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Patent Searching and Data


Title:
METALLOCENE-PHOSPHORAMIDITE CONJUGATES, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1997/009337
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention concerns metallocene-phosphoramidite conjugates comprising one or a plurality of metallocenes and one or a plurality of phosphoramidites. The invention further concerns a process for preparing the metallocene-phosphoramidite conjugates and their use.

Inventors:
Wiessler
Manfred, Sch�tte
Dagmar
Application Number:
PCT/DE1996/001681
Publication Date:
March 13, 1997
Filing Date:
September 06, 1996
Export Citation:
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Assignee:
Deutsches, Krebsforschungszentrum Stiftung Des �FFENTLICHEN Rechts Wiessler
Manfred, Sch�tte
Dagmar
International Classes:
C12N15/09; C07F17/00; C07F17/02; C07F19/00; C07H19/10; C07H21/00; C12Q1/68; C12S3/00; (IPC1-7): C07F17/02; C07F17/00; G01N33/48; C12Q1/68; C12N9/16; C07H23/00
Other References:
MUCIC, R.C. ET AL.: "synthesis and characterization of dna with ferrocenyl groups attached to their 5'-termini: electrochemical characterization of a redox-active nucleotide monolayer", CHEMICAL COMMUNICATIONS, no. 4, 1996, pages 555 - 557, XP002022094
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 121, no. 11, 12 September 1994, Columbus, Ohio, US; abstract no. 134702f, DEBITSUDO, A.: "preparation of oligonucleotide having redox group" XP002022095
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Claims:
Patentansprüche
1. ) MetallocenPhosphoramiditKonjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere Metallocene und ein oder mehrere Phosphoramidite aufweist.
2. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeich¬ net, daß das oder die Metallocene über einen Spacer an das oder die Phosphorami¬ dite gebunden sind.
3. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Metallocen ein ÜbergangsmetallMetallocen ist.
4. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich¬ net, daß das Metallocen Ferrocen, Ruthenocen oder Osmocen ist.
5. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach einem der Ansprüche 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer eine C^ C10 Alkylgruppe ist.
6. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da¬ durch gekennzeichnet, daß die in dem Konjugat vorhandenen Metallocene gleich oder verschieden sind.
7. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, da¬ durch gekennzeichnet, daß der PhosphoramiditBestandteil aus der Verbindung ChioroN,Ndiisopropylaminocyanoethoxyphosphit stammt.
8. MetallocenPhosphoramiditKonjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich¬ net, daß es sich bei dem MetallocenPhosphoramiditKonjugat um Metallocen ylalkyl(2cyanoethyl)diisoproylamidophosphithandelt, wobei das Metall ein Uber¬ gangsmetall, insbesondere Eisen, Ruthenium oder Osmium ist. 9) Verfahren zur Herstellung eines MetallocenPhosphoramiditKonjugats, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte aufweist: a) Umsetzung eines Metallocens mit einem Dicarbonsaureanhydrid oder chlorid zu einer Metallocenoylalkylcarbonsäure (I), b) Reduktion der in Schritt a) erhaltenen Verbindung zu einem Alkohol, c) Umsetzung des in Schritt b) erhaltenen Alkohols mit einem Phosphoramiditderi¬ vat unter Erhalt des MetallocenPhosphoramiditKonjugats.
9. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallocen ein ÜbergangsmetallMetallocen ist, insbesondere Ferrocen, Ruthenium oder Osmium ist.
10. 1 1 ) Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt c) verwendete Phosphoramiditderivat ChloroN,Ndiisopropylaminocyano ethoxyphosphit ist.
11. 1 2) Verwendung eines MetallocenPhosphoramiditKonjugats zur elektronenmikro¬ skopisch detektierbaren Markierung von Oligonukleotiden bzw. DNA bzw. RNA.
12. 1 3) Verwendung nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung während der Oligonukleotidsynthese stattfindet.
13. Verwendung von Metallocenmarkierten Oligonukleotiden als künstliche Restriktionsenzyme.
Description:
Metaliocen-Phosphoramidit-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft Metallocen-Phosphoramidit-Konjugate, ein Ver¬ fahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung.

