SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere en general al campo del análisis de proteínas, al análisis de muestras por electroforesis capilar de inmunoafinidad en particular y específicamente al análisis de isoformas de glicoproteína por electroforesis capilar de inmunoafinidad. En un modo de realización particularmente preferido, se refiere al análisis de isoformas de la a-1 glicoproteína ácida mediante electroforesis capilar de inmunoafinidad.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La a-1 glicoproteína ácida (AGP) u orosomucoide es una proteína con un pl de 2.8 a 3.8 y con un peso molecular comprendido entre 41 y 43 kDa. Las diferentes moléculas de la proteína debidas a variaciones en la glicosilación y/o en la secuencia peptídica se denominan formas y cada grupo de formas que migran en la misma banda de electroforesis se denomina isoforma. Los cambios en el perfil electroforético de isoformas de AGP en las muestras biológicas se han relacionado con diferentes estados patológicos como cáncer, inflamación y enfermedades cardiovasculares y del hígado, entre otros [Duche, J. C, Urien, S., Simón, N., Malaurie, E., Monnet, I., Barre, J., Clin Biochem 2000, 33, 197-202; Hashimoto, S., Asao, T., Takahashi, J., Yagihashi, Y., Nishimura, T., Saniabadi, A. R., Poland, D. C, van Dijk, W., Kuwano, H., Kochibe, N., Yazawa, S., Cáncer

2004, 101, 2825-2836; Poland, D. C, Garda Vallejo, J. J., Niessen, H. W., Nijmeyer, R., Calafat, J., Hack, C. E., Van het Hof, B., Van Dijk, W., J Leukoc Biol

2005, 78, 453-461 ; Budai, L, Ozohanics, O., Ludanyi, K., Drahos, L, Kremmer, T., Krenyacz, J., Vekey, K., Anal Bioanal Chem 2009, 393, 991 -998]. La comparación entre los perfiles electroforeticos de isoformas de AGP existentes en fluidos biológicos de individuos que sufren de diferentes enfermedades y los perfiles de individuos sanos podría ser potencialmente utilizada como biomarcador de la enfermedad con fines diagnósticos, pronósticos y de seguimiento terapéutico. Las diferencias en la composición glucídica y/o en la secuencia peptídica entre las formas de la glicoproteína pueden dar lugar a diferencias en su relación carga/tamaño, siendo por tanto la electroforesis capilar en zona libre (CZE) una técnica adecuada para el análisis de las isoformas de la glicoproteína intacta, es decir sin hidrolizar. El análisis de isoformas de la glicoproteína por CZE requiere el aislamiento previo de la proteína a partir de la muestra biológica. La purificación de AGP a partir de suero humano consiste por lo general en un proceso largo y tedioso basado en el uso de columnas de intercambio iónico o mediante cromatografía de afinidad [Kishino, S. , Miyazaki, K. , J Chromatogr B 1997, 699, 371 -381 ]. Se ha descrito un método de purificación por cromatografía de inmunoafinidad de AGP a partir de suero y plasma humanos que hace posible el análisis de sus isoformas por CZE (Ongay, S. , Neusuess, C , Vaas, S. ; Diez- Masa, J. C , de Frutos, M. , Electrophoresis 2010, 31, 1796-1804). Este método permite realizar la preparación de la muestra para el posterior análisis por CZE y detección de las isoformas de la glicoproteína en un tiempo de 4 horas. Esta metodología se ha aplicado con éxito para la comparación de isoformas de AGP en las muestras de individuos sanos y de pacientes que sufren dos enfermedades vasculares, concretamente aneurisma aórtico abdominal (AAA) y ateroesclerosis carotidea (ACT), mostrando un alto poder predictivo en los grupos sanos vs enfermos, sanos vs AAA, y sanos vs ACT [Puerta, A. , Diez-Masa, J. C , Martín- Álvarez, P. J. , Martín-Ventura, J. L. , Barbas, C , Tuñón, J. , Egido, J. , de Frutos, M. Analyst, 201 1 , 136, 816-822]. Esta última contribución muestra la viabilidad de las isoformas de AGP analizadas por CZE como biomarcador de aterotrombosis.

