【명세서】

【발명의 명칭】

세포내또는세포간단백질-단백질상호작용분� � 방법 및장치 【기술분야】

단백질-단백질 상호작용 분석을 통하여 세포 또는조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로 (signal ing pathway)의 활성화 상태를 분석하는 방법， 이를 이용한 치료제 선정 및/또는 치료제 효능 모니터링 방법， 후보약물스크리닝 방법 및 이에 사용하기 위한장치에 관한것이다. 【배경기술】

최근 질병 진단, 예후 예측 및 치료는 유전자 분석 (genomi c prof i l ing)에 집중되고 있다. 하지만， 암을비롯한특정 질병의 발병원인은 신체를 구성하는 세포의 비정상적인 활동， 더욱 자세하게는 세포를 구성하고 조절하는 다양한 단백질간의 비정상적인 상호작용에 의한 것이으로， 유전자 분석을 통한 개별적 단백질 관찰만으로는 이해하기 어려운 문제가 있다. 실제로 이러한유전자돌연변이의 프로파일링을 통해 동일한 유전적 성질을 지닌 환자들에 대해서도 표적 항암제에 대한 감수성이 다르고, 예후 역시 다양하게 나타난다. 따라서, 개별적 단백질 분석이 아닌 단백질-단백질 간의 상호작용의 정확한 분석은 세포 내 및/또는 세포 간 신호전달 네트워크 (signal ing network)가 어떻게 변화하는 지를 이해할수 있도록 할뿐 아니라， 암과 같은 질병의 진행과 특성 및 그 치료제 선정 및 치료방법에 대한 정보까지도 제공할 수 있을 것으로기대된다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

일 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는단계를포함하고,

상기 제 1단백질은세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로 (signal ing pathway)에 관여하는 단백질이고， 제 2 단백질은 상기 세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로중에서 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질 (예컨대， 제 1 단백질의 하위 단백질， 제 1 단백질의 리간드， 제 1 단백질과 동일세포, 동종세포 또는 이종세포 立면에 위치하거나 이종세포에서 분비되고 제 1 단백질과 상호작용하는단백질등)인， 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화측정 （또는확인또는결정 또는분석） 방법 ; 상기 세포또는조직， 또는상기 세포또는조직이 유래하는 개체의 상기 제 1 단백질을표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예즉하는 방법 또는 예즉에 정보를 제공하는 방법 ; 및상기 제 1단백질을표적으로하는치료에 적합한개체를선별하는 방법 또는선별에 정보를제공하는방법을제공한다.

상기 제 1 단백질이 2종 이상 사용되는 경우, 상기 제 1 단백질을 표적으로하는 약물은상기 2종 이상의 제 1단백질 중어느하나또는 2종 이상을 표적으로 하는 약물일 수 있고， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 상기 2종 이상의 제 1 단백질 충 어느 하나 또는 2종 이상을 표적으로하는치료일 수 있다. 상기 치료는 제 1단백질을표적으로하는 약물을처방및/또는투여하는것을포함할수 있다. 상기 개체는상기 제 1 단백질이 관여하는신호전달또는제 1단빡잘및 제 2단백질 간상호작용과 관련된 질병 （예컨대， 암）에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 개체 （즉, 상기 제 1 단백질이 관여하는 신호전달 또는 제 1 단백질 및 제 2 단백질 간 상호작용과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체）일 수 있다. 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물이 소망하는 효과（예컨대， 상기 제 1 단백질이 관여하는 신호전달 또는 제 1 단백질 및 제 2 단백질 간상호작용과 관련된 질병의 예방및/또는치료및/또는경감효과（상기 질병이 암인 경우항암 효과）등）를발휘할수있는개체를의미할수있 다.

다른 예는 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 2개 이상의 제 1 단백질에 대하여 수행하는， 상기 세포 또는 조직， 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체에 적용하기에 적합한 표적으로서의 제 1 단백질또는이를표적으로하는 약물을선별하는방법 또는선별에 정보를 제공하는방법을제공한다.

다른 예는， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물이 처리된 세포 또는 조직， 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직 내， 및/또는 세포 또는 조직 간의 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하는， 상기 세포 또는 조직， 또는 상기 개체의 상기 제 1단백질을표적으로 하는 약물 및/또는상기 제 1단백질과 저 12단백질이 관여하는신호전달또는상기 제 1 단백질과제 2 단백질 간의 상호작용과관련된 질병의 치료제에 대한반응성을모니터링하는방법 또는 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

모니터링에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 다른 예는, 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직， 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직 내， 및/또는 세포 또는 조직 간의 제 1단백질과제 2단백질 간단백질-단백질상호작용을측정하는 단계를포함하는， 상기 제 1단백질을표적으로하는약물및/또는상기 제 1 단백질과 제 2 단백질이 관여하는 신호전달 또는 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 상호작용과관련된 질병의 치료제의 스크리닝 방법을제공한다. 일구체예에서， 다음의 단계를포함하는， 세포또는조직 내 및/또는 세포또는조직 간의 신호전달경로의 활성화측정 방법이 제공된다:

(1) 제 1 단백질을포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계;

(2) 상기 준비된 제 1단백질이 고정된 기판에 표지 물질이 결합된 저 12단백질을첨가하여 반응시키는단계 ; 및

(3)단계 (2)에서 얻어진반응물로부터 신호를즉정하는단계.

상기 활성화측정 방법은단계 (1)내지 (3)에 더하여,

(4)단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 (1)에서 첨가한시험 시료내의 제 1단백질의 단위량에 대한신호값을구하는단계， 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한신호값을구하는단계 ; 및

(4-2) 상기 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는단계

를추가로포함할수있다.

상기

단계 (4) 또는 (4-2)에서 얻어진 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값은 각각의 제 1 단백질과 각각의 제 2 단백질에 대하여 얻어진값을모두합한값일수있다.

상기 단계 (4)또는 (4-2) 이후에，

(5) 단계 (4) 또는 (4-2)에서 얻어진 결과를 기준 시료에서 얻어진 결과와비교하는단계를추가로포함하고，

상기 기준시료는정상세포, 제 1단백질이 관여하는신호전달경로의 활성화 정도가 확인된 세포， 또는 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

활성화정도가확인된개체로부터 분리된세포를포함하는것일수있다. 다른구체예는, 상기한단계 (1)， (2)， 및 (3)， 또는 (1) , (2) , (3) , 및 (4) , 또는 (1)， (2)， (3) , (4-1) 및 (4-2)를포함하고, 여기에 추가하여，

(5)상기 단계에서 얻어진결과를비교하는단계를포함하고， 상기 제 1단백질은세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로에 관여하는 단백질 중에서 선택되는 2종 이상이고， 상기 제 2 단백질은상기 제 단백질과상호작용하는단백질이며，

단계 (5)는 상기 2종 이상의 제 1 단백질에 대하여 얻어진 결과를 서로비교하는것인,

개체에 적용하기에 적합한 표적 약물의 선별에 정보를 제공하는 방법을제공한다.

상기 방법에 있어서， 상기 시험 시료는 포유류 개체로부터 분리된 세포， 조직, 세포또는조직의 용해물， 파쇄물， 또는추출물, 또는체액일 수 있으며， 예컨대， 암세포, 암조직, 암세포또는암조직의 용해물, 파쇄물, 또는추출물일수있다.

상기 방법에 있어서, 상기 표지 물질은효소반응， 형광， 발광， 또는 방사선 검출을 통하여 측정 가능한 신호를 발생시키는 소분자 화합물， 단백질， 펩타이드， 및 핵산분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 방법에 있어서， 단계 (2)의 표지 물질은 형광을 발생시키는 소분자 화합물, 단백질， 펩타이드, 및 핵산분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고， 단계 (3)의 신호를 측정하는 단계는 전반사 형광 현미경 또는형광카메라또는이들모두를사용하여 수행되는것일수있다.

상기 방법에 있어서， 상기 형광카메라의 1프레임 당노출시간이 약 0.0()1초내지 약 1초일수있다.

다른구체예는，

(I)시험 시료에 후보화합물을처리하는단계, 및

(I I) 상기 후보 화합물이 처리된 시험 시료 및 처리되지 않은 시험 시료 각각에 대하여 상기 단백질-단백질 상호작용， 상호작용 수준， 활성화 수준 측정을 수행한 후 상호 비교하여 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별방법을제공한다:

상기 비교 결과， 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용, 단백질-단백질 상호작용 수준， 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은시험 시료에서보다낮은경우， 상기 후보화합물을 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하는 단계를 추가로 포함할수있다.

다른구체예는，

제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질을 포함하는멀티 웰, 및

임의의 신호검출수단

을포함하고，

상기 멀티 웰은 일면이 개방된 복수의 관을 포함하거나, 지지 플레이트에 이격 형성된복수의 비관통형 홀을포함하는것으로,

상기 관또는비관통형 홀의 개방된 일면에 위치하는시료주입부， 상기 관 또는 비관통형 홀의 내부의 단백질-단백질 상호작용이 일어나는반응부, 및

상기 관또는비관통형 홀의 내부와접촉하는적어도 일부의 내벽의 표면에 제 1 단백질의 포획용 물질이 고정화되거나 고정화 가능한 제 1 단백질의 포획부를포함하며，

상기 제 1 단백질의 포획부의 표면은 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로이루어진 군에서 선택된 작용기를포함하는화합물로표면 처리된 것인，

세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간 단백질-단백질 상호작용분석 장치를제공한다.

상기 분석 장치에 있어서，

상기 표면 처리는, 바이오틴 (biot in) , 바이오틴이 결합된 소혈청알부민 (Bovine serum albumin) , 폴리에틸렌글리콜 (PEG, polyethylene glycol ) , 폴리에틸렌글리콜-바이오틴 (PEG-biot in) , 또는 폴리소르베이트를사용하는것일수있다.

상기 표면 처리는 뉴트라비딘 (neutravidin) , 스트렙타비딘 (streptavidin) , 및 아비딘 (avidin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 도포하는것일수있다.

상기 멀티월은검출가능한신호를발생시키는표지 물질로표지된， 신호전달 경로 상에서 상기 제 1 단백질과 상호작용 하는 1종 이상의 제 2 단백질을추가로포함하는것일수있다.

상기 멀티 웰은， 제 1 단백질과 제 2 단백질 간상호작용이 일어나는 반응부 (제 1 반응부)를 포함하는 하나 이상의 웰 및 제 1 단백질과 저 U 단백질에 결합하는탐지용물질이 결합하는반응부 (제 2반응부)를포함하는 하나이상의 웰을포함하는것일수있다.

상기 방법 및 장치에 있어서， 상기 세포또는조직 내 및/또는세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화 측정 방법에 있어서， 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질은 각각 독립적으로 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로에 관여하는 단백질 중에서 선택되는 1종 이상이고， 상기 제 2 단백질은 신호전달경로 상에서 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질 (예컨대， 제 1 단백질보다 하위 경로에 관여하는 단백질, 제 1 단백질의 리간드, 제 1 단백질과 동일세포， 동종세포 또는 이종세포 표면에 위치하거나 이종세포에서 분비되고 제 1 단백질과 상호작용하는 단백질 등) 일 수있다. 상기 신호전탈은 세포 내부에서의 신호전달， 세포외부에서 세포 내부로의 신호전달, 또는동종또는 이종의 2이상의 세포간의 신호전달 (예컨대， 면역체크포인트간의 면역신호전달 등)을 총괄하여 의미하는 것일 수 있다. 상기 제 1 단백질은 세포막 단백질일 수 있다. 상기 제 1 단백질은수용체 티로신 카이네이즈， 톨-유사 수용체， G-단백질 연결 수용체 (G-protein-coupled receptors； GPCR)， 트랜스페린 수용체 (transferr in receptors) , 저밀도지질단백질 (Low_ Dens ity Lipoprotein； LDL) 수용체, R0S1； BCR-Abl l 융합 단백질; 비수용체형 카이네이즈; GTP가수분해효소 (GTPases)； 호르몬 수용체; 항- 아팝토시스 단백질; 및 면역 체크포인트 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수있다.

일 예에서, 제 1 단백질로서 PD-L1 및 卵 -1 중 어느 하나， 제 2 단백질로서 다른하나를선택하여 상기 방법 및장치에 적용할수있다. 다른 예에서， 제 1 단백질로서 HER2와 HER3의 헤테로다이머를 선택， 제 2 단백질로서 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로 중에서 HER2 및/또는 HER3의 하위 단백질을 선택하여 상기 방법 및 장치에 적용할수있다.

일 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고， 상기 제 1 단백질은 HER2 및 HER3이고， 상기 HER2및 HER3는헤테로다이머를형성하며， 제 2단백질은세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로중에서 HER2 , HER3 , 또는 이들 모두의 하위 단백질인， 세포 또는 조직 내에서의 HER2 , HER3 , 또는 이들 모두（예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머 형태）가 관여하는 신호전달경로의 활성화 측정 （또는 확인 또는 결정 또는 분석） 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는， HER2-HER3 헤테로다이머의 활성화 정도를 측정 （또는 확인 또는 결정 또는분석） 방법을 제공한다. 이 경우 제 2단백질은 HER2-HER3 헤테로다이머의 인산화기 （예컨대， 인산화된 타이로신）에 결합하는단백질들중에서 선택된것일수있다. .

다른예는상기 기재된방법에사용하기 위한장치를제공한다.

다른예는，

PD-L1이 부착된 기판에 표지물질이 결합된 卵 -1을 공급하여 반응시키는단계; 및

상기 반응시키는단계에서 발생한신호（A）를즉정하는단계 를포함하고，

상기 PD-L1과 PD-1의 반응물은클러스터를형성하는것인,

PD-L1과 PD-1의 상호작용측정 방법을제공한다. 상기 방법은， 상기 반응시키는단계 이전에, PD-L1에 결합하는물질이 표면에 부착된 기판에 PC-L1을 공급하여， PD-L1을 기판에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. PD-L1에 결합하는 물질이 표면에 부착된 기판에 표지 물질이 결합된 PC-L1을 공급하고， PD-L1과 기판 표면의 물질 간 반응에 의하여 발생하는 신호 （ 를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 신호 （ 에 대한신호 （A） 값 （즉， ［신호 （A） 값］/［신호 （B） 값］）을 구하여 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 반응시키는 단계에서, PD-L1 및 PD-1 간 결합에 대하여 PD-L1 또는 PD- 1과 경쟁하는물질을 첨가하여 반응시카고， 신호 （ 를즉정하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 방법에서, 상기 신호 （A） 또는 （ 는 근접장 （near-f i eld） 영역에서 측정되는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서， 상기 기판에 부착된 PD-L1에 결합하는 물질은 PD- L1의 말단부위에 결합하는물질일수있다.

다른예는，

후보 물질， 卵 -L1， 및 표지 물질이 결합된 抑- 1가혼합된 혼합물을

PD-L1과 결합하는 물질이 표면에 부착된 기판에 공급하여 반응시키는 단계; 및

상기 반응시키는단계에서 얻어진신호（시를측정하는단계 를 포함하는, 抑- L1과 PD-1 간 상호작용 억제제의 선정 방법을 제공한다. 상기 방법은 PD-L1에 결합하는물질이 표면에 부착된 기판에 표지 물질이 결합된 PC-L1을 공급하고， PD-L1과 기판 표면의 물질 간 반응에 의하여 발생하는 신호 ( 를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 신호 (A) 또는 ( 는 근접장 (near-f ield) 영역에서 측정되는 것일 수 있다. 상기 방법은상기 신호 ( 에 대한신호 (A) 값 (즉, ［신호 (A) 값］/［신호 (B) 값］)을구하여 정량화하는 단계를추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법에서, 후보물질 무처리군 (예컨대， 후보물질 처리 전)과비교하여, 후보물질 처리군 (예컨대, 후보물질 처리 후)에서의 신호 (A) 값 또는 신호 ( 에 대한 신호 (A) 값이 감소하는 경우, 상기 후보물질을 PD-L1과 PD-1 간 상호작용 억제제로 선정하는 단계를추가로포함할수있다.

다른예는,

제 1수용체 타이로신 인산화효소또는이를암호화하는유전자를제 2 수용체타이로신 인산화효소발현세포에 도입시키는단계;

상기 세포에 제 1수요에 타이로신 인산화효소리간드를투입하여 제 1 수용체 타이로신 인산화효소와 제 2 수용체 타이로신 인산화효소 간 이합체를형성시키는단계; 및

상기 이합체가 형성된 세포에 콜레스테롤-유사 세정제를 처리하는 단계

를포함하고，

제 1 수용체 타이로신 인산화효소과 제 2 수용체 타이로신 인산화효소는서로다른종류이고,

생체외에서 수행되는것을특징으로하는，

활성화된 수용체 타이로신 인산화효소 이합체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조된 수용체 타이로신 인산화효소 이합체는 상기 방법에 의하지 않은 경우와 비교하여, 활성화된 형태일 수 있다. 상기 방법에서， 상기 제 1수용체 타이로신 인산화효소는 HER3이고, 제 2수용체 타이로신 인산화효소는 HER2일 수 있다. 또한, 상기 콜레스테롤-유사 세정제는 0.05내지 5%(w八 0의 DGTN(digi tonin) 및 0.003내지 2%(w八 0의 GDN (glycol-diosgenin)중에서 선택된 1종이상일수있다.

【기술적 해결방법】

이하， 보다상세히 설명한다. 본 명세서에서 사용된 바로서， 용어 ’’단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interact ion： PPI)”은 저 U 단백질과 제 2 단백질 간의 물리적 및/또는화학적 결합또는복합체 형성을의미할수 있으며, 예컨대， 결합 빈도， 결합 세기 (강도) , 및 결합 시간 등의 인자들 중에서 하나 이상으로 측정될 수 있다. 또한， 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 상호작용 (결합)은 이들 간의 직접적인 상호작용 (결합)뿐 아니라 중간에 다른 단백질 (신호전달경로 중에서 제 1 단백질 및 제 2 단백질 사이에 위치하는단백질)을매개로한간접적인상호작� � (결합)도포함할수 있다. 본명세서에서의 단백질-단백질상호작용은단분자 (s ingle molecule) 반응 (1분자의 제 1단백질과 1분자의 제 2단백질 간의 반응)일 수 있다. 세포 또는 조직 간의 상호작용은 2 이상의 동종 세포 또는 동종 조직， 또는 동일/동종/이종 세포 또는 동일/동종/이종 조직의 표면 단백질 사이에서 일어나는모든상호작용을의미하는것일수있다 .

본 명세서에서, 제 1 단백질과 제 2 단백질은 각각 독립적으로 진핵 유기체 (예컨대， 다세포 동물， 다세포 식물 등)의 세포 또는 조직의 신호전달경로에 관여하는 단백질 중에서 선택되는 1종 이상이거나, 어느 하나는수용체이고 다른 하나는 리간드이거나， 이종 세포의 표면 단백질들 중에서 선택되는 ₁ 종이상일수있다 _.

일 예에서， 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질 중에서 하나 이상은 인산화된 것일 수 있다 (예컨대, 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질 중에서 하나 이상은 인산화된 타이로신 (p-Tyr)을포함하는 것일 수 있다) . 이와 같이 제 1 단백질 및 제 2 단백질 중에서 하나 이상은 인산화된 것인 경우， 상기 제1 단백질과 제2 단백질 간의 상호작용은 인산화 정도 (p-Tyr 수준)에 의존적인 것일 수 있다. 다른 예에서， 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질 중에서 하나 이상은 이들 간상호작용에 영향을 미치는돌면변이를 갖는것일 수 있다. 상기 돌연변이는신호경로상에서 서로상호작용할대상 단백질의 존재 또는수준에 의존하지 않고 (예컨대， 제 1단백질이 수용체인 경우， 이와 상호작용하는 리간드 또는 하위 단백질의 존재 또는 수준에 무관하게) 신호전달이 가능하도록하는것일수 있다 (예컨대， EGFR의 exon 19및/또는 exon 21변이 (결실)등) .

본 명세서에서 제공되는 모든 방법에서의 단백질-단백질 상호작용 측정에서의 단계 (1)， (2)， 및 (3)， 또는 (1) , (2) , (3) , 및 (4) , 또는 (1)， (2)， (3)， 및 (4-1)， 또는 (1)， (2) , (3) , (4-1) , 및 (4-2)는, 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

（ ₃ ）수용체 （제 1단백질） 및 리간드（제 2단백질）간의 상호작용（이 경우， 첨가하여 ??1변화측정 가능）,

（ 1단백질 및 제 2단백질 중에서 하나이상이 인산화된 타이로신 잔기를 갖는 경우의 제 1 단백질 및 제 2 단백질 간의 상호작용 （이 경우， 타이로신의 인산화 정도로 제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질의 활성화 정도 예측가능）， 및

（ ₀ ）제 1단백질 및상기 제 1단백질이 관여하는신호전달경로중에서 저 단백질의 하위 단백질인제 2단백질간의 상호작용

중에서 선택된 하나 이상, 두 개 이상, 또는 세 개 모두에 대하여 수행되는것일수있다.

본 명세서에 사용된 바로서 , 제 1단백질은신호전달경로에 관여하는 1종 이상 또는 2종 이상 （예컨대， 1종 내지 10종 또는 2종 내지 10종）의 단백질을 의미할 수 있다. 또한， 제 2 단백질은 상기 제 1 단백질과 상호작용（결합）하는 단백질로서， 상기 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는단백질 중에서 선택된 1종 이상또는 2종 이상 （예컨대， 1종내지 10종또는 2종 내지 10종）의 단백질을의미할 수 있다. 제 1 단백질이 2종 이상인 경우， 상기 제 2 단백질은 제 1 단백질 각각에 대하여 독립적으로 1종 이상 선택될 수 있으며， 각각의 제 1 단백질에 대하여 선택된 제 2 단백질은 서로 다르거나, 부분적으로 또는 전부중복될수있다.

본 명세서에 있어서， 상기 제 1 단백질은 병적 상태 （예컨대， 암, 염증， 그 외 면역 질환 등）와 관련 있는 단백질들 중에서 선택됨으로써， 이들이 관련된 병적 상태 （예컨대, 암， 염증， 그외 면역 질환등）의 치료 （및/또는 개선 및/또는 경감）에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 측면에서， 상기 제 1 단백질은 치료하고자 하는 질병의 치료 타겟이 되는 단백질일 수 있다. 구체적으로， 상기 제 1 단백질은 치료하고자 하는 질병에 대한 표적 치료제 또는 효과를 시험하고자 하는 치료제의 표적이 되는단백질일수 있다. 따라서， 상기 제 1단백질은치료하고자하는질병 또는효과를알고자하는치료제에 따라서 적절히 선택될수있다.

일 예에서， 상기 제 1단백질은세포또는조직의 생체 신호전달경로 중상위 경로에 관여하는단백질, 및 이종세포간상호작용관여하는세포 표면 단백질 또는 이종세포가 분비（방출）하는 단백질 （예컨대, 엑소좀 등）들 중에서 선택될 수 있으며， 약물의 치료 타겟으로서 유리하게 작용하기 위하여, 세포외 (extracel lular) 환경 (예컨대， 수성 환경)에 노출된 도메인을 갖고 세포막에 존재하는 세포막 단백질 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 제 1 단백질은 세포막에 존재하는 다양한 수용체， 마이크로필라멘트 (microfilaments)와 결합된 구조단백질 (structural proteins) , 세포부착분자 (cell adhesion molecules) , 세포막 효소 (membrane enzymes ) , 세포막 수용체 (membrane receptors) , 캐리어 단백질 (carrier proteins) , 채널 단백질 (chamel proteins) , 운반 단백질 (transport proteins) , 지질 고정 단백질 (lipid-anchored proteins) 등모든종류의 세포막단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상， 일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 제 1 단백질은 수용체 티로신 카이네이즈류 (Receptor Tyrosine Kinase； RTK) (예컨대, 상피세포 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor； EGFR； ErbBl) , HER2( Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein； ErbB2) , HER3( Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein； ErbB3) , 간세포 성장인자 수용체 (hepatocyte growth factor receptor (HGFR) : MET) , 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR , 예컨대， PDGFR-alpha, PDGFR-beta 등)， 혈관내피세포 성장인자 수용체 (vascular endothelial growth factors; VEGFR, 예컨대， VEGFR1 , VEGFR2 , VEGFR3등), 인슐린-유사성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor； IGF1R) , 에프린 수용체 (ephrin receptors) , 섬유아세포 성장인자 수용체 (Fibroblast growth factor receptor; FGFR, 예컨대, FGFR1, FGFR2 등)， 인슐린-유사 성장인자 수용체 (Insulin-1 ike Growth Factor Receptor； IGFR, 예컨대, IGF1R등)， c-KIT, RET receptor tyrosine kinase, Anaplastic lymphoma kinase (ALK) , 등); 톨-유사수용체 (Toll like receptor； 예컨대， TLR1， TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, ^· TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12, TLR13) : G_단백질 연결 수용체류 (G-protein- coupled receptors； GPCR)； 트랜스페린 수용체 (transferrin receptors); 저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein； LDL) 수용체; R0S1; BCR-Abll 융합 단백질; 비수용체형 카이네이즈류 (예컨대， BRAF, MEK (Mitogen- act ivated protein kinase kinase) , Src, PI3K ( Phosphoi nos i tide 3- kinase) , CDK Cycl in-dependent kinases； 예컨대, CDK4, CDK6등) 등); GTP 가수분해효소류 (GTPases) (예컨대， KRAS 등); 호르몬 수용체류 (예컨대, 에스트로겐수용체 (ER) , 프로게스테론수용체 (PR) , 안드로겐수용체 (AR) 등) ; 항-아팝토시스 단백질류 (Ant i-apoptot i c proteins) (예컨대, BCL2 (B-cel 1 lymphoma 2) , BIM (Bcl-2-1 ike protein 11) ; 면역 체크포인트 단백질류 ( Immune checkpoint proteins) (예컨대， CTLA-4 (cytotoxic T- lymphocyte -associated ant igen 4)， PD-1 (programmed death 1)， PD-L1 (programmed death- l igand 1) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 "간세포 성장인자 수용체 (MET 또는 c-Met)’’은 간세포 성장인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며， 예컨대， 인간 c-Met (예컨대 , NP_000236.2) , 원승이 c-Met (예컨대， Macaca mulatta,

NPJ301162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대， NP_032617.2) , 래트 c-Met (예컨대， NP_113705.1) 등과같은설치류유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number ■_00(犯45.3에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NP_000236.2에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 단백질， 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면， 암발생， 암전이, 암세포 이동， 암세포 침투， 신생혈관생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 "상피세포성장인자수용체 (Epidermal growth factor receptor；

EGFR)" , HER2 (human epidermal growth factor receptor 2 protein) , 및 HER3 (human Epidermal growth factor receptor 3 protein)는 각각 EGFR (HERD , HER2, HER3 및 HER4으로 구성되어 있는 HER 패밀리와 수용체 티로신 키나아제 (RTKs)의 일원이다. EGFR, HER2, 또는 HER3의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로-이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 티로신 잔기의 세포내 자가인산화를유발한다. EGFR자가인산화는세포증식， 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. EGFR, HER2, 및/또는 HER3의 과발현, 유전자 증폭， 돌연변이， 또는재배열은여러 종류의 인간악성 종양에서 빈번히 관찰되며, 암치료의 불량한예후및 나쁜 임상적 결과와관련 있다. 이러한이유로, 이들 EGFR, HER2, 및/또는 HER3는항암요법에 있어서 중요한표적이 된다. 상기 EGFR, HER2, 또는 HER3는 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트등의 설치류등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 EGFR은 GenBank Accession Nos . JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM_005228.3, NM_201284.1,

NM_201282.1, 또는 NM_201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (_A)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 HER2는 GenBank Accession No. X03363.1 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대， 상기 HER3는 GenBank Accession No. NM_001982 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 "혈관내피세포 성장 인자 수용체 (Vascular Endothel i al Cel l

Growth Factor Receptor : VEGFR)”는 혈관내피세포 성장 인자 정상세포에서도 존재하며， 특히 암세포에서 분비되는 혈관내피세포 성장인자 (VEGF)와 결합하여 혈관신생을 일으키며, 암세포에 필요한 양분을 공급한다. VEGFR의 과발현은다양한질병의 원인이되며， 특히 암의 발생뿐 아니라, 침습， 전이 등의 나쁜예후에도관여한다. 이러한이유로， VEGF는 항암요법에 있어서 중요한표적이 된다. 상기 VEGFR은인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트등의 설치류등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 VEGFR은 GenBank Accession Number AF063657.2 등에 제공된 뉴클레오타이드서열 (mRNA)에 의해 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 "혈소판유래성장인자수용체 (platelet-der ived growth factor receptors； PDGFR)"는표면수용체 티로신 카이네이즈중하나로， 세포증식， 세포분화， 세포성장 등의 조절 및 암을 일으키는 많은 질병과 관련 있다. 상기 PDGFR은 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 PDGFR은 GenBank Accession Nos. NM_006206.4(PDGFR-A) , NM_002609.3(PDGFR-B)，

■_016205.2(卵 GFR-C) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 "인슐린-유사성장인자 1수용체 (Insul in-l ike Growth Factor 1 Receptor； IGF1R) ¹ ’는수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로， 인슐린-유사 성장인자 l(IGF-l)에 의하여 활성화되는 막통과 수용체이다. 상기 IGF1R은 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 IGF1R은 GenBank Accession No. NM_000875.3 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (_A)에 의해 암호화된 2019/132517 1»（：1/10公018/016675

폴리펩타이드일수있다.