Bisher gab es Schwierigkeiten Oligonukleotide und Teile von DNA bzw. RNA im Elektronenmikroskop zu detektieren bzw. zu differenzieren. Es gibt bisher keine zufriedenstellende Möglichkeit, DNA bzw. RNA in reproduzierbarer Weise elek¬ tronenmikroskopisch sichtbar zu machen, um daran Studien durchführen zu können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Mittel bereitzustellen, mit dem durch einfache Veränderung der DNA bzw. RNA, möglichst schon bei der Synthese, ein Signal an der DNA bzw. RNA angebracht werden kann, um die DNA bzw. RNA besser elektronenmikroskopisch nachweisbar zu machen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Patentansprüche 1 , 9, 1 2 und 14. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Bei dem erfindungsgemäßen Metallocen-Phosphoramidit-Konjugat handelt es sich um Konjugate von einem oder mehreren Phosphoramiditen an ein oder mehrere Metallocene, bevorzugt Übergangsmetall-Metallocene, insbesondere Ferrocen, Ruthenocen oder Osmocen. Dabei können die in einem Konjugat vorkommenden Metallocene gleich oder verschieden sein. Zwischen dem Phosphoramidit und dem Metallocen befindet sich vorzugsweise noch ein Spacer, z.B. ein C--C 10 -Alkyl- spacer, bevorzugt eine Propyl- oder Butylgruppe.

Bei dem erfindungsgemäßen Metallocen-Phosphoramidit-Konjugat handelt es sich bevorzugt um Metallocenyialkyl-(2-cyanoethyl)-diisopropylamidophosphit, wobei das Metall ein Übergangsmetali ist, vorzugsweise Fe, Ru oder Os.

Das erfindungsgemäße Metallocen-Phosphoramidit-Konjugat wird vorzugsweise im Rahmen der Oligonukleotidsynthese an ein Festphasen-gekoppeltes Oligomer addiert. Gute Ergebnisse werden erreicht, wenn das Metallocen-Phosphoramidit- Konjugat im Vergleich zu den Oligonukleotiden im Überschuß eingesetzt wird . Bei der Oligonukleotidsynthese kommt es dann zu einer Metallocen-Markierung der DNA bzw. RNA, die elektronenmikroskopisch damit gut untersuchbar wird. Es ist natürlich auch möglich die DNA bzw. RNA nachträglich durch das Konjugat mit dem Metallocen zu markieren. Mit den metallocenmarkierten Oligonukleotiden lassen sich Feinstrukturen von DNA bzw. RNA im Elektronenmikroskop unter¬ suchen. Antisense-Oligonukleotide können auf ihre Hybrdisierungseigenschaften hin untersucht werden, es kann zwischen spezifischen und unspezifischen Bindun¬ gen unterschieden werden, die Doppel- oder Tripel-Helix-Bildung kann verfolgt werden. Bei bekannter Sequenz lassen sich Strukturen im Elektronenmikroskop der Sequenz zuordnen. Außerdem kann bei Markierung verschiedener Oligonukleotide mit unterschiedlichen Metallocenen eine bevorzugte Hybridisierung gemessen werden. Mittels der Elektronenverlustspektroskopie kann man dabei einzelne Metallatome anhand ihrer charakteristischen Elektronenspektren nachweisen.

