Alkylenthio- und C 2 -C 3 -Alkylen- amino-Einheiten des erfindungsgemäßen Metallkomplexes sind vorzugsweise C 2 -Einheiten und insbesondere Ethylenoxy-Ein- heiten. Der Komplex enthält pro Metallkation vorzugsweise 1 bis 30 und besonders bevorzugt 2 bis 20 C 2 -C 3 -Alkylenoxy-, C 2 - C 3 -Alkylenthio- bzw. C 2 -C 3 -Alkylenamino-Einheiten. Diese Ein¬ heiten sind Bestandteile von Substituenten der heterocycli- schen Liganden des Metallkomplexes. Sie können im Linker zwischen einem der Liganden und der reaktiven funktioneilen Gruppe X oder/und in einfachen Substituenten vorliegen. Die Alkylenoxy-, Alkylenthio-bzw. Alkylenamino-Einheiten können auch über einen Brückenkopf miteinander verknüpft sein, der gegebenenfalls eine funktionelle Gruppe X tragen kann. Ande¬ rerseits können über den Brückenkopf auch mehrere Komplex- Einheiten miteinander verknüpft sein.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt der erfindungsgemäße Metallkomplex die allgemeine Formel

] - X in:

worin M, X und A wie vorstehend definiert sind, R lf R 2 , R 3 , R Λ , R 5 und R 6 gleich oder verschieden sind und jeweils einen oder mehrere Substituenten bedeuten, unter der Voraussetzung, daß X über einen der Substituenten R-, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 oder R 6 als Linker an einen der Liganden gebunden ist.

Die Liganden des Komplexes sind je nach Anwesenheit bzw. Abwesenheit der durch gebrochene Linien bezeichneten Gruppen gegebenenfalls substituierte Phenanthrolin- bzw. Bipyridinsy- steme.

Die Substituenten R 1; R 2 , R 3 , R 4 , R 5 und R 6 an den Liganden sind - sofern sie nicht den Linker der Gruppe X enthalten - vorzugsweise Wasserstoff, kyl, oder eine hydrophile Gruppe wie oben definiert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzen die Metallkomplexe die allgemeine Formel (lila) :

worin M, X und A wie vorstehend definiert sind, R 1( R 2 , R 3 , R 4 und R s wie vorstehend definiert sind, s eine ganze Zahl von 0 bis 6 vorzugsweise von 1 bis 4 ist und Y den Linker mit freien Ladungsträgern bedeutet.

Beispiele für Verbindungen der Formeln (III) bzw. (lila) sind in Abb. 1-3 dargestellt. Abb. 1 und 2 zeigen Komplexe, die einen Linker mit jeweils einem freien negativen Ladungsträger

aufweisen. Der Linker enthält jeweils eine trifunktionelle Aminosäure, nämlich Lysin, deren Aminogruppen zur Ausbildung von Peptidbindungen im Linker dienen, während die Carboxylat¬ gruppe den freien Ladungsträger bildet. Abb. 3 zeigt einen Linker, aus 4 Aminosäure-Einheiten, nämlich ß-Alanin, Lysin und zweimal Glutaminsäure aufgebaut ist. Der Linker enthält 3 negative Ladungsträger, jeweils eine Carboxylatgruppe von den beiden Glu-Resten und eine Carboxylatgruppe, die von Lys stammt. Die funktioneile Gruppe X ist in Abb. 1 und 3 ein zur Kopplung an SH-Gruppen geeignetes Maleimid und in Abb. 2 ein zur Kopplung an NH 2 -Gruppen geeigneter N-Hydroxysuccinimid- ester.

Die Liganden des erfindungsgemäßen Metallkomplexes können auch miteinander verknüpft sein, so daß der Metallkomplex in Form eines Halbkäfigs bzw. Käfigs vorliegt. Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Metallkomplexes in Form eines Halbkäfigs oder Käfigs besitzt die allgemeine Formel (IV) : ^

worin M, X, n und A wie vorstehend definiert sind, R lf R 2 und R 3 gleich oder verschieden sind und jeweils einen oder meh¬ rere Substituenten - wie vorstehend definiert - an dem Bipy- ridin- oder Phenanthrolin-Liganden bedeuten und Y jeweils einen Linker mit mindestens einem Ladungsträger bedeutet.

Wenn die Substituenten R 1# R 2 und R 3 in Formel (IV) und gege¬ benenfalls über Linkergruppen kovalent miteinander verknüpft

sind, dann besitzt der Komplex der Formel (IV) die Form eines Käfigs.