A pesar de estos logros, el tratamiento de la muestra sigue contribuyendo de forma significativa al tiempo total de análisis. En este sentido, la electroforesis capilar de inmunoafinidad (IACE) empleando anticuerpos inmovilizados es una técnica híbrida que combina la inmunocaptura y la separación por CE. En la IACE en columna, un ligando de afinidad, concretamente un anticuerpo, unido a un soporte sólido o inmovilizado directamente en la pared capilar se fija en el interior del capilar de electroforesis en la zona próxima a la entrada. A continuación se introduce la muestra, y los antígenos de ésta son capturados y posteriormente eluídos y separados empleando un medio disociador de la unión antígeno- anticuerpo, seguido de la aplicación de un alto voltaje [Guzman, N. A., Phillips, T. M., Electrophoresis 201 1 , 32, 1565-1578]. Esta técnica de IACE es la combinación "on-line" de una etapa de cromatografía de inmunoafinidad con una etapa de separación electroforética. La IACE se está convirtiendo en una herramienta de gran alcance que tiene características únicas, que incluyen la automatización, cortos tiempos de preparación de muestra y la utilización de bajas cantidades de muestra y de reactivos. Por otra parte, un inconveniente del tratamiento de la muestra en el capilar de separación es que la matriz de la muestra se introduce directamente en los capilares, lo cual puede ocasionar la adsorción de los componentes de la matriz en la pared capilar. Por lo general, los capilares se recubren con una sustancia química para evitar que los componentes de la matriz se adsorban en la pared de los capilares y para suprimir el flujo electroosmótico (EOF). Además, en la mayoría de los casos es necesario el uso de procedimientos de isotacoforesis (ITP) para aumentar la sensibilidad y la resolución del método. Hasta el momento, no se había conseguido utilizar con éxito esta técnica de IACE en la separación de isoformas de glicoproteínas.

Teniendo en cuenta la utilidad del perfil electroforético de las isoformas de AGP y otras glicoproteínas como biomarcadores de diferentes enfermedades, se hace necesario un método de análisis que permita de forma automática la preparación de la muestra biológica y la separación rápida y eficaz de las diferentes isoformas de estas proteínas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un nuevo método de electroforesis capilar de inmunoafinidad, para el análisis de isoformas de glicoproteínas en muestras de fluidos biológicos, donde la preparación de la muestra se realiza, de forma mayoritaria, dentro del capilar.

El nuevo método combina la inmunocaptura y preconcentración de la muestra dentro de una columna de electroforesis capilar, mediante el uso de una fase inmunoadsorbente, y la inducción de una etapa de concentración, que permiten purificar, concentrar y separar las isoformas de la proteína al aplicar alto voltaje con un mínimo de manipulación de la muestra. La fase inmunoadsorbente está formada por anticuerpos específicos frente a la glicoproteína de interés, unidos covalentemente a partículas magnéticas y se inmoviliza en el interior de la columna mediante un campo magnético.

El nuevo método permite la purificación, concentración, separación y determinación de las isoformas de la glicoproteína AGP, a partir de una muestra de fluido biológico, en un tiempo de unos 65 min, prácticamente la cuarta parte que los procesos previamente descritos. El proceso es reproducible y en la mayoría de pasos automatizable. El consumo de muestra y reactivos también representa una mejora respecto a los procedimientos previamente descritos.