상기 "에프린 수용체 (ephr in receptors) "는 표면 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로， axon guidance, format ion of t i ssue boundar i es , cel l migrat ion, segmentat ion등의 배발생 과정을 조절한다. 상기 에프린 수용체는 인간， 원숭이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에프린 수용체는 GenBank Accession Nos . NM_004440.3 , NM_004438.3 , NM_004431.3,

NM_004442.6, NM_017449.3, NM_004093.3, NM_004441.4, NM_182472.2,

NM-005232.4， NM_005233.5, NM_173641.2, NM_001099439.1, NM_001080448.2, NM_001080448.2, NM_004443.3, NM_182689.1, NM_004428.2, NM_004439.5,

NH001962.2， NM_004429.4， NM_182644.2, NM_004952.4, NM_173655.2,

NM_182690.2, NM_020526.3, NM_001406.3, NM_005227.2, NM_182685.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "트랜스페린 수용체 (transferr in receptors)"는 트랜스페린의 캐리어 단백질로， 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 철의 세포내 이동에 관여하며， 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 트랜스페린 수용체는 안간， 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank Accession Nos . NM_001128148.1， NM_003234.2, NM_001206855.1,

NM_003227.3, B⑶ 01188.1, M11507.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 "저밀도지질단백질 (Low-Densi ty Lipoprotein； LDL) 수용체"는 트랜스페린의 캐리어 단백질로, 수용체-매개 엔도사이토시스를통하여 철의 세포내 이동에 관여하며， 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 LDL 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank

Accession Nos . NM_000527.4, NM_001195802.1, NM_001195799.1,

NM_001195803.1, NM_001195800.1, NM_001195798.1 등에 제공된 뉴클레오타아드서열 (mRNA)에 의해 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 "표면 분화 항원류 (c luster of di f ferent iat ion； cluster of designat ion； CD)’'는 수용체 또는 리간드로서 다양하게 작용하는 단백질로서, 인간의 경우 약 350 가지가 알려져 있고， _· 세포 신호화 (cel l signal ing) , 세포부착등의 다양한세포과정에 관여한다. 상기 표면분화 항원류는 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 표면 분화 항원류는 모든 CD계열일 수 있으며， 특히 암전이와관련된 CD44, CD147 , 또는이의 var i ant들일 수 있고， 보다 구체적으로 GenBank Accession Nos .

(NM_000610.3 , NM_001728.3 , X55150.1) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된폴리펩타이드일수있다.

상기 ⁿ G-단백질 연결 수용체 (G-prote in-coup led receptors； GPCR)”는 막통과 수용체 단백질로， 신호 도입 경로 (signal transduct ion pathway) 및 세포 반응을 활성화하며, 다양한 질병에 관여한다. GPCR은 거대한 단백질군으로 서열 상동성 및 기능적 유사성을 기초로 6개의 클래스로 분류될 수 있다: 클래스 A 또는 클래스 1 (Rhodops in-1 ike receptors)； 클래스 B또는클래스 2 (Secret in receptor fami ly) ; 클래스 C 또는 클래스 3 (Metabotropi c glutamate/pheromone)； 클래스 D 또는 클래스 4 (Fungal mat ing pheromone receptors) ; 클래스 E또는 클래스 5

(Cycl ic AMP receptors)； 및 클래스 F 또는 클래스 6

(Fr zled/Smoothened) . 상기 GPCR은 인간， 원승이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， GPCR은 암 전이에 관련되는 케모카인 수용체 (chemokine receptors; Rhodopsin-1 ike receptor subfami ly) , 예컨대, CXC 케모카인 수용체, CC 케모카인수용체, CX3C케모카인수용체， 등일 수 있으며, 보다구체적으로 GenBank Accession Nos. NM_001123041.2, NM_005508.4 NM_005201.3, NM_016602.2 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일수있다.

상기 제 2 단백질은 앞서 설명한 바와 같이 선택된 제 1 단백질과 상호작용하는 모든 단백질들， 예컨대， 상기 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직의 생체 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는 단백질， 제 1 단백질의 리간드， 이종 세포 표면에 존재하거나 이종세포에서 방출되는 단백질등으로 이루어진군에서 1종이상또는 2종이상 (예컨대， 1종내지 10종 또는 2종 내지 10종) 선택될 수 있다. 세포 또는 조직， 예컨대, 인간의 세포또는조직의 신호전달경로및 여기에 관여하는단백질들， 특정 수용체에 대한 리간드, 세포 표면에 존재하는특정 단백질과상호작용하는 이종 세포 표면 단백질들， 세포 방출 단백질들은 비교적 잘 정립되어 있으므로 （Untangl ing the ErbB signal l ing network, Nat . Rev. Mol . Cel l Biol . 2, 127（2001）; Cel l signal ing by receptor tyrosine kinases, Cel l 141, 1117 （2010） 참조）， 제 1 단백질이 선정되면， 그 하류의 신호전달경로에 관여하는 단백질을 선정하는 것은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을가진자에게 명확한사항이라할수있다.

또한， 하나의 단백질이 다양한 생체 신호전달경로에 관여하여， 다수의 신호전달경로가 네트워크를 형성할 수 있음도 잘 알려져 있다. 따라서， 제 1 단백질이 2종 이상인 경우, 어느 하나의 제 1 단백질에 대한 제 2 단백질 중 하나 이상은 다른 제 1 단백질（들）에 대한 제 2 단백질들 중 하나이상과중복될수 있다（즉, 제 1단백질이 2개 이상인 경우， 이들 2개 이상의 제 1 단백질들에 대한 제 2 단백질들은 서로 다르거나， 일부 또는 전부가동일할수있다）.

일 예에서， 상기 제 1 단백질은 서로 다른 2 종 이상의 단백질이 복합체 （제 1 단백질-제 1 단백질 복합체）를 이루는 것일 수있다. 다른 예에서， 제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 상호작용에 의하여 형성된 제 1 단백질-제 2 단백질 복합체가 2 이상 연결되어 （예컨대， 이웃하는 제 1 단백질-제 2 단백질 복합체의 제 2 단백질 간의 결합）, 클러스터를 이루는 것일수있다.

일 구체예에서， 상기 제 1 단백질은 EGFR, MET, HER2, 및 HER3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고， 각각의 제 1 단백질에 대한 제 2 단백질은 서로 같거나 다를 수 있으며， 각각 독립적으로, 포스포리파아제 C （PLC） （예컨대, PLC-gamma （PLC-gamma 1） （예컨대, GenBank Accession No. NP_002651.2, NP_877963.1, NP_037319.1등）, 또는 이의 SH2 도메인（Src homology 2 domain： N-terminal SH2 domain 및 C- terminal SH domain 중 하나 이상을 포함; 예컨대， NP_037319.1 중의 545번째부터 765번째까지의 아미노산 서열 부위 또는 NP_002651.2 중의 540번째 또는 545번째부터 765번째까지의 아미노산 서열 부위 등）, 성장인자 수용체 결합 단백질 （Growth factor receptor-binding protein： Grb； 예컨대, Grb2 （예컨대, GenBank Accession No. NP_002077.1 , NP_987102.1 등） 또는 이의 일부 （예컨대， SH2 도메인 （NP_002077.1의

57번째부터 155번째까지의 아미노산 서열 부위）， SH3_N-SH2 도메인 （NP_002077.1의 첫 번째부터 154번째까지의 아미노사 서열 부위）， SH2- SH3_C 도메인 （NPJ302077.1의 57번째부터 217번째까지의 아미노산 서열 부위))， 포스파티딜이노시톨 3 -카이네이즈 조절 서브유닛

(Phosphat idyl inosi tol 3-kinase regul atory subuni t alpha； PIK3R1； p85- alpha； 예컨대， GenBank Accession No. NP_001229395.1， NP_852556.2, NP_852664.1, NP_852665.1, P26450.2 등) 또는 이의 SH2 도메인 (예컨대， NP_852664.1 (human p85a)의 SH2_N 도메인 (333번째부터 428번째까지의 아미노산서열 부위) , SH2_C도메인 (624번째부터 718번째까지의 아미노산 서열부위) , 또는 tandem SH2도메인 (333번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위) ; 또는 P26450 (mouse p85a)의 SH2_N 도메인 (333번째부터 428번째까지의 아미노산 서열 부위) , SH2_C 도메인 (624번째부터 718번째까지의 아미노산서열 부위) 또는 tandem SH2도메인 (333번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

본명세서에 제공된구체예에서는， 폐암의 경우， 제 1단백질로 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의 조합을 사용하고， 이들 제 1 단백질의 공통된 제 2 단백질로서 PLC-gamma 1, Grb2, 및 p85_alpha를 사용하였으며， 유방암의 경우, 제 1 단백질로 HER2 및 HER3의 조합을 사용하고， 이들 제 1 단백질의 공통된 제 2단백질로서 PLC-gamma 1, Grb2, 및 p85-alpha를사용하는 것을 예시하고 있으나， 이에 제한되는 것은 아니며， 앞서 설명한 내용에 기초하여 치료하고자하는 질병 또는 효과를 알고자하는 치료제에 따라서 적절하게 선택될 수 있고， 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을가진자에게 명확한사항이다.

다른 구체예에서, 상기 제 1 단백질은 EGFR, MET, HER2, 및 HER3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고、 제 1 단백질에 대한 제 2 단백질은 각각의 제 1 단백질에 결합하는 리간드들 중에서 선택된 것일 수 있다 (예컨대， EGFR의 경우 epidermal growth factor (EGF) , MET의 경우 hepatocyte growth factor (HGF) , HER2 및 HER3의 경우 Neuregul ins (NRGs)) .

일 예에서， 제 1 단백질은 PD-L1 및 卵 -1 중에서 선택된 어느 하나이고， 제 2 단백질은 나머지 하나인 것을 특징으로 한다. 일 구체예에서, 제 1 단백질은卵 -1이고, 제 2 단백질은 PD-L1일 수 있다. 다른 구체예에서， 제 1단백질은 PD-L1이고， 제 2단백질은 PD-1일수있다.

PD-L1 (Programmed death-l igand 1)은주로 암세포표면에 존재하는 단백질로, CD274 (cluster of di f ferent i at ion 274) 또는 B7_H1(B7 homolog 1)라고도 칭해지며， 40kDa의 타입 1 막통과 단백질 (type 1 transmembrane protein)이다. PD-L1은 암세포 이외에도 면역세포 (Macrophage 등)의 subtype에도 존재한다. PD-L1은 조직 이식， 면역 질환， 간염 등과 같은 다양한 질병에서 면역계를 억제하는데 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 PD-L1은 인간 등의 포유 동물 유래의 것일 수 있으며 , 예컨대， 인간 PD-L1 (e.g. , GenBank Access ion No. NP_001254635.1 (유전자: NM_014143.3) , NP_001300958.1 (유전자: NM_001314029.1)，

NP_054862.1 (유전자: NM_001267706.1)등)일수있다.

PD-1 (Programmed cel l death protein 1)은 CD279 (cluster of di f ferent iat ion 279)라고도 칭해지며, 활성화된 T세포 (면역세포)의 표면에 주로존재하는단백질로， 면역 체크포인트중하나이며, 림프절에서의 항원 특이적 T 세포 (ant i gen-speci f ic T_cel l)의 아팝토시스 (apoptos i s )를 촉진하고， 조절 T 세포 (regulatory T cel Is)의 아팝토시스는 감소시키는 역할을 한다. 또한, 암세포 표면에서 발현되어 mTOR 등의 신호전달 (signal ing pathway)을 통하여 암 증식 (tumor prol i ferat ion)을 촉진하기도한다. 본 명세서에 기재된 PD-1은 인간등의 포유동물유래의 것일 수 있으며， 예컨대， 인간 PD-1 (e.g. , GenBank Accession No.

NP_005009.2 (유전자: NM_005018.2)등)일수있다.

PD-L1이 T 세포 표면에 있는 PD-1 단백질과 결합하면, T 세포는 암세포에 대한공격능력을상실한다.

PD-L1 및/또는 卵 -1는 항암제 개발에 있어서 중요한 표적이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질은 세포， 조직， 또는 이들의 용해물 또는 추출물에 포함된 형태로 사용되거나, 정제된단백질형태로사용될수있다.

다른 예에서, 제 1 단백질은 HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein； ErbB2) 및 HER3 (Human Epidermal growth factor

Receptor 3 protein； ErbB3)이며， 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 이루는것 (HER2-HER3헤테로다이머)일수있다,

HER2 및 HER3는각각 HER패밀리의 수용체 티로신 키나아제 (RTKs)의 일원이다. HER2 또는 HER3의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로-이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 타이로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. HER2 및/또는 HER3의 자가인산화는 세포 증식, 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. HER2 의 과발현， 유전자 증폭은 유방암과 위암에서 빈번히 관찰되며， 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과 등과 관련 있다. 한편 HER3는 여러 표적 약물 치료의 저항 기제로 잘알려져 있다. 이러한 이유로， 이들 HER2 및/또는 HER3는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. HER2 및 HER3는 인간 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, HER2는 GenBank Accession No. NP_001005862.1, NP_001276865.1, NP_001276867.1, NP_004439.2 등에 제공되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. HER3는 GenBank Accession No. NP_001005915.1, NP_001973.2 등에 제공되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 제 2단백질은다양한생체신호전달경로에 있어서 HER2및/또는 HER3 (예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머)의 하위 단백질로서， HER2 및/또는 HER3 (예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머)와 상호작용 (결합) 가능한 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 제 2 단백질은 HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)의 인산화기 (예컨대, 인산화된타이로신)에 결합하는것일수있다.

본명세서에서 제공되는방법에서 수행되는제 1단백질과제 2단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계， 제 1단백질 또는 제 1단백질 효소의 활성화 정도를 측정하는 단계는 분리된 세포 또는 조직에 대하여 생체외 또는세포외 (in _F/i ro)에서 수행되는것일수있다.

상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는단계는다음의 단계를포함할수있다:

(1)제 1단백질을포함하는시험 시료를, 표면에 상기 제 1단백질에 특이적으로 결합하는물질을포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 (표지 물질이 결합된)제 2단백질을첨가하여 반응시키는단계 ; 및

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 즉정하는 단계

₍ 단백질-단백질상호작용측정 _{) .}

상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는, 단계 (1) 내지 (3)에 더하여， (4) 단계 (3)에서 측정된 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

신호를 이용하여 제 1 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할수있다.

상기 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 제 1 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계 (4)는 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한시험 시료내의 제 1단백질 단위량에 대한신호값을구하는 단계일수있다.

일 예에서, 상기 단계 (4)는,

단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계를 통하여 수행하거나,

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한신호값을구하는단계 (단백질-단백질 상호작용 수준측정) ; 및

(4-2) 상기 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는단계 (활성화수준측정)

를포함할수있다.

상기 측정된 제 1단백질과제 2단백질 간단백질-단백질 상호작용을 이용하여 소망하는 사항을 측정 (확인， 결정 또는 분석)하기 위하여， 상기 단계 ⑷ 이후에，

(5) 단계 (4)에서 얻어진 결과를 기준 시료에서 얻어진 결과와 비교하는단계를추가로포함할수있다.

일 예에서， 상기 제 1 단백질은 ?^ ^~ 11 및 卵 -1 중에서 선택된 어느 하나이고， 제 2단백질은 및 ?^ ^~ 1중에서 선택된 다른하나일 수 있다. 또 다른 예에서 , 상기 제 1 단백질은 四묘2 - 1¾ 헤테로다이머일 수 있다. 이 경우， 四1?2 -四묘3 헤테로다이머에서의 他1?2 및/또는 四요3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는단계는다음의 단계를포함할수있다:

(1-1) 四요2 -他요3 헤테로다이머 또는 四1?2 -四묘3 헤테로다이머를 포함하는시료를， 표면에 四묘2및/또는他요3에 특이적으로결합하는물질을 포함하는기판에 가하여 헤테로다이머가고정된 기판을준비하는 단계;

(2-1) 상기 抑요2 -抑: 1?3 헤테로다이머를 인산화시키고, 표지된 (표지 물질이 결합된) 인산화된 Tyr특이적 결합물질 (예컨대， 항체)를 첨가하여 반응시키는단계 ; 및

(3-1) 단계 (2-1)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 즉정하는 단계 (타이로신카이네이즈활성화측정) .

상기 단계 (2-1)에서， 인산화시키는 단계는 상기 기판 또는 상기 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 인산화제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인산화제는 HER2 및/또는 HER3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 예컨대， ATP와 마그네슘 (예컨대， MgCl ₂ 등)일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 인산화전, 후， 또는동시， 및 단계 (3-1)의 활성화측정 전에， 상기 기판 또는 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 DGTN, GDN 등을 포함하는 콜레스테롤 유사 세정제들 중에서 선택된 1종 이상의 세정제 (detergent)를 CMC(cri t ical mi cel l ar concentrat ion) 이상 또는 이를 초과하는 농도로 처리하여 HER2-HER3 헤테로다이머의 구조적 및/또는 기능적 활성을유지시키는것을특징으로할수있다.

제 1단백질이 HER2-HER3헤테로다이머인경우， 앞서 설명한단계 (1) 내지 (3)또는 (1-1)내지 (3-1)에 더하여， 다음의 단계 (4) , 및/또는단계 (5)를추가로포함할수있다.

이하， 상기 단계를보다상세히 설명한다:

단계 (1)또는 (1-1)： 제 1단백질이 고정화된기판준비 단계

상기 단계 (1)은 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된기판을준비하는단계이다.

상기 제 1단백질은앞서 설명한바와같다.

상기 시험 시료는세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로의 활성화 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 등을시험하는데사용가능한모든생물시료일수 있다.

예컨대， 상기 시험 시료는개체로부터 분리된세포， 조직, 세포또는 조직의 용해물， 파쇄물， 또는 추출물， 체액 (예컨대, 혈액 (전혈, 혈장, 또는 혈청)， 타액 등)일 수 있다. 상기 개체는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화 시험， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 시험, 제 1 단백질 표적 치료에 적절한 대상인지 여부의 결정 _, 제 ₁ 단백질 표적 치료 효과의 모니터링， 및/또는 효과적인 제 1 단백질 표적 치료제의 선정 등을 수행하고자하는모든포유류（예컨대, 인간， 원숭이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 등）로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일 예에서， 상기 개체는 제 1단백질과관련된 질병을 갖는환자일 수 있다. 상기 제 1 단백질과관련된 질병은 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, 예컨대， 암일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 시험 시료는 개별 암환자 （예컨대， 제 1 단백질이 관여하는세포또는조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화 정도 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 시험하거나， 제 1 단백질 표적 치료에 적절한 대상인지 여부를 결정하거나， 또는 효과적인 제 1 단백질 표적 치료제의 선정하고자 하는 특정 개체）로부터 분리된 세포， 예컨대， 암 세포를 포함하는 것일 수 있다. 조직의 경우 분쇄를 위하여 최소 125 mm ³ 이상의 크기이면족하고, 1회 측정에 필요한조직 시료의 양은 위에서 언급한 조직의 양（최소 125 mm ³ 이상）의 약 1/50 내지 약 1/75 범위로 할수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 （암세포）의 경우， 1회 측정에 필요한세포 시료의 양은 약 10 cel l s 내지 10 ¹⁰ cel ls, 약 10 cel l s내지 10 ⁷ cel ls, 약 10 cel l s내지 10 ⁵ cel l s, 약 10 ³ cel ls내지 10 ¹⁰ cel l s , 약 10 ³ cel l s내지 10 ⁷ cel ls, 약 10 ³ cel l s내지 10 ⁵ cel ls, 예컨대 약 10 ⁴ + 50 cel ls- 정도일 일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니며， 세포주의 종류에 따라서 적절하게 정해질수있는값이다.

일 예에서， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 및/또는 제 1 단백질 표적 치료에 적절한 대상의 선별 방법의 경우， 상기 시험 시료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료 （예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여）가수행되지 않은 세포 또는 조직, 또는 상기 치료 （또는 약물의 투여）가 수행되지 않은 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있으며， 제 1 단백질을 표적으로 치료에 대한 반응성을 모니터링하는 방법의 경우, 상기 시험 시료는 제 1단백질을 표적으로 하는 치료 （예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여）가 수행된 세포 또는 조직， 또는 상기 치료 （또는 약물의 투여）가 수행된 개체로부터 분리된세포또는조직일수있다.

상기 기판은 표면에 제 1 단백질을 고정시킬 수 있는 모든 재질 및/또는모든구조를 갖는 것일 수 있다 （결정질 또는 비결정질 모두사용 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

가능함）. 일 예에서, 상기 기판은， 표지 신호의 검출용이성을고려하여, 빛의 굴절률이 생체 물질의 많은 부분을 차지하는 물의 굴절률 （약 1.3） 이상인 재질일수있다. 일 예에서， 상기 기판은두께가약 0.1내지 약 1 _， 약 0.1내지 약 0.5■， 0.1내지 약 0.25 _1®, 또는 약 0.13내지 약 0.21 _■ 정도일 수 있으며, 굴절률이 약 1.3 내지 약 2, 약 1.3 내지 약

1.8， 약 1.3내지 약 1.6, 또는약 1.5내지 약 1.54정도인 것일수 있다. 상기 기판은 상기 굴절률 범위를 만족시키는 모든 재질일 수 있으며， 예컨대 유리 （굴절률: 약 1.52）, 석영 등으로 이루어진 군에서 선택된 재질로부터 얻어진 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기판은 생물 시료 관찰에 통상적으로 사용되는 모든 형태를 갖는 것일 수 있으며， 예컨대， 웰 타입， 슬라이드 타입， 채널 타입， 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 （캐필러리） 등일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 형광현미경 관찰시, 상기 시료가적용된 기판위에 커버글라스를 장착하여 관찰할 수 있으며， 커버글라스의 재질은 앞서 기판에서 설명한 바와 같고， 두께는 기판에서 설명한 범위 또는 이보다 얇을 수 있다 （예컨대， 굴절률 1.52, 두께 0.17·일 수 있으나이에 제한되는것은아님）. 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질로부터 선택된 것일 수 있으며， 예컨대， 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항 _: 원결합단편 （예컨대， 항체의 1 ， （ ） 산 -! ⁷ 。， Fab , ¹ 및 （ ’）2 등）， 압타머 （단백질 또는 핵산분자）， 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 때， 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질과 제 2 단백질과의 상호작용을 방해하지 않는 부위， 즉, 제 1 단백질과 제 2 단백질이 상호작용（결합）하는 부위가 아닌 부위에서 제 1단백질과결합하는것일수있다.

일 예에서， 상기 기판은 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 （예컨대, 항체 등）을 표면에 포함（고정）하기 위하여 적절히 표면개질되거나， 표면에 직접 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이 고정된 것일수 있다. 상기 기판이 표면개질된 경우， 상기 기판은 일면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 （예컨대， 항체 등）을고정화시킬수 있는작용기를갖는모든화합물로처리（예컨대 , 도포）될수 있으며， 예컨대, 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로이루어진 군에서 선택된 작용기를포함하는화합물로처리될수 있다. 일 구체예에서， 상기 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물은 바이오틴 (biotin)， 소혈청알부민 (Bovine serum albumin； BSA) , 바이오틴이 결합된 소혈청알부민， 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol； PEG) , 바이오틴이 결합된 PEG (폴리에틸렌글리콜-바이오틴; PEG-biot in) , 폴리소베이트 (e.g. , Tween20) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표면 처리된 기판은 뉴트라비딘 (neutravidin) , 스트렙타비딘 (streptavidin) , 아비딘 (avidin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상이 추가로처리 (예컨대, 도포)될수있다.

일 예에서， 상기 제 1 단백질은 PD-L1 또는 卵 -1일 수 있다. 구체적으로， 상기 제 1단백질은 PD-L1일수 있다. 제 1단백질로서 PD-L1를 사용하여, PD-L1와 특이적으로 결합하는 물질 (예컨대, 항체)를 이용하여 PD-L1를 기판에 고정화시켜 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 경우, PD- 1이 cluster ing된 스팟이 형성되어， 정성적 및/또는 정량적 분석에 유리한 효과를얻을수있다.

다른 예에서， 상기 제 1 단백질은 PD-1일 수 있다. 제 1 단백질로서 PD-1를 사용하여, 卵 -1와 특이적으로 결합하는 물질 (예컨대， 항체)를 이용하여 PD-1를 기판에 고정화시켜 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 경우상대적으로단일 스팟으로관찰되어， 단일 스팟검출이 필요한분석에 유리한효과를얻을수있다.

상기 시험 시료는세포또는조직 간의， PD-L1와卵 -1간의 상호작용 수준, 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 여부， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 등을 시험하는데 사용 가능한 모든 생물학적 시료일수있다.

또한， 상기 PD-L1과 PD-1 (예컨대 이종세포표면에 위치)간결합에 의하여 형성된복합체는클러스터를이루어， 생체 내 환경을보다유사하게 모사할수 있다. 생체 내 환경과보다유사한클러스터를형성하기 위하여， 기판에 고정화되는제 1단백질로서 PD-L1을선택하여 사용하는 것이 유리할 수있다.

일 예에서, 제 1 단백질로서 PD-L1을 사용하는 경우, 상기 제 1 단백질에 .특이적으로 결합하는 ^’ 물질은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. PD-L1와抑- 1 간의 상호결합에 영향이 없도록 하기 위하여， 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원결합단편은 PD-L1의 PD-1과의 결합 부위를 제외한 （결합 부위와 중복하지 않는） 비결합 부위， 예컨대， PD-L1의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. PD-L1이 PD-1과 결합하는부위는 대체적으로 PD- L1의 N-말단쪽 부위（세포외 도메인 부위）이며， 구체적으로, 20번째부터 150번째까지， 20번째부터 130번째까지, 20번째부터 125번째까지，

25번째부터 200번째까지， 25번째부터 150번째까지， 25번째부터 130번째까지, 또는 25번째부터 125번째까지의 아미노산 부위에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 부위일 수 있으며， 예컨대, PD-L1의 D26, Y56, E58, R113, A121, D122, Y123, R125 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 （GenBank Accession No. NP_001300958.1,

NP_054862.1 등의 인간 PD-L1 기준） 또는 이에 해당하는 잔기를 포함하는 부위일수 있다（도 32참조）. 상기 PD-L1의 PD-1과의 결합부위를제외한 비결합부위는, 앞서 설명한 PD-L1의 N 말단쪽의 PD-L1가 PD-1과 결합하는 부위의 와 중복되지 않는 PD-L1 부분일 수 있으며, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편은 상기 PD-L1의 PD-

1과의 결합 부위를 제외한 비결합 부위 （예컨대， PD-L1의 C-말단 부위） 중의 1개 이상, 예컨대， 1내지 30개， 1 내지 25개， 1내지 20개， 1 내지 15개, 또는 1내지 10개의 아미노산에 결합하는항체 또는항원결합단편일 수 있다. 일 예에서， 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편은 PD-L1 단백질의， N-말단에서 C-말단 방향으로， 250번째 이후， 260번째 이후， 270번째 이후, 또는 280번째 이후의 아미노산 부위， 예컨대， 250번째부터 300번째까자 또는 280번째부터 290번째까지의 아미노산 부위 중 선택된 하나 이상의 .아미노산에 특이적으로 결합하는 것일수있다.