Der Komplex der Formel (IV) kann nicht nur als Monomer, sondern als Oligomer aus vorzugsweise bis zu 5 einzelnen Metallkomplexen vorliegen. Hierzu kann die funktioneile kopplungsfähige Gruppe X beispielsweise ein Substituent an einem aromatischen Kern, z.B. einem Phenylkern sein, wobei zwei oder mehr der restlichen Substituentenpositionen des aromatischen Kerns durch einen halbkäfig- bzw. käfigförmigen Metallkomplex substituiert sein können.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe kann durch Reaktion eines Metallsalzes, z.B. eines Metallhaloge- nids mit den entsprechenden Liganden und ggf. anschließenden Austausch des Halogenidions durch Hexafluorophosphat-, Tri- fluoracetat- oder Tetrafluoroborat-Anionen erfolgen. Der¬ artige Verfahren sind im Stand der Technik, z.B. in EP-B- 0 178 450 und EP-B-0 255 534 beschrieben. Auf diese Offenba¬ rung wird hiermit Bezug genommen.

Der Aufbau eines geladenen Linkers an einem N-heterocycli- schen Liganden mit einem geladenen Linker kann einerseits als Kopplungsreaktion in Lösung durchgeführt werden, wobei eine gegebenenfalls partiell geschützte Aminocarbonsäure an eine reaktive Gruppe des Liganden, z.B. eine Carbonsäure, gekop¬ pelt wird. Dieser Kopplungsabschnitt kann gegebenenfalls nochmals wiederholt werden, bis ein Linker mit der gewünsch¬ ten Länge aufgebaut ist. Dabei wird mindestens eine polyfunk- tionelle Aminocarbonsäure eingeführt, die eine oder mehrere geladene Seitengruppen enthält.

Anschließend wird die reaktive Gruppe X eingeführt und gege¬ benenfalls vorhandene Schutzgruppen auf den Seitengruppen der Aminocarbonsäuren werden abgespalten. Dieser Aufbau des Liganden durch sukzessive Ankopplung von Aminosäuren in Lösung kann einerseits an einem einzelnen Liganden und ande-

rerseits an einem bereits an einen Metallkomplex gebundenen Liganden als Ausgangsmaterial erfolgen. Ein geeignetes Aus¬ gangsmaterial ist z.B. ein lumineszierender Metallkomplex, der eine freie Carboxylatgruppe enthält. Derartige Komplexe sind aus den obengenannten Dokumenten bekannt und werden auch z.B. von der Firma Igen Inc., Rockville, MD, USA kommerziell angeboten.

Andererseits kann die Herstellung der Komplexe auch durch Festphasen-Peptidsynthese erfolgen. In einer ersten Ausfüh¬ rungsform der Festphasensynthese wird eine Aminosäure über ihre Carboxylatgruppe an den Festphasenträger gekoppelt und dann durch sukzessive Kopplung weiterer Aminosäuren der gewünschte Linker aufgebaut. Zur Herstellung eines erfin¬ dungsgemäßen Linkers wird dabei mindestens eine Aminosäure verwendet, die als Seitengruppe eine geladene Gruppe, z.B. eine Amino- oder eine Carboxylatgruppe, gegebenenfalls in geschützter Form enthält. Nach Fertigstellung der gewünschten Linkersequenz kann ein aktivierter Metallkomplex, z.B. als Aktivester, an die freie N-terminale Aminogruppe des fest- phasengebundenen Peptids gekoppelt werden. Nach Abspaltung von der Festphase kann die reaktive Gruppe X an den Carboxy- terminus des Peptidlinkers gekoppelt und gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden.

In einer anderen Ausführungsform der Festphasensynthese kann ein Aminosäure-Metallkomplex-Konjugat, das eine geschützte Aminogruppe und eine Carboxylatgruppe enthält, z.B. Fmoc-Lys (BRu) -OH (Abb. 4) über die freie Carboxylatgruppe an eine Festphase verankert werden und nach Freisetzung der blockier¬ ten Aminogruppe ein Peptidlinker aufgebaut werden. Nach Fertigstellung der gewünschten Linkersequenz wird der Komplex von der Festphase abgespalten, wobei ein Linker erhalten wird, der zumindest die ursprüngliche Carboxylatankergruppe als freien Ladungsträger enthält. Die reaktive Gruppe X kann an den Aminoterminus des resultierenden Peptidlinkers gekop¬ pelt werden.