Die Herstellung der Metallocen-Phosphoramidit-Konjugate erfolgt beispielsweise über ein Verfahren, dessen Reaktionsschema in Fig. 1 dargestellt ist: Ein Metallo¬ cen (Ubergangsmetall, bevorzugt Ferrocen, Ruthenocen oder Osmocen) wird mit einem Dicarbonsäurechlorid oder -anhydrid unter der Katalyse eines Friedel-Crafts- Katalysators zur Metallocenoylalkylcarbonsäure (I) umgesetzt. Die Ketofunktion im Molekül wird danach unter geeigneten Bedingungen hydriert, z.B. Hydrierung unter Katalyse eines Pt0 2 -Katalysator (II). Die Carbonsäurefunktion im Molekül wird dann durch Umsetzung mit einem Alkohol verestert (III) und anschließend unter ge¬ eigneten Bedingungen, z.B. durch Umsetzung mit LiAIH 4 , reduziert (IV) . Den ent¬ standenen Alkohol (IV) kann man mit einem Phosphoramiditderivat, z.B. dem in der

Oligonukleotidsynthese üblichen C hloro-N, N-diiso pro py lärm ino-cyanoethoxy- phosphit (V), umsetzen. Das erhaltene Konjugat aus Metallocen und Phosphorami- dit (VI) kann nun in der Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden.

Die Markierung von (Oligo)nukleotiden während ihrer Synthese ist in Fig. 2 gezeigt. Das in Fig. 2 gezeigte Reaktionsschema ist beispielhaft für die durch die Umset¬ zung von Metallocen-Phosphoramidit-Konjugat mit einem Nukleotid oder Oligonu¬ kleotid stattfindende Kopplung des (Oligo)nukleotids an das Metallocen. So wird das erfindunsgemäße Metallocen-Phosphoramidit-Konjugat (VI) mit einem Fest¬ phasen-gekoppelten 5'-0H freien (Oligo)nukleotid mit einem Aktivator, z.B. Tetra- zol, umgesetzt. Die entstehende Verbindung (VII ) wird mit einem Oxidationsmittel, z.B. verdünnter Peroxidlösung, insbesondere 5 %iger Cumolhydroperoxidlösung, umgesetzt, wobei eine Verbindung (VIII) entsteht. Unter Baseneinwirkung, z.B. Ammoniak, wird das an das Metallocen gekoppelte Nukleotid von der Festphase abgetrennt, wobei Verbindung (IX) entsteht.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß die durch die Metallocene markier¬ ten (Oligo)nukleotide außer der guten Analysierbarkeit im Elektronenmikroskop eine andere interessante Anwendung haben, nämlich als künstliche Restriktionsenzyme. Es ist allgemein bekannt, daß im Körper Fremdstoffe durch Oxidation in eine wasserlösliche Form überführt werden. Das dafür benötigte Wasserstoffperoxid wird aus Sauerstoff zunächst durch Reduktion zu einem Superoxidanion (0 2 - " ) hergestellt. Dieses Anion kann mit Hilfe der Superoxid-Dismutase zu Sauerstoff und Wasserstoffperoxid disproportionieren. Sind Eisen(ll )-lonen vorhanden kann das intermediär entstehende H 2 0 2 zu Hydroxylradikalen, die eine höchst reaktive Spezies darstellen, abreagieren. Findet diese Reaktion in der näheren Umgebung von DNA statt, kann die DNA ähnlich wie von einem Restriktionsenzym gespalten werden. Führt man die Spaltung künstlich herbei, fügt man ein Reduktionsmittel zu, z.B. Dithiothreitol (DTT), das aus dem Eisen (III) dann wieder Eisen (II) erzeugt, welches erneut reagieren kann. Ferrocen kann diese Reaktion als Eisen (Il)-enthal- tende Substanz auslösen. Wenn man ein Ferrocen-markiertes Oligonukleotid einsetzt, wird durch die Hybridisierung des Oligonukleotids gegen einzelsträngige

DNA (unter Bildung von Watson-Crick-Basenpaarung) oder auch doppelsträngige DNA (unter Bildung von Hoogsteen-Basenpaarung) das Eisen(ll)-lon in direkter Umgebung zur DNA an einer bestimmten Sequenz fixiert. Katalysiert dort das Eisen (II) die Spaltung von H 2 0 2 kommt es durch die entstehenden reaktiven Hydrox- ylradikale bei der DNA an einer definierten Stelle zu einem Strangbruch. Idealerwei¬ se erfolgt dieses Schneiden nur an einer spezifischen Stelle der DNA. Das Be¬ schriebene gilt natürlich anstelle von Eisen (II) auch für Ruthenium (II) und Osmium (II) in den jeweiligen Ruthenocenen und Osmocenen, sowie für alle Übergangs- metall-Metallocene, in denen das Ubergangsmetall einfach durch Reduktion bzw. Oxidation in verschiedene Oxidationsstufen überführt werden kann.

Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die Figur erläutert:

Fig. 1 : beispielhaftes Reaktionsschema für die Herstellung eines

Metallocen-Phosphoramidit-Konjugats

Fig. 2: Verwendung des Metallocen-Phosphoramidit-Konjugats in der

Oligosynthese zur Markierung von Oligonukleotiden mit Metal- locenen

Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele beschrie¬ ben:

Beispiel 1 : Herstellung von (5-Ferrocenylpentyl)-(2-cyanoethyl)-diisopropylamido- phosphit

a) 4-Ferrocenoylbutansäure (I)

Zu 3, 5 g (26 mmol) Aluminiumtrichlorid in 100 ml wasserfreiem CH 2 CI 2 wurde eine Mischung aus 5,0 g (27 mmol) Ferrocen und 2,3 g (20 mmol) Glutarsäureanhydrid in 100 ml CH 2 CI 2 getropft. Die Lösung färbt sich dabei violett. Nach 3 h unter Rückfluß wurde der Ansatz hydrolysiert und zur Entfernung von Reaktionsproduk-

ten, die weder in wässriger noch in organischer Phase löslich sind, durch eine Fritte gesaugt. Die wässrige Phase wurde anschließend abgetrennt und die organi¬ sche Phase dreimal mit Wasser gewaschen, mit NaS0 4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 3,5 g (58,3 % d. Th. )

DC:R f (Kieselgel, CHCL 3 /MeOH 95:5) : 0,6

SC: Alox, sauer (Akt. III), 1 ) CH 2 CI 2 ; 2) CH 2 CI 2 /MeOH 1 : 1 + 5 Vol-% HOAc

1 H-NMR (250 MHz) CDCU: 6 = 4,76-4,75 (t, 2H, Cp subst. ); 4,51 -4,50 (t, 2H,

Cp subst. ); 4, 1 9 (s, 5H, Cp unsubst.); 2,82-2,76 (t, 2H, CH 2 -C(0)); 2,40-2,34 (t,

2H, CH 2 -COO); 1 ,90-1 ,86 (m, 2H, C-CH 2 -C)

MS: (C 15 H 16 Fe0 3 , 300,04), m/z = 300 (M + , 100 %)

b) 5-Ferrocenylpentansäure (II)

2,0 g (6, 66 mmol) 4-Ferrocenoylbutansäure (I) wurden in einem Dreihalskolben mit 50 ml Eisessig gelöst, der anschließend mit Stickstoff gespült wurde. 100 mg Platinoxid wurden als Katalysator zugefügt. Der Kolben wurde abermals mit Stickstoff gespült und dann mit Wasserstoff beladen. Nach 1 8 h ist die Hydrierung abgeschlossen und der Katalysator wird abgesaugt. Der Reaktionsansatz wird mit 100 ml H 2 0 verdünnt und 5x mit CH 2 CI 2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden noch 2x mit H 2 0 gewaschen, mit NaS0 4 getrocknet, eingeengt und chromatographiert.