El análisis del perfil electroforético de isoformas de AGP obtenido mediante la utilización de esta metodología permitiría estudiar su potencial como biomarcador de enfermedades tales como cáncer, inflamación o enfermedades vasculares y del hígado.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1 . La Fig. 1 a muestra un esquema en perspectiva del dispositivo magnético formado por dos ¡manes (1 ) y un dispositivo de sujeción (3) que contiene un orificio (2) por el que puede pasar un capilar de electroforesis. La fig. 1 b muestra un esquema frontal del mismo dispositivo. FIGURA 2. La Fig. 2 es un electroforegrama de AGP de una muestra de suero analizada según el procedimiento on-line IACE donde se pueden distinguir las isoformas de la AGP. En la parte inferior derecha se muestra una ampliación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención describe un nuevo método de análisis, basado en electroforesis capilar, que permite la separación de al menos una isoforma de glicoproteína en una muestra de fluido biológico ya obtenida, mediante un proceso que comprende los siguientes pasos: (a) inyección en un capilar de electroforesis de una fase inmunoadsorbente de modo tal que permita la inmovilización de dicha fase inmunoadsorbente en dicho capilar de electroforesis,

(b) inyección en dicho capilar de electroforesis de la muestra de fluido biológico que contiene la glicoproteína a analizar de modo que permita la captura del antígeno (la glicoproteína) en la fase inmunoadsorbente descrita en el paso (a);

(c) inyección en dicho capilar de una disolución que contiene un agente disruptor de la unión anticuerpo-glicoproteína de modo que permita la desorción de la glicoproteína capturada en la fase inmunoadsorbente;

(d) inyección en dicho capilar de una disolución que permita inducir un efecto de enfoque de la glicoproteína al aplicar un campo eléctrico;

(e) aplicación de un campo eléctrico a lo largo de dicho capilar de electroforesis de manera que permita separar al menos una isoforma de la glicoproteína, preferentemente se separan diferentes isoformas de la glicoproteína;

(f) detección de dicha(s) isoforma(s) descrita(s) en (e) de la glicoproteína en el extremo de salida del capilar de electroforesis y obtención de su perfil electroforético.

En una realización preferida de la presente invención, el método descrito se caracteriza porque la glicoproteína es la a-1 glicoproteína ácida. Se entiende por muestra de fluido biológico ya obtenida, por ejemplo a partir de una muestra ya obtenida de sangre humana, se ha obtenido el plasma (por centrifugación) o el suero (por coagulación). Por tanto, en una realización preferente de la presente invención, el método descrito anteriormente se caracteriza porque la muestra de fluido biológico ya obtenida, es suero o plasma sanguíneo.

Se entiende como fase inmunoadsorbente un anticuerpo unido covalentemente a un soporte sólido, como por ejemplo una partícula magnética. Por tanto, una realización preferente de la presente invención, se caracteriza porque la fase inmunoadsorbente está formada por anticuerpos específicos frente a la glicoproteína de interés, unidos covalentemente a partículas magnéticas. Preferentemente, dichos anticuerpos son anti-a-1 -glicoproteína ácida. Se entiende como agente disruptor de la unión anticuerpo-glicoproteína un compuesto o mezcla de compuestos capaz de romper las interacciones anticuerpo-antígeno, como por ejemplo un tampón ácido.

En electroforesis capilar se entiende como efecto de enfoque, el confinamiento de un analito en una banda estrecha del capilar debido a una discontinuidad en la velocidad de migración del analito en dos disoluciones diferentes.

La fase inmunoadsorbente se prepara mediante una reacción de acoplamiento entre una partícula magnética activada con grupos funcionales y un anticuerpo. De forma preferida los grupos funcionales son grupos tosilo y el anticuerpo utilizado es anti- α-1 -glicoproteina ácida humana desarrollado en cabra.

En una realización preferida la fase inmunoadsorbente descrita en el paso (a) se inmoviliza en el interior del capilar de electroforesis mediante la aplicación de un campo magnético. En una realización más preferida, la inyección de la fase inmunoadsorbente del paso (a) se realiza a partir de una suspensión de 1 mg/ml_ de esta fase en un tampón fosfato salino durante un tiempo superior a los 100 segundos a una presión comprendida entre 50 y 150 mbar. En una realización aun más preferida la inyección se realiza durante 240 segundos a una presión de l OO mbares.