다른 예에서, 제 1 단백질로서 PD-1을 사용하는 경우， 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 卵 -1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. PD-1와 PD-L1 간의 상호결합에 영향이 없도록 하기 위하여, 상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원결합단편은 抑 -L의 PD-L1과의 결합 부위를 제외한 （결합 부위와 중복하지 않는） 비결합 부위, 예컨대， 抑- 1의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 PD-1이 PD-L1과결합하는부위는 대체적으로 卵 -1의 N-말단쪽 부위（세포외 도메인 부위）이며, 구체적으로 60번째부터 200번째까지， 60번째부터 150번째까지, 60번째부터 135번째까지， 65번째부터 200번째까지, 65번째부터 150번째까지, 또는 65번째부터 135번째까지의 아미노산 부위에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 부위일 수 있으며, 예컨대， 卵 -1의 Y68, Q75, K78, T76, 1126, 1134 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 부위일 수 있다. 상기 PD-L의 PD-L1과의 결합 부위를 제외한 비결합 부위, 예컨대, PD-1의 C-말단 부위는， 앞서 설명한 卵 -1의 N 말단쪽의 PD-1가 PD-L1과 결합하는 부위와 중복되지 않는 PD-1 부분일 수 있으며， 상기 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편은 상기 PD-1의 PD-L1과의 결합 부위를 제외한 비결합 부위 （예컨대， PD-1의 C-말단부위） 중의 1개 이상， 예컨대， 1 내지 30개, 1 내지 25개， 1내지 20개, 1 내지 15개， 또는 1 내지 10개의 아미노산에 결합하는 항체 또는 항원결합단편일수있다.

다른 예에서, 상기 제 1 단백질이 HER2 및 HER3가 이합체화된 HER2- HER3 헤테로다이머일 수 있다. 이 경우， 상기 제 1 단백질을 포함하는 시료는 HER2 및/또는 HER3, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하거나，

HER2 및 HER3를 동시에 발현하는 세포， 세포 용해물， 또는 세포 파쇄물을 포함하는 것으로， 시험 대상 환자로부터 분리된 세포, HER2와 HER3를 동시에 발현하도록 조작된 재조합 세포 （예컨대， HER2를 （과）발현하는 세포에 HER3유전자를포함하는재조합벡터가도입된 재조합세포， HER3를 （과）발현하는세포에 HER2유전자를포함하는재조합벡터가도입된 재조합 세포등）， 또는상기 세포의 용해물또는파쇄물일수있다.

제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우， HER2와 HER3의 헤테로다이머 형성을 위하여, HER2와 HER3를 동시에 포함하거나 발현하는 세포에 이합체화 제제를 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 이합체화 제제는 HER3의 리간드 （예컨대, Neuregulin pi （NRGbl）；

NP_039250, NP_039250.2, 등）， 콜레스테롤-유사 세정제 （Cholesterol-like detergent； 예컨대， DGTN（digitonin； CAS Number : 11024-24-1） , GDN

（glycol-diosgenin； CAS Number: 1402423-29-3） 등） 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수 있다. 일구체예에서 , HER2와 HER3를동시에 발현하는 세포에 NRGbl을 처리（주입）하여 HER2-HER3 헤테로다이머를 형성하는 경우， 상기 NRGbl는 HER2와 HER3를 발현 후 용해（lysis） 전에 세포에 주입될 수 있다. 다른 구체예에서， HER2와 HER3를 동시에 발현（포함）하는 세포에 콜레스테롤-유사 세정제를 처리하여 HER2-HER3 해테로다이머를 형성하는 경우, 상기 콜레스테롤-유사 세정제는 세쏘 용해 후 및 HER2 및/또는 HER3의 활성화 측정 전에 처리 (첨가)될 수 있다 (일 예에서, 상기 세포는 NRGbl가 10ng/mL 내지 lOOOng/mL, 50ng/ mL 내지 200ng/mL, 또는 10ng/mL 내지 100ng/mL 의 양으로 주입된 것일 수 있음) . 이 때， 사용되는 콜레스테롤-유사 세정제의 농도는 사용되는 세정제의 CMCCcr i t i cal mi cel lar concent rat ion)을 초과하는 농도일 수 있으며, 예컨대， 세포 용해물 (cel l lysi s) 전체를 기준으로， DGTN의 경우 0.05%(w/v) 이상, 0.05%(w/v) 초과, 또는 0.06%(w/v) 이상, 예컨대, 0.05 내지 2%(w/v) 또는 0.06내지 2¾ _>( w八)일 수 있고， GDN의 경우 0.003%(w八 0 이상， 0.005%(w ) 이상, 0.007%(w八 0 이상， 또는 0.01%(w/v) 이상, 예컨대, 0.003내지 2%(w/v) , 0.005내지 2%(w/v) , 0.007내지 2%(w/v) , 또는 0.01 내지 2¾ _>( w八 0일 수 있다. 사용되는 세정제의 농도가 CMC 이하인 경우 mi cel le 구조의 유지, 단백질의 세포막 투과 영역의 보호, 및 tyrosine kinase act ivi ty유지가어렵고， HER2-HER3헤테로다이머의 활성도 (예컨대, 인산화정도)가낮아지고복구되지 않음이 확인되어, 세정제는상기 농도로 사용할 것을 제안한다. Digi tonin은 용해시 상당히 불안정해지며, 수 시간 이내에 침전물이 생긴다. 따라서 용해시 10%(w/v) 내외 (5 내지 15%(w/v) 또는 8내지 12%(w八 0)의 glycerol을 첨가하면좀더 안정적으로유지된다. GDN은 용해해도 수 일 동안 안정하다. 모든 용액은 HEPES 버퍼를 이용해 pH를 7 내지 8. 7,2 내지 7.6, 또는 7.4로 유지할 수 있다. 또 NaCl

150mM을 첨가해 적절한 이온농도를유지해주어야 한다. 세포 용해시 세포 내 protease에 의한 단백질 분해를 막기 위해 protease inhibi tor cocktai l을첨가할수있다 (예컨대 , Sigmaaldr i ch P8340 , 약 2%(w/v)) .

제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우， 상기 저 U 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질， 즉， HER2, HER3, 또는 이들 모두와특이적으로결합할수 있는모든물질로부터 선택된 것일 수 있으며, 예컨대， HER2, HER3, 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편 (예컨대， 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab' )2 등)， 압타머 (단백질 또는 핵산분자) , 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 、 이 때， 상기 제 1 단백질 (則: R2， HER3, 또는 이들 모두)에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질과 제 2 단백질과의 상호작용을 방해하지 않는 부위， 즉， 제 1 단백질과 제 2 단백질이 상호작용 (결합)하는 부위가 아닌 부위에서 제 1 단백질과결합하는것일수있다.

단계 (2)： 제 1단백질과제 2단백질을반응시키는단계

상기 단계 (2)는, 상기 준비된 제 1단백질이 고정된 기판에， 표지된 제 2단백질을첨가하여 반응시키는단계이다.

상기 제 2단백질은앞서 설명한바와같다.

상기 표지된 제 2 단백질은 제 2 단백질이 검출 가능한 신호를 발생시키는표지 물질로표지되거나 (표지 물질이, 예컨대， 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적) , 재조합적， 또는 물리적으로， 결합되거나)， 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태를 의미할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 통상적인 효소 반응， 형광， 발광， 및/또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있는 모든 신호 (예컨대, 빛， 방사선 등)들 중에서 선택될수 있다. 상기 표지 물질은상기 표지 신호를발생시킬 수 있는 모든 소분자 화합물, 단백질， 펩타이드， 핵산분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광 염료 (소분자화합물; Cyanine, Alex, Dyl ight , Fluoprobes 등)， 형광 단백질 (예컨대， 녹색형광단백질 (GFP, enhanced GFP) , 황색형광단백질 (YFP) , 청록색형광단백질 (CFP) , 청색형광단백질 (BPF) , 적색형광단백질 (RPF) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 tag은 Hi s-tag / Ni-NTA등과같이 통상적으로사용되는모든종류에서 선택된 1종이상일 수 있다. 상기 표지 물질의 사용 농도는, 노이즈를 발생시키지 않고 정확하고용이한검출이 가능하도록 하기 위하여, 약 luM이하의 범위에서 적절하게 정할수 있으며, 예컨대， InM내지 1000nM, InM내지 500nM, InM 내지 100nM, 10nM 내지 lOOOnM, lOnM 내지 500nM, 또는 lOnM 내지 lOOnM 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 표지물질로부터 발생하는 신호는 이를 검출 또는 측정하는데 통상적으로 사용되는모든신호검출수단 (예컨대， 통상의 형광현미경, 형광카메라， 형광세기 측정 (정량)장치 등)에 의하여 측정될수있다.

제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 상호작용을 보다 정확하게 측정하기 위하여, 반응시키는 단계 (단계 (2))와 후속하는 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 (단계 (3)) 사이에， 상기 반응이 일어난 기판을 통상적인 방법으로세척하는단계를추가로포함할수있다 .

일 예에서， 상기 제 2단백질은 PD-L1또는 PD-1일 일 수 있다. 일 구체예에서， 제 1 단백질이 PD-L1인 경우， 제 2 단백질은 PD-1일 수 있다. 다른 구체예에서, 제 1 단백질이 PD-1인 경우， 제 2 단백질은 PD-L1일 수 있다.

다른예에서， 제 1단백질이 HER2-HER3헤테로다이머인경우， (2)제 1 단백질과제 2단백질을반응시키는단계는 (2-1) HER2-HER3헤테로다이머을 인산화시키고， 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질과 반응시키는 단계에 적용될수있다.

제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우, 상기 단계 (2) 또는 (2-1)는， 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에， 표지된 제 2 단백질을 첨가하거나 또는 제 1 단백질을 인산화시키고, 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합물질을 첨가하여 반응시키는단계이다. 상기 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질은 HER2 또는 HER3의 인산화된 타이로신에 특이적으로결합하는항체일수있다.

제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우， 상기 제 2 단백질은, 앞서 설명한바와 같이, 다양한 생체 신호전달경로에 있어서 HER2 및/또는 HER3 (예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머)의 하위 단백질로서， HER2 및/또는 HER3 (예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머)와 상호작용 (결합) 가능한 단백질 중에서 선택된 1종이상일수있다.

제 1단백질이 HER2-HER3헤테로다이머인경우， 상기 단계 (2-1)에서， 인산화시키는 단계는 상기 기판 또는 상기 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 인산화제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인산화제는 HER2 및/또는 HER3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 예컨대， ATP와 마그네슘 (예컨대， MgCl ₂ 등)일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 인산화 전, 후， 또는 동시， 및 단계 (3-1)의 활성화 측정 전에， 상기 기판또는 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에， 앞서 단계 (1) 또는 (1-1)에서 설명한 바와 같은， DGTN, GDN 등을 포함하는 콜레스테롤-유사 세정제들 중에서 선택된 1종 이상의 세정제 (detergent )를 CMC cr i t i cal mi cel lar concent rat ion)를 초과하는 농도로 처리하여 HER2-HER3 헤테로다이머의 구조적 및/또는 기능적 활성을유지시키는것을특징으로할수있다.

단계 (3)또는 (3-1)： 단백질-단백질상호작용측정 단계

상기 단계 (3)은 상기 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계이다. 상기 신호 측정은 단계 (2)에서 사용된 표지 신호 (예컨대， 효소 반응， 형광， 발광, 또는 방사선 검출 등의 통상적인 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

방법을통하여 측정 가능한신호)를검출 (또는측정 또는확인)할수 있는 모든수단을사용하여 수행될수있다.

일 예에서, 단계 (3)에서의 단백질-단백질 상호작용 측정은 실시간 분석에 의한것일수있다.

일 예에서， 상기 표지 신호가 형광신호인 경우， 상기 신호 검출은 상기 형광 신호를 발생시키는 표지 물질이 흡수하는 광원을 공급하여 발생하는 형광 신호를, 예컨대, 형광 현미경， 형광 카메라， 및/또는 형광 세기 측정 (정량) 장치 등을 사용하여， 영상화하거나 및/또는 정량할 수 있다.

일 구체예에서， 상기 신호는 형광 신호인 경우, 상기 형광 신호는 형광카메라를이용하여 영상화및/또는정량할수있다.

상기 신호가 형광신호인 경우， 단계 (3) (단백질-단백질 상호작용 측정 단계)은

(0상기 단계 (2)의 반응물에 광원을공급하는단계 ; 및

(11 )상기 공급된광원에 의하여 발생한형광신호를검출하는단계 를포함할수있다.

상기 단계 0 )의 광원을공급하는단계는상기 단계 (2)에서 얻어진 제 1단백질과제 2단백질의 반응물에 광원흩공급하는단계로서， 이와같은 목적을 달성할 수 있다면, 광원의 공급 시기는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 광원은 단계 (1) 이전, 동시, 또는 이후부터 단계 (2) 이후까지 지속적으로 공급되거나, 단계 (2) 직전， 동시， 또는 직후에 소정의 시간동안공급될수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 광원은 형광 신호에 해당하는 파장을 갖는 모든 광원일 수 있으며， 예컨대， 레이저， 할로겐 램프등일수있다.

상기 광원의 파장은사용된 형광신호에 따라서 조절될 수 있으며， 예컨대, 약 300^ 내지 약 600 ₁ ^또는 약 350™ 내지 약 560™ 범위에서 선택될수 있다. 보다구체적으로， 녹색형광단백질은 약 480 ₁₁₁₁₁ 를흡수하고， 황색형광단백질은 약 540™를 흡수하고， 청색형광단백질은 약 375^ ₁ 를 흡수하고， 청록색형광단백질은 약 425 을 흡수하므로， 형광 신호로 녹색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 460 내지 약 500™, 형광 신호로 황색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 520 내지 약 560^, 형광신호로청색 형광을사용하는경우상기 광원의 파장은 약 350 내지 약 400에 _{1 ,} 형광 신호로 청록색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은약 400내지 약 450nm범위에서 선택될수있다.

일 구체예에서， 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계는 전반사 형광 현미경 (Total Internal Ref lect ion Fluorescence (TIRF) mi croscope)또는공초점 현미경 등을사용하여 광원을공급하고， 통상적인 ₅ 방법으로 형광 신호를 관찰하여 수행될 수 있다. 다른 예에서， 상기 전반사 형광 현미경에 신호 영상화를 위한 형광 카메라， 예컨대 EMC抑

(Electron-mul t iplying charge-coupled devi ce) 카메라 또는 CMOS (Complementary metal oxide semi conductor) 카메라를 장착하여 사용함으로써， 광원공급및 형광신호의 영상화및/또는정량을수행할수 ₀ 있다.

다음에서는단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용측정 단계를 전반사 현미경 및 형광카메라를사용하여 수행하는경우를 예를들어 보다상세히 설명한다:

가) 상기 단계 (1) 또는 단계 (2)의 기판을 전반사 현미경에 ₅ 장착시킨다. 전반사 현미경에서 광원의 공급 위치는 통상적으로 아래쪽이며， 전반사 현미경 종류에 따라서， 형광 신호를 기판의 위 (이 경우, 아래에서 위 방향으로， 광원 공급부, 기판， 렌즈， 또는 기판, 광원 공급부， 렌즈의 순서로위치할수 있음) 또는아래에서 (이 경우， 아래에서 위 방향으로， 렌즈， 광원 공급부， 기판， 또는 광원 공급부， 렌즈, 기판， ₀ 또는렌즈, 기판， 광원공급부의 순서로위치할수있음)관찰할수있다.

나)광원은레이저일수있으며, 광원의 세기는약 0.5 mW내지 약 5 mW, 약 0.5 mW내지 약 4.5 mW, 약 0.5 mW내지 약 4 mW, 약 0.5 mW내지 약 3.5 mW, 약 0.5 mW내지 약 3 mW, 약 0.5 mW내지 약 2.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2 mff, 약 1 mff 내지 약 5 mW, 약 1 mW내지 약 4.5 mW, 약 1 mW ₅ 내지 약 4 mW, 약 1 mW내지 약 3.5 mW, 약 1 mff 내지 약 3 mW, 약 1 mW 내지 약 2.5 mW, 약 1 mW내지 약 2 mW, 약 1.5 mW내지 약 5 mW, 약 1.5 mW내지 약 4.5 mW, 약 1.5 mW내지 약 4 mff, 약 1.5 mff 내지 약 3.5 mW,

감쇄필터를 사용하는 경우 세기가 센 광원을 사용할 수 있음)에 따라서 적절하게선택할수있다.

다) 상기 광원 공급에 의하여 발생한 형광 신호를 형광 카메라로 촬영하여 영상화및/또는정량할수있다.

상기 형광신호의 촬영 （또는영상화）은， 표지 물질의 형광신호발생 유지 시간 （발광시간， l i fet ime）을고려하여， 광원 공급과동시 또는상기 신호발생유지 시간이내에 수행할수있다.

형광 카메라 （예컨대， EMCCD 카메라）로 형광 신호를 촬영（또는 영상화）함에 있어서， 1 프레임당 노출시간， 레이저 파워， 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등을 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 1 프레임 당 노줄시간이 짧을수록 1 프레임에 누적되는 신호가 줄어들게 되며， 이를 상쇄하기 위하여 레이저 파워를 높이거나, 형광 카메라의 감도를 높일 수 있다. 일 예에서, 1 프레임 당 노출시간을 약 0.0（）1초 내지 약 5초, 약 0.001초 내지 약 3초， 약 0.0이초 내지 약 2초, 약 0.0（）1초 내지 약 1초, 약 0.001초내지 약 0.5초， 약 0.001초내지 약 0.3초， 약 0.001초내지 약 0.1초， 약 0.01초내지 약 5초, 약 0.（）1초내지 약 3초, 약 0.01초내지 약 2초， 약 0. 초내지 약 1초， 약 0.01초내지 약 0.5초, 약 0.01초내지 약 0.3초， 약 0.（）1초내지 약 0.1초， 약 0.05초내지 약 5초, 약 0.05초내지 약 3초， 약 0.05초 내지 약 2초, 약 0.05초 내지 약 1초， 약 0.05초 내지 약 0.5초， 약 0.05초내지 약 0.3초， 약 0.05초내지 약 0.1초， 약 0.07초 내지 약 5초, 약 0. 07초 내지 약 3초， 약 0. 07초 내지 약 2초， 약 0. 07초내지 약 1초， 약 0. 07초내지 약 0.5초， 약 0. 07초내지 약 0.3초， 약 0.07초 내지 약 0.1초, 약 0.1초 내지 약 5초, 약 0.1초 내지 약 3초, 약 0.1초 내지 약 2초， 약 0.1초 내지 약 1초, 약 0.1초 내지 약 0.5초， 또는 약 0.1초 내지 약 0.3초， 예컨대 약 0.1초로 할 수 있으나 이에 제한되는것은아니다.

예컨대， EMCCD 카메라를 사용하는 경우， 표지 물질 （예컨대, eGFP）로부터 생성된 광자（photon）는 EMCXD의 소자를 통해 전자로 바뀌어 계즉된다 （광전효과， photoelectr i c ef fect） . 이 때， 광자 1개 당 생성되는전자의 개수를 gain값을통해 변경할수 있다. 설정된 gain값이 높을수록 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수가 늘어나서， EMCCD의 감도가 높아지는 동시에 background noi se도 함께 증가하므로 signal-to-noi se 비율이 중요하다. 일 구체예에서, 우수한 signal-to-noi se 비율을 얻기 위하여， gain값을약 10내지 약 100， 약 10내지 약 80， 약 10내지 약 60, 약 10내지 약 50, 약 20내지 약 100, 약 20내지 약 80, 약 20내지 약 60, 약 20내지 약 50, 약 30내지 약 100, 약 30내지 약 80, 약 30내지 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

약 60， 또는 약 30 내지 약 50, 예컨대, 약 40 정도로 정할 수 있지만, 이에 한정되지 않고 카메라의 감도, 수명， 장비 구축 현황, 노이즈, 시험 조건등을고려하여 적절하게선택될수있다.

총촬영 프레임 개수와노출시간을곱하면총촬영 시간이 얻어진다 (노출시간 _* 총 촬영 프레임 개수 =촬영 시간) . 형광물질의 발광시간 (1 ₆₎ 이후에는 형광신호가사라지므로, 상기 촬영 시간이 발광시간 내에 진행되도록총촬영 프레임 개수및/또는노출시간을조절할수 있다. 단백질-단백질 상호작용측정 결과의 정확도를높이기 위하여, 상기 영상화를 하나 이상， 예컨대， 2개 이상， 3개 이상， 4개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 또는 10개 이상 (상한값은기판의 크기 및 영상화가능한면적에 따라서 결정됨)의 기판 또는 이를 포함하는 하나 이상의 채널 (각 채널은 2개 이상의 기판을 포함함)에서 수행하고， 신호가 나타난 ₃₁ 야

:에世 라고도함)의깨수를구하여， 상기 얻어진 형광신호를정량화할수 있으며， 이는단백질-단백질상호작용을정량화한것으� �볼수있다 _.

다른 예에서, 단계 (3)에서 측정된 형광 세기를 통상적인 장치를 이용하여 수치화함으로써 단백질-단백질상호작용을정량할수도있다.

제 1단백질 및/또는제 2단백질을 2종이상사용하는경우， 단계 (1) 내지 (3)은각각의 제 1단백질과제 2단백질조합에 대하여 각각수행될수 있다 (즉， 단계 (1) 내지 (3)은 제 1 단백질과 제 2 단백질 조합의 수만큼 반복수행될수있다) .

제 1 단백질이 四묘2 - 요3 헤테로다이머인 경우， 상기 (3) 단백질- 단백질 상호작용 측정 단계는 (3-1) 타이로신 잔기의 인산화 측정 단계에 적용될수있다.

상기 단계 (3) 또는 (3-1)은상기 단계 (2) 또는 (2-1)에서 얻어진 반응물로부터 신호를측정하는단계이다. 상기 신호측정은단계 (2)또는 (2-1)에서 사용된 표지 신호 (예컨대， 효소 반응， 형광, 발광, 또는 방사선 검출 등의 통상적인 방법을통하여 측정 가능한 신호)를 검출 (또는 측정 또는확인)할수있는모든수단을사용하여 수행될수있다.

제 1 단백질이 1世1?2 -四묘3 헤테로다이머인 경우, 단계 (3-1)의 타이로신 잔기의 인산화 측정 단계는 四1?2 - 묘3 헤테로다이머와 표지된 他1?2 또는 四1?3의 인산화된 타이로신 잔기에 특이적으로 결합하는 물질 (예컨대, 항체) 간의 반응에서 발생하는 신호를 검출 및/또는 정량하는 단계를포함할수 있다. 일 예에서, 표지 물질로 형광물질 (예컨대 형광 단백질)을 사용하는 경우, 상기 타이로신 잔기의 인산화는 앞서 설명한 바와 같이, 반응물에서 검출되는 형광 세기를 측정 및 정량화하여 측정될 수있다.

단계 (4)： 제 1단백질의 활성화수준측정 단계

단계 (4)의 제 1 단백질의 활성화 수준 측정 단계는 단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 (1)에서 첨가한시험 시료내의 제 1단백질의 단위량에 대한신호값 (act ivat ion score)을구하는단계일수있다.

본 명세서에서, "제 1 단백질의 활성화”는 제 1 단백질의 제 2 단백질과의 상호작용 (결합)을 의미하고, "제 1 단백질의 활성화 수준'은 제 1 단백질의 제 2 단백질과의 상호작용 (결합)의 정도를 의미하고， "활성화된 제 1 단백질은 제 2 단백질과 상호작용 (결합)한 제 1 단백질을 의미할수있다.

제 1 단백질의 단위량에 대한 신호값이라 함은 제 1 단백질의 단위 중량또는농도 (예컨대， lug/ml )또는신호값에 대한단계 (3)에서 측정된 신호값 (신호또는신호세기의 정량화된값)을의미하는것으로,

(a) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 시험 시료 내의 제 1 단백질의 중량， 농도， 또는형광신호값으로나누어 주거나,

(b) 시험 시료 내의 제 1 단백질 중량， 농도, 또는 형광 신호값의 증가에 따른단계 (3)에서 측정된신호값의 증가분 (즉시험 시료내의 제 1 단백질 중량, 농도, 또는 형광 신호값을 x축으로 하고, 단계 (3)에서 측정된 신호값을 y값으로 하여 얻어진 그래프의 기울기)을 구하여 얻어질 수있다.

본 명세서에서는 시료 내 제 1 단백질의 양보다， 활성화된 제 1 단백질의 비율이 상기 시료가유래하는 개체에서의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물 반응성에 보다 유의미한 상관관계를 나타냄을 제안한다. 즉， 시료 내 제 1 단백질의 수준이 낮아도 (즉, 양이 적어도) 활성화된 저 U 단백질의 비율 (활성화 수준: act ivat ion score)이 높은 경우에는 제 1 단백질 양이 많지만 활성화된 제 1 단백질의 비율이 낮은 경우와 비교하여 약물 반응성이 현저히 우수하다 (도 19 및 20 참조) . 따라서， 본 발명은 단백질-단백질 상호작용을측정하여 이를제 1단백질 단위량에 대한값으로 계산 (제 1 단백질 양으로 나누어줌)하여 약물 반응성 판단에 보다 정확한 정보를제공한다는점을특징으로한다.

단계 (4)의 제 1단백질의 활성화수준측정 단계는 (i ) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질의 중량 _, 농도 _, 또는 형광 신호값으로 나누어 직접적으로 구하거나，

(i i ) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 중량， 농도， 또는 형광 신호값으로 나누어 시험 시료의 단위량에 대한신호값을구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용수준측정 단계) u- 1)， 및 상기 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한신호값을 단계 (1)에서 첨가한시험 시료 내의 제 1단백질의 중량, 또는농도， 또는 형광 신호값으로 나누어 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 신호값을구하는단계 (활성화수준즉정) (4_2)를통하여 수행될수있다.

단백질-단백질상호작용수준측정 단계 (4-1)

단계 (4-1)의 단백질-단백질 상호작용 수준 측정 단계는 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한신호값을구하는단계이다.

상기 단백질-단백질 상호작용 수준은 단백질-단백질 상호작용 세기

(PPI strength)로도 표현할 수 있으며， 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구함으로써 시험 시료의 사용량 등의 시험 시료 조건에 의한 오차를 줄일 수있다.

단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한신호값을구하는단계는단계 (3)에서 측정된신호를 시험 시료의 양 (농도 또는 중량)으로 나누거나, 단계 (3)에서 측정된 신호를 y축으로 하고 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료의 양 (농도 또는 중량)을 x축으로 하여 얻어진 그래프의 기울기를 구함으로써 수행될 수 있다.

제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우， 상기 단백질-단백질 상호작용 수준 측정 단계는 각각의 단백질 조합에 대하여 수행될수있다.

제 2단백질 (downstream protein)이 2종 이상인 경우, 다음의 수식에 표현한 바와 같이， 각각의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 PPI strength의 합을구하여, 단백질-단백질상호작용수준 (PPI score)으로결정할수 있다:

c _{DD T} 제 1단백질

Sum of PPI시험시료 = 2V_ _, ^DDT _f ᄀ제 1단백질

( ^PPI strength) _k

k=제 2단백질 제 1단백질이 2종 이상인 경우， 각각의 제 1단백질에 대하여 얻어진 PPI score를 합한 값을 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score)으로 결정할수있다.

다른 예에서， 상기 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI strength또는 PPI score)을 하기에 설명되는 기준 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 1이 되도록 normal izat ion하여， 시험 시료의 PPI strength를기준시료의 PPI strength에 대한상대값으로나타낼수있다.

활성화수준측정 단계 (단계 4또는 4-2)

단계 (4) (앞서 설명한 단계 (4-1)의 단백질-단백질 상호작용 수준 라 score) 측정 단계 없이 직접 활성화수준을측정하는 경우) 또는 단계 (4-2)는 상기 단계 (3)에서 얻어진 신호값 또는 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1단백질의 단위량에 대한값을구하는 단계이다. 본 명세서에서， 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 결과를 활성화 수준 (또는 act ivat ion score)이라고칭한다.

상기 활성화 수준은 단계 (3)에서 얻어진 신호값 또는 단계 (4 - 1)에서 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준을 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 양으로 나누어줌으로써 시험 시료에 존재하는 제 1 단백질의 양 및/또는 분포 등에 의한오차를 줄여서 보다 제 1 단백질의 활성화 정도를 보다정확하게측정할수있다.