Ausbeute: 1 ,91 g (98 % d . Th. )

DC: R f , (Kieselgel, CHCI 3 /MeOH 95:5) : 0,65

SC: Alox, sauer (Akt. III), 1 ) CH 2 CI 2 ; 2) CH 2 CI 2 /MeOH 95 :5 + 5 Vol-% HOAc

^-NMR (250 MHz) CDCL,: δ = 4,08 (s, 5H, Cp unsubst. ); 4,03 (s, 4H, Cp subst.); 2,37-2,32 (m, 4H, Fc-CH 2 , CH 2 -COOH); 1 , 67-1 , 55 (m, 4H, 2xCH 2 )

MS: (C 15 H 18 Fe0 2 , 286,07), m/z = 286 (M τ , 1 00%) ; 1 99 (Fc-CH 2 , 31 %); 1 21

(FeCp, 40%)

c) 5-Ferrocenylpentansäureethγlester (III)

Zu 1 g (3,5 mmol) 5-Ferrocenylpentansäure (II) und 500 μ\ Ethanol in THF wurde 1 g (4,8 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und über Nacht bei Raumtempe¬ ratur gerührt. Am nächsten Tag wurde der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, der Reaktionsansatz eingeengt und ohne weiteres Aufarbeiten chroma¬ tographiert.

Ausbeute: 692 mg (63 % d. Th. ) DC: R f (Kieselgel, CHCI 3 ); 0,8 SC: Alox, neutral (Akt. III) , PE/EE 9: 1

1 H-NMR (250 MHz) CDCU: δ = 4, 1 7-4, 1 0 (q, 2H, 0-CH 2 ); 4,08 (s, 5H, CP un¬ subst.); 4,04-4,03 (m, 4H, Cp subst.); 2,37-2,28 (m, 4H, Fc-CH 2 , CH 2 -COO); 1 ,72-1 ,51 (m, 4H, 2x CH 2 )

MS: (C 17 H 22 Fe0 2 , 314,09), m/z = 314 (M + , 32,6%); 206 (M τ -Cp-OEt, 49,2 %); 1 63 (FeCp-CH 2 -CH = CH 2 , 83, 6%), 55 (C 4 H 7 , 100 %)

d) 5-Ferrocenylpentanol (IV)

Zu 0,5 g ( 1 60 mmol) 5-Ferrocenylpentansäureethylester (III) in 20 ml THF wurden 61 mg (1 ,60 mmol) LiAIH 4 , gegeben und 2 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde hydrolysiert, es wurden 50 ml Dichlormethan zugegeben, mit 2 molarer Salzsäure neutralisiert und dreimal mit H 2 0 gewaschen, mit NaS0 4 getrocknet und einge¬ engt.

Ausbeute: 378 mg (89 % d .Th . )

DC: R f (Alox, CH 2 CI 2 ) = 0,2

SC: Alox, neutr. (Akt. III), CH 2 CI 2

,H-NMR (250 MHz) CDCU: δ = 4,08 (s, 5H, Cp unsubst.); 4, 1 0-4,02 (m, 4H, Cp subst.); 3,68-3, 61 (dt, 2H, CH 2 -OH); 2,37-2,31 (m, 2H, Fc-CH 2 ), 1 , 65- 1 ,49 (m,

4H, 2x CH 2 ); 1 ,45-1 ,35 (m, 2H, CH 2 )

MS: (C 15 H 20 FeO, 272,08), m/z = 272 (M + , 100%); 1 99 (Fc-CH 2 , 20,2 %); 1 21

(FeCp, 22,4 %)

e) (5-Ferrocenylpentyl)-(2-cyanoethyl)-diisopropylamidophosphit (VI) 0, 1 50 g (0, 55 mmol) des 5-Ferrocenylpentanols (IV) wurden zweimal mit THF eingeengt, mit 5ml THF aufgenommen und 376 μl (2,2 mmol) Hünig-Base zu¬ gefügt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 1 95 μ\ (0,83 mmol) Chloro-N,N- diisopropylamino-cyanoethoxyphosphin (V) mit Hilfe einer Spritze über ein Septum zugetropft. Nach 1 5 min bei RT wurden 50 μ\ H 2 0 zugegeben und weitere 30 Minuten gerührt. Der Ansatz wurde in 20 ml EE/NEt 3 aufgenommen und mit 10 % NaHC0 3 -Lösung ausgeschüttelt, anschließend 2 x mit Wasser gewaschen, mit NaS0 4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 1 64 mg (94 % d.Th.)