In einer dritten Ausführungsform der Festphasensynthese kann die Linkersequenz mit Ladungsträgern auch direkt an ein ausgewähltes Peptidepitop synthetisiert werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe kann auch eine Kombination der obengenannten Synthesevarianten erfolgen. Aminosäure-Metallkomplex-Konjugate, die zur Fest¬ phasensynthese der erfindungsgemäßen Komplexe mit geladenem Linker geeignet sind, werden in DE-A-44 30 998.8 beschrieben. Auf diese Offenbarung wird hiermit Bezug genommen.

Die Herstellung von Metallkomplexen der Formel (IV) mit Halbkäfig- oder Käfigstruktur kann beispielsweise erfolgen durch Anfügen von geladenen Linkern an die Bipyridin- oder Phenanthrolinliganden und Knüpfung dieser Einheiten an einen Brückenkopf über eine Amidbindung. Bei Verwendung von zwei Brückenköpfen können vollständige Käfigstrukturen erhalten werden. Bevorzugt ist die Knüpfung von drei Liganden an einen trivalenten Brückenkopf, z.B. Tris.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat, umfassend eine biologische Substanz, an die minde¬ stens ein erfindungsgemäßer Metallkomplex gekoppelt ist. Beispiele für geeignete biologische Substanzen sind Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Proteine, Lipoproteine, Glyco- proteine, Peptide, Polypeptide, Nukleinsäuren, peptidische Nukleinsäuren (PNA) , Oligosaccharide, Polysaccharide, Lipo- polysaccharide, zelluläre Metaboliten, Haptene, Hormone, phar akologische Wirkstoffe, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren und Zucker.

Die Kopplung des Metallkomplexes mit der biologischen Sub¬ stanz erfolgt über die reaktive funktioneile Gruppe des Metallkomplexes, die mit einer funktionellen Gruppe der biologischen Substanz kovalent kuppeln kann. Wenn die funk¬ tioneile Gruppe ein Aktivester ist, kann beispielweise eine Kopplung mit freien Aminogruppen der biologischen Substanz

erfolgen. Wenn die funktioneile Gruppe ein Maleimidrest ist, kann eine Kopplung mit freien SH-Gruppen der biologischen Substanz erfolgen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie¬ genden Erfindung werden die Metallkomplexe an ein Peptid gekoppelt, das vorzugsweise eine Länge von maximal 50 Amino¬ säuren und besonders bevorzugt von maximal 30 Aminosäuren aufweist. Die Herstellung dieser Metallkomplex-markierten Peptide erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man ein Peptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz an einer Festphase synthe¬ tisiert, wobei man a) nach der Synthese einen aktivierten Me¬ tallkomplex, vorzugsweise ein Metallkomplex-Aktivesterderivat an die N-terminale Aminogruppe des Peptids koppelt oder/und b) während der Synthese an mindestens einer Position des Pep¬ tids ein Aminosäurederivat einführt, das kovalent mit einem Metallkomplex gekoppelt ist. Die Kopplung des Metallkomplexes an die N-terminale Aminosäure des Peptids erfolgt vorzugs¬ weise vor Abspaltung des Peptids von der Festphase und vor einer Abspaltung von Schutzgruppen an reaktiven Seitengruppen der zur Peptidsynthese verwendeten Aminosäurederivate.

Die Peptide enthalten vorzugsweise einen immunologisch reak¬ tiven Epitopbereich und einen Spacerbereich, wobei indesens eine Metallkomplex-Markierungsgruppe an den Spacerbereich gekoppelt wird. Der Spacerbereich weist vorzugsweise eine Länge von 1 bis 10 Aminosäuren auf und ist am Amino- oder/und Carboxyterminus des Peptids angeordnet.

Der Spacerbereich enthält vorzugsweise Aminosäuren, die Ladungen aufweisen oder/und Wasserstoffbrücken ausbilden können. Die Aminosäuren des Spacerbereichs werden vorzugs¬ weise gebildet aus der Gruppe bestehend aus Glycin, ß-Alanin, γ-Aminobuttersäure, e-Aminocapronsäure, Lysin und Verbindun¬ gen der Strukturformel NH 2 - [ (CH 2 ) y O] x -CH 2 -CH 2 -COOH, worin y 2 oder 3 ist und x 1 bis 10 ist.