본 명세서에서 제공되는 방법은 시험 시료 내의 제 1 단백질의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시험 시료 내의 제 1 단백질의 양을 측정하는 단계는 단계 (4) 또는 단계 (4-2) 수행 전 또는 동시에 진행될수있다.

상기 제 1단백질의 양은통상적인 모든방법으로측정할수 있으며， 예컨대, 통상적인 면역블라팅법 (예컨대, quant i tat ive western blott ing) , ELISA (enzyme- l inked immunosorbent assay； direct assay, indi rect assay, sandwich assay등) 등을사용하여 측정할수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서， 제 1 단백질이 고정화된 기판에 표지된 검출 항체 (detect ing ant ibody)를 첨가하고 표지에서 발생하는 신호를 측정함으로써 제 1단백질을정량할수있으나, 이에 제한되는것은아니다.

제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우， 상기 활성화수준측정 단계는각각의 제 1단백질과제 2단백질의 조합에 대하여 각각수행될수있다.

제 2 단백질 (downstream protein)이 2종 이상인 경우， 앞서 설명한 바와 같이 각각의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 PPI strength의 합 또는 상기 PPI strength의 합으로부터 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 score)을 사용하여 활성화 수준 (act ivat ion score)을 결정하거나， 각각의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 act ivat ion score의 합을 구하여, 상기 2종 이상의 제 2단백질에 대한활성화수준 (act ivat ion score)으로 결정할수 있다.

제 1단백질이 2종이상인 경우， 앞서 설명한바와같이, 각각의 제 1 단백질에 대하여 얻어진 PPI strength의 합 또는 상기 PPI strength의 합으로부터 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score)을 사용하여 활성화수준 (act ivat ion score)을결정하거나, 각각의 제 1단백질에 대하여 얻어진 act ivat ion score의 합을 구하여， 상기 2종 이상의 제 1 단백질에 대한활성화수준 (act ivat ion score)으로결정할수있다.

다른 예에서， 상기 얻어진 활성화 수준을 하기에 설명되는 기준 시료의 활성화수준이 1이 되도록 normal izat ion하여, 시험 시료의 활성화 수준을기준시료의 활성화수준에 대한상대값으로나타낼수있다.

일 예에서, 제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우， 단계 (4)는 상기 단계 (3) 또는 (3-1)에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 또는 타이로신 카이네이즈 활성화 정도)을 기준 시료에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 또는 타이로신 카이네이즈 활성화 정도)과비교하는단계일수있다.

제 1 단백질이 HER2-HER3 헤테로다이머인 경우， 상기 기준 시료는 발명의 목적에 따라서 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대， 세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로의 활성화측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법의 경우， 상기 기준 시료는 (1) 정상 세포, 및/또는 (2) 제 1 단백질 (HER2, HER3, 또는 이들 모두 (예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머 형태))이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 정상 세포 또는 암세포) , 및/또는 (3) 제 1단백질 (HER2, HER3, 또는이들모두 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 개체로부터 분리된 세포 (예컨대， 정상 세포 또는 암세포)를포함할수 있다. 일 구체예에서， 상기 시험 시료가개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우， 그 개체로부터 분리된 암세포와 동일 조직또는동일기관의 정상세포를포함하는것일수있다.

단계 (4)를수행하기 위하여， 상기 방법들은, 단계 (4) 이전에， 상기 기준 시료에 대하여 제 1 단백질 및 제 2 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용또는타이로신 카이네이즈활성화정도를측정하는단계를추가 로 포함할수 있으며， 이들단계는 앞서 설명한단계 (1)， (2)， 및 (3)， 또는 (1-1)， (2-1)， 및 (3-1)을참조하여 수행할수있다.

제 1단백질이 HER2-HER3헤테로다이머인경우, 상기 단계 (4) 이후에, 단계 (4)에서 얻어진 비교 결과로부터 목적하는 사항을 확인 (결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이를 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다:

제 1단백질이 HER2-HER3헤테로다이머인경우, 상기 확인 (결정)하는 단계는다음의 단계를포함하는것일수있다:

단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준보다 높은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된)활성화정도보다높다고확인 (결정)하는단계;

단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준과 동등한 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된)활성화정도와동등하다고확인 (결정)하는단계; 및/또는 단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준보다 낮은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된)활성화정도보다낮다고확인 (결정)하는단계.

단계 (5)： 기준시료와비교하는단계

단계 (5)는 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-1) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score) 또는 활성화 수준 (Act ivat ion score))을기준시료에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score) 또는 활성화 수준 (Act ivat ion score))과 비교하는 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

단계이다.

상기 기준시료는발명의 목적에 따라서 적절하게선택될수있다. 예컨대， 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 5 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법의 경우， 상기 기준 시료는 (1) 정상 세포， 및/또는 (2) 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 정상 세포 또는 암세포)， 및/또는 (3) 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 개체로부터 분리된 세포 (예컨대, 정상 세포 또는 암세포)를 포함할 수 ₁₀ 있다. 일 구체예에서， 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 그 개체로부터 분리된 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상세포를포함하는것일수있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 ’’정상세포’는 비-병리적 상태의 모든 세포를 의미할 수 있으며， 상기 "비-병리적 상태"는 질병 상태가 ₁₅ 아니거나， 돌연변이, 종양 형성， 기능적 및/또는 형태적 이상 등을 갖는 질병을유발할수 있는 상태가 아닌 것을 의미할수 있다. 예컨대， 정상 세포는제 1단백질과관련된 질병 또는시험 대상약물의 치료대상질병을 갖지 않는 세포일 수 있으며， 시험 시료가유래한 개체 또는 조직과 동종 또는동일한개체또는조직으로부터유래한것일 수있다.

₂₀ 또한, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는 예즉에 정보를 제공하는 방법의 경우, 상기 기준 시료는 정상 세포 또는 상기 약물에 대한 반응성이 알려진 (확인된) 세포 (예컨대, 암세포)를 포함하거나, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 ₂₅ 포함하는것일수있다.

또한, 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법의 경우, 상기 기준 시료는 정상 세포또는상기 제 1단백질을표적으로하는치료의 효과가알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 암세포)를포함하거나， 상기 시험 시료가개체로부터 분리된 30 암 세포를 포함하는 경우， 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를포함하는것일수있다.

단계 (5)를수행하기 위하여， 상기 방법들은, 단계 (5) 이전에， 상기 기준 시료에 대하여 다음의 단계 (1’)， (2 )， (3 )， 및 (4 ) , 또는 (1’) , 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

(2’)， (3’) , (4-1 ) , 및 (4-2 )를추가로포함할수있다:

(1' ) 제 1단백질을포함하는기준시료를， 표면에 상기 제 1단백질에 특이적으로 결합하는 물질을포함하는 고정된 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된기판을준비하는단계 ;

₅ (2 ) 상기 준비된 제 1단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2단백질을 첨가하여 반응시키는단계;

(3' )상기 (2’)단계에서 얻어진반응물로부터 신호를측정하는단계 (단백질-단백질상호작용측정 ) ; 및

(4' ) 상기 측정된신호를 이용하여 상기 (1' ) 단계에서 첨가한기준 ₁₀ 시료에 포함된제 1단백질의 양으로나누는단계 (활성화수준측정)

(또는 (4-1 ' ) 상기 측정된 신호를 이용하여 상기 (1’) 단계에서 첨가한 기준 시료의 중량 또는 농도로 나누는 단계 (단백질-단백질 상호작용수준측정 단계) 및 (4-2' ) 상기 단계 (4-1’)에서 얻어진 결과를 기준시료에 포함된 제 1단백질의 양으로나누는단계 (활성화수준측정)) . ₁₅ 각단계의 상세한사항은앞서 시험 시료에 대한각단계에서 설명한 바와같다.

단계 (6)

본 명세서에서 제공되는 방법은, 상기 단계 (5) 이후에， 단계 (5)에서 얻어진 비교 결과로부터 목적하는 사항을 확인 (결정)하는 단계를 ₂₀ 추가로포함할수있다.

이를보다구체적으로살펴보면다음과같다:

3 ₀ 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준보다높은경우, 시험 시료또는상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

정도보다높다고확인 (결정)하는단계;

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준과동등한경우, 시험 시료또는상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 정도와동등하다고확인 (결정)하는단계; 및/또는

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준보다낮은경우, 시험 시료또는상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가정상세포의 활성화정도또는기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 정도보다낮다고확인 (결정)하는단계 .

( { [ ) 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는예측에 정보를제공하는방법

단계 (6)은다음의 단계를포함하는것일수있다:

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준보다높은경우, 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는개체의 제 1단백질을표적으로하는 약물에 대한반응성이 기준시료의 약물반응성 보다높다고확인 (결정)하는단계;

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준과동등한경우， 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는개체의 제 1단백질을표적으로하는약물에 대한반응성이 기준시료의 약물반응성과동등하다고확인 (결정)하는단계 ; 및/또는

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준보다낮은경우， 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는개체의 제 1단백질을표적으로하는 약물에 대한반응성이 기준시료의 약물반응성보다낮다고확인 (결정)하는단게.

기준 시료를 시험 대상 개체에 요구되는 정도의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 갖는 세포를 포함하도록 선정하여， 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

상기 약물이 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 시험 대상 개체에 소망하는 효과를 갖는지 여부를 조사하거나， 기준 시료를 정상세포로 선정하여 상기 약물이 시험 시료 또는 시험 대상 개체에서 정상 세포보다 제 1단백질과관련된 질병에 특이적으로작용하는지 여부를조사할수 있다. 예컨대, 시험 대상 개체에 요구되는 정도의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한반응성을갖는세포를상기 기준시료로선정하는 경우， 단계 (6)은 단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용수준또는활성화수준과비교하여 동등이상， 예컨대， 높은경우, 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는 개체의 제 1 단백질을표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나， 및/또는 상기 약물이 시험 시료 또는상기 시험 시료가유래하는 개체에 효과를 갖는다고 결정하는단계를 포함할수있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는예측에 정보를제공하는방법에 있어서, 단계 (6)에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나， 및/또는 상기 약물이 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에 효과를 갖는다고 결정된 경우, 상기 개체에게 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할수있다.

다른 측면에서， 상기의 결정 내용을 기초로 각 개체에 적합한 개별 맞춤 치료 수단이 제공된다. 일 예는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 유효성분으로 포함하는, 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나， 및/또는 상기 약물이 효과를 갖는다고결정된 개체에서의 제 1단백질과관련된 질병의 치료를위한약학 조성물을제공한다. 다른 예는상기 제 1 단백질을표적으로 하는 약물의， 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나， 및/또는 상기 약물이 효과를 갖는다고 결정된 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 용도를 제공한다 _. 다른 예는 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나, 및/또는 상기 약물이 효과를 갖는다고 결정된 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 포함하는， 상기 개체에서의 저ᅵ ₁ 단백질과관련된질병의 치료방법을제공한다 _. 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

0 ） 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는선별에 정보를제공하는방법

상기 기준시료는정상세포또는상기 제 1단백질을표적으로하는 치료의 효과가 알려진（확인된） 세포 （예컨대， 암세포）를포함하거나, 상기 5 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 암세포와 동일 조직 또는동일기관의 정상세포를포함하는것일수있다.

단계 （6）은 단계 （4） 또는 （4-2）에서 측정된 시험 시료의 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 비교하여 동등 이상， 예컨대，0 높은 경우， 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체를 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 환자로 확인 （결정）하는 단계를 포함할수있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 제 1 단백질을 표적으로 하는약물을처방및/또는투여하는것을의미할� �있다.

5 상기 기준 시료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료가효과를 갖는 세포를포함하는것일수있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는선별에 정보를제공하는방법에 있어서， 단계 （6）에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체가 제 1 단백질을 표적으로 하는0 치료에 적합한 환자로 확인 （결정）된 경우， 상기 개체에게 제 1 단백질을

^_ 표적으로 하는 치료를 수행 （예컨대, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방및/또는투여）하는단계를추가로포함할� �있다.

다른측면에서， 상기의 확인 （결정）내용을기초로각개체에 적합한 개별 맞춤 치료 수단이 제공된다. 일 예는 상기 제 1 단백질을 표적으로5 하는 약물을 유효성분으로 포함하는， 상기 단계 （6）에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 것으로 확인된 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를위한약학조상물을제공한다. 다른 예는상기 제 1 단백질을표적으로하는 약물의， 상기 단계 （6）에서 체 1단백질을표적으로 하는치료에 적합한것으로확인된 개체에서의 제 1단백질과관련된 질병의0 치료를위한용도를제공한다. 다른예는상기 단계 （6）에서 제 1단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 것으로 확인된 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 수행 （예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및/또는 투여）하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서의 제 1 단백질과 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

관련된질병의 치료방법을제공한다.

（^） 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과 （제 1 단백질을 표적으로 하는 약물와 반응성）을 모니터링하는 방법 또는 모니터링에 정보를제공하는방법

상기 기준시료는정상세포또는상기 제 1단백질을표적으로하는 치료의 효과가 알려진（확인된） 세포 （예컨대， 암세포）를 포함하거나， 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우， 암세포와 동일 조직 또는동일기관의 정상세포를포함하는것일수있다.

단계 （6）은 단계 （4） 또는 （4-2）에서 측정된 시험 시료의 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 비교하여 동등 이상， 예컨대, 높은 경우， 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체를 저 단백질을 표적으로 하는 치료가 효과를 발휘하고 있는 것 （예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여 후， 투여받은 개체에서 상기 약물에 대한반응성이 유지되고 있는것 또는투여받은개체에서 상기 약물에 대한 저항성이 발생하지 않은것）으로확인 （결정）하는단계를포함할수있다. 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 제 1 단백질을 표적으로 하는약물을처방및/또는투여하는것을의미할� �있다.

상기 기준 시료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료가효과를 갖는 세포를포함하는것일수있다.

상기 제 1단백질을표적으로하는치료의 효과를모니터링 하는방법 또는모니터링에 정보를 제공하는 방법에 있어서， 단계 （6）에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 발휘되고 있는 것으로 확인 （결정）된 경우， 상기 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 계속적으로 수행 （예컨대， 저 11 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및/또는 투여）하는 단계 또는 단계 （6）에서 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는개체에서 제 1단백질을 표적으로하는치료의 효과가발휘되지 않는 것 （예컨대， 치료 효과 （약물 반응성） 감소 또는 저항성 획득 등）으로 확인 （결정）된 경우, 상기 개체에게 상기 제 1 단백질을표적으로 하는 치료를중단하는 단계 및/또는 제 1 단백질을표적으로 하는 다른 약물을투여하거나상이한 제 1단백질을 표적으로하는치료를수행하는단계를추가로포 함할수있다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

측정하는단계를포함하고, 상기 제 1단백질은세포또는조직 내 및/또는 세포또는조직 간의 신호전달경로에 관여하는단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간 의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질이고， 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 2개 이상의 제 1 단백질에 대하여 수행하는， 상기 세포 또는 조직 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체 (개별 환자)에 적용하기에 적합한 치료 표적으로서의 제 ₁ 단백질 또는 이를 표적으로 하는 약물을선별하는방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은，

(1) 제 1 단백질을포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반응시키는단계;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계

(단백질-단백질상호작용측정) ; 및

(4)단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 (1)에서 첨가한시함 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화수준 측정) ; 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정) , 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한값을구하는단계 (활성화수준측정) ; 및

(5) 2 이상의 제 1 단백질에 대하여 상기 단계 (4) 또는 단계 (4- ₂₎ 에서 얻어진결과를서로비교하는단계

를포함할수있다.

이 때, 상기 제 1 단백질로서 세포 또는 조직의 신호전달경로에 관여하는단백질중에서 선택되는 2종이상이 사용되고,

단계 ( 1)， (2)， (3) 및 (4) , 또는 단계 (1) , (2) , (3)， (4-1)， 및 (4-2)는 2종이상의 제 1단백질각각에 대하여 수행되며，

단계 (5)의 비교하는단계는 2종이상의 제 1단백질에 대하여 얻어진 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

결과를서로비교하는것일수있다.

상기 단계 (5)에서의 비교 결과, 단백질-단백질 상호작용수준또는 활성화수준이 높은제 1단백질을상기 시험 시료또는시험 시료가유래한 개체의 치료 표적으로 선택하거나， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 시험 시료 또는 시험 시료가 유래한 개체의 치료를 위한 후보 약물로선택하는단계 (단계 (6))를추가로포함할수있다.

상기 단계 (1) 내지 (6) 및， 시험 시료， 제 1 단백질, 제 2 단백질 등의 용어 설명은앞서 기재한바와같다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는단계를포함하고， 상기 제 1단백질은세포또는조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질이고, 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는단계를후보물질 처리 전 및 처리 후에 수행하는， 제 1단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보약물의 효능확인방법을제공한다.

상기 방법은，

시험 시료에 후보화합물을처리하는 (예컨대, 접촉시키는)단계, 및 상기 후보화합물이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료 각각에 대하여 하기의 단계 (1)， (2) , (3) , 및 (5) , 또는 (1) , (2)， (3)， (4)， 및 (5) 또는 (1)， (2) , (3) , (4-1) , 및 (5) , 또는 (1) , (2) , (3) , (4-1) , (4-2) , 및 (5)를수행하는단계를포함할수있다:

(1) 제 1 단백질을포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반응시키는단계;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질상호작용측정) ; 및

(4)단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화수준 측정 ) ;또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정) , 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한값을구하는단계 (활성화수준측정) ; 및

(5) 상기 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 상기 단계 (3) , 단계 (4) , 단계 (4-1) , 또는 단계 (4- 2)에서 얻어진각각의 결과를서로비교하는단계.

상기 후보화합물이 처리되지 않은시험 시료와처리된 시험 시료는 각각후보화합물의 처리 전시험 시료및 처리 후시험 시료를의미하거나， 시험 시료를 분량하여 상기 후보 화합물을 처리한 일부의 시험 시료 및 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 다른 일부의 시험 시료를 의미할 수 있다.

상기 단계 (5)에서의 비교 결과， 후보화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화수준이 후보 화합물이 처리되지 않은시험 시료에서보다낮은경우， 상기 후보화합물을상기 제 1단백질을 표적으로 하는후보 약물로선택하거나, 상기 후보 화합물이 제 1 단백질을 표적으로하는약물로서 효과가있는것으로확인할수있다.

따라서， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법은， 상기 단계 (5) 이후에, 상기 단계 (5)에서의 비교 결과， 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은시험 시료에서보다낮은경우， 상기 후보화합물을 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하거나， 상기 후보 화합물이 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물로서 효과가 있는 것으로 확인하는단계 (단계 (6) )를추가로포함할수있다.

일 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 및 ?0-1 중에서 선택된 어느 하나이고， 제 2 단백질은 다른 하나이고, 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 후보 물질 처리 전 및 처리 후에 수행하는， 제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법， 또는 _: 제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법을 제공한다. 다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질- 단백질 상호작용을측정하는단계를포함하고, 상기 제 1단백질은 나및 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

?0-1 중에서 선택된 어느 하나이고， 제 2 단백질은 다른 하나이고， 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 후보 물질 처리 전 및 처리 후에 수행하는， 제 1 단백질 및/또는 제 2 단백질과 관련된 질병 (예컨대, 제 1 단백질 및/또는 제 2단백질의 (과)발현 및/또는 (과)활성화와 관련된 질병; 암, 면역 질환 등)의 예방 또는 치료을 위한 후보 약물의 선별 방법을제공한다.

상기 방법은,

시험 시료에 후보화합물을처리하는 (예컨대， 접촉시키는)단계， 및 상기 후보 화합물이 처리되지 않은시험 시료 및 처리된 시험 시료 각각에 대하여 하기의 단계 (1)， (2)， (3)， 및 (5)， 또는 단계 (1)， (2)， (3)， (4)， 및 (5)， 또는 단계 (1)， (2)， (3) , (4-1) , 및 (5)， 또는 단계

(1)， (2)， (3)， (4-1) , (4-2) , 및 (5)를수행하는단계를포함할수있다:

(1) 제 1 단백질을포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계 ;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반응시키는단계;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질상호작용측정) ; 및

(4)단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 (1)에서 첨가한시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) ; 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정)， 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한값을구하는단계 (활성화수준측정) ; 및

(5) 상기 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 상기 단계 (3)， 단계 (4)， 단계 (4-1) , 또는 단계 (4- 2)에서 얻어진각각의 결과를서로비교하는단계.

각단계의 구체적 설명은앞서 설명한바와같다.

상기 단계 (5)에서의 비교결과, 후보화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 제 1 단백질을 표적으로 하는후보 약물로 선택하거나， 상기 후보 화합물이 제 1 단백질을 표적으로하는 약물로서 효과가 있는 것으로 확인할수 있다. 따라서, 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제 1 단백질을 표적으로하는후보약물의 효능확인 방법은, 상기 단계 （5） 이후에, 상기 단계 （5）에서의 비교 결과， 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우， 상기 후보 화합물을 제 1 단백질 또는 제 2단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하거나， 상기 후보 화합물이 제 1 단백질 또는 제 2단백질을표적으로 하는 약물로서 효과가 있는 것으로 확인하는단계 （단계 （6））를추가로포함할수있다.

상기 후보 화합물은 제 1 단백질의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대， 소분자 화학 약물 （smal l molecular chemi cal s） , 단백질 （예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등）, 펩타이드， 핵산분자（예컨대， DNA, RNA（예컨대， s iRNA, mi croRNA, shRNA 등）, PNA （pept ide nuclei c acid） , 앱타머, 등）， 식물 주줄물, 동물 주줄물， 세포 주줄물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 시험 시료는 제 1 단백질이 과발현 및/또는 （과）활성화된 세포 （예컨대, 세포용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）， 또는 제 1 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용（치료） 대상 질병과관련된 분리된 세포 （예컨대， 세포 용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）일 수 있으며, 일 예에서, 확립된 세포주또는상기 질병 （예컨대， 암）을 앓는환자로부터 분리된 세포또는 조직일 수 있다. 예컨대， 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 （상기 암은 제 1 단백질의 과발현및/또는（과）활성화와관련된것일수� �다）.

제 1 단백질이 PD-L1 및 PD-1 중에서 선택된 어느 하나이고， 저 12 단백질은다른하나인 경우， 상기 약물스크리닝에 사용된시험 시료는제 1 단백질이 과발현 및/또는 （과）활성화된 세포 （예컨대， 세포 용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）, 또는제 1단백질과관련된 질병 또는 선별하고자 하는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용（치료） 대상 질병과관련된 분리된 세포 （예컨대， 세포용해액 등） 또는조직 （예컨대, 조직 용해액 등）， 또는 정제된 제 1단백질을포함하는 것일 수 있으며， 일 예에서， 확립된 세포주또는상기 질병 （예컨대， 암， 면역질환등）을 앓는 환자로부터 분리된 세포 또는 조직， 또는 정제된 제 1 단백질을 포함하는 것일수 있다. 상기 제 2단백질은정제된 （또는세포로부터 분리된） 형태일 수있다.

상기 단계 （1）내지 （6）은 in /iro에서 수행되는것일수있다. 상기 단계 （1） 내지 （6） 및 제 1 단백질， 제 2 단백질 등와 용어 설명은앞서 기재한바와같다.

상기한 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 제 1 단백질의 표적으로 하는 신약 개발에 있어서， 후보 약물로 개발된 약물의 효능검정 （또는확인또는시험）에 유용하게 적용될수있다.

후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다높은 경우， 상기 후보 화합물을 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하는단계 （단계 （6））를추가로포함할수있다.

상기 후보 화합물은 제 1 단백질의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 소분자 화학 약물 （smal l molecular chemi cal s） , 단백질 （예컨대 , 항체， 항체 단편 , 또는 이의 유사체 등）, 펩타이드， 핵산분자（예컨대， DNA, RNA（예컨대， siRNA, microRNA, shRNA 등）, PNA （pept ide nuclei c acid） , 앱타머, 등）， 식물 추출물, 동물 추출물， 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 시험 시료는 제 1 단백질이 과발현 및/또는 （과）활성화된 세포 （예컨대， 세포용해액 등） 또는조직 （예컨대, 조직 용해액 등）， 또는제 1 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용（치료） 대상 질병과관련된 분리된 세포 （예컨대， 세포용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）일 수 있으며, 일 예에서, 확립된 세포주또는상기 질병 （예컨대， 암）을 앓는환자로부터 분리된 세포또는 조직일 수 있다. 예컨대， 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 （상기 암은 제 1 _. 단백질의 과발현및/또는（과）활성화와관련된것일수� �다）.

상기 단계 （1） 내지 （6） 및 제 1 단백질， 제 2 단백질 등의 용어 설명은앞서 기재한바와같다. 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

상기한 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 제 1 단백질의 표적으로 하는 신약 개발에 있어서， 후보 약물로 개발된 약물와 효능검정 (또는확인또는시험)에 유용하게 적용될수있다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를포함하고, 상기 제 1 단백질은세포또는조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고， 제 2 단백질은 상기 세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질 중에서 선택된 1종 이상인, 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적을 선정하는 방법 또는 상기 선정에 정보를 제공하는 방법， 또는 제 1 단백질의 표적 약물과 병용 투여하기 위한 병용 약물을 선정하는 방법 또는 상기 선정에 정보를 제공하는방법을제공한다.

상기 방법은，

(1) 제 1단백질을포함하는시험 시료를표면에 상기 제 1단백질에 특이적으로 결합하는 물질을포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을준비하는단계;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반응시키는단계;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 즉정하는 단계 (단백질-단백질상호작용측정) ; 및

(4)단계 (3)에서 측정된신호를이용하여 단계 (1)에서 첨가한시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) ; 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정) , 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된제 1 단백질의 단위량에 대한값을구하는단계 (활성화수준측정) ; 및

(5) 상기 단계 (3) , 단계 (4) , 단계 (4-1) , 또는 단계 (4-2)에서 얻어진결과를비교하는단계

를포함할수있다.

상기 단계 (5)의 비교하는단계는,

(a) 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

결과를 기준 시료에 대하여 얻어진 결과와 비교하거나 (이 경우, 상기 방법은 기준 시료는 앞서 설명한 바와 같고， 기준 시료에 대하여 앞서 설명한단계 (I )， (2' ) , (3’)， 및 (4，) , 또는 (I )， (2' ) , (3 ) , (4-1’)， 및 (4-2’)를추가로포함할수있다)，

( 2종 이상의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 결과를서로비교하여 수행될수있다.

상기 단계 (5)의 비교결과,

( ₃₎ 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료보다 높은 경우， 상기 제 2단백질을제 1단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료표적으로선정하거나， 상기 제 2단백질을표적으로하는약물을제 1 단백질의 표적 약물과병용투여하기 위한약물로선정하거나;

( 2종 이상의 제 2단백질 중상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 가장 높은 제 2 단백질을 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 병행 치료 표적으로 선정하거나， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물을 제 1 단백질의 표적 약물과병용투여하기 위한약물로선정할수있다.

따라서， 상기 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적을선정하는방법 (또는상기 선정에 정보를제공하는방법)， 또는제 1 단백질의 표적 약물과 병용 투여하기 위한 병용 약물을 선정하는 방법 (또는상기 선정에 정보를제공하는방법)은， 상기 단계 (5) 이후에,

(6-1) 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는단계 (4-2)의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료보다 높은 경우, 상기 제 2단백질을제 1단백질의 표적 치료와병행하기 위한 병행 치료표적으로선정하거나， 상기 제 2단백질을표적으로하는 약물을저 11 단백질의 표적 약물과병용투여하기 위한약물로선정하는단계; 또는

(6-2) 2종이상의 제 2단백질중상기 단계 (4)또는단계 (4-2)에서 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 가장 높은 제 2 단백질을 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적으로 선정하거나， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물을 제 1 단백질의 표적 약물과병용투여하기 위한약물로선정하는단계

를추가로포함할수있다.