DC: R f (Alox, CH 2 CI 2 ) = 0,61

SC: KG, PE/EE/NEt 3 1 8: 1 : 1

1 H-NMR (250 MHz) CDCU: δ = 4,08 (s, 5H, Cp unsubst. ); 4,04-4,02 (m, 4H, Cp subst.); 3,89-3,75 (2x sep, je 1 H, NCHMe 2 ); 3,70-3, 52 (m, 4H, CH 2 -Cyanoethyl,

5"-H 2 ); 2,65-2,60 (t, 2H, CH 2 -CN); 2,36-2,30 (m, 2H, 1 "-H 2 ); 1 ,68-1 ,35 (m, 6H,

3x CH 2 ); 1 ,20-1 , 1 6 (4x s, je 3H, 4x CH 3 )

MS: (C 24 H 37 FeN 2 0 2 P, 472, 1 9), m/z = 472 (M + , 14,4 %); 389 (M + -N((CH(CH 3 ) 2 -

CN, 63,0 %); 1 21 (FeCp, 100 %)

Beispiel 2: Markierung von Oligonukleotiden mit Ferrocen

a) (5-Ferrocenylpentyl)-(2-cyanoethyl)-(3'-O-acetyl-2'-desoxyth ymidin-5')- phosphittriester (VII)

50 mg (0, 1 8 mmol) 3'-0-Acetyl-2'-desoxythymidin und 20 mg (0,29 mmol) Tetra- zol wurden zweimal mit 5 ml wasserfreiem CH 3 CN eingeengt und mit 5 ml CH 3 CN aufgenommen. Dazu wurden langsam 1 00 mg (0,21 mmol) des Phosphoramidites (VI) in 1 0 ml CH 3 CN getropft, welches zuvor ebenfalls zweimal mit CH 3 CN einge¬ engt worden war. Nach einer Stunde Rühren bei RT wurden dem Ansatz 100 ml PE/EE 9: 1 zugefügt, mit 10 % NaHC0 3 Lösung, 2x mit H 2 0 gewaschen und einge¬ engt.

Ausbeute: 103 mg (88 % d.Th.) DC: R f (KG, CHCI 3 /MeOH 95/5) = 0,5 SC: KG, CHCI 3 /MeOH/NEt 3 98/1/1

b) Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyl)-(3'-O-acetyl-2'-desoxy thymidin-5')- phosphat (VIII)

103 mg (0,15 mmol) des Phosphittriesters (VII) wurden mit 1 ml einer 5 % Cumol- hydroperoxid-Lösung in CH 3 CN versetzt. Nach 3 min wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100/vl Isopropanol gestoppt. Der Ansatz wurde mit 1 ml Triethylamin versetzt und ohne weiteres Aufarbeiten vorsichtig eingeengt und sofort chromato¬ graphiert. Die Cyanoethoxy-Gruppe wird dabei durch das Triethylanim abgespalten.

Ausbeute: 104 mg (93 % d.Th.) DC: R f (KG, CHCI 3 /MeOH 95/5) = 0,2 SC: KG, CHCI 3 /MeOH/NEt 3 981/1

1 H-NMR (250 MHz) CDCU: δ = 7,77 (q, 1H, 6-H); 6,29-6,24 (dd, 1H, 1'-H); 5,29- 5,28 (dt, 1H, 3'-H); 4,12-4,08 (m, 2H, Cp subst.); 4,06 (s, 5H, Cp unsubst.); 4,05-3,98 (m, 5H, Cp subst., 4'H, 5'H 2 ); 3,84-3,76 (dt, 2H, 5"-H 2 ); 2,32-2,22 (m, 4H, 2'-H, 1"-H 2 ); 2,03 (s, 3H, C(0)CH 3 ); 1,84 (d, 3H, 5-CH 3 ); 1,66-1,42 (m, 6H, 3xCH 2 ) J 5 . . β = 1,18; J v . 2 . = 6,53; J 5 . P = 6,45; J 6 .. p = 6,45

c) Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyl)-2'-desoxythymidin-5')- phosphat (IX)