Die Epitopbereiche der Peptide stammen vorzugsweise aus pathogenen Organismen, z.B. Bakterien, Viren, und Protozoen, oder aus Autoimmun-Antigenen. Besonders bevorzugt stammt der Eptitopbereich aus viralen Antigenen, z.B. den Aminosäurese¬ quenzen von HIVI, HIVII oder Hepatitis C-Virus (HCV) .

Weitere bevorzugte Beispiele für biologische Substanzen sind Biotin, Nukleinsäuren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Polypeptidantigene, d.h. immunologisch reaktive Polypeptide, oder Haptene, d.h. organische Moleküle mit einem Molkularge- wicht von 150 bis 2000, insbesondere Moleküle mit einem Steroidgrundgerüst, wie etwa Cardenolide, Cardenolid-Glyco- side (z.B. Digoxin, Digoxigenin) , Steroid-Alkaloide, Sexual¬ hormone (z.B. Progesteron), Glucocorticoide etc. Weitere Beispiele für Haptene sind Prostaglandine, Leucotriene, Leuco-en-diine, Thromboxane etc.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe, bzw. der erfindungsgemäßen Konjugate in einem immunologischen Nach¬ weisverfahren oder einem Nukleinsäure-Hybridisierungsver- fahren, insbesondere in einem Lumineszenz-Assay.

Dabei wird der Metallkomplex als Markierungsgruppe verwendet, mit deren Hilfe die qualitative oder/und quantitative Bestim¬ mung eines Analyten in einer Probelösung möglich ist. Der Nachweis des Metallkomplexes erfolgt vorzugsweise durch Elektrochemilumineszenz, wobei lumineszierende Spezies elek¬ trochemisch an der Oberfläche einer Elektrode erzeugt werden. Beispiele zur Durchführung von Lumineszenz-Assays mit Metall- komplexen des Standes der Technik finden sich in EP-A-0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 und WO 92/14138. Auf die dort offenbarten Verfahren und Vorrichtungen für Lumineszenz- Assays wird hiermit Bezug genommen. Die Elektrochemilumines¬ zenz-Assays werden in Gegenwart einer Festphase durchgeführt, die vorzugsweise aus Mikropartikeln, insbesondere aus magne¬ tischen Mikropartikeln besteht, die mit einer reaktiven

Beschichtung versehen sind, z.B. mit Streptavidin. Auf diese Weise können Immun- oder Hybridisierungskomplexe , die einen Metallkomplex als Markierungsgruppe enthalten, an die Fest- phase gebunden nachgewiesen werden.

Die Elektrochemilumineszenz-Messung wird vorzugsweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels für den Metallkomplex durchgeführt, z.B. einem Amin. Bevorzugt sind aliphatische Amine, insbesondere primäre, sekundäre und tertiäre Alkylami- ne, deren Alkylgruppen jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen. Besonders bevorzugt ist Tripropylamin. Das Amin kann jedoch auch ein aromatisches Amin, wie Anilin oder ein heterocyclisches Amin sein. Das Reduktionsmittel kann bereits in der Ligandensphäre des Komplexes integriert sein.

Weiterhin kann ggf. Verstärker ein nichtionisches oberflä¬ chenaktives Mittel, z.B. ein ethoxyliertes Phenol vorhanden sein. Derartige Substanzen sind beispielsweise kommerziell unter den Bezeichnungen Triton X100 oder Triton N401 erhält¬ lich.

Andererseits kann der Nachweis des lumineszierenden Metall¬ komplexes auch durch Fluoreszenz erfolgen, wobei das Metall- chelat durch Bestrahlung mit einem Licht der geeigneten Wellenlänge angeregt und die daraus resultierende Fluores¬ zenzstrahlung gemessen wird. Beispiele zur Durchführung von Fluoreszenz-Assays finden sich in EP-A-0 178 450 und EP-A-0 255 534. Auf diese Offenbarung wird hiermit Bezug genommen.

Das zuvor beschriebene Prinzip der Verwendung von Metallkom¬ plexen mit geladenen Linkern kann im übrigen auch auf andere Markierungs- oder/und Festphasenbindungsgruppen übertragen werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Markierungs- oder/und Festphasenbindungsgruppen mit einer kovalent über einen Linker gebundenen, reaktiven funktionellen Gruppe X, wobei der Linker mindestens einen positiven oder/und negativen Ladungsträger enthält. Vorzugs-

weise ist der Linker zumindest teilweise aus Aminocarbon¬ säure-Einheiten aufgebaut, die über Peptidbindungen mitein¬ ander verknüpft sind.