다른 측면에서, 상기의 결정 내용을 기초로 한 병용 치료 수단이 제공된다. 일 예는상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물 및 상기 단계 （6-1） 또는 （6-2）에서 병행 치료 표적으로 선정된 제 2 단백질을 표적으로 하는 （예컨대, 저해하는） 약물을 포함하는， 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 상기 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는 개체에서의 제 1단백질과 관련된 질병의 치료를위한 병용투여 용도로사용될 수 있다. 다른 예는 상기 제 1단백질을표적으로하는약물및 상기 단계 （6-1）또는（6-2）에서 병행 치료표적으로선정된 제 2단백질을표적으로하는（예컨대, 저해하는） 약물의， 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 병용 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료 （예컨대， 제 1 단백질을표적으로하는 약물의 투여） 및 상기 단계 （6-1） 또는 （6-2）에서 병행 치료 표적으로 선정된 제 2 단백질을 표적으로 하는 치료 （예컨대， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 （예컨대, 저해하는） 약물의 투여）를 동시에 또는 순서에 상관 없이 연속하여 수행하는 단계를 포함하는， 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다. 상기 환자는 상기 시험 시료또는상기 시험 시료가유래하는개체일수있다.

다른 예에 있어서， 상기 제공된 제 1단백질을표적으로하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법， 제 1 단백질을표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는선별에 정보를 제공하는 방법， 및 세포 또는 조직 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체 （개별 환자）에 적용하기에 적합한 치료 표적으로서의 제 1 단백질또는이를표적으로하는약물을선별하는 방법 또는선별에 정보를 제공하는 방법은， 앞서 설명된 단백질-단백질 상호작용 측정 및 활성화 수준측정 단계에 더하여, 제 1단백질의 번역 후변형 （Post-trans lat ional modi f icat ion； PTM） 여부를 확인하는단계 （단계 （7））를추가로포함할수 있다. PTM은 제 1단백질의 활성화상태를 보여주는 일반적인 마커입니다. 그러므로현존방법과의 대조군으로서사용된다.

상기 제 1단백질의 번역 후변형은， 정상개체 （암또는종양을갖지 않는 개체）와 비교하여, 암 또는 종양 환자에서 발생 빈도가 높은 변형 （제 1단백질의 종양관련 번역 후 변형）을의미하며， 제 1단백질 또는 제 1 단백질을 암호화하는 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 아미노산 변이 （또는 하나 이상의 아미노산 변이를 유발하는 뉴클레오타이드의 변이）， 인산화 （예컨대, Tyr 잔기의 인산화） 등으로 이루어진군에서 선택된하나이상포함하는의미일 수 있다. 예컨대， 제 1 단백질이 EGFR인 경우, 상기 변이는 엑손 19및/또는엑손 21에 집중적으로 존재할수 있으며, 일 구체예에서， 상기 변이는 EGFR의 엑손 19및 엑손 21 내의 하나 이상의 유전자의 결실 （예컨대， 엑손 19 및/또는 엑손 21의 결실）， L858R 치환을 유발하는 유전자 변이, Tyr 1068 및/또는 Tyr 1086에서의 인산화 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은아니며, 정상개체 （암또는종양을 갖지 않는 개체）와비교하여, 암 또는 종양 환자에서 발생 빈도가 높고 알려진 모든 EGFR （유전자/단백질） 변형 중에서 선택될수 있다. 제 1단백질이 HER2인 경우， 상기 변이는 Tyr 1221에서의 인산화일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니며， 정상 개체 （암또는종양을갖지 않는개체）와비교하여 , 암또는종양환자에서 발생 빈도가 높고 알려진 모든 HER2 （유전자/단백질） 변형 중에서 선택될 수 있다. 제 1 단백질이 HER3인 경우， 상기 변이는 Tyr 1289에서의 인산화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며， 정상 개체 （암또는 종양을 갖지 않는 개체）와 비교하여， 암또는 종양 환자에서 발생 빈도가 높고 알려진 모든 HER3 （유전자/단백질） 변형 중에서 선택될 수 있다. 제 1 단백질이 MET인 경우， 상기 변이는 Tyr 1349에서의 인산화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 정상 개체 （암 또는 종양을 갖지 않는 개체）와 비교하여, 암 또는 종양 환자에서 발생 빈도가 높고 알려진 모든 MET （유전자/단백질）변형 중에서 선택될수있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제 1 단백질을 표적으로 한다” 함은 제 1 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 것을 의미할 수 있으며， 예컨대， 제 1 단백질의 활성을 저해하는 것을 의미할 수 있다. 제 1 단백질의 활성의 저해는 제 1 단백질과 결합하거나， 및/또는 제 1 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대, 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "약물'’은 약리적 효과를나타내는 모든 물질， 예컨대， 소분자 화합물， 단백질 （예컨대， 항체, 항체 단편， 또는 이의 유사체 등）， 펩타이드, 핵산 분자 （예컨대， DNA, RNA （예컨대， siRNA, mi croRNA, shRNA등）， PNA （pept ide nucleic acid） , 앱타머， 등）， 식물추출물， 동물추출물， 세포추출물등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는것일수있다.

다른예는，

(a) 제 1 단백질의 발현 수준 및/또는 번역 후 변형 (Post- translational modification； PTM)즉정부,및

(b)제 1단백질과제 2단백질간의 단백질-단백질상호작용측정부 를포함하고,

상기 제 1단백질은수용체 티로신키나아제 (RTK)인， RTK프로파일링 키트 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 예측용 키트를 제공한다. 일 예에서, 상기 약물은 폐암치료제 (예컨대， 아파티닙 (Afatinib)등)일수있으나,이에 제한되는것은아니다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "제 1 단백질을 표적으로 하는 약물"은 제 1단백질의 활성을 저해하는 모든 물질， 예컨대， 제 1단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물 (small molecule) , 단백질 (예컨대, 항체， 항체 단편， 또는이의 유사체 등),펩타이드,핵산분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대 , siRNA (small interfering RNA) , shRNA (small hairpin RNA) , miRNA (microRNA) , 등)， PNA (peptide nucleic acid) , 앱타머, 등)， 식물 주줄물, 동물 주줄물， 세포 주줄물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다구체적으로， "제 1단백질을표적으로 하는 약물”은 제 1 단백질과 결합하거나， 및/또는 제 1 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능， 예컨대, 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 모든 물질, 예컨대, 제 1단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물, 단백질 (예컨대, 항체， 항체 단편， 또는 이의 유사체 등)， 펩타이드， 핵산분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대， siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid) , 앱타머, 등)， 식물 추출물， 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일수있다.

일 구체예에서， 상기 "제 1 단백질을 표적으로 하는 약물”은 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료제， 예컨대， 제 1 단백질의 표적 저해제를 의미하는 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 제 1단백질을 표적으로 하는 약물은, EGFR 표적 치료제 (cetuximab, gefitinib, erlotinib, afatinib, osimertinib (AZD9291), 각종 항- EGFR 항체 등), MET 표적 치료제 (각종 항- MET 항체， Crizotinib， Cabozant inib 등), HER2 표적 치료제 (trastuzumab, Trastuzumab, Pertuzumab, Lapatinib등)， HER3표적 치료제 (각종항- HER3항체 등), FGFR1, 2)표적 치료제 (Lenvatinib, Nintedanib, Regorafenib 등)， VEGFR(1, 2, 3)표적 치료제 (Bevacizumab, Axitinib, Lenvat inib등)， PDGFR표적 처료제 (Axitinib, Gef itinib, Imatinib등)， IGF1R 표적 치료제 (Ceritinib 등), c-KIT 표적 치료제 (Axitinib, Cabozant inib, Dasatinib 등)， RET 표적 치료제 (Vandetanib 등)， BRAF 표적 치료제 (Vemurafenib, Dabrafenib등), MEK표적 치료제 (Trametinib 등), Src표적 치료제 (Bosutinib, Dasatinib, Ponat inib, Vandetanib등)， PI3K표적 치료제 (Crizotinib, Cabozant inib등)， CDK(4, 6)표적 치료제 (Palbocicl ib, Sorafenib 등)， R0S1표적 치료제 (Ceritinib, Crizotinib 등)， ALK표적 치료제 (Ceritinib, Crizotinib등)， BCR-Abll표적 치료제

(Bosutinib, Dasatinib, Imatinib, Ni lotinib 등), AR 표적 치료제 (Abiraterone, Enzalut amide 등)， CTLA4 표적 치료제 (Ipilimumab， Tremel imumab 등)， PD-1 표적 치료제 (Nivolumab 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수있으나이에 제한되는것은아니다.

다른 구체예에서， 상기 "제 1단백질을 표적으로 하는 약물" (약물 반응성 측정 대상 또는 스크리닝 대상 약물)은 제 1 단백질과의 결합에 있어서 제 2단백질과 경쟁적으로 작용하여， 제 1단백질과제 2단백질 간의 상호작용을 억제하는 약물 (예컨대, 소분자 화합물 (small molecule) , 단백질 (예컨대， 항체， 항체 단편， 또는 이의 유사체 등)， 펩타이드， 핵산 분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대 , siRNA (small interfering RNA) , shRNA (small hairpin RNA) , miRNA (microRNA) ,등)， PNA (peptide nucleic acid) , 앱타머, 등)， 식물 주줄물, 동물 주줄물, 세포 주줄물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종이상)일수있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 ”제 1 단백질을 표적으로 하는 치료"는제 1단백질의 활성을저해하는모든의학적 및/또는 약학적 행위를 의미할 수 있으며， 예컨대, 앞서 설명한 바와 같은 제 1단백질의 활성을 저해하는약물을제 1단백질의 활성을저해하는것을필요로하는대상에게 처방 및/또는 투여하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로， "제 1단백질을 표적으로 하는 치료”는 제 1단백질과 결합하거나, 및/또는 제 1단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능， 예컨대， 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 약물을 이를필요로하는대상에게 처방및/또는투여하는것일수있다.

다른 예는 제 1단백질과 제 2단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

측정하는 단계를 포함하고， 상기 제 1 단백질은 1世요2 및 抑묘3이고， 상기 1世요2및 묘3는헤테로다이머를형성하며， 제 2단백질은세포또는조직 내 및/또는세포또는조직 간의 신호전달경로중에서 他1?2， 抑1¾， 또는 이들 모두의 하위 단백질이고， 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 후보 물질이 처리된 시료와 처리되지 않은 시료에서 수행하는, 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법 또는 상기 질병의 예방또는치료를위한후보 약물의 효능확인 방법을제공한다. 다른예는 四묘2 - 묘3 헤테로다이머에서의 抑묘2 및/또는 1?3의 활성화 정도 （예컨대， 타이로신 잔기의 인산화）를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 활성화를 측정하는 단계를 후보 물질이 처리된 他요2 - 요3 헤테로다이머 또는 1世묘2_ 四 1?3 헤테로다이머를 포함하는 시료와 처리되지 않은 他요2 - 요3 헤테로다이머 또는 ?世요2 - 1?3헤테로다이머를포함하는시료에서 수행하는， 제 1단백질을표적으로하는후보약물의 효능확인 방법 또는상기 질병의 예방또는치료를위한후보약물의 효능확인방법을제공한다.

상기 방법은，

시험 시료에 후보물질을처리하는（예컨대， 접촉시키는）단계， 및 하기의 단계 （ ₃ ）， 0））， （（：）， 및 （ 를 수행하는 단계를 포함할 수 있다:

（ ₃ ） ｝世1씽 - 묘3 헤테로다이머를 포함하는 시험 시료를 준비하거나， 四요2 -四요3 헤테로다이머를 포함하는 시험 시료를 표면에 및/또는 他묘3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 四요2 -四1?3 헤테로다이머가고정된기판을준비하는단계 ;

（ 상기 1?2 -四1씼헤테로다이머를 인산화시키고, 표지된 인산화된 타이로신특이적 결합물질을첨가하여 반응시키는단계 ;

（ ₀ ） 단계 （ 에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계

（단백질-단백질 상호작용 측정 또는 및/또는 抑1?3의 타이로신 카이네이즈활성화정도측정）; 및

（（1） 상기 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 상기 단계 （ 에서 얻어진 각각의 결과를 서로 비교하는 단계 .

앞서 설명한바와같이, 상기 인산화된타이로신특이적 결합물질은 1世요2 및/또는 요3의 인산화된 타이로신에 특이적으로 결합하는 항체일 수있다. 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

상기 후보 물질은 상기 단계 （ 에서 처리될 수 있으며, 예컨대, 단계 （ 의 인산화 또는 인산화된 타이로신 특이적 결합물질의 처리 전, 후， 또는 동시에 처리될 수 있다. 상기 단계 （ 의 인산화는 인산화제를 처리하여 수행될 수 있다. 상기 인산화제는 및/또는 요3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 예컨대， 쇼†! ³ 와 마그네슘 （예컨대, ¾1故1 ₂ 등）일 수 있으나, 이에 제한되는 것은아니다.

단계 （ 에서의 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료의 결과를 비교하기 위하여, 상기 단계 （ ₃ ）-（0는 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 각각 수행될 수 있다.

상기 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료와 처리된 시험 시료는 각각후보물질의 처리 전 시험 시료 및 처리 후시험 시료를의미하거나, 시험 시료를분량하여 상기 후보물질을처리한 일부의 시험 시료 및 상기 후보물질을처리하지 않은다른일부의 시험 시료를의미할수있다.

상기 단계 （ 에서의 비교 결과, 후보 물질이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 四묘2 및/또는 四묘3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은경우（즉상기 후보물질이 四1?2및/또는四묘3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는 경우）， 상기 후보 물질이 ｝世1?2， ｝世요3， 또는 이들 모두（예컨대， 헤테로다이머 형태）를 표적으로 하는 （즉, 抑모2 및/또는 1?3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는） 약물로서 효과가 있는것으로확인할수있다.

따라서 , 상기 후보약물의 효능확인방법은, 상기 단계 （ 이후에， 상기 단계 （ 에서의 비교 결과， 후보물질이 처리된 시험 시료의 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 四묘2 및/또는 요3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 이 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우（즉 상기 후보 물질이 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 상호 작용 또는 四요2 및/또는 1?3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는 경우）， 상기 후보 물질이 四묘2, 四묘3， 또는 이들 모두（예컨대, 四1?2 -四묘3 헤테로다이머 형태）를 표적으로 하는（즉， 제 1 단백질과 제 2 단백질의 상호작용을 억제하거나 1?2 및/또는 1?3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는） 약물로서 효과가 있는 것으로 확인하는 단계 （단계 （이）를 추가로 포함할 수 있다. 상기 후보약물이 처리된시험 시료의 단백질-단백질상호수준 또는 HER2및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈활성화정도가후보물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮다고 함은 후보 약물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈활성화정도가후보물질이 처리되지 않은시험 시료의 단백질- 단백질 상호 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도의 75%이하（즉， 25%이상억제）， 50%이하（즉， 50%이상억제）, 45% 이하, 40%이하, 35%이하， 30%이하, 25%이하（즉， 75%이상억제）, 20% 이하（즉 80%이상억제）， 15%이하， 또는 10%이하（즉, 90%이상억제）인 것을의미할수있다.

상기 후보 물질은 제 1 단백질（HER2， HER3, 또는 이들 모두（예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머 형태））의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 소분자 화학 약물 （small molecular chemicals） , 단백질 （예컨대， 항체， 항체 단편, 또는 이의 유사체 등）， 펩타이드, 핵산분자（예컨대, DNA, RNA（예컨대， siRNA, microRNA, shRNA 등）, PNA （peptide nucleic acid） , 앱타머， 등）, 식물 추출물, 동물 추출물， 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 시험 시료는 제1 단백질（HER2, HER3, 또는 이들 모두（특히， HER2-HER3 헤테로다이머 형태））이 과발현 및/또는 （과）활성화된 세포 （예컨대, 세포용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）， 또는 제 1 단백질과관련된 질병 또는효능을확인하고자하는제 1단백질을표적으로 하는 약물의 적용（치료） 대상 질병과 관련된 분리된 세포 （예컨대， 세포 용해액 등） 또는조직 （예컨대， 조직 용해액 등）일 수 있으며， 일 예에서, 확립된 세포주 또는 상기 질병 （예컨대， 암）을 앓는 환자로부터 분리된 세포또는 조직일 수 있다. 예컨대， 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 （상기 암은 제 1 단백질의 과발현및/또는（과）활성화와관련된 것일수있다）.

상기 단계 （a）내지 （ 는 in F/ZTO에서 수행되는것일수있다. 각단계의 용어 설명은앞서 기재한바와같다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 제 1 단백질을 표적으로 한다'’ 함은 제1 단백질（HER2, HER3, 또는 이들 모두（예컨대， HER2-HER3 헤테로다이머 형태））의 활성을촉진또는저해하는것을의미할수 있으며, 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

예컨대, 제 1 단백질 0恨1?2， 1抑?3， 또는 이들 모두（예컨대, 他1?2 -他묘3 헤테로다이머 형태））의 활성（타이로신 카이네이즈 활성）을 저해하는 것을 의미할 수 있다. 제 1 단백질의 활성의 저해는 제 1 단백질과 결합하거나， 및/또는제 1단백질을분해 및/또는구조적 변형시켜 고유의 기능， 예컨대， 5 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는것일수있다.

상기 투여는 경구 또는 비경구 경로로 수행될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입, 복강 주입， 내피 투여， 병변부위 국소투여， 비내 투여， 폐내 투여， 또는직장내 투여 등의 ₁₀ 경로로수행될수있다.

상기 개체， 환자 또는 대상은 모든 포유류， 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등일 수 있고， 예컨대 제 1 단백질과관련된 질병을 갖는환자일 수 있다 _. 상기 제 단백질과관련된 질병은 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 ₁₅ 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며， 예컨대, 암, 염증, 그외 면역질환등일수 있다. 구체예에서, 상기 개체， 환자또는대상은암환자일수있다.

상기 암은모든고형암및 혈액암중에서 선택될수 있으며， 예컨대 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내 ₂₀ 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화와 관련된 암일 수 있다. 예컨대， 상기 암은 편평상피세포암， 소세포폐암， 비소세포폐암, 폐의 선암， 폐의 편평상피암， 복막암， 피부암， 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암， 항문부근암， 식도암， 소장암, 내분비선암， 부갑상선암, 부신암， 연조직 육종， 요도암， 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종， 위암， ₂₅ 췌장암, 교아종, 경부암， 난소암， 방광암， 유방암， 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암, 전립선암， 음문암， 갑상선암， 두경부암， 뇌암등으로이루어진군에서 선택된 1종이상일수 있으나이에 제한되는것은아니다. 상기 암은원발성 암뿐아니라전이성 암을포함할 수 있다. 또한, 상기 암은 기존의 항암 치료에 대하여 저항성을 갖거나 ₃₀ 획득한암일수있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "약물에 대한 반응성’’은 약물을 투여받은개체에서 상기 약물이 효과를발휘하는정도를의미할수있다. 본 명세서에 사용된 바로서， 용어 ”효과’’는 약물 또는 치료가 처치 대상에서 달성하고자하는의학적 및/또는 약학적 효과를의미하는것으로， 처치 대상이 갖는질병의 예방및/또는치료， 및/또는증상의 완화및/또는 개선 등을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대， 상기 약물이 항암제이고 치료가항암치료이고， 상기 처치 대상이 암환자인 경우, 상기 효과는항암 효과 (암의 예방및/또는치료효과)일수 있고， 상기 항암효과는암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동 (migrat ion)， 침습 ( invasion) , 및/또는 전이 (metastas is) 등을 억제， 및/또는 암의 악화를 억제， 및/또는 저항성을감소또는제거하는효과등을포함하는 것일수있다.

다른 예에서， 앞서 설명한 세포 또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화 측정， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 방법， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 모니터링 방법, 제 1 단백질을표적으로하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법, 및/또는 약물의 스크리닝 방법에 사용하기 위한 단백질- 단백질 상호작용 측정용 장치를 제공한다. 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정용 장치， 제 1 단백질을표적으로하는약물에 대한반응성 예측및/또는모니터링용장치， 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하기 위한 장치, 및/또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 확인용 장치로서 적용 가능하다.

일 예에서， 상기 장치에서의 제 1 단백질은 PD-L1 또는 PD-1일 수 있다.

다른 예에서 , 상기 장치에서의 제 1단백질은 HER2, HER3, 또는 이들 모두 (예컨대， HER2-HER3헤테로다이머 형태)일수있다.

상기 단백질-단백질 상호작용측정용장치는 앞서 설명한세포또는 조직 내 및/또는 세포 또는 조직 간의 신호전달경로의 활성화 측정, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 방법， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 모니터링 방법， 제 1 단백질을표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법， 및/또는 약물의 스크리닝 방법에 적용됨으로써， 소량의 시료에서의 생체 분자 간 상호 작용도 정확하고효율적으로 관찰， 분석, 검출， 및/또는측정할수 있다는 이점을 갖는다. 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대， needle biopsy) 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도유용하고효과적으로적용될수 있다. 또한， 상기 단백질-단백질 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

상호작용 측정용 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 다양한 생체 분자 （예컨대， 단백질， 핵산 등） 간의 상호작용을 소량의 시료를 이용하여 정확하고효율적으로관찰， 분석, 검출， 및/또는측정할수있다.

상기 단백질-단백질상호작용측정용장치는,

제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질을 포함하는멀티 웰을포함하는것일수있고，

여기에 더하여， 신호검출수단을추가로포함할수있다.

상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 （예컨대， 상기 제 1단백질이 관여하는세포또는조직의 생체 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는） 단백질 （제 2 단백질）을 추가로 포함할 수 있으며， 일 예에서， 상기 제 2 단백질은 검출 가능한 신호를 발생시키는표지 물질로표지되거나（표지 물질이， 예컨대， 화학적 （예컨대, 공유적 또는 비공유적）， 재조합적， 또는 물리적으로, 결합되거나）， 표지물질이 결합될 수 있는 1 ₃ 당이 부착된 형태일 수 있다. 또한, 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제 1 단백질의 수준으로 정상화 （ ₁₁ 이 ₁₁ 1 1 ₀₁₁ ）시키기 위하여， 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질 및 상기 탐지용 물질에 결합하는 표지용물질을추가로포함할수있다.

상기 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질은 앞서 설명한 멀티 웰에 포함된 제 1 단백질의 포획용 물질과 상이한 부위에서 제 1 단백질과 결합하는생물분자（예컨대， 항체）일수 있으며， 상기 표지용물질은검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되고 （표지 물질이， 예컨대， 화학적 （예컨대, 공유적 또는 비공유적으로 결합） _. 상기 제 1 단백질에 결합하는탐지용물질에 결합가능한생물 분자 （예컨대， 항체）일 수 있다 （도 6참조）.

제 1단백질이 ?^-11또는 1）-1인경우， 상기 단백질-단백질상호작용 측정용 장치는, 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질을포함하는반응부를포함하는것일 수 있고, 여기에 더하여 신호검출 수단을추가로포함할수있다.

상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 1）-［그과 ¥1）-1 간의 상호작용（결합） 여부및/또는정도를측정하는데사용될수있다.

제 1 단백질이 P^-ll 또는 므1）-1인 경우， 상기 반응부는 표면에 제 1 단백질포획용물질이 고정화된 기판을포함할수 있으며， 상기 제 1단백질 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

포획용 물질은 앞서 제 1 단백질이 고정화된 기판 준비 단계 부분에서 설명한 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질， 예컨대， 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. 예컨대, 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은, 앞서 설명한 바와 같이， 나과 ［）-1 간의 결합부위인 1）-1그의 -말단 부위를 제외한 비결합 부위 （예컨대， （：-말단 부위）에 결합하는 항 항체 또는 이의 항원결합단편, 간의 결합부위인 1의 말단부위를 제외한비결합부위 （예컨대, 0말단부위）에 결합하는 항 ?0-1 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. 상기 반응부는 웰 （예컨대， 멀티웰） 타입， 슬라이드 타입, 채널 타입， 어레이 형태, 미세유체칩， 미세관 （캐필러리） 등일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

제 1단백질이 p^-ll또는抑- 1인경우, 상기 단백질-단백질상호작용 측정용 장치는 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 제 2 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서， 상기 제 2 단백질은 검출 가능한 신호를ᄊ 발생시키는표지 물질로표지되거나（표지 물질이, 예컨대， 화학적 （예컨대, 공유적 또는 비공유적）, 재조합적, 또는 물리적으로， 결합되거나）, 표지물질이 결합될수있는 _3§ 이 부착된형태일수있다.

제 1단백질이 ?^-11또는抑- 1인 경우， 상기 제 1단백질은抑- 1그및 ?å）-1중에서 선택된 어느하나이고, 제 2단백질은다른하나이다. 예컨대， 제 1 단백질이 므1）-1그인 경우, 상기 제 2 단백질은 ?1）-1이며， 상기 제 1 단백질이抑- 1인경우, 상기 제 2단백질은 1）-1그이다.

상기 제 1단백질이, 四1?2 및 四 1«, 특히, 1世묘2 -四묘3헤테로다이머인 경우， 상기 분석 장치는, 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질 또는 제 1 단백질을 포함하는 반응부를 포함하거나， 여기에 더하여， 신호검출수단을추가로포함하는것일수있다.

일 예에서, 상기 제 1단백질은｝世요2 -四묘3헤테로다이머 , 또는 1世요2- 1世1?3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 （발현하는） 세포 또는 상기 세포의 용해물 형태로 사용될 수 있으며， 상기 반응부는 （1） ｝世묘2 -四요3 헤테로다이머， 또는 則及2 -四1?3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 （발현하는） 세포 또는 상기 세포의 용해물， 또는 （2） 이들이 고정화된 기판을 포함하는 것일 수 있다. 상기 四묘2 - 묘3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 （발현하는） 세포는 1世1¾ 및 抑요3를 발현하고, 하기의 설명되는 이합체화 제제 （예컨대， 他요3의 리간드 （예컨대 |31 （NRGbl） 등）， 콜레스테롤-유사 세정제 （Cholesterol-1 ike detergent ; 예컨대, DGTN（digi tonin； CAS Number : 11024-24-1） , GDN（glyco卜 diosgenin; CAS Number : 1402423-29-3） 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상）이 처리된 것일수 있으며， 예컨대， HER2및 HER3를발현하고， ■（¾；［이 처리된 세포로서， 임의로 DGTN 및 GDN로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 콜레스테롤-유사세정제로처리된세포또는세� �용해물일수있다.

상기 분석 장치는 HER2및 HER3, 특히, HER2-HER3헤테로다이머어와 이들의 신호전달경로상의 하위 단백질 간의 상호작용（결합） 여부 및/또는 정도, 또는 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 （예컨대， Tyr 잔기의 인산화 정도）를측정하는데사용될수있다.

상기 반응부는표면에 제 1단백질포획용물질이 고정화되거나， 상기 제 1 단백질이 포획용 물질을 통하거나 통하지 않고（직접적으로） 고정화된 기판을 포함할 수 있다. 상기 제 1 단백질은 HER2 및 HER3, 특히 , HER2- HER3헤테로다이머이며， 상기 제 1단백질포획용물질은앞서 제 1단백질이 고정화된 기판 준비 단계 부분에서 설명한 제 1 단백질 （HER2 및/또는 HER3）에 특이적으로 결합하는 물질， 예컨대, 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. 상기 반응부는 웰 （예컨대， 멀티웰） 타입, 슬라이드 타입， 채널 타입， 어레이 형태, 미세유체칩， 미세관 （캐필러리） 등일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

상기 분석 장치는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 장치일 수 있으며, 이를 위하여， 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 제 2 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 분석 장치는 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 （예컨대, Tyr 잔기의 인산화）를 측정하는 장치일 수 있으며， 이를 위하여 인산화된 Tyr에 특이적으로 결합하는 물질 （예컨대， 항체）를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서， 상기 제 2단백질또는인산화된 Tyr에 특이적으로결합하는물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 （표지 물질이, 예컨대, 화학적 （예컨대， 공유적 또는 비공유적）， 재조합적, 또는 물리적으로， 결합되거나）， 표지물질이 결합될수 있는 tag이 부착된 형태일 수있다.