Para activar el anticuerpo de la fase inmunoadsorbente, en una realización preferida de la presente invención, el paso (a) también comprende la adición de un tampón ácido. En una realización más preferida, el tampón ácido consiste en una mezcla de tricina 10 mM, cloruro de sodio 20 mM, acetato de sodio 10 mM, urea 7 M y putrescina 3,9 mM, ajustado a pH 4.5, preferentemente con ácido acético 2N.

En una realización preferida, la inyección de la muestra de fluido biológico que contiene la glicoproteína en el paso (b) se realiza en un tiempo comprendido entre 100 y 900 s a una presión de 100 mbar. En una realización más preferida el tiempo de inyección de la muestra de fluido biológico es de 500 s. En una realización preferida, de forma previa al paso (b), la muestra de fluido biológico se acidifica y se centrifuga para obtener el sobrenadante. En una realización más preferida la muestra de fluido biológico se acidifica con ácido thcloroacético 1 M. En una realización preferida se realiza un lavado entre las etapas (b) y (c). En una realización más preferida este lavado se realiza mediante la inyección de una disolución acuosa a una presión comprendida entre 0, 1 y 4 bar y en un tiempo comprendido entre 1 y 600 segundos. En una realización aún más preferida, la solución acuosa es agua Milli-Q y se inyecta durante 60 segundos a una presión de 1 bar.

El agente de desorción utilizado en el paso (c) es un tampón ácido o básico o una sustancia caotrópica. En una realización preferida, el agente de desorción es un tampón ácido formado por una mezcla de thcina 10 mM, cloruro de sodio 20 mM, acetato de sodio 10 mM, urea 7 M y putrescina 3,9 mM, ajustado a pH 4.5. En una realización más preferida el agente disruptor se inyecta en sentido inverso desde el extremo de salida del capilar de electroforesis, preferentemente durante un tiempo de 480 s a 100 mbar de presión. En una realización preferida el tampón utilizado como agente de desorción se emplea también como tampón de separación.

Para mejorar la resolución de la separación de las isoformas, en el paso (d) se realiza la adición de una disolución que permita inducir un efecto de enfoque. En una realización preferida se utiliza una disolución de conductividad inferior a la disolución utilizada en el paso (c) que se emplea también como tampón de separación. En una realización más preferida la disolución del paso (d) es una mezcla metanol/agua en una relación 1/3 v/v. En una realización preferida, la disolución utilizada en el paso (d) se inyecta de modo tal que cubra la fase inmunoadsorbente y el resto del capilar quede lleno de la disolución utilizada en el paso (c), que se emplea como tampón de separación. Ambos extremos del capilar están sumergidos en el tampón de separación. En una realización más preferida, el tiempo de inyección de la disolución está comprendido entre 1 y 70 segundos y la presión está comprendida entre 1 y 100 mbares (milibares). En una realización aún más preferida, el tiempo de inyección es de 35 segundos y la presión de 50 mbares. El campo eléctrico aplicado en el paso (e) es superior a 100 V/cm. En una realización preferida el campo eléctrico es de 333 V/cm.

La detección de las isoformas separadas se realiza próxima al extremo de salida del capilar. En una realización preferida, se realiza detección ultravioleta, en una realización más preferida la detección ultravioleta se realiza a 214 nm.

En una realización preferida se realiza cuantificación de las isoformas. La cuantificación de las isoformas se realiza teniendo en cuenta la proporción de cada una de ellas. En una realización preferida la proporción considerada consiste en el porcentaje de área de cada isoforma respecto al área total; en una realización más preferida, el porcentaje de área considerado es el porcentaje de área corregida teniendo en cuenta su velocidad electroforética aparente.

Para la realización de análisis sucesivos en el mismo capilar siguiendo el mismo procedimiento y evitando problemas de contaminación en las partículas magnéticas de inmunoadsorbente, éstas se pueden retirar del capilar y emplear nuevas partículas para cada análisis. En una realización preferida la retirada de las partículas se realiza mediante la aplicación de una presión superior a 5 bares sin necesidad de interrumpir el campo magnético.