Die Markierungs- oder/und Festphasenbindungsgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Fluoreszenzmarkierungsgruppen, z.B. Fluorescein, Cumarin, Rhodamin, Resorufin, Cyanin und Derivaten davon, sowie aus Biotin und Biotinanaloga, wie etwa Iminobiotin oder Desthiobiotin.

Die Erfindung betrifft auch Konjugate der zuvor genannten Markierungs- oder/und Festphasenbindungsgruppen mit einer biologischen Substanz wie zuvor definiert. Die Markierungs¬ oder/und Festphasenbindungsgruppen bzw. deren Konjugate können in einem immunologischen Nachweisverfahren oder in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren eingesetzt wer¬ den. Dabei kann eine Verbesserung der Löslichkeit sowie eine Verringerung bzw. Verhinderung eines Signalquenching aufgrund der Bildung von Dimeren oder höheren Aggregaten erreicht werden.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung einer N-Hydroxysuccinimidester- gruppe in Peptide oder Peptidderivate, welches dadurch ge¬ kennzeichnet ist, daß man ein Peptid oder Peptidderivat, das eine freie Aminofunktion, vorzugsweise eine aliphatische und besonders bevorzugt eine primäre aliphatische Aminofunktion aufweist, mit Korksäure-bis-hydroxysuccinimidester (DSS) umsetzt, wobei die Aminofunktion in einen N-Hydroxysuccin- imidester überführt wird. Das durch Einführung der N-Hydroxy- succinimidestergruppe aktivierte Peptid oder Peptidderivat kann anschließend an biologische Substanzen wie zuvor defi¬ niert gekoppelt werden.

Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß Peptide oder Peptidderivate verwendet werden können, die mindestens eine freie Säurefunktion, insbesondere eine Carbonsäurefunk-

tion aufweisen. Im Gegensatz zu bekannten Verfahren ist eine Blockierung der Säurefunktion nicht erforderlich.

Neben Peptiden kann man auch solche Peptidderivate aktivie¬ ren, die mindestens eine Markierungs- oder/und Festphasenbin- dungsgruppe, z.B. einen Metallkomplex, eine Fluoreszenzgruppe oder eine Biotingruppe tragen.

Die Aktivierungsreaktion wird vorzugsweise in einem organi¬ schen Lösungsmittel, z.B. Dimethylformamid, in Gegenwart einer Base, z.B. einem tertiären Amin wie etwa Triethylamin, durchgeführt. Der Korksäure-bis-N-hydroxysuccinimidester wird vorzugsweise in einem molaren Überschuß von 2:1 bis 10:1 bezüglich des Peptids oder Peptidderivats eingesetzt.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch nachfolgende Beispiele und Abbildungen erläutert. Es zeigen:

Abb.1-3 erfindungsgemäße Metallkomplexe,

Abb. 4 ein zum Aufbau eines erfindungsgemäßen Metallkom¬ plexes geeignetes Aminosäure-Metallkomplex-Konju- gat, und

Abb. 5 ein aktiviertes Peptid-Metallkomplex-Konjugat.

Beispiel 1

Herstellung eines Metallkomplexes mit geladenem Linker

6 mmol des Metallkomplexes Ru(Bipyridin) 2 - (Bipyridin-CO-N- Hydroxysuccinimidester) gemäß EP-A-0 580 979 werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und dazu eine Lösung von Fmoc-Lysin in Dimethylformamid getropft. Das Lösungsmittel wird im Hoch¬ vakuum entfernt. Der Rückstand wird in wenig Aceton gelöst, mit 300 ml Chloroform versetzt und kurz zum Sieden erhitzt. Man läßt abkühlen und trennt das abgeschiedene Öl vom Lö¬ sungsmittel ab. Durch Trocknen erhält man die gewünschte Verbindung Ru(bpy) 2 (bpy-CO- (Fmoc) -Lys) als Festsubstanz.

Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgt durch Umsetzung in Dioxan/Aceton mit einem 4-fachen Überschuß an Piperidin für 2 Stunden bei 80°C. Nach dem Abkühlen trennt man den öligen Rückstand ab und führt eine Chloroform/Wasser-Ex¬ traktion durch. Die wäßrige Phase wird isoliert und man erhält die Verbindung Ru(bpy) 2 (bpy-CO-Lys) als roten Fest¬ stoff.

60 mg dieser Verbindung werden in 10 ml Aceton gelöst, Male- imidopropionsäure-N-Hydroxysuccinimidester zugefügt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wird über präparative HPLC gereinigt. Man erhält 17 mg der Verbindung Ru(bpy) 2 (bpy-CO-Lys-MP) . Diese Verbindung ist in Abb. 1 dargestellt.