Der Phosphatdiester (VIII) wurde mit 1 ml MeOH/H,0/NEt 3 4:2:1 versetzt. Nach einer halben Stunde wurde der Ansatz eingeengt, zweimal mit Ethanol aufgenom¬ men und erneut eingeengt.

1 H-NMR (250 MHz) CDCU: δ = 7,66 (q, 1H, 6-H); 6,21-6,16 (dd, 1H, 1'-H);4,40- 4,35 (m, 1H, 3'-H); 4,22-4,20 (dd, 2H, Cp subst.); 4,10-3,87 (m, 7H, Cp subst., 4'H, 5'-H 2 ); 4,06 (s, 5H, Cp unsubst.); 3,81-3,73 (dt, 2H,6"-H 2 ); 2,33-2,27 (m,

2H, 1 "-H 2 ); 2, 1 8-2, 1 1 (m, 2H, 2'-H); 1 ,85 (d, 3H, 5-CH 3 ); 1 , 66-1 ,44 (m, 4H, 2xCH 2 ); 1 ,43-1 ,28 (m, 2H, CH 2 )

"B-Me.ε = ' ι 2.£) J ι - 2 ' = b, b b ; J5. p = O, 0θ

Beispiel 3: Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Triethylammonium-(5-ferro- cenylpentyl)-(2'-desoxynukleosid-5')-phosphate an der Festphase

Die Säulen mit der Festphase enthalten in der Regel 0, 2 //mol eines Nukleosides. In diesem Fall jedoch wurden Festphasen mit der Beladung 1/ymol gewählt, um eine spektroskopische Untersuchung zu ermöglichen. Die Säulen die in der automa¬ tisierten Oligonukleotidsynthese verwendet werden, sind so beschaffen, daß man auf beiden Seiten eine Luer-Spritze aufsetzen kann. Man kann so die Säule mit den gewünschten Reaktionspartnern oder Lösungsmitteln spülen, indem man sie von einer Spritze in die andere drückt. Die Festphasensynthese wurde mit allen vier Desoxynukleosiden durchgeführt:

1 . Abspalten der Dimethoxytritylschutzgruppe: 2x je 1 ml 3% Dichloressig¬ säure in Dichlormethan für 1 min

2. Spülen mit dem Abspaltungsreagenz bis das Eluat farblos ist

3. Spülen mit mindestens 5x1 ml Dichlormethan, zum Entfernen jeglicher Säurespuren

4. Restliches Lösungsmittel an der Wasserstrahlpumpe bis zur Trockene ab¬ ziehen

5. Belüften mit Argon

6. Kopplung: 1 80 μ\ einer Tetrazol-Lösung (35 mg/ml) in Acetonitrii und 23,6 mg (50 μmol) des Phosphoramidites (VI) in 500 μ\ Acetonitrii werden ge¬ mischt und sofort auf die Festphase gegeben. Nach 3 min wird das Reak¬ tionsgemisch grob ausgespült und der Vorgang wiederholt.

7. Spülen mit mindestens 5x 1 ml Acetonitrii

8. Oxidation : 1 ml einer 5 % Cumolhydroperoxid in Acetonitrii für 2 min

9. Spülen mit mindestens 5x 1 ml Acetonitrii

10. Abziehen des restlichen Lösungsmittels an der Wasserstrahlpumpe

1 1 . Festphase mit 1 ml einer konzentrierten Ammoniak/Methylamin-Lösung (jeweils ca . 1 0-30%) 5 min inkubieren

1 2. Lösung in ein verschraubbares Eppendorf-Reaktionsgefäß spülen und für 1 h bei 55 °C inkubieren.