En un segundo aspecto de la presente invención, describe un aparato o sistema para el análisis de al menos una isoforma de una glicoproteína en una muestra de fluido biológico por electroforesis capilar a través del método anteriormente descrito; dicho aparato o sistema comprende: a) un capilar de electroforesis;

b) una fase inmunoadsorbente que contiene anticuerpos específicos frente a la glicoproteína de interés;

c) un dispositivo magnético capaz de inmovilizar la fase inmunoadsorbente en el interior del capilar de electroforesis.

El capilar de electroforesis utilizado es un capilar de sílice fundida no recubierto. En una realización preferida el capilar tiene unas medidas de 90 cm de longitud y 75 mieras de diámetro interno.

En una realización preferida el dispositivo magnético está formado por uno o varios ¡manes y un dispositivo de sujeción que permite inmovilizar los ¡manes próximos al capilar. En una realización más preferida el dispositivo de sujeción mantiene dos ¡manes separados entre sí a una distancia comprendida entre 0.1 y 100 mm y sujeta el capilar entre los dos ¡manes. En una realización aun más preferida los dos ¡manes son de Nd-Fe-B con geometría de disco de 9 mm de diámetro y 5 mm de grosor, y se encuentran a una distancia entre sí de 1 mm y el capilar se dispone de forma equidistante entre ellos. Las Figuras 1 a y 1 b muestran un ejemplo, en forma de esquema, del dispositivo magnético formado por dos ¡manes (1 ) y un dispositivo de sujeción (3). El dispositivo de sujeción contiene un orificio (2) que permite pasar un capilar de electroforesis y fijarlo entre los dos ¡manes. En una realización preferida, el dispositivo magnético se sitúa a una distancia comprendida entre 1 y 16 cm de la entrada del capilar. En una realización más preferida, el dispositivo magnético se sitúa a una distancia de 8,5 cm.

En un tercer aspecto de la invención, la comparación del perfil electroforético de al menos una isoforma de la glicoproteína, obtenido utilizando el método o procedimiento descrito anteriormente, entre individuos sanos e individuos enfermos, se puede utilizar como biomarcador de diferentes enfermedades que causan cambios, a nivel fisiológico, en el perfil de isoformas de glicoproteínas. En una realización preferida, las enfermedades se comprenden entre cáncer, enfermedades vasculares, inflamación y enfermedades del hígado. En una realización más preferida, las enfermedades son aneurisma aórtico abdominal y ateroesclerosis carotidea. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las figuras y ejemplos incluidos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ¡lustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ¡lustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1

Métodos Experimentales

Reactivos

Todos los reactivos fueron de grado analítico o superior. La cantidad requerida de α-1 -glicoproteína ácida humana estándar, adquirida a Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), se disolvió en agua MILLI-Q (Millipore Corp., Madrid, España), para obtener una disolución de 1 mg/ml que se almacenó a 4 °C. Se utilizó ácido tricloroacético (Merck, Darmstadt, Alemania) para la precipitación ácida correspondiente a la etapa de pretratamiento de la muestra. Las partículas magnéticas de 1 ,08 mieras de diámetro activadas con grupos tosilo (MB) fueron adquiridas a Dynabeads (Invitrogen, Oslo, Noruega). El anticuerpo policlonal anti- α-1 -glicoproteína ácida humana desarrollado en cabra se adquirió a Inmune Systems Ltd (Paignton, Devon, Reino Unido). Se utilizaron tricina (Sigma), cloruro de sodio (Merck), acetato de sodio (Merck), urea (Sigma), putrescina (Sigma) y ácido acético (Merck) para la preparación del tampón empleado como agente de desorción, para activar las partículas, y como tampón de separación electroforética. Se utilizó hidróxido de sodio (Merck) para el acondicionamiento capilar. Se utilizó metanol (Merck) para realizar un efecto de enfoque. Se utilizó Brij 35 (Merck) para pasivar los dispositivos de filtración. Se utilizaron azida de sodio (JT Baker, Deventer, Holanda), cloruro de trizma (Sigma), fosfato disódico (Merck), fosfato monosódico monohidratado (Merck), cloruro de sodio (Merck) y sulfato amónico (Merck) en el acoplamiento MB- anticuerpo. Las muestras de suero de un donante sano fueron proporcionadas por un Hospital, con el correspondiente consentimiento. Las alícuotas de suero fueron almacenadas a -80 °C hasta su uso posterior.