일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰은 일면이 개방된 복수의 관을 포함하거나, 지지 플레이트에 이격 형성된 복수의 비관통형 홀 （예컨대， 지지 플레이트에 형성된 홈 형태）을 포함하는 구조로서, 상기 일면이 개방된 관 또는 비관통형 홀을 웰로 정의할 수 있으며， 상기 웰이 제 1 방향으로 2개 이상 배치관 일렬 구조가 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향으로 하나 존재하거나， 2개 이상 배치（격자구조）된 구조체를 의미할수 있다 （도 30 참조） . 이 때， 상기 멀티 웰은 상기 관 또는 비관통형 홀의 개방된 일면에 위치하는 시료 주입부, 상기 관 또는 비관통형 홀의 내부의 단백질-단백질 상호작용 （예컨대, 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 상호작용）이 일어나는 반응부， 및 상기 관또는비관통형 홀의 내부와접촉하는적어도 일부의 내벽의 표면에 제 1 단백질의 포획용 물질 （예컨대， 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질（예컨대, 항체））이 고정화되거나 고정화 가능한 제 1 단백질의 포획부（또는기판）를포함할수 있다. 일 구체예에서， 상기 멀티 웰은제 1 단백질과 제 2 단백질 간 상호작용이 일어나는 반응부 （제 1 단백질과 제 2 단백질의 반응부: 제 1반응부）를포함하는하나이상의 웰및 제 1단백질과 제 1단백질에 결합하는탐지용물질이 결합하는반응부 （제 1단백질 탐지부: 제 2 반응부）를 포함하는 하나 이상의 웰을 포함할 수 있다. 상기 제 1 단백질에 결합하는탐지용물질은앞서 설명한바와같다. 상기 제 1단백질 탐지부는시험 시료내의 제 1단백질수준을측정하여， 장치에 포함된신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제 1 단백질의 수준으로 정상화 （normal izat ion）하는데사용될수있다.

상기 신호검줄 수단은 사용된 표지 물질에서 발생시키는 신호에 따라서 통상적으로사용되는모든신호검출수단일 수 있다. 예컨대， 상기 신호검출수단은신호자극부및 신호검출부를포함할수 있으며， 여기에 더하여 측정된신호를분석 （예컨대， 정량또는영상화）하는신호분석부를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서， 신호 자극, 신호 검출， 및 신호 분석은 각각 다른 부위에서 수행되거나, 이들 중 적어도 두 가지 이상이 하나의 부위에서 동시에 또는 연속하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 표지가 형광물질인 경우， 상기 신호 검출 수단은 형광 신호를 발생 및 검줄할수 있는모든수단들중에서 선택될 수 있으며， 예컨대, 형광신호 자극부 （예컨대, 광원）, 및 형광신호검출부， 및/또는형광신호분석부를 포함할 수 있다. 일 구체예에서， 상기 신호 검출 수단은 전반사 형광 현미경（Total Internal Ref lect ion Fluorescence （TIRF） microscope） 또는 공초점 현미경 （광원 및 형광신호 검출용）을 포함하거나， 여기에 더하여, 형광카메라， 예컨대 EMCCD（Electron-mult iplying charge-coupled device） 카메라 또는 CMOS （Complementary metal oxide semi conductor） 카메라를 추가로포함하여, 광원공급및 형광신호의 영상화및/또는정량을수행할 수 있다. 상기 광원의 파장， 세기， 형광 카메라 측정 조건 （예컨대, 1 프레임당 노출시간, 레이저 파워， 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등）은 앞서 설명한바와같다.

상기 제 1 단백질, 기판, 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 제 2 단백질, 표지 물질, 상기 표지 물질에 따른 신호 검출 수단은 앞서 설명한바와같다.

본 명세서에서 제공되는 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 다양한 생체분자 （예컨대， 단백질， 핵산 등） 간의 상호작용 （예컨대， 단백질-단백질 상호작용 등）을 관찰， 분석， 검출 _, 및/또는 측정하는데 유용하게 적용될수있다.

따라서, 다른 예는 분석하고자 하는 생체분자 （예컨대， 제 1 단백질）를포함하는시료를상기 단백질-단백질 상호작용측정용장치 또는 상기 장치에 포함된 멀티 웰에 접촉시키는 단계를 포함하는 생체분자 간 상호작용 （예컨대， 단백질-단백질 상호작용） 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은, 상기 접촉시키는 단계 이후에， 시료에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때， 상기 신호는 생체분자 분석에 통상적으로사용되는모든신호들 （예컨대， 형광， 발광, 등）중에서 적절하게 선택될 수 있고， 상기 신호의 측정은 사용된 신호의 종류에 따라서 통상적으로사용되는모든방법들중에서 적절하게 선택하여 수행할 수 있다. 상기 생체분자는 생체로부터 분리된 단백질, 핵산， 세포등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대 단백질일 수 있다. 상기 생체분자가 단백질인 경우， 단백질-단백질 상호작용 분석에 사용되는 단백질-단백질상호작용측정용장치에 포함된 멀티 웰은표면에 분석 대상 단백질 중어느하나에 특이적으로결합하는분자（예컨대， 항체）가고정된 것일수있다.

다른 예에서， 앞서 설명한 바와 같은 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질을 포함하는 멀티 웰을 포함하는 단백질-단백질 상호작용 측정용 키트가 제공된다. 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 키트는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정용 키트, 제 1 단백질을표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 및/또는모니터링용 키트， 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하기 위한 키트, 및/또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 확인용 키트로서 적용가능하다.

본 명세서에 제공된 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 소량의 시료에서의 생체 분자 간 상호 작용도 정확하고 효율적으로 관찰， 분석， 검출, 및/또는 측정할 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서， 상기 멀티 웰 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대， needle biopsy) 시료와 같이 매우소량의 시료에 대해서도유용하고효과적으로적용될수있다. 다른예는 HER2와 HER3의 헤테로다이머 제조방법을제공한다. 상기 방법은， HER2와 HER3를 동시에 포함하거나 발현하는 세포에 이합체화 제제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이합체화 제제는, 앞서 설명한 바와 같이， HER3의 리간드 (예컨대， Neuregul in p i (NRGbl)； NP_039250, NP_039250.2 등)， 콜레스테롤-유사 세정제 (Cholesterol-l ike detergent； 예컨대, DGTNCdigi tonin； CAS Number : 11024-24-1)， GDN (glycol-diosgenin； CAS Number : 1402423-29-3 등) , 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 방법이 HER2와

HER3를 동시에 발현하는 세포에 NRGbl을 처리 (주입)하는 단계를 포함하는 경우, 상기 NRGbl는 HER2와 HER3를 발현 후 용해 (lysis) 전에 세포에 주입될수 있다. 다른구체예에서, HER2와 HER3를동시에 발현하는세포에 콜레스테롤-유사 세정제를 처라하는 단계를 포함하는 경우， 상기 콜레스테롤-유사 세정제는 세포 용해 후의 세척 단계에 처리 (첨가)될 수 있다 (일 예에서， 상기 세포는 NRGbl가 10ng/mL 내지 1000ng/mL 또는 50ng/mL내지 200ng/mL의 양으로주입된 것일 수 있음) . 이 때, 사용되는 콜레스테롤-유사 세정제의 농도는 사용되는 세정제의 CMCCcr i t ical mi cel lar concent rat ion) 를 초과하는 농도일 수 있으며, 예컨대, 세포 용해물 (cel l lysi s)을기준으로, DGTN의 경우 0.05%(w/v) 이상, 0.05%(w/v) 초과， 또는 0.06%(w/v) 이상， 예컨대， 0.05 내지 5%(w/v) , 0.05 내지 4%(w/v) , 0.05내지 3%(w/v) , 0.05내지 2%(w/v)또는 0.06내지 2%(w八 0일 수 있고， 의 경우 0.003%(w八) 이상， 0.003%(w八 0 이상, 0.007%(w八 0 이상， 또는 0.01%(w/v) 이상， 예컨대， 0.003 내지 2%(w/v) , 0.005 내지 2%(w/v) , 0.007내지 2%(w/v) , 또는 0.01내지 2%(w八)일수있다.

【발명의 효과】

본명세서에서 제공되는기술은세포내 및/또는세포간의 단백질- 단백질 상호작용을 측정함으로써， 상기 단백질이 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료에 있어서 효과적인 약물을 스크리닝 또는 선택하는데 유용하게 적용될수있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은단분자단백질상호작용측정방법에 관한모식도이다.

도 2는 기판에 고정된 표적단백질 （제 1 단백질） 확인 결과를 보여주는그래프이다 _.

도 3은 형광표지된 상호작용 단백질 （제 2 단백질） 주입 후 단백질 상호작용을나타낸형광이미지이다.

도 4는도 3에서 관측된 PPI comp lex의 개수를정량화한그래프이다. 도 5는 주입된 세포 용해액 양에 따른 PPI complex 개수 변화를 보여주는그래프이다.

도 6은 단분자 sandwi ch ELISA를 통하여 제 1 단백질을 정량하는 과정을보여주는모식도이다.

도 7은 단분자 sandwich ELISA 방법을 통하여 얻어진 특이도 （speci f i ci ty）결과를보여주는그래프이다.

도 8은세포주 종류 （빨간색① vs 하늘색③） 및 상태 （빨간색① vs 검은색②）에 따른 PPI complex개수의 변화를보여주는그래프이다.

도 9는세포의 상태에 따른다양한표적 RTK（제 1단백질） 별로 PPI complex개수변화를보여주는그래프이다.

도 10은 EGFR변이 상태에 따른 PPI complex의 변화및 이를토대로 세포당활성화된 EGFR의 비율계산한결과를보여주는그래프이다.

도 11은 도 10에서 EGFR에 대하여 수행한 방법을 HER2, HER3에 대해서 동일하게수행한결과를보여주는그래프이다.

도 12는각각의 세포주에 대해 EGFR, MET, HER2, HER3 （제 1단백질） 와 하위신호전달 단백질（제 2 단백질） 사이의 상호작용을 모두 측정하여 heatmap형식으로표시한결과를보여준다.

도 13은도 12의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프 （좌측 및 중간） 및 EGFR 표적항암제의 일종인 AZD9291의 반응성 결과를 보여주는 그래프（우측）이다.

도 14는 EGFR 표적 항암제（AZD9291）의 반응성 （좌측, y축）과 Act ivat ion score （좌측， x축） 사이의 상관관계 및 유전자 타입에 따른 표적 항암제 반응의 다양성 （우측）을보여주는그래프이다.

도 15는 유방암 세포주에서 HER2와 HER3 신호의 세기를 나타낸 heatmap이다.

도 16은 유방암 세포주에서 기존에 trastuzumab 항암제의 반응성을 예측하기 위해 사용되는 biomarker인 HER2 （상단）， HER3 （중간） 발현량을 측정한 결과 및 trastuzumab에 의해 세포 성장이 억제되는 정도 （하단）를 측정하여 나타낸그래프이다.

도 17은 HER2또는 HER3신호를이용하여 PPI score를측정한결과와 trastuzumab반응성 （logGI50）사이의 상관관계를보여주는그래프이다. 도 18은 PDTX마우스모델에서 측정한 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의 3종의 하위 신호 단백질과의 PPI complex 신호 결과를 각각 보여주는 heatmap이다.

도 19는 PDTX마우스모델에서 EGFR의 발현량（상단） 및상기 EGFR의 발현량을 이용하여 act ivat ion score를 계산한 결과 （하단）를 보여주는 그래프이다.

도 20은 PDTX 마우스 모델에 gef i t inib을 투여하여 종양크기의 변화를측정한결과를보여주는그래프이다.

도 21은 PDTX 마우스 모델에서 gef i t inib에 의한 종양크기 억제

（tumor growth inhibi t ion） 정도와 EGFR act ivat ion score 사이의 상관관계를보여주는그래프이다.

도 22는 PDTX 마우스 모델에서 gef i t inib을 처방하기 전， 후의 조직에서 각각 측정된 EGFR PPI complex 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

도 23a내지 23i는폐암 PDTX모델에서의 EGFR표적 저해제 반응성을 보여주는것으로，

23a는 PDTX모델생성 과정을예시적으로보여주는모삭도이고, 23b는 비히클또는표시된 EGFR-특이적 억제제 처리시의 PDTX에서의 종양부피 변화를 보여주는 그래프로서， 폐선암종 PDTXs （PDTX-A1 A3）에는 오시머티닙 （Osimert inib; 5 mg per 1 kg of weight dai ly）을 처리하고, 폐편평세포암（就 ICC） PDTXs （PDTX-S1 S5）에는 게피티닙 （gef i t inib; 50 mg per 1 kg of weight dai ly）을 처리하여 얻어진 종양크기 변화를 보여주며 （각 PDTX당시험 개체수는 3이상임），

23c는 표시된 수용체 타이로신 카이네이즈 （RTK; EGFR, HER2, HER3 및 MET）의 하위신호단백질에 대한 PPI complex counts （PPI complex의 수）를보여주는그래프이고， 23d는 8마리의 PDTX (A1-A3및 S1~S5) 개체에서의 EGFR발현수준을 A549 세포 (대조군)에서의 EGFR 발현 수준으로 normal i zat ion한 결과를 보여주는그래프이며，

23e및 23f는종양성장억제율 (%)을 y축으로하고， 폐선암종 PDTX 모델 (E) 및 SQCC PDTX 모델 (0로부터 얻어진 EGFR PPI 합계를 EGFR 수준으로나눈값을 x축으로하여 나타낸그래프이고，

23g는 gef i t inib을 15일 동안 매일 처리한 경우의 PPI complex counts (EGFR와 x축에 기재된 제 2 단백질 간 PPI complex의 수)의 변화를 보여주는그래프이며，

23h는 PDTX-Sl(n=2)에 gef i t inib과 BKM120을 15일간 병용 처리한 경우의 종양성장정도를단독처리시와비교하여 보여주는그래프이고,

23i는 8마리의 PDTX (A1-A3 및 S1-S5) 개체 모두에서 얻어진 EGFR 수준으로 PPI 합계를 나눈 값을 x축으로 하고 종양 성장 억제율 (%)를 y축으로하여 나타낸그래프이다 (Error bars： s.d. ) .

도 24a 내지 24d는 단분자 (single-molecule) co-IP 및 단분자 면역표지법 (singlenolecule immunolabel ing)을 .인간 종양 시료에 적용한 예를보여주는것으로，

24a는 두 종양 환자 (P1 및 P2)의 종양 절제 수술로 얻어진 인간 종양조직을보여주며，

24b는 단분자 면역표지법에 의하여 얻어진 1◦개 단백질의 발현량과

PTM 수준 ( Immunolabel 1 ing level ) 및 고효율 단분자 영상화 시스템을 사용하여 각 시료를 단분자 co-IP에 의하여 얻어진 10개의 단백질-단백질 쌍의 PPI 수준을 보여주는 그래프로서， 양성대조군으로서 PC9 세포 ( for EGFR) , HCC827세포 ( for MET) , 및 SKBR3세포 ( for HER2및 HER3)가각각 사용되었으며，

24c는 P1 및 P2에서의 표시된 RTK에 대한 PPI complex counts를 보여주는그래프이고，

24d는 표면 상에서 EGFR을 pul l ing down한후 PTPN1 처리한 경우의 PLC _g-a s _H2 및 Grb2의 PPI complex count 변화를보여주는그래프이다 (Error bars : s . d . ) .

도 25a내지 25h는 PDTX-model (n=3)의 특성을보여주는것으로，

25a내지 25c는 MET수준 (a) , HER2수준 (b) , 및 HER3수준 (c)을 HCC827세포 ( for MET) 및 SKBR3세포 ( for HER2및 HER3)에서의 MET, HER2, 및 HER3의 수준과비교한결과를보여주는그래프로서 (Error bars： s.d.； JT=5), 이들 RTK중어느것도과발현되지 않았음을확인할수있고，

25d는 대표적으로 5 마리의 SQCC PDTX에서 측정된 EGFR의 면역조직화학염색 (IHC) 결과를 보여주는 이미지이며, EGFR의 발현은 magnification rule로 EGFR H-score를계산하여산정하였고,

25e는 단분자 면역표지법에 의해 결정된 EGFR수준과 EGFR H-score 간의 상관 관계를 보여주는 산포도로서， IHC H-score는 단분자 면역표지법에 의해 결정된 전체 EGFR발현수준과완전한선형 상관관계를 나타내는것으로확인되었으며,

25f 및 25g은 SQCC 卵 TX의 EGFR 수준 (g) 및 PPI 합계 (h)와 종양 성장억제의 상관관계를보여주는산포도이고，

25h는 vehicle 또는 gefitinib 처리한 PDTX-S2의 Immunoblot 분석 결과를보여주는 것으로， 15일 gefitinib처리 후 EGFR의 1068번째 잔기인 티로신의 인산화 (pEGFR)가 완전히 사라지고, gefitinib 처리에 의하여 AKT 및 S6K의 인산화 (각각 pAkt와 pS6K)도 억제됨을보여주며， 이러한결과는 PDTX-S2에서의 종양 성장 억제 효과가 gefitinib 처리에 의한 EGFR/AKT/mT0R/S6K 신호전달 경로를 억제함으로써 얻어지는 것임을 보여준다.

도 26a 및 26b는 PDTX-S1및 PDTX-S2에서의 gefitinib 처리 효과를 보여주는것으로，

26a는 15일 동안 gefitinib 처리한 경우의 EGFR 수준 변화를 보여주는그래프이고 (Error bars: s.d.； TF5),

26b는 gefitinib 처리에 의한 EGFR PPI 억제 정도를 보여주는 그래프로， A549 세포의 EGFR PPI complex count를 음성대조군으로 나타내었다 (Error bars: s.d.； n=5) .

도 27a는 GFP-PD-1과 mcherry PD-L1을각각발현시킨 세포용해액을 이용하여 단백질을 획득, 단백질-단백질 상호작용 분석， 및 정량하는 과정을예시적으로보여주는모식도이다.

도 27b은 10nM의 GFP-卵 -1과 mcherry PD-L1을 사용하여 진행하여 얻어진 단백질-단백질 상호작용의 형광 이미지이고， 도 27c는 이를 정량한 결과 (PPI complex 개수; Fluorescence-count s； F-counts)를 보여주는 그래프이다.

도 28a는억제제후보약물스크리닝 과정을모식적으로보여준다. 도 28b는 약물 스크리닝을 위한 tube에서의 one-step react ion의 반응조건（반응시간）을최적화하기 위한시험 결과를보여주는그래프이다. 도 28c는 시판중인 두 종의 卵 -1/PD-L1 억제제인 BMS202 및 S7911 （이상， Sel leck Chem에서 구입）을 사용하여 얻어진 PD-1/PD-L1 간의 PPI complex개수（F-counts）를보여주는그래프이다.

도 28d는 PPI l ibrary screening （http:/八，. asinex.com/ppi/）에서 제공하는 non-macrocycl ic PPI drug l ibrary의 화합물을 사용하여 얻어진 卵 -1/PD-L1간의 PPI complex개수（F-counts）를보여주는그래프이다.

도 28e는상기 도 28d에서 우수한억제 효능을보이는것으로선별된 4종의 약물 （Bl, B2, B3, 및 E2）을 대상으로 t i trat ion을진행하여 얻어진 결과를보여주는그래프이다.

도 29은 다양한 항체를 기판에 고정시키고 GFP-PD-1과 mcherry PD- L1을 사용하여 진행하여 얻어진 抑- 1/PD-L1 간의 PPI complex 개수（F- counts）를나타낸그래프이다.

도 30a는기판에 GFP PD-L1을고정시킨 경우와, GFP-卵 -1을고정시킨 경우의 Total GFP- 1 abe 1 ed count （왼쪽） 및 형광 이미지 （오른쪽）를 보여준다.

도 30b는기판에 GFP PD-L1을고정시킨 경우와, GFP-PD-1을고정시킨 경우의 GFP PD-L1및 GFP抑- 1의 cluster rat io（%） （왼쪽） 및 형광이미지 （오른쪽）를보여준다.

도 31a는 에피토프 맵핑을 위한 PD-L1 mutant construct의 설계 과정을모식적으로보여준다.

도 31b는 PD-L1 ant ibody （9A11）의 PD-L1 WT （야생형）, d280, 또는 d270변이체에 대한결합정도를보여준다.

도 31c는卵 -1와 PD-L1 WT, d280, 또는 d270 변이체 간의 단백질- 단백질상호작용정도를보여준다.

도 32는 卵 -1와 PD-L1 간의 상호작용（결합） 부위를 모식적으로 보여준다.

도 33는약물 Bl, B2, B3, 및 E2의 구조를보여준다.

도 34a는 HER3-eGFP를 SKBR3에 발현한 뒤， NRGbl을 처리하여 HER2-

HER3-eGFP heterodimer를 형성시키는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.

도 34b는상기 세포추출물에 존재하는 HER3-eGFP의 양에 따라 HER2 - HER3-eGFP heterodimer의 양이 비례함을보여주는그래프이다.

도 34c는 NRGbl를 세포 용해 전에 처리한 경우와세포 용해 이후에 처리한경우에 검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을보여주는그래프이다. 도 34d는 SKBR3세포에 NRGbl을처리하여 세포내에 존재하는 HER2와 HER3의 heterodimer를 유도， 추출， 및 검출하는 과정을 예시적으로 보여주는모식도이다.

도 34e는기판에 첨가한세포추출물의 양에 따라검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을보여주는그래프이다.

도 34f는 34d의 과정을 따라 추출된 세포 추출물을 다른 종류의 항체를 이용해 기판에 부착했을 때， HER2-HER3 heterodimer가 주요하게 존재함을 보여주는 그래프이다 (리간드를 처리하지 않았을 때， EGFR-HER3, EGFR-HER2, HER2-HER3 heterodimer , 리간드를 처리했을 때， EGFR-HER3 heterodimer는리간드를처리했을때 HER2-HER3 heterodimer의 양에 비하여 매우적다)

도 34g는 HER2-eGFP를四 K293T세포에 과발현시켜 HER2-eGFP - HER2- eGFP homodimer 형성하고 기판 (PEG, neutravidin, biot in, 및 ant i -HER2 ant ibody를 표면처리된) 에 부착하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.

도 34h는 34g에서 기판에 부착된 HER2_eGFP - HER2-eGFP homodimer 또는 HER2-eGFP monomer로부터 나오는형광신호를측정한결과를보여준다. 도 34i는 34h에서 homodimer 또는 monomer로부터 얻은 형광신호에서 단분자 형광 신호 꺼짐 현상을 관찰해 2단계로 꺼짐 (dimer) , 과 2단계 이상으로 꺼짐 (ol igomer)의 비율을 나타내는 그래프이다. 2단계 및 2단계 이상의 비율이 HER2-eGFP의 경우가 eGFP또는 HER3_eGFP보다 많은 것을 알 수있다.

도 35a는 HER2-HER3 heterodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로보여주는모식도이다.

도 35b는 HER2-HER3 heterodimer가 고정화된 기판에 ATP와 ¾¾ ²⁺ 를 처리한 후 HER3 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER3 pTyr counts)를 측정한 결과를보여주는그래프이다.

도 35c 및 도 35d는 HER2-HER3 heterodimer 형성 세포 용해물을 다양한 농도의 digi tonin를 사용하여 세척하여 얻어진 HER3의 활성화 정도를 digi tonin 농도에 따른 HER3 Y1289의 인산화 정도로 보여주는 그래프이다.

도 35e는 HER2-HER3 heterodimer 형성 세포용해물의 세척에 사용된 detergent 종류에 따른 HER3의 활성화정도를 HER3 Y1289의 인산화정도를 통하여 보여주는그래프이다.

도 35f는 HER2-HER3 heterodimer가 기존에 EGFR homodimer에 의해 알려진 것과동일한활성화 메커니즘을 따른다는 것을보이기 위해 EGFR과 상응하는 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 시켰을 때, HER2-HER3 heterodimer의 활성화정도가감소하는것을보 ^' 여주는그래프이다.

도 35g는 HER2-HER2 homodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로보여주는모식도이다.

도 35h는 抑 R2-HER2 homodimer 가 고정화된 기판에 ATP와 당 ²⁺ 를 처리한 후 HER2 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER2 pTyr counts)를 측정한 결과를보여주는그래프이다.

도 35i는 HER2-HER2 homodimer 형성 세포 용해물의 세척에 사용된 detergent 종류에 따른 HER2의 활성화정도를 HER2 Y1196의 인산화 정도를 통하여 보여주는그래프이다.

도 36a는 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을보여주는모식도이다.

도 36b는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는그래프이다.

도 36c는 하나의 HER2-HER3，heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일분자꺼짐 현상의 개수로보여주는그래프이다.

도 36d는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는그래프이다.

도 36e는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일분자꺼짐 현상의 개수로보여주는그래프이다.

도 36f는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85 alpha - pi 10 alpha complex)과 상호작용하는지를형광신호의 크기로보여주는그래프이다 .

도 36g는기판에 부착된 HER2 homodimer가인산화과정을거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는모식도이다.

도 36h는하나의 HER2 homodimer에 얼마나많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는 그래프이다.

도 36i은하나의 HER2 homodimer에 얼마나많은양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로보여주는그래프이다.

도 36j은하나의 HER2 homodimer에 얼마나많은양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는 그래프이다.

도 36k은하나의 HER2 homodimer에 얼마나많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로보여주는그래프이다.

도 37a는 HER2-HER3 heterodimer에 ATP 와 Mg2 + 처리시의 HER3 Tyr 잔기의 인산화 속도를 보여주는 그래프이다 (x축은 인산화에 걸린 시간， y축은해당시간동안인산화된 Tyr의 양) .

도 37b는 HER2-HER3 heterodimer에 ATP 처리 농도를 증가시키면서

HER3 Tyr잔기의 인산화속도를측정하여 나타낸그래프이다.

도 37c는 HER2-HER2 homodimer를 사용하여 ATP 처리 농도를 증가시키면서 HER2 Tyr잔기의 인산화속도를측정하여 나타낸그래프이다. 도 37d는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 여러 농도의 Lapat inib을선처리 한뒤, ATP와 magnesium chlor ide를후처리하여 얻어진

HER2의 활성화정도를 Lapat inib농도에 따라사나타낸그래프이다.

도 37e는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 Lapat inib, ATP, 및 magnesium chlor ide를 동시에 처라하여 얻어진 HER2의 활성화 정도를 Lapat inib농도에 따라서 나타낸그래프이다.

도 37f는 HER2-HER3 heterodimer 에 Lapat inib, ATP, 및 magnesium chlor ide를 다양한 농도의 PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase, Non receptor type 1)과 함께 처리하여 얻어진 HER3 Y1289 인산화 수준을 Lapat inib농도에 따라서 나타낸그래프이다. 도 38은 single-molecule co-IP및 single-molecule immunolabel ing의 인간종양표본에 대한적용결과를보여주는그래프이다. 도 39a~39g는 Grb2와 mutant EGFR 간의 SH3 도메인-매개 상호작용 (pTyr- independent manner)을 보여준다 ((a) Suppression of EGFR_Grb2 interaction by gef itinib (100 nM for 24 h) treatment during cell culture. Osimertinib (same dose as gefitinib) was treated to H1975 for further suppression of EGFR_Grb2 interaction due to the presence of gatekeeper mutation, T790M , in H1975 cell (b-g) Single-molecule immunolabel ing assay profiling the change in components of EGFR- associated proteins depending on the presence of phosphatase inhibitor during cell lysis or EGFR-TKI treatment during cell culture. After EGFR immunoprecipitat ion, HSP90 a (b) , MIG6 (c) , GAPDH (d) , Shcl (e) , EGFR (f ) or c-Cbl (g) antibody was used as the detection antibody, respectively. Inset in Fig. 40g shows the immunolabel ing count for Cbl-b. The inset x_ and y-axis are the same as for Fig. 40g. The amounts of cell extracts used are shown at bottom. Error bars in Fig. 40 show s.d. )

【발명의 실시를위한형태】

본 발명을 하기 실시예를 들아 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가하기 실시예로한정되는의도는아니다.

실시예 1： 제 1단백질 (EGFR, MET, HER2,및 HER3)준비

제 1 단백질로서 EGFR, MET, HER2, 및 HER3를 선정하였으며， 이를 포함하는세포주 (예컨대, 암세포주)또는암세포조직을용해하여 얻어진 용해물 (lysate)로부터 상기 제 1 단백질을 얻었다. 본과정을 보다상세히 설명하면다음과같다:

1.1.세포용해물준비

1.1.1.세포주준비

세포주를배지 (RPMI 1640, high glucose (Thermo 11965-092))에 2 x

10 ⁶ cel Is의 양으로 분주하여 배양하였다. 100-pi culture dish에서 90% conf luency이상일 때 상기 세포주를수집하여 2개의 1.5 ml 튜브에 나누어 넣었다. 상기 튜브를 원심분리 (5 min x 15,000g) 하여 배양 배지를 제거한후세포만남기고 - 80 ^° C에 얼려서 보관하였다.