Beispiel 2

Herstellung eines Metallkomplexes mit geladenem Linker

Ru(bpy) 2 (bpy-CO-Lys) gemäß Beispiel 1 und der 10-fache molare Überschuß an Korksäure-bis-N-hydroxysuccinimidester werden in Dimethylformamid gelöst und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Hochvakuum entfernt, der Rückstand mit Wasser extrahiert und nach Hexanbehandlung lyophilisiert. Die Reinigung erfolgt über HPLC (100% H 2 0, in 20 min. auf 100% Acetonitril, C 18 , 3 μm-Säule, Flußrate: 1 ml/min. , Reten- tionszeit: 10,00 min.). Die erhaltene Verbindung ist in Abb. 2 dargestellt.

Beispiel 3

Herstellung von Metallkomplexen über eine Festphasen-Peptid- synthese

Die Metallkomplexe mit geladenem Linker wurden mittels Fiuor- enylmethyloxycarbonyl- (Fmoc) -Festphasenpeptidsynthese an einem Batch-Peptidsynthesizer, z.B. von Applied Biosystems A431 oder A433, hergestellt. Dazu wurden jeweils 4.0 Äquiva-

lente der in Tabelle 1 dargestellten Aminosäurederivate verwendet:

Tabelle 1:

Bei der Variante (a) - Einführung des Metallkomplexes nach Beendigung der Festphasensynthese - wurde ein aktivierter Ruthenium(bipyridyl) 3 -Komplex (BPRu) , z.B. Ru(bpy) 2 (bpy-CO- NHS) (vgl. Beispiel 1) an die N-terminale Aminosäure des Peptids gekoppelt.

Gemäß Variante (b) erfolgte die Einführung von Metallchelat- gruppen in die Peptidsequenz durch direkten Einbau von Me- tallchelat-gekoppelten Aminosäurederivaten, z.B. am Carboxyl- terminus der Sequenz über einen mit Metallchelat-Aktivester e-derivatisierten Lysinrest, z.B. das Lysin-Derivat K3 (Abb. 4)

Die Aminosäuren oder Aminosäurederivate wurden in N-Methyl- pyrrolidon gelöst. Das Peptid wurde an 400-500 mg 4-(2',4'- Dimethoxyphenyl-Fmoc-Aminomethyl) -Phenoxy-Harz (Tetrahedron Letters 28 (1987) , 2107) mit einer Beladung von 0,4-0,7 mmol/g aufgebaut (JACS 95 (1973) , 1328) . Die Kupplungsreak¬ tionen wurden bezüglich des Fmoc-Aminosäurederivats mit 4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 4 Äquivalenten N- Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid als Reaktionsmedium während 20 min durchgeführt. Nach jedem Syntheseschritt wurde die Fmoc-Gruppe mit 20%igem Piperidin in Dimethylformamid in 20 min abgespalten.

Bei Anwesenheit von Cysteinresten in der Peptidsequenz er¬ folgte unmittelbar nach Beendigung der Synthese eine Oxida- tion an der Festphase mit Jod in Hexafluorisopropanol/Di- chlormethan.

Die Freisetzung des Peptids vom Träger und die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen erfolgte mit 20 ml Trifluoressig- säure, 0, 5 ml Ethandithiol, 1 ml Thioanisol, 1,5 g Phenol und 1 ml Wasser in 40 min bei Raumtemperatur. Die Reaktionslösung wurde anschließend mit 300 ml gekühltem Diisopropylether versetzt und zur vollständigen Fällung des Peptids 40 min bei 0°C gehalten. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Diiso-

propylether nachgewaschen, mit wenig 50 %-iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Das erhaltene Rohmaterial wurde mittels präparativer HPLC an Delta-PAK RP C18-Material (Säule 50 x 300 mm, 100 Ä, 15 μ) über einen entsprechenden Gradien¬ ten (Eluent A: Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in ca. 120 min. aufge¬ reinigt. Die Identität des eluierten Materials wurde mittels Ionenspray-Massenspektrometrie geprüft.