Equipos Las etapas de tratamiento de la muestra y separación electroforética de las isoformas de AGP realizadas dentro del capilar de electroforesis se llevaron a cabo empleando un equipo Agilent 7100 CE (Waldbronn, Alemania) con detección UV-Vis (λ = 214 nm) y una fuente de presión externa. Se utilizó el software Agilent ChemStation para controlar el instrumento y para adquirir y procesar los datos. Los capilares de sílice fundida sin recubrir (90 cm de longitud total, 75 mieras de diámetro interno, 375 mieras de diámetro externo) fueron adquiridos a Polymicro technologies (Phoenix, Arizona, EE. UU).

El campo magnético fue aplicado por dos ¡manes de disco de Nd-Fe-B, de 9 mm de diámetro, 5 mm de espesor con magnetismo residual estimado de 1 ,40-1 ,46 T (Supermagnete, Zurich, Suiza). Se utilizó un dispositivo de metacrilato fabricado en el laboratorio para mantener los ¡manes con una separación de 1 mm entre ellos, y para fijar el capilar en la posición central entre los dos ¡manes. Este dispositivo se ubicó a una distancia de 8,5 cm del extremo de entrada del capilar. Se utilizó un dispositivo de filtración con una membrana con tamaño de corte de 50 kDa (MICROCON ® YM-50, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) empleado en una centrífuga Biofuge Stratos (Heraeus, Hanau, Alemania) para la preparación de anti-AGP. Se utilizó un tubo de baja adsorción de proteína de 0,5 ml_ LoBind (Eppendorf Ibérica, Madrid, España) para llevar a cabo la reacción de acoplamiento anti-AGP-MB. Por último, se utilizó un espectrofotómetro Beckman Coulter DU 800 UV/Vis (Brea, CA, EE.UU.) para el cálculo indirecto de la cantidad de anticuerpo inmovilizado sobre las MBs.

Acoplamiento de los anticuerpos anti-AGP a las partículas magnéticas (MBs).

Se añadieron 100 μΙ_ de una suspensión comercial de MBs activadas con grupos tosilo (100 mg/ml_) a un tubo de 0,5 ml_ LoBind (Eppendorf) y se lavó tres veces con 100 μΙ_ de tampón de recubrimiento (sulfato amónico 1 M en fosfato sódico 0, 1 M, pH 7,4).

Para preparar el anticuerpo para la reacción de acoplamiento, se acondicionó un filtro de centrífuga MICROCON ® con una membrana de 50 kDa de corte nominal mediante tratamiento con un volumen de 500 μΙ_ de una disolución acuosa de Brij 35 al 5% (w:v), a 4 °C durante 24 horas. La disolución de Brij se descartó y el MICROCON ® se enjuagó con agua Milli-Q (500 μί), y se lavó dos veces con 500 μί de agua haciéndolo pasar a través de la membrana por centrifugación a 14000 g durante 10 min. En el siguiente paso, el MICROCON ® se invirtió y se centrifugó durante 3 min a 1000 g. Utilizando el MICROCON ® así preparado se intercambió el disolvente de la solución de anticuerpo pasando de PBS-azida a tampón de recubrimiento. Para ello, se eliminó, por centrifugación (14000 g, 30 min), el disolvente de 400 μί de la solución de anti-AGP en PBS-azida (1 mg/mL). A continuación, se añadió sobre el anticuerpo retenido en la membrana un volumen de 400 μί del tampón de recubrimiento y se centrifugó a 14000 g durante 30 min. Posteriormente, el anticuerpo se recogió en un nuevo vial centrifugando el MICROCON ®, boca abajo durante 3 minutos a 1000 g. Se midió el volumen de anticuerpo recogido y se adicionó tampón de recubrimiento hasta un volumen final de 250 μΙ_. Esta solución de anti-AGP se adicionó al tubo que contenía 10 mg de MBs lavadas. En el siguiente paso, la mezcla se incubó durante 24 horas a 37 °C con agitación constante y homogénea (combinando inclinación y rotación). Se retiró el sobrenadante, y el material se lavó tres veces con PBS. Por último, los grupos tosilo sin reaccionar se bloquearon con Tris HCI 0,2 M preparado en PBS y ajustado a pH 7,4 (12 horas de tiempo de reacción a 37 °C). Las MBs con anticuerpo unido (MB-Ab) fueron almacenadas a 4 °C en PBS a pH 7,4 (conteniendo azida sódica al 0,02% (w:v) como agente bacteriostático). Condiciones para la inmunocaptura en línea, preconcentración y separación de las isoformas de AGP.