준비된세포주를아래의 표 1에 정리하였다: [표 1]

1.1.2.세포용해물준비

50 mM Tris-HCl (pH 7.4), l%(v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10%(v/v) glycerol , protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) 100X, 및 tyrosine phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, P5726) 100) (의 조성을갖는세포용해 버퍼를준비하였다.

상기 실시예 1.1.1에서 준비된 세포주 시료를 피펫팅하여 뭉쳐있는 세포들을피펫으로풀어주었다. 상기 피펫팅한세포주시료에 상기 준비된 세포용해 버퍼를각튜브당 200ul의 양으로넣고ᄂ얼음위에 올려진 cold block (0-4 ^° C)에 보관하면서 총 30분 반응시켰다. 이 때 10분 간격으로 주기적인 피펫팅을 통해 물리적으로 섞는 과정을 반복하여 계면활성제에 의한세포용해 반응이 활발하게 일어나도록하였다.

상기한 바와 같이 30분 반응 후, 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g, 4°C ) . 그 후, 가라 앉은 부분 (pel let)은 버리고， 상청액 (supernatant )만을 취하여 0.2um 크기 기공을 갖는 멤브레인을 사용하여 여과시켜 상기 멤브레인을 통과한 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담아， 다음시험에사용시까지 보관하였다.

전체단백질 계량법 (Bradford, BCA, DC protein assay 등)을 이용하여 상기 반응 결과물내의 전체 단백질 농도를측정한결과， 단백질 농도가약 5-10 mg/ml 정도로측정되었다.

1.2.조직용해액준비

1.2.1. 환자유래종양이종이식모델준비

폐편평세포암 (Lung squamous cel l carcinoma； SQCC) 환자 유래의 tumor xenograft를 연세대학교 연구팀으로부터 입수하였다. Pat ient- der ived tumor xenograft (PDTXs) 제작과정을간략히 살피면 다음과같다: 6 내지 8주령의 암컷 중증 복합 면역 결핍증 마우스 (severe combined immunodef icient mice； NOG) 및 누드 마우스 (nu/nu mi ce； Or ientBio)를 준비하였다. 모든 동물 시험은 Inst i tut ional Animal Care and Use Commi ttee (IACUC)에 의하여 승인된 가이드라인에 따라서 수행하였다. 환자에서 _유래한 임상종양 샘플을 3mm이하의 크기의 절편으로 절단한후 상기 준비된 N0G 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 종양 크기는 캘리퍼스로주 2회 측정하여 피하조직에서의 성장률을측정하였다. 종양 크기가직경 1.5 cm정도가되면, 종양조직을 적출하고작은 절편 (한면 길이가 약 5mm인 육각형)으로 절단하였다. 그 후， 절단된 조직을 다른 마우스에 재이식하여 연속적으로 subsequent tumor를 포함하는 개체들을 얻었다. 이렇게 얻어진 환자-유래 종양을갖는마우스를 라고명명하고， 이로부터 연속적으로 유래된 subsequent tumor를 갖는 마우스들을 일련번호를 붙여서 FI, F2, F3, F4 등으로 칭하였다. 3세대 subsequent tumor를 갖는 마우스 (F3)에 비히클 (PBS) 또는 게피티닙 Xgef i t inib)를 투여하여 시험에 사용하였다. 상기 준비된 PDTXs에 50 mg/kg의 게피티닙 또는 비히클을 하루 한 번 복강내 (intraper i toneal) 투여하였다. 게피티닙 투여로부터 15일 후 PDTX로부터 종양 조직을 수거하여 하기하는 PPI 및 발현수준변화모니터링에사용하였다. 1.2.2.조직용해액준비

상기 실시예 1.2.1.에서 얻어진 종양조직을 20 mm ³ 정도 양으로 준비하였으나, 이보다큰경우라도무방하다.

상기 준비된종양조직 20 mm ³ 당 앞서 실시예 1.1.2에서 준비된 용해 버퍼를 약 300 uL 정도 첨가하고， 4°C 냉장고에서 1시간 동안 계속 회전시키며 반응시켰다. 이 때， 수술용 가위를 이용하여 조직의 크기를 최대한 잘게 만들어， 단위 부피 당 표면적을 넓게 하여， 용해 버퍼 내의 계면활성제에 의한화학반응이 최대한효율적으로 일어날수 있도록하였다. 상기한 바와 같이 1시간 반응 후， 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g， 4°C ) . 그 후， 가라 앉은 부분 (pel let)은 버리고, 상청액 (supernatant )만을 취하여 0.2um 크기 기공을 갖는 멤브레인을 사용하여 여과시켜 상기 멤브레인을 통과한 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담아， 다음시험에 사용시까지 보관하였다.

전체단백질 계량법 (Bradford, BCA, DC protein assay 등)을 이용하여 상기 반응 결과물내의 전체 단백질 농도를측정한 결과， 단백질 농도가약 5-10 mg/ml 정도로측정되었다.

실시예 2： 제 2단백질준비

본 실시예에서는 상기 실시예 ₁ 에서 준비된 제 ₁ 단백질의 하위신호전달 단백질에 형광 단백질이 부착된 형태의 제 2 단백질의 준비 과정이 예시된다.

본실시예에서 예시되는제 2단백질을아래의 표 2에 정리하였다: ［표到

단백질의 발현이 적은세포주인 HEK293세포 (ATCC)및 HeLa세포 (ATCC)를 준비하였다.

상기 표 2에 기재된 제 2단백질각각에 대한발현벡터를상기 준비된 HEK293 세포 또는 HeLa 세포에 주입하고 배양하여， 제 2 단백질을 발현시켰다. 24시간배양후세포를수집한후,적절한양으로분 배하여 - 80 ^° C에 보관하였다.

상기 세포에 용해액 ((50 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 1% Triton X-100, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 10% glycerol , protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) 100X, tyrosine phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, P5726) 100X))을 넣어 주었다. 높은 농도의 계면활성제 (Triton X-100)는 단백질상호작용을방해할수있으므로,우선 5x10 ^s cel Is에 대하여 60 uL의 용해액을투입하였다.

파이펫팅을 통해 뭉쳐있는 상기 얻어진 반응 혼합물 내의 세포를 모두풀어준후， 이를 얼음위에 올려진 cold block (0-4 °C)에 보관하면서 총 30분 반응시켰다. 이 때 10분 간격으로 주기적인 파이펫팅을 통해 물리적으로섞는과정을수행하여 계면활성제에 의한용해 반응이 활발하게 일어나도록하였다.

30분 반응 후, 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g, 4°C). 가라 앉은 부분은 버리고 (pellet), 상층액만 (supernatant)실험을 위해 새로운튜브에 옮겨 담았다.

상기 얻어진 수용액 60 를 취하여 140 uL의 PBS에 첨가해주었다. 이렇게 되면 최종적으로 0.3% Triton X-100이 포함된 제 2단백질의 용해액을 얻을 수 있다. Fluoremeter를 이용하여 제 2단백질에 부착된 형광단백질의 농도를 측정하였다. 그 결과 사용된 3종의 제 2 단백질의 농도가대략 400내지 1000nM범위 내로측정되었다.

실시예 3： 기판의준비

Coverslip을 R0H 1M 용액에 침지시킨 후, sonicator에 담아서 세척하였다 (20-30 min). 그 후， 3차 증류수로 잘 씻은 후， piranha solution (황산:과산화수소 = 2:1 - 3:1 (v八 0)을 이용하여 세척하였다. 세척한 covers 1 ip 표면에 대하여 aminopropylsi lane와 PEG를 차례로 처리하여 코팅을수행하였다.

2시간 반응후， 3차증류수로 세척한뒤 PEG코팅된 면이 접촉되지 않게 하여 -20 ^° C에서사용시까지 보관하였다.

동시에 석영 재질의 channel 형태의 기판또는 아크릴 재질의 well 형태의 기판을 준비하였다. 석영 재질의 기판의 경우， 앞서 설명한 cover si ip처리 과정을참조로세척 및 PEG코팅 과정을수행하였다.

아크릴 재질의 기판의 경우， 제작 후 3차 증류수에 침지시킨 후 sonication하여 세척하였다. 세척된 아크릴 재질의 기판을 5% BSA용액에 침지시키고 2시간 반응시켜 비특이적 단백질 흡착 (nonspecific protein adsorption)을방지하고, -20C에서사용시까지 보관하였다.

하기 시험에서는 상기 준비된 covers lip과 아크릴 재질의 기판을 사용하였으며,시험 전에 상기 coverslip과아크릴 재질의 기판을해동하여 조립하거나， PEG 코팅이 끝난 뒤 미리 조립하고, 조립된 형태로 -20C에 보관하여사용전에 해동하여사용하였다.

실시예 4： 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용 이미징

상기 준비된 기판에 Avidin 계열의 단백질인 Neutravidin (Thermo , A2666)을 0.1 mg/ml 농도로 투입하였다. 상온에서 5분 반응 시킨 후 PBS buffer 30 ul를이용하여 2회 기판을세척하였다.

상기 준비된 기판에 표적이 되는 제 1단백질에 대한 항체를 투입하였다. 이 때， 사용되는 항체는 biotin이 접합된 형태인 것으로 준비하였다. 항체의 농도는항체-항원의 affinity (dissociation constant , KD)에 따라 적절히 조절될 수 있으며， 본 실험예에서는 2 ug/ml 정도로 사용하였으며, 반응시간은 5분 정도로 하였다. 만약 Biotin이 접합되어 있지 않은 항체를 사용하는 경우에는 이차 항체를 이용하여 제 1단백질의 항체를부착할수있다.

이 때사용된제 1단백질에 대한항체를다음의 표 3에 정리하였다:

[표 3]

상기 항체가 처리된 기판을 PBS buf fer 30 ul를 이용하여 2회 세척하였다. 상기 준비된 기판에 앞서 실시예 1에서 준비한제 1단백잘을 포함하고 있는 세포 용해액 또는 조직용해액을 투입하였다. 항원-항체 반응의 경우 15분까지는 계속증가할수 있고 15분을초과하면서 시간대비 항원-항체 반응 효율이 낮아질 수 있어서， 반응시간을 15분 정도로 설정하였다.

반응 후, 기판을 PBS에 tween 20이 0.05%(v/v) 포함된 버퍼를 이용하여 세척하였다. Tween 20 0.05%는 nonspeci f ic binding을 줄여주는 동시에， 막단백질의 hydrophobi c region이 망가지지 않도록도와준다.

그 후, 상기 기판에 실시예 2에서 얻어진 제 2단백질 용해액을 투입하였다. 사용된 제 1단백질 용해액 내 제 2단백질의 농도는형광단백질 기준으로 1-50 nM사이의 값 (약 30nM)으로하였다. 제 2단백질농도가 100 nM 이상이 되면 형광현미경에서 background noi se가 커지게 되어 정확한 형광신호를측정하는데방해가된다.

형광현미경에 기판을고정시키고이미징하여， 각각의 제 1단백질/제 2 단백질에 대한데이터를얻었다.

실시예 5: 단백질복합체 (PPI complex)분석

Mat 1 ab프로그램 (MathWorks 제공)에서 제공되는 toolki t에 기반하여 단백질복합체를분석하였다.

상기 실시예 4에서 얻어진 형광미지는 16bit unsigned integer 형식으로 저장하였다. 형광 신호는 eGFP (enhanced green f luorescent protein)로부터 얻었으며， 상기 신호를 관측하기 위하여 레이저의 파장을 488nm로 하였고， eGFP의 발광시간을 11초 정도 유지시키기 위하여 레이저 파워를 2mW로 조절하여 사용하였다. 전체 프레임 (30 프레임) 중， 초반 프레임을 버리고, 프레임의 이미지를 평균하여 하나의 이미지를 생성하였으며, 이와 같은 과정을 wel l 안에서 위치를 옮겨가며 반복 수행하여 총 5개의 이미지를 획득하여 아래 과정을 수행하였다. 초반 프레임을 버리는 이유는， 아무것도 없는 기판의 표면에서 발생하는 불필요한 신호 (autof luorescence)가 사라지고， eGFP 신호가 유지되는 구간을 선별하여 사용하기 위함이다. 이와 같이 선별되는 구간은 이미징 조건/장비구축 상태에 따라서 달라질 수 있다. 본 실시예에서는 EMCCD (Electron-mult iplying charge-coupled devi ce； Andor iXon Ul tra 897 EX2 (DU-897U-CS0-EXF)) 카메라를사용하여 1프레임당노출시간을 0.1초로하고， EMCCD gain값은 40으로하여 형광이미지를얻었다.

노이즈를 제거하기 위해， 각 프레임 마다 아래와 같은 절차를 수행하였다:

(a) 최초시작은왼쪽상단에서 시작한다. 1프레임은 512x512개의 픽셀로구성되어 있다. 기준픽셀을기준으로오른쪽으로 11개， 아래쪽으로

11개인 11x11개의 픽셀에서 medi an 값을 구하고， 이 medi an 값을 기준 픽셀의 수치에서 빼주었다 [(Intensi ty_pixel )_

(medi anIntensi ty_llxllneighborhood)] . 512x512의 모든 픽셀에 대해서 위 절차를 수행하였다. Medi an f i lter ing을 통해서 pepper & salt noi se를 제거하였다.

(b) 위의 처리된 이미지에서 s i gma=0.7 , si ze=5x5의 Gaussian smoothing을수행하여, 이미지를부드럽게만들어 주었다.

(c) Threshold를 설정하였다. Threshold는 전체 이미지에서 pixel intensi ty가 threshold 이하가 되는 pixel의 값을 threshold 값으로 모두 만들어 준다 (Mat l ab toolki t에서 local maximum을 찾는 알고리즘을 사용함) . 이를 통해 이미지에서 형광신호에 의해서 만들어지지 않은 국소 극대값 ( local maximum)을 제거할수 있다. 본실시예의 이미징 조건에서 사용되는 threshold값은 70이다.

형광단백질로부터 나오는 신호는 특정 위치에 모여있는 형태 ( local i zed point spread funct ion (PSF))로 발생하는데， 이 PSF 개수 (물리적인 값)를 측정하고자 하는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 PPI complex숫자 (생물학적인 값)이다. 상기 PSF 값은 아래와 같은 과정을 거쳐서 생물학적인값인 PPI complex값으로전환시켰다:

(a) Local maximum의 위치를구하였다 (예를들어, i번째 row, j번째 column pixel ) . 앞서 기술한바와같이， 단분자형광신호는 512x512픽셀 중에서 특정 위치 (현재 관측장비 하에서 대략 5x5픽셀사이즈, 1 pixel = 0.167 마이크로미터)에 모여 형성되므로, local maximum을 찾으면 개별 PSF를선별할수 있다. 이는 Mat lab에서 제공되는 toolki t을이용하여 구할 수있다.

(b) 상기 (a)에서 구한 local maximum이 실제 PSF로부터 발생한 것인지에 대한 판별과정을 거친다. 우선 local maximum의 최소값 (minimum intens i ty value)을 정의하고, 상기 얻어진 local maximum 중에서 이 최소값보다큰경우만분석에 사용하였다. 본실시예에서 사용된 최소값은 2019/132517 1»（：1/10公018/016675

75이고, 이 값은 레이저 파워/노출시간/장비구축 상황에 따라서 달라질 수 있다. 최종적으로 얻어진 local maximum 좌표를 중심으로 5x5 픽셀의 정보를 불러온 후, 이 5x5 픽셀에서 밝기에 대한 중심을 구하였다 (centroid of intensi ty) . 이 때, 구해진 밝기 중심이 기존 local maximum 좌표에 대하여 0.5 pixel 이상 벗어나게 되면 (PSF모양에 대한 2D 대칭이 사라지면)， 정상적이지 않은형광신호라고판단하고분석에서 제외시켰다.

(c) 모든 조건을 통과한 PSF 만 최종적으로 선별하여 좌표와 전체 개수를 구하였다. 이 때 얻어진 PSF 전체 개수가 PPI comp lex의 개수가 된다 i

같은 조건하에서 촬영된 모든 파일에 대하여 상기 과정을 수행하여

PSF개수를구한후， 이를 취합하여 평균과표준편차를 구하였다. 이 값이 최종적으로 특정 조건에서 PPI complex의 개수를 나타내는 값이 된다 (도면중에 "Number of single PPI complexes"로표시됨) .

실시예 6： PPI 세기, PPI 스코어 (PPI score) , 및 활성화 스코어 (Act ivat ion score)의 결정

세포 용해물 (실시예 1.1.2 참조)의 농도를 x축으로 하고， 각 세포 용해물에서 측정된 PPI complex 값 (실시예 5 참조)을 축으로 하여 얻어진 그래프의 기울기， 즉， ［(PPI complex)/ (세포용해액 단위 농도 ( Wml ) 당 PPI complex 개수)］를 상기 세포에서의 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 PPI 세기 (또는 PPI slope)로 정의하였다. 각 세포주 별로 얻어진 모든 PPI 세기를합하여 PPI 세기 총합을구하였으며， 이 값을그세포주에 대한 PPI 스코어 (PPI score)로 정의하였다. 상기 PPI 세기 총합 (또는 PPI 스코어)은 각 세포주의 세포용해물 단위 농도에서의 시험된 제 1 단백질과 저 12단백질의 총 PPI 정도를나타낸다.

상기 PPI세기 총합을구하는방법을수식으로표현하면다음과 같다:

(제 1 단백질: RTK (폐암의 경우， EGFR, MET, HER2 , 또는 HER3； 유방암의 경우 HER2및 HER3) ;

제 2단백질: downstream protein (PLC-ga_a_SH2 , Grb2 , p85_alpha) ) . 또한， 세포주들 간 상대적인 PPI 스코어를 나타내기 위하여, 특정 세포주 （이하， '기준 세포라 칭함;본 시험예에서， 폐암세포주중에서는 PC9세포를， 유방암 세포주 중에서는 SKBR3세포를 각각 사용함）의 PPI 스코어가 1이 되도록 다른 세포（상기 기준 세포를 제외한 세포로서, 이하 '시험 세포’라 칭함）에서 얻어진 PPI 스코어들을 normalization하였으며， 이 때 각각의 세포주에 대하여 얻어진 값을 그 세포주에 대한 normalized PPI스코어로정의하였다.

또한,각세포용해물내의 제 1단백질 （예컨대， RTK（폐암의 경우, EGFR, MET, HER2, 또는 HER3； 유방암의 경우 HER2 및 四 R3）의 총량을 측정하였다. 상기 제 1단백질의 총량은 앞서 기재한 각각의 항체 （표 3 참조）를 사용하는 Sandwich ELISA 또는 quantitative western blot 등을 통하여 정량한 후， 세포 용해물의 중량 （세포 용해물 내의 총 단백질 중량）으로나눈값으로정하였다.

상기 얻어진 PPI스코어 또는 normalized PPI스코어를제 1단백질의 총량으로 나누어 얻어진 값을 활성화 스코어 （activation score）로 정의하였다. 이 때， 세포주들 간 상대적인 활성화 스코어를 나타내기 위하여， 기준세포（폐암세포주: PC9세포,유방암세포주: SKBR3세포）의 활성화 스코어가 1이 되도록 시험 세포에서 얻어진 활성화 스코어들을 normalization하였으며， 이 때 각각의 세포주에 대하여 얻어진 값을 그 세포주에 대한 normalized활성화스코어로정의하였다.

PDTX （patient -derived tumor xenogrft） 마우스 모델에서 PPI 스코어를 구하는 경우,상기 방법으로 얻어진 값에서 negative background 값을측정하여 이를공제하여 background noise를줄일 수있다. 이 경우, negative backgromid는 동일 환자의 정상조직 또는 시험 단백질 （예컨대, EGFR）이 정상인 암세포 용해물을 사용할 수 있다. 일 예로 EGFR유전자가 정상상태인 A549세포에서 EGFR과각하위 단백질 사이의 상호작용 정도를 측정하여 PPI 스코어를 구한다. 이를 negative background로 설정하여 각 PDTX마우스모델에서 얻어진 PPI 스코어에서 negative background를빼서 최종 PPI스코어를산출한다.

실시예 7 : Heatmap작성

Data를 실시예 5에서 수치화한 것에 더하여， 이의 분석에 보충적 판단을추가하기 위하여 Heatmap을작성하였다. Heatmap는 data를보여주는 한방법일뿐이며, data해석을특별히 제한하기 위한것은아니다.

X축과 Y축 중， 한쪽 축은 제 2단백질 （하위신호 단백질）로 하고， 다른 축은 세포 종류로 하여 3x16（제 2 단백질 개수 （총 3개: 표 2 참조（p85_alpha， Grb2, PLC-ga_a_SH2）） x 세포주 개수（종 15개 （폐암 세포주） 또는 총 11개 （유방암 세포주）: 표 1 참조））의 격자체를 만들었으며, 이러한 격자체는 제 1 단백질 별로 총 4개 （EGFR, MET, HER2, 및 HER3； 폐암）， 또는 총 2개 （HER2 및 HER3； 유방암）를 만들었다 （단， HER3의 경우 제 2단백질로서 p85-alpha만사용함）. 그후, 해당세포에서 얻어진 제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 PPI 세기에 따라서 색과 밝기를 변화시키며 Heatmap을 작성하였다 （예컨대, PPI 세기가높아질수록 어둡고 검은색에서 중간밝기의 붉은색 , 밝은녹색 순서로표시될수 있는데， 이는 각시험마다시험자가정하는값으로정해진 값은아니다）. 어떠한세포를 기준으로삼더라도세포주사이의 상대적인차이는변하지 않는다.

실시예 8： 약물 반응성과, PPI 스코어 및 활성화 스코어 간의 상관관계

상기 실시예 1내지 7에 기재된방법으로시험한결과를도면을들어 아래에 설명하였다:

도 1은 단분자 단백질 상호작용 측정방법에 관한 모식도이다. 좌측은 PolyeUiylene glycol 이 코팅된 기판에 Neutravidin, RTK 항체, 및 분석하고자 하는 세포 용해액 또는 조직 용해액을 순서대로 주입한 후, 세척하는 방법을 모식적으로 보여주고, 중간은 이를 통해 표적 RTK 단백질을 기판에 고정하는 모습을 보여주며. 우측은 기판에 형광표지된 상호작용 단백질을 주입하여 형광신호를 관측 및 계량하여 단분자 단백질 상호작용정도를측정하는모습을보여준다.

도 2는 기판에 고정된 표적단백질 （제 1 단백질） 확인 결과를 보여주는그래프이다. 실시예 4및 5에 기재된 방법을참조하여 시험하였다. EGF은 100ng八 il의 양으로 3분간 처리하였으며, 도 2의 왼쪽 그래프는

H1666을사용하고 EGFR의 extracel lul ar domain에 결합하는 ant ibody（MAS- 13266, Themof i sher）를 통해 기판에 부착하고, EGFR의 intracel lular domain （#4267, Cel l signal ing technology） 대한 ant ibody를 넣어 부착 확인한 결과이고， 도 2의 가운데 그래프는 EGFR이 HER2와 dimer를 형성하는지 여부를 HER2의 ant ibody를 넣어서 확인한 결과이고, 도 2의 오른쪽그래프는 EGFR이 Shcl과 dimer를 형성하는지 여부를 Shcl의 항체를 넣어서 확인한결과를보여준다.

기판의 항체 주입 여부에 따라 표적 RTK 단백질 （제 1 단백질）이 고정되거나 （+로 표시）, 고정되지 않게 된다 （-로 표시）. 이를 통해 적절한 항체 선별을 거쳐 다양한 표적단백질을 기판에 부착할 수 있다. 또한 EGFR-HER2나 EGFR-Shcl의 경우와 같이 단일 표적 단백질뿐만 아니라 생체 내 존재하던 단백질 결합체 형태로도기판에 고정할수 있음을확인할 수있다.

도 3은 제 1 단백질이 고정화된 기판에 형광표지된 상호작용 단백질 （제 2 단백질） 주입 후 단백질 상호작용을 나타낸 이미지이다. 실시예 5에서 설명한방법으로관즉된 PPI complex는 Point spread funct ion（PSF） 형태로나타나며， 컴퓨터 알고리즘을통해 PPI complex를선별하였다. 하위 신호전달단백질이 주입된상태에서만형광신호가발생하는것을볼 수 있다. 초록색원형은관찰된 PPI complex를나타낸것이다.

도 4는도 3에서 관측된 PPI comp lex의 개수를정량화한그래프이다. 하위 신호전달 단백질（제 2 단백질）이 주입된 경우 （x축에서 PLCgammaSH2, Grb2, 및 p85-alpha로 표시）에만 선택적으로 높은 PPI complex가 관측된 것을 확인할수 있다. 반면 표적 RTK단백질 （제 1 단백질 （EGFR）의 항체가 없거나 （검은 막대）, 주입된 하위 신호전달단백질이 없는 경우 （x축의 buf fer）에는 관측되는 신호가 매우 작은 것을 볼 수 있다. 두 경우에도 관즉되는것은 background noi se로해석할수있다.

도 5는 주입된 세포용해액 양에 따른 PPI complex 개수 증가를· 보여주는 그래프이다. 표적 RTK 단백질 （제 1 단백질: EGFR）을 포함하는 세포 용해액의 양이 증가함에 따라 축）, 관측되는 PPI complex 의 양 （y축）도 선형적으로 증가함을 볼 수 있다. 이를 통해 특정 세포 용해액의 양에서 시료간의 PPI comp lex의 정량적 비교가가능하다.

도 6은 단분자 sandwich ELISA를 통하여 제 1 단백질을 정량하는 과정을 보여주는 모식도이다. 기판의 표면에 표적 RTK 단백질（제 1 단백질）을부착하는 과정은 도 1과동일하다. 형광표지된 하위 신호단백질 （제 2단백질） 대신， 표적 RTK단백질을인식하는제 2항체를주입하여 표적 RTK단백질의 양을 측정할 수 있다. 이 때 사용되는 제 2 항체 （detect ion ant ibody）는표적 RTK단백질을기판의 표면에 고정시키기 위해 사용된 제 1 항체 （pul l down ant ibody）와 표적 RTK 단백질 상에서 서로 다른 항체인식부위 （epi tope）를 가지고 있어야 한다. 제 2 항체를 인식하는 형광표지된 항체 （labeled ant i body）를 통해 기판의 표면에 고정된 RTK 단백질의 양을단분자기법（실시예 5참조）을통해측정할수있다. 도 7은 단분자 sandwich ELISA 방법을 통하여 얻어진 특이도 （speci f ici ty） 결과를 보여주는그래프이다. 도 6의 모식도에 나타난구성 요소중에서 하나의 구성요소만빠져도단분자 sandwich ELISA신호결과가 억제됨을볼수있다.

도 8은 세포주 종류 （빨간색① vs 하늘색③） 및 상태 （빨간색① vs 검은색②）에 따른 PPI complex개수의 변화를보여주는그래프이다. 세포에 존재하는 표적 RTK 단백질（제 1 단백질; EGFR）이 해당 리간드에 의해 활성화되었을 때 （EGF+）, 그렇지 않은 경우와 비교하여， 동일 주입량에서 높은 PPI complex가 관측됨을 볼 수 있다. 또한 표적 RTK에 활성변이가 존재하면 （PC9, 하늘색）， 관측되는 표적 RTK의 PPI complex 개수가 증가함을확인할수있다.

도 9는 세포의 상태에 따른 다양한 표적 RTK （제 1 단백질） 별로 시료의 단위농도 당 PPI complex 개수 변화（PPI slope）를 보여주는 그래프이다. 실시예 6에 기재된 단분자 co-IP 기술을 이용하여 EGFR, MET, HER2, HER3 각각의 표적 단백질 （제 1 단백질）에 대하여 l igand st imulat ion 하였을 때 （회색）와 그렇지 않은 상태 （검은색）에서 PPI complex 개수가 달라지는 것을 정량적으로 측정하였다. 이를 바탕으로 PPI complex정량을통해표적 RTK의 활성도를측정할수있다.

도 10은 EGFR변이 상태에 따른 PPI complex의 변화및 이를토대로 세포 당 활성화된 EGFR의 비율 계산한 결과를 보여주는 그래프이다. 상단은 PPI complex 측정법을 통해 개별 세포 별로 EGFR과 하위신호전달 단백질 사이의 상호작용을측정한 결과를 보여주는 것이고， 하단은 단분자 sandwi ch ELISA （도 6 참조）를통해 세포 당 EGFR발현량을 측정한후 두 값을 나누어 각 세포 당 활성화된 EGFR의 양을 계량한 결과（Absolute occupancy（%））를보여준다.