Anschließend wird der Reaktionsansatz am Lyophilisator und zur Weiterverarbei¬ tung mit 1 ml TEAA/CH 3 CN 1 : 1 aufgelöst.

1 nach Maniatis, Sambrook, 1 989

2 Die HPLC wurde auf einer präparativen RP 18 -Säule durchgeführt. Fluß 4 ml/min,

25 %-75 % B in 40 min, A: 90 % TEAA/1 0 % CH 3 CN,B: 1 0 % TEAA/90 %

CH 3 CN

Die Absoprtion des Ferrocens ist bei dieser geringen Menge zu vernachlässigen. Zur Berechnung der Ausbeute wurden die Absorbtionswerte für die entsprechen¬ den dNMPs herangezogen.

Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyl)-(2'-desoxythymidin- 5')-phosphat

MS (ESI): (C 25 H 33 FeN 2 0 3 P, 576, 1 6): m/z = (575, 1 [M-H]); (449,0 [M-Thymin-H] " ); (383,0 [M-Thymin-Cp-K]); (351 , 1 [Fc-(CH 2 ) 5 -0-P0 3 ]); (285, 1 (CpFe-(CH 2 ) 5 -0-P0 3 ];

(1 25,2 [Thymin-H])

Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyl)-(2'-desoxycytidin-5 ')-phosphat

MS (ESI) : (C 24 H 32 FeN 3 0 7 P, 561 , 1 3): m/z = (560, 1 [M-H]);

Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyl)-(2'-desoxyguanosin- 5')-phosphat

MS (ESI) : (C 25 H 32 FeN 5 0 7 P, 601 , 14): m/z = (600, 1 [M-H]);

Triethylammonium-(5-ferrocenylpentyI)-(2'-desoxyadenosin- 5')-phosphat

MS (ESI ) : (C 25 H 32 FeN 5 0 6 P, 585, 14) : m/z = (584, 1 [M-H] ' ); (448,8, [M-Adenin-H] " ); (383, 1 [M-Adenin-Cp-HD; (350,9 [Fc-(CH 2 ) 5 -0-P0 3 D (285, 1 [CpFe-(CH 2 ) 5 -0-P0 3 D; (1 34,2 [Adenin-H] ' ) (586,0 [M + H] + ) (352, 1 [Fc-(CH 2 ) 5 -0-P0 3 + H] + ); ( 1 36,2 [Adenin + H] + )

Ferrocenylverknüpftes 4-mer

Die Seqeuenz 5 TGAC 3' wurde mit der automatisierten Oligonukleotidsynthese dμmol) hergestellt. Die Dimethoxytrityl-Gruppe am Ende des letzten Nukleotids wurde dann von Hand abgespalten und weiterhin so verarbeitet wie auch die Monomere. Die praparative HPLC wurde unter geänderten Bedingungen durch¬ geführt.

HPLC: RP 18 -Säule, Fluß 4 ml/min, 10 %-50 % B in 40 min und 10 min bei 50 %,

A: 90 % TEAA/1 0 % CH 3 CN, B: 10 % TEAA/ 90 % CH 3 CN

Retentionszeit 4-mer: 43 min

MS (ESI) : (C 54 H 69 FeN 15 0 25 P 49 1 507,28) : m/z = ( 1 506,9 [M-H]; (1064,5 [M-

Cytidin-CpFe-OH]); (61 9,0 [pApC])

Ferrocenylverknüpftes 27-mer

Das 27-mer mit der Sequenz

5 TTC CTC CTT CCT TCC TTC CTT CCT CCC 3' wurde am Oligonukleotidsynthesizer hergestellt und das Ferrocen mit der Hand analog zu den Monomeren und dem 4-mer addiert.

Die Analytik mit Hilfe der HPLC lief unter den gleichen Bedingungen wie bei dem 4-mer: Retentionszeit Ferrocenylverknüpftes 27-mer: 35,3 min