Die Einführung der Metallchelat-Markierung erfolgte gemäß Variante (a) über entsprechende Aktivester-Derivate an die freie N-terminale Aminogruppe des trägergebundenen Peptids. Hierzu wurden 4 Äquivalente Rutheniu (bipyridyl) 3 -Komplex (BPRu) pro freie primäre Aminofunktion, aktiviert mit N- Hydroxybenzotriazol/Dicyclohexylcarbodiimid und in wenig DMSO gelöst, zugetropft und bei Raumtemperatur gerührt. Der Umsatz wurde über analytische HPLC verfolgt. Nach Abspaltung vom Träger wurde das Produkt mittels präparativer HPLC aufgerei- nigt. Die Identität des eluierten Materials wurde mittels Ionenspray-Massenspektrometrie geprüft.

Die Herstellung der Peptide erfolgte auch durch eine Kom¬ bination von Variante (a) und (b) , d.h. Einbau von Metall- chelat-gekoppelten Aminosäurederivaten innerhalb der Sequenz, Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Gruppe und Reaktion der freien N-terminalen Aminogruppe mit einem Metallchelat-Aktiv- esterderivat.

Bei einem ausschließlich direkten Einbau der Metallchelat- gekoppelten Aminosäurederivate während der Festphasensynthese gemäß Variante (b) war eine nachträgliche Einführung von Metallchelat-Aktivestern nicht mehr erforderlich.

Ein Beispiel für einen durch Festphasensynthese hergestellten Metallkomplex ist in Abb. 3 gezeigt.

Zur Einführung der Maleinimidfunktion wurde das Peptid in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst und mit einem Äquivalent Maleinimidpropionsäure-N-hydroxysuccinimidester in DMSO ver¬ setzt und 16 h bei 25 °C gerührt. Der Ansatz wurde über präparative HPLC (siehe oben) aufgereinigt. Die Identität des eluierten Materials wurde mittels Ionenspray-Massenspektro¬ metrie geprüft. Die Einführung einer reaktiven-N-Hydroxy- succinimidesterfunktion erfolgte entsprechend DE-A-43 02 241.

Beispiel 4

Anwendung von Metallkomplexen mit geladenem Linker in immuno¬ logischen Tests

Es wurde ein Doppel-Antigen-Brückentest zum Nachweis spezifi¬ scher Antikörper gegen Hepatitis C-Virus (HCV) durchgeführt. Hierbei wurde die Probeflüssigkeit mit einem Ruthenium-mar¬ kierten Antigen und einem biotinylierten Antigen gegen den zu bestimmenden Antikörper in Gegenwart einer Streptavidin-be- schichteten Festphase inkubiert. Das Vorhandensein von Anti- HCV-Antikörpern in der Probeflüssigkeit wurde durch Bestim¬ mung der Markierung in der Festphase durch Elektrochemilumi- neszenz nach dem Flash-System bestimmt.

Als Antigen wurde ein HCV-Polypeptid, welches die Aminosäuren 1207-1488 von HCV enthält, verwendet. Die Aminosäuresequenz und Herstellung eines derartigen Polypeptids ist in DE-A-44 28 705.4 beschrieben.

Zur Derivatisierung des HCV-Polypeptids mit Succinimidester- aktivierten Rutheniumkomplexen wurde das Polypeptid in einem 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 0,1 % SDS in einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml gelöst. Durch Zusatz von 5 M NaOH wurde der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und die Lösung mit Dithiothreitol auf eine Endkonzentration von 2 mM aufge¬ stockt. Zu dieser Lösung wurde die der gewünschten Angebots- stöchiometrie entsprechende Menge eines Succinimidester- aktivierten Rutheniumkomplexes in DMSO zugegeben und an-

schließend für 60 min bei 65 °C unter Rühren inkubiert. Die Reaktion wurde durch Aufstocken des Reaktionsgemisches mit Lysin auf eine Endkonzentration von 10 mM und eine weitere Inkubation für 30 min abgestoppt. Anschließend wurde der Ansatz gegen 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 0,1 % SDS dialysiert. Die resultierende Proteinlösung wurde mit Sac¬ charose (Endkonzentration 6,5 % (w/v) ) versetzt und in Por¬ tionen lyophilisiert.

Zur Herstellung eines mit einem Maleinimid-aktivierten Ru¬ theniumkomplex derivatisierten HCV-Polypeptids wurde das Polypeptid in 100 M Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 0,1 % SDS (Proteinkonzentration 10 mg/ml) aufgenommen. Zu dieser Lösung wurde eine der gewünschten Angebotsstöchiometrie entspre¬ chende Menge des Maleinimid-aktivierten Rutheniumkomplexes in DMSO zugegeben und 60 min bie 25 °C unter Rühren inkubiert. Die Reaktion wurde durch Aufstocken des Reaktionsgemisches mit Cystein auf eine Endkonzentration von 10 mM und weitere Inkubation für 30 min abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde daraufhin wie oben beschrieben dialysiert, mit Saccharose versetzt und in Portionen lyophilisiert.