Cada capilar de electroforesis nuevo fue acondicionado, de forma secuencial, con NaOH 1 M (10 min), agua Milli-Q (5 min) y tampón de separación (BGE) (10 min) a 1 bar. El BGE utilizado consistió en tricina 10 mM, cloruro sódico 20 mM, acetato sódico 10 mM, urea 7 M y putrescina 3,9 mM, ajustado a pH 4,5 utilizando ácido acético. Al comienzo de cada día, el capilar se acondicionó con NaOH 0, 1 M (10 min), agua Milli-Q (5 minutos) y BGE (10 min). Entre análisis el capilar se acondicionó a una presión de 1 bar con NaOH 0,1 M (270 s) y con agua Milli-Q (270 s).

A partir de muestras de suero humano se llevó a cabo una precipitación ácida para la purificación de AGP, que consistió en la adición de 10 μΙ_ de ácido tricloroacético 1 M a 50 μί de suero (relación 1 :5 v:v). A continuación, la mezcla se centrifugó (3000 g, 5 min) y el sobrenadante se analizó siguiendo el procedimiento que se describe a continuación.

El procedimiento de purificación dentro del capilar consistió en 8 pasos. Paso 1 : captura de las MB-Ab por el campo magnético; se inyecta una suspensión de 1 mg/ml MB-Ab durante 240 s a baja presión (100 mbar). Paso 2: lavado con BGE (300 s, 1 bar). Paso 3: aislamiento de la glicoproteína; la muestra sometida a pretratamiento ácido se inyecta durante 500 s a 100 mbar, quedando la AGP retenida en las MB-Ab. Paso 4: lavado con H ₂ O durante 60 s a 1 bar. Paso 5: inyección de BGE desde el extremo de salida del capilar durante 480 s a 100 mbar. Paso 6: inyección de CH ₃ OH/H ₂ 0 (1 :3 v/v), durante 35 segundos a 50 mbar. Paso 7: elución y separación por aplicación de 30 kV con polaridad directa (polaridad negativa a la salida) a 35 °C detectando las isoformas a 214 nm. Paso 8: eliminación de las MB-Ab a 5,5 bar empleando agua Milli-Q (30 s) y NaOH 0, 1 M (30 s).

Los resultados obtenidos en el análisis por quintuplicado de una muestra de suero de un individuo sano, se resumen en la siguiente tabla. En ella se recoge el valor medio del porcentaje de área corregida relativa para cada una de las isoformas (picos) de AGP observadas en el electroforegrama de la Fig. 2, junto con su desviación estándar relativa (RSD); la tabla incluye también los valores de RSD para el tiempo de migración de cada una de las isoformas. El área corregida se calcula multiplicando el área de pico por su velocidad electroforética aparente.

N° de pico de Porcentaje de RSD porcentaje de RSD tiempo de AGP área (%) área (%) migración (%)

1 0,8 1 1 ,2 3,9

2 2,0 2,8 3,7

3 5,0 0,9 3,6

4 13, 1 0,5 3,5

5 22,7 0,3 3,4

6 25,4 0,5 3,3

7 18,8 0,4 3,2

8 8,7 1 , 1 3, 1

9 2,8 3,9 3, 1

10 0,8 8,8 3,0