Es wurden 3 Experimente durchgeführt, in denen jeweils unter¬ schiedliche ruthenylierte Antigene eingesetzt wurden. Für Experiment A (Vergleich) wurde das Polypeptid an den in den Beispielen 1 und 2 als Ausgangsmaterial verwendeten Ruthe¬ nium-Komplex gemäß EP-A-0 580 979 in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:3 gekoppelt. Für Experiment B wurde das Polypeptid mit dem in Beispiel 1 hergestellten erfindungs¬ gemäßen Ruthenium-Komplex (Abb. 1) in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 gekoppelt. Für Experiment C wurde das Polypeptid mit dem in Beispiel 3 hergestellten Ruthenium- Komplex (Abb. 3) im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 gekoppelt. Als biotinyliertes Antigen wurde in allen 3 Expe¬ rimenten ein Polypeptid verwendet, das im stöchiometrischen Verhältnis von 1:6 an ein Maleinimid-aktiviertes Biotin gekoppelt worden war. Das ruthenylierte und das biotinylierte

Antigen wurden jeweils in einer Konzentration von 400 ng/ml Testflüssigkeit eingesetzt.

In Tabelle 4 ist das Ergebnis der Experimente A, B und C in ECL-Counts dargestellt. Es ist ersichtlich, daß erst die Verwendung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe mit geladenem Linker als Markierungsgruppen eine zuverlässige Unterschei¬ dung zwischen einer negativen Serumprobe und einer kritischen positiven Serumprobe erlaubt. Dies zeigt sich in einem höhe¬ ren Verhältnis positiv/negativ.

Tabelle 2

Experiment A (Vergleich) B C negative Probe 323317 1322ΘΘ 14467 positive Probe 465769 1323338 319752

Verhältnis 1,4 10 22 positiv/negativ

Beispiel 5

Anwendung von Metallkomplexen und Biotingruppen mit geladenem

Linker in immunologischen Tests

Es wurde ein Doppel-Antigen-Brückentest zum Nachweis spezifi¬ scher Antikörper gegen HIV I entsprechend dem Protokoll gemäß Beispiel 4 durchgeführt.

Als Antigen wurde das HIV-Polypeptid gp32 verwendet.

Der Einbau der Peptidlinkersequenzen "EEE" und "EEEUZU" zwischen dem Antigen und dem Rutheniumkomplex oder/und Biotin führte zu einer deutlichen Absenkung des unspezifischen Signals im Vergleich zu den Antigenen ohne Linkersequenz, während das spezifische Signal bei HIV-positiven Proben im wesentlichen erhalten blieb. Durch Verwendung von Markierungs-

oder/und Festphasenbindungsgruppen mit geladenen Linkern kann somit eine wesentlich bessere Dynamik bei der Bestimmung von Analyten erzielt werden.

Beispiel 6

Einführung von N-Hydroxysuccinimidestergruppen in Peptidderi¬ vate

250 mg Korksäure-bis-N-Hydroxysuccinimidester (DSS) wurden zusammen mit 50 μl Triethylamin in Dimethylformamid gelöst. Dazu wurde eine Lösung des Peptidderivats BPRu-UEEK (100 mg in DMF) , das gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen Standard¬ methode hergestellt wurde, zugetropft. Nach ca. 15 min wurde das DMF im Hochvakuum entfernt, der Rückstand in Wasser aufgenommen und das ungelöste DSS abfiltriert. Das Filtrat wurde lyophilisiert.

Es wurde das in Abb. 5 dargestellte Produkt erhalten.

Die Reinheit gemäß HPLC war 91 %. Die Analytik durch NMR und

MS entsprach dem erwarteten Produkt.

Auf analoge Weise wurde ein zweifach ruthenyliertes Peptidde¬ rivat mit der Sequenz Ac-K (BPRu) UEUEUK- (DSS) -UEUEUK (BPRu) UE hergestellt. Statt ruthenylierter Peptide lassen sich auf analoge Weise auch biotinylierte oder mit anderen Markie¬ rungsgruppen versehene bzw. unmarkierte Peptide mit DSS aktivieren. Überraschenderweise verläuft die Reaktion in Gegenwart freier Carbonsäurefunktionen glatt.