도 11은 도 10에서 EGFR에 대하여 수행한 방법을 HER2, HER3에 대해서 동일하게 수행하여 얻어진 Absolute occupancy（%） 결과를보여주는 그래프이다. HER2의 경우 활성도가 매우 낮은 반면, HER3는 매우 높은 활성비율을나타낸다.

도 12는폐암세포주에 대해 EGFR, MET, HER2, HER3（제 1단백질）와 하위신호전달 단백질（제 2 단백질） 사이의 상호작용（신호 세기）을 모두 측정하여 heatmap 형식（실시예 7）으로 표시한 결과를 보여준다. 각 신호 세기에 대한 color indicator는아래에 표시되어 있다. 도 13은도 12의 결과중에서 EGFR（제 1단백질）과 3종의 제 2단백질 간의 신호세기를각각정량한수치를더한값을나타낸 그래프（좌측및 중간） 및 각세포주의 EGFR표적항암제의 일종인 AZD9291（0smert inib）에 대한 반응성（IC50; 세포 생존률이 처리 전과 비교하여 50%가 되는 처리 농도）결과를보여주는그래프（우측）이다.

각 막대의 색은 EGFR 유전자 변이 상태에 따라 우측에 표시된 그룹으로 구별된다. PPI score와 비교하여， Act ivat ion score가 약물 반응성 （IC50）과 보다 유의미한 상관관계를 보임을 확인할 수 있다 （Act ivat ion score가높을수록 IC50값이 낮아짐（약물반응성이 높아짐））. 도 14는 EGFR 표적 항암제（AZD9291）의 반응성 （y축）과 Act ivat ion score （x축） 사이의 상관관계 （좌측） 및 유전자 타입에 따른 표적 항암제 반응의 다양성 （우측）을 보여주는 그래프이다. Act ivat ion score는 AZD9291의 반응성에 대하여 높은 상관관계（r=0.85）를 보이며， 기존 EGFR 유전자 검사에서는 동일한 유전자형을 가지고 있다고 하더라도 약물 반응성이 다르게나타날수있음을볼수있다.

도 15는 유방암 세포주에서 HER2 및 HER3（제 1 단백질）와 하위신호전달단백질（제 2단백질） 간의 신호의 세기（상호작용）를 heatmap 형식（실시예 7）으로나타낸그림이다.

도 16은 유방암 세포주에서 기존에 trastuzumab 항암제의 반응성을 예측하기 위해 사용되는 biomarker인 HER2 （상단）， HER3 （중간） 발현량을 측정한 결과 및 trastuzumab에 의해 세포 성정이 억제되는 정도 （하단）를 측정하여 나타낸그래프이다.

도 17은 HER2또는 HER3신호를이용하여 PPI score를측정한결과와 trastuzumab 반응성 （logGI50） 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. PPI score（r=0.91）는 기존의 biomarker인 HER2（r=0.54）나 pHER2（r=0.44） 발현량 （하단）과 비교하여 trastuzumab 반응성과 보다 높은 상관관계를 보임을확인할수있다.

도 18은 PDTX 마우스 모델에서 얻어진 조직 용해액 （실시예 1.2） （n=5; PDTX-1, - 2, -3， -4， 및 -5로표시）에서 측정한 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의 3종의 하위 신호 단백질과의 PPI complex 신호 결과를 각각 보여주는 heatmap이다.

도 19는 PDTX마우스모델에서 얻어진조직 용해액 （실시예 1.2）에서 EGFR의 발현량 （상단） 및 상기 EGFR의 발현량 （도 18의 결과）를 이용하여 activation score를계산한결과 (하단)를보여주는그래프이다.

도 20은 PDTX 마우스 모델 (실시예 1.2.1)에 gefitinib(50mg/kg)을 투여하여 종양크기의 변화를 측정한 결과를 Vehicle (PBS) 투여군에서의 결과와비교하여 보여주는 그래프이다. PDTX-2의 경우， EGFR발현 수준은 높지 않지만 activation score는 높게 나타났으며 (도 19 참조)， 항종양 효과역시 우수하게 나타남 (도 20참조)을확인할수 있다. 이러한결과는 EGFR 발현 수준보다는 활성화된 activation score (즉 활성화된 EGFR 비율)이 약물반응성과보다밀접한상관관계를나타냄을 확인시켜 준다. 도 21은 PDTX 마우스 모델 (실시예 1.2.1)에서 gefitinib에 의한 종양크기 억제 (tumor growth inhibition) 정도와 EGFR activation score 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 앞서 설명한 바와 같이 gefitinib에 의한 종양크기 억제 (tumor growth inhibition) 정도와 EGFR activation score 사이에 유의미한 상관관계 (r=0.96)가 있음을 확인할 수 있다.

도 22는 PDTX마우스모델 (실시예 1.2.1)에서 gef it inib(50mg/kg)을 투여하기 전， 후의 조직 용해액 시료에서 각각측정된 시료의 단위 농도당 EGFR PPI complex 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다. Gefitinib을 처리한후 얻은조직에서는 EGFR PPI complex가현저히 줄어든 것을볼수 있다. 이는 gefitinib에 의해서 EGFR신호가억제된증거가될수있다. 실시예 9

9.1.항체및시약준비

각각의 해당 단백질의 pulling down을 위하여, 다음의 항체를 사용하였다: 항- EGFR 항체 (MS-378-B0 ThermoFisher) , 항- MET 항체 (ab89297 Abeam) , 항- HER2 항체 (BMS120BT ThermoFisher), 항- HER3 항체 (BAM348 R&D systems) mCherry (ab34771 Abeam) , 및 항- KRas 항체 (sc-521

Santa Cruz) .

각각의 해당 단백질 및 PTMs(post-translat ional modi f i cat ions)에 대한 검출 항체로서 다음의 항체를 사용하였다: 항- EGFR항체 (4267 Cell signaling), 항- EGFR(pTyr 1068) 항체 (ab32430 Abeam) , 항- EGFR(pTyr 1086) 항체 (ab32086 Abeam) , 항- EGFR(pTyr 1173) 항체 (4407 Cell signaling), 항- MET 항체 (8494 Cell signaling), 항- HER2 항체 (MA5-15050

ThermoFisher), 항- HER2(pTyr 1221/1222) 항체 (2243 Cell signaling), 항_ HER3 항체 (ab32121 Abeam) , 항- HER3 (pTyr 1289) 항체 (Cell signaling technology, cat . No. 4791) , 항- Grb2항체 (ab32037 Abeam) , 항- Shcl항체 (ab33770 Abeam) , 항- She pTyr 239/240) 항체 (abl09455 Abeam) , 항- HSP90 항체 (PA3-013 ThermoF i sher ) , 항- MIG6 항체 (11630-1-AP Proteintech) , 항- GAPDH 항체 (3906 Cell signaling), 및 항- c-Cbl 항체 (2179 Cell signaling).

바이오틴 (biotin) 접합된 항-마우스 면역글로불린 G (IgG) (405303 BioLegend) 및 Cy3 접합된 항-래빗 IgG (111-165-046 Jackson

ImmunoResearch)항체들을 secondary antibody로사용하였다.

웨스턴블라팅은다음의 항체들을사용하여 수행하였다: 항- EGFR(pTyr 1068) 항체 (2234 Cell signaling), 항- EGFR항체 (2232 Cell signaling), 항- Erk(pThr202/Tyr204) 항체 (9106 Cell signaling), 항- Erk 항체 (4696 Cell signaling), 항- Akt(pSer473) 항체 (4060 Cell signaling), 항- Akt 항체 (4691 Cell signaling), 항 -S6K(pSer235/236) 항체 (4858 Cell signaling), 항 -S6K 항체 (2217 Cell signaling), 및 항- act in 항체 (ab8227 Abeam)를사용하였다.

lOOng/ml EGF (PHG0311L Life technologies)를 사용 (3분간)하여 EGFR를자극하였다.

Gefitinib (S1025 Sel leckchem) , Osimert inib (S7297 Sel leckchem) , BKM120 (S2247 Sel leckchem) , Dabrafenib (S2807 Sel leckchem) , 및 Trastuzumab (A1046 BioVision)를 폐선암 (lung adenocarcinoma) 세포에서의 PPI 변화 및 유방암 세포에서의 HER2-/HER3-PPI 측정, MTT assay에 의한 세포생존률측정 , 및 PDTX모델에서의 종양성장측정에 사용하였다.

9.2. 세포배양

모든 세포주들은 10%(w/v) 우태아혈청 (26140-079 Life technologies) , 10//g/ml gentamicin (15710-063 Life technologies) , 100 units/ml 페니실린, 및 100 促/ml 스트렙토마이신 (15140-122 Life technologies)이 보충된 RPMI1640배지 (22400-105 Life technologies)에서 배양하였다. PC9-GR (gefitinib내성 세포주; Accession No. CVCL_S706) , HCC827-GR5 (gefitinib 내성 세포주; Accession No. CVCL_V622), 및 HCC4006-ER (erlotinib내성 세포주; Accession No. CVCL_S746) 세포주들은 각각 100 의 gefitinib또는 erlotinib의 존재하에서 배양하였다. 모든 세포주들은 37 ^° C 및 5% C0 ₂ 조건의 가습배양기에서 배양하였다. 배양된 세포를 찬 phosphate buffered saline (PBS)로 행구었다. 찬 PBS 1ml와 scraper (90020 SPL Life Science)를사용하여 세포를신속하게 수집하였다. 하나의 petri dish (직경 100 mm)로부터 얻어진 세포 현탁액을 3-4 aliquots로 분량하였다. 이 분액을 4 ^° C에서 3,000xg로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 얻어진 펠렛을 -80 ^° C에서 보관하고， 이후분석에사용하였다.

9.3. eGFP표지된 prey protein의 제작및형질감염 (transfections)

Bglll and EcoRI를사용하여 tandem SH2도메인 (542 to 765 amino acids of NM_013187.1)을 포함하는 Rat PLC Y _S H2 cDNA를 Rat cDNA library로부터 직접 분리하였다. Grb2 (인간 Grb2； Addgene 46442) , p85 a (마우스 p85 a Addgene 1399) , Shcl (인간 Shcl, Addgene 73255) , Eat2 (인간 Eat 2, Addgene 46423), APCS (인간 APCS, Addgene 46477) , Nckl (인간 Nckl, Addgene 45903) 및 S0S1 (인간 S0S1, Addgene 32920)의 cDNA들을 각각의 원래의 플라스미드에 포함된 제한부위에 대응하는 제한효소들을 사용하여 절제하였다. eGFP-tagged CARM1 (인간 CARM1) 및 EGFR유전자는각각서울대학교 (한국)와 KAIST (한국)으로부터 제공받았다. 모든 cDNA를 pEGFP-Cl (Clontech Laboratories)에 클로닝하여 상응하는 eGFP- 1 abe 1 ed prey protein들을제작하였다. Grb2유전자에 W36K, R86M및 W193K 점돌연변이를 각각 도입하여 Grb2 변이체인 N*-, SH2*-, 및 C*- construct를 각각 제작하였다. EGFR 유전자에서 E746-A750을 결실 시키거나 858번째 잔기인 라이신을 아르기닌으로 치환하여 EGFR 변이체를 제작하였다.

상기 얻어진 플라스미드를 Neon transfection system (MPK5000 Life technologies)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 electroporation을 통해 HEK293세포에 도입하였다. 플라스미드 DNA 30 ! 를 2xl0 ⁶ 세포를함유한 HEK293 세포현탁액 100 M와 혼합하였다. 2번의 950V 전기펄스 (with a duration of 35 ms for each pulse)를 HEK293 세포에 적용하였다. 형질감염 후 24시간 경과 후에 형질감염된 세포를 수확한 후 -80 ^° C에서 보관하였다.

9.4. 폐암환자유래의 종양이종이식 모델

모든 동물 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee

(IA⑶ C)으로부터 승인받은 지침에 따라 수행하였다. 6 내지 8주령의 암컷 마우스 (severe combined immunodef icient (NOG) and nude (nu/nu) mice； OrientBio)를사용하였다. 임상종양샘플 (폐선암종 (lung adenocarcinoma) 환자유래 또는 폐편평상피암 (lung squamous cell carcinoma； SQCC) 환자 유래)을 ~3 mm ³ 크기의 조각으로 절단한 후， 상기 N0G 마우스의 옆구리 내부로 피하 이식 (subcutaneous implantation) 하였다. 이식 후 1~4개월 경과후， 이식된 부위에서 종양이 관찰되었다. caliper로 주 2회 종양의 체적을 측정하여 종양의 피하 성장률을 측정하였다. 종양 크기가 직경

1.5cm에 도달하였을 때, 종양 조직을 절제하고 작은 절편 (대략 5 mm ³ 크기)으로 절단하였다. 상기 절단된 조직을 다른 마우스 집단에 재이식하여 속발성 종양 (subsequent tumors)을 얻었다. 환자유래 종양을 갖는마우스세대를 이라명명하고, 이후의 후속세대는차례대로번호를 매겼다 (FI, F2, F3 등) (도 23a 참조). 3세대 (F3) 마우스를 vehicle

(Phosphata buffered saline, PBS) , osimert inib, 또는 gefitinib 처리 시험에사용하였다.

상기 얻어진 환자 유래 종양 이종이식 마우스 (patient -derived tumor xenograft； PDTX) 중에서, 폐선암종환자유래 종양이 이식된마우스 (F3； n=3)을卵 TX-A1, 卵 TX-A2, 및 卵 TX-A3으로 명명하고， lung SQCC환자 유래 종양이 이식된 마우스 F3； n=5)을 PDTX-S1, 卵 TX-S2， 卵 TX-S3， PDTX- S4， 및 PDTX-S5로명명하였다.

상기 얻어진 환자 유래 종양 이종이식 마우스 (pat ient -derived tumor Mnograft; PDTX)에 체중 (kg) 당 5mg의 osimert inib 또는 50mg의 gefitinib또는 vehicle를 각각 1일 1회 복강내 주사로주입하였다. 상기 약물 처치 후 15일 경과 후에 PDTX로부터 종양 조직을 절제하여 PPI 및 발현수준변화를모니터링하였다.

9.5. 단분자 co-IP (Single-molecule co-IP)및 면역 표지 이미지화 (immuno labeling imaging)

단분자 co- IP및 immunolabel ing이미지화에 대한자세한프로토콜은

"Lee, H. W. et al . Real-time single-molecule coimmunoprecipitat ion of weak protein-protein interactions . Nat . Pro toe. 8, 2045-2060 ,

(2013)"를 참조하였다. NeutrAvidin (10 jd of 0.1 mg/ml : A2666 Life technologies)을각각의 개별 반응챔버에 넣었다. 10분간인큐베이션후， 미결합 NeutrAvidin을 제거하였다. Miniaturized imaging chamber를 PBS가 채워진 reservoir에 담갔다가 100번 정도 측면방향으로 흔들어서 완전히 씻어주었다. PBS를 완전히 제거한 후, biotinylated pul 1 down antibodies를 NeutrAvidin 코팅된 표면에서 10 분간 배양하여 증을 만들었다. MET 항체의 경우， biot inylated secondary ant ibody (alpha- mouse IgG)를사용하여 1차항체를 결합시켰다. PBS로 첨버를세척한후， 암세포또는종양조직 추출물을항체가코팅된표면에 적용하였다. 15분 후, 미결합 추출물을 제거하고, 챔버를 0.05%(v/v) Tween 20이 보충된 PBS로채워진 reservoi r에 담갔다.

single-molecule co-IP imaging을 위하여， 형질전환된 HEK293 세포 추출물을 30 nM (eGFP-tagged probe protein)으로 희석시킨 후, imaging chamber에 로딩시켰다. 첨버를 TIRF 현미경 상에 위치시키고 eGFP 형광을 EMC抑으로기록하였다 (20프레임 ; 100-ms노출) .

single-molecule immunolabel ing imaging의 경우， 5 프레임 동안 eGFP- labeled probe protein을 대신하여 dye- labeled 검출 항체를 사용하였다. 검출 및 풀다운 항체 간의 중복을 피하기 위하여, 검출 항체는 세포질 키나아제 부위 또는 말단 (tai l ) 상의 티로신 잔기 내에 에피토프를 갖는 것으로선정하였다. 검출항체는 Alexa488 (MET항체)로 직접 표지하거나， Cy3 -표지된 2 차 항체 (EGFR, HER2, HER3 및 pTyr 항체)로 간접적으로 가시화하였다. TIFF stack에서의 5또는 20프레임의 형광 (0.1초노출)을 기록한후， 형광스팟의 개수를카운팅하여， 단분자 PPI complex 또는 면역표지된 (immunolabeled) 단백질의 수를 즉정하였다. 단분자수 (single-molecule counts)의 평균 및 표준 편차는 동일한 반응 챔버 내에서 10개의 상이한위치로부터 구하였다.

실시예 9.6. Count ing PPI complex및면역표지된단백질의 counting 형광이미징하여 얻어진 TIFF파일을 custom GUI (wr i tten in Mat 1 ab (Mat lab 2016a, MathWorks))로 분석하였다. 세 개의 프레임 (eGFP의 경우 17-19, Cy3 및 Alexa488의 경우 3_5)을 사용하여 단일 PPI 복합체 또는 면역표지된 단백질을 대표하는 세기 (intensi ty)의 local maxima를 확인하였다. background보정을위하여, spat i al medi an-f i l ter ing (11x11 pixel)으로 얻은 이미지를 원본 이미지에서 프레임별로 공제 (subtracted)하였다. 얻어진 이미지는 평균화하여 thresholding 투 local maxima를검출하는데사용하였다 (custom Mat 1 ab GUI사용) .

실시예 10: EGFR표적 억제제에 대한 PDTX의 반응성 예측

10.1. 폐선암 이종이식된 PDTX에서의 Osimert inib에 대한 반응성 예즉

HER 계열 수용체의 PPI 측정 지표가 암의 약물 반응성과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였으며， HER 계열 수용체 표적 치료에 반응성을 갖는 (HER 계열 수용체 표적 치료가 항암 효과를 보이는) 특정 암을 스크리닝에 single-molecule immuno label ing또는 co-IP analysi s를 적용할 수 있는지 조사하였다. 이를위하여, 상기 실시예 9에서 기술한방법으로 3 종의 폐선암종 환자유래 종양 이종이식 마우스 (PDTXs; 도 23의 PDTX-

A1 A3)를제작하였다.

이들 폐선암종 抑 TX는 EGFR 유전자에서 활성화 돌연변이 (exon 19 또는 L858R돌연변이)를갖는것으로확인되었다.

상기 폐선암종 PDTXs (PDTX-A1-A3； 각각의 개체수는 3이상이며 하기 결과는그평균값으로나타냄)에 대하여 30일동안 osimert inib(5 mg per 1 kg of weight dai ly)을처리하고종양크기를측정하여, 대조군 (vehi cle 투여군)과비교하여, 그결과를도 23b좌측에 나타내었다. 도 23b좌측 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, PDTX-A1 A3는 osimert inib 처리에 의하여 현저한종양크기의 감소를보였다 (A1>A2>A3) .

또한 각 卵 TX(PDTX-A1~A3)에서 EGFR, HER2, HER3 및 MET 수용체 각각과 하위신호단백질인 PLCgammaSH2, Grb2, 및 p85-alpha 각각 간의 PPI complex (도 23c에서 PPI count로 표시됨)를 측정하여， 도 23c 좌측에 나타내었다. 도 23c에 나타난 바와 같이， EGFR과 3종의 하위신호단백질 간의 PPI complex count는 A1>A2>A3순서로 나타났으며， 이는 도 23b에 나타난 EGFR 저해제인 osimert inib 처리시의 종양 크기 감소효과 양상과동일함을 확인할수 있다. 이러한결과는 폐선암종의 PDTX 모델에서 표적단백질과 하위신호단백질 간의 PPI complex count가 상기 표적단백질을 표적으로 하는 표적치료제의 항암 효과와 유의미한 상관관계를나타냄을보이는것이다.

또한, 8마리의 PDTX (A1-A3 및 S1-S5) 개체에서의 EGFR과 다른 수용체 (MET, HER2및 HER3)의 발현수준을측정하고， 상기 각각의 수용체의 발현수준을 대조군 (EGFR： A549 세포， MET： HCC827-GR5, HER2 및 HER3： SKBR3)에서의 발현 수준으로 normal izat ion하여 그 결과를도 23d 및 도 25a_c에 나타내었다.

도 23c에 나타난 바와 같이， 시험된 卵 TX모델 (A1~A3)는 모두 MET,

HER2 및 HER3 수용체에 대해 유의미한 PPI complex 수치를 나타내지 않았지만， EGFR에 대해서는 어느 정도 유의미한 PPI complex 수치를 나타내었다. 이러한 결과는 PDTXs가 단백질과 PPI 수준에서 EGFR signaling에 종양 유전자 중독 (oncogene addict ion)을 나타냄을 의미하는 것이라할수있다.

다음으로， normalized PPI count (제 1 단백질의 단위 농도당 PPI complex 수; activation score 해당)에 의하여, 폐선암종 세포주에서 입증된 바와 같이， osimertinib 치료에 대한 卵 TX의 반응성을 예측할 수 있는지를 조사하였다. 상기에서 PDTX 모델 (A1 A3)에 30일동안 osimert inib(5 mg per 1 kg of weight daily)을 처리하여 얻어진 각 모델에서의 종양성장억제율 (tumor growth inhibition(%)=[( h^vehicle- A Igefi t inib) / A V vehicle] x 100 : vehicle.· vehicle 처리 전후의 종양 부피 변화; Mgefitinib· gef it inib 처리 전후의 종양 부피 변화)을 y죽으로하고， PPI sum/EGFR level (PPI sum： PPI score이고, PPI sum/EGFR level: Activation score)를 x축으로하여 도 23e에 나타내었다. 도 23e에 나타난바와같이， normalized PPI count (PPI sum/EGFR level; Activation score)가 실제로 osimert inib에 의한 종양 성장 억제와 높은 상관 관계 (r=l)를나타냄을확인할수있다.

10.2. lung SQCCClung squamous cell carcinoma)이종이식 PDTX에서의 Osimert inib에 대한반응성 예측

폐선암의 29%가 EGFR의 감작 돌연변이와 관련되어 있는 반면， lung SQCC의 0.5%만이 EGFR의 감작 돌연변이를 가지고 있다. 따라서, 현재로서는 lung SQCC에서 EGFR 표적 치료를 위한 적절한 바이오 마커가 없는실정이다.

본실시예에서는 lung SQCC환자조직으로부터 5마리의 抑 TX(PDTX_ S1 S5)를 제작하고 단분자 면역 표지 및 co-IP 프로파일링 (실시예 9.5)을 수행하였다. 5마리의 PDTX(PDTX-S1~S5)가모두 MET, HER2 및 HER3수용체 단백질 및 이들과관련된 PPI complex가최소수준을 나타냄을 확인하였다 (도 23c, 우측및도 25a-c).

한편, 총 EGFR count (EGFR level)와 EGFR PPI complex count가 상당한수준으로검출됨을확인하였다 (도 23c및 23d, 및도 25d및 25e). 이러한 결과는 lung SQCC가 증식 신호에 있어서 종종 EGFR에 의존하기 때문인것으로예상된다.

10.3. lung SQCC( lung squamous cell cm"cinoma)이종이식 PDTX에서의 gefitinib에 대한반응성 예측

5마리의 抑 TX(PDTX-S1~S5)를 모두 15일동안 gefitinib를 투여하고， 종양 성장 정도를 측정하여 도 23b 우측에 나타냈다. PDTX-S1-S5중에서 S1과 S2에서 현저한종양억제 효과를보이는것으로확인되었다. 시험된 다양한 PDTX 개체들 중에서， EGFR 수준으로 normalized된 PPI complex count (Activation score)가 종양 성장 억제와 매우 높은 상관관계 (Spearman correlation of 0.9)를 가짐을 다시 한번 확인하였다 (도 23 f 및도 25f-h) .

상기 얻어진 결과들은 normalized PPI count가 비소세포 폐암 (non- smal 1 cell lung cancer)의 EGFR표적 억제제에 대한반응성과밀접한상관 관계가 있음을보여준다. PPI 수치의 합계가아닌 normalized PPI 수치가 항종양약물에 대한반응성과보다높은관련성을갖는지 이해하기 위하여, 고유한 signaling phenotype과 gefitinib반응성을보인 2마리의 lung SQCC PDTX (PDTX-S1및 S2)를집중적으로관찰하였다.

gefitinib 처리 전 (Before)과 처리후 15일 경과 후 (After), PDTX- S1과 PDTX-S2에서의 PPI complex count를 측정하여 도 23g 및 도 26a_b에 나타내었다.

상기 결과에서 보여지는 바와 같이， PDTX-S1은 특히 의 조절 p85 a 서브유닛에서 검출가능한 수준의 EGFR PPI complex counts를 유지하였다. 반면， PDTX-S2는 A549세포를사용한음성 대조군과비교하여 감소하거가구별되지 않는정도의 EGFR PPI complex counts를나타냈다 (도 23g 및 도 26). 따라서, 시험에 사용된 gefitinib 투여량 (50 mg/kg)은

PDTX-S2에서 EGFRs의 hyperactive but smaller pool을 완전히 억제하여 해당 암의 위축 (shrinkage)을 유도한다고 할 수 있다. 반면, 동일한 gefitinib투여량은 PDTX-S1에서 EGFR활성을억제하지 못하고상당한 EGFR 과발현을 나타내었다. 이러한 결과는 높은 normalized PPI cmint를 갖는 抑 TX-S2가,높은 EGFR수준과 total PPI count를갖는抑 TX-S1과비교하여 , gefitinib에 대하여 보다우수한반응성을보이는 이유를제안한다고할수 있다.

상기 결과에서 PDTX-S1이 증가된 EGFR-p85a 결합을보인다는사실에 기초하여， PDTX-S1을 PI3K inhibitor인 BKM120(50 mg/kg)으로 처리하였다 (도 23h).

상기 결과에서 보여지는 바와 같이, BKM120는 동일한투여용량 (50 mg/kg)에서 gefitinib보다 강력한 종양 성장 억제 효과를 보였다. 또한, gefitinib과 BKM120의 병용 치료 (gefitinib (50mpk(mg per lkg weight (mpk))/BKM120(50mpk))는종양을위축시켰다. 이러한결과는상이한 다운스트림 단백질을 사용하여 PPI를 검사하는 single-molecule co-IP prof i l ing이 표적 신호화경로의 선택 및 복수의 약물의 병용 치료 전략을 설계하는데유용하게사용될수있음을제안한다 .

10.4. 비소세포성 폐암이종이식 PDTX에서의 반응성 예측

두 종류의 비소세포성 폐암 이식 모델인 PDTX-A1-A3 및 PDTX- S1 S5로부터 얻은 normal ized PPI complex counts를 풀링하고 단일 플롯을 비교하였다 (도 23i ) .

유전체 변이 양상 및 암 서브타입에서의 모든 차이에도 불구하고, data points는 일정한 양상을 보이며， Spearman상관 관계가 0.95인 종양 성장억제와잘일치하는모양을형성하였다.

이러한 결과는 normal ized PPI complex count가 EGFR-표적 요법에 대한효능예측마커로서 작용할수 있는 EGFR신호강도의 척도 (gauge)임을 제안한다.

실시예 11. 인간 환자 시료에 대한 단분자 면역 표지 (Single- molecule immunolabel in)및 co-IP프로파일링 (co-IP prof i l ing)

본 발명에서 제시되는 마이크로 챔버와 고성능 단분자 영상 시스템 (high-throughput single-molecule imaging system)을사용하여 인간 환자의 종양조직을특성화하였다 (도 24) .

프로토콜 (cryogenic lysi s protocol )을폐선암종환자로부터 외과적 절제로 얻은 두 개의 폐선암종 환자조직 (연세대 세브란스병원)에 적용하였다 (도 24a, P1및 P2라고함) .

간략히 설명하면, 상기 준비된 환자조직을분쇄 (~0.6cm)하고, 액체 질소에 침지시킨다. 추가 분쇄 후 PBS를 투여하여 완전히 용해시키고, 원심분리하여， 펠렛을 취하였다. 이후 PBS를 투여하고， 계속적으로 섞어주면서 4°C에서 배양하였다. 그후， 원심분리하여 상청액을취하였다. 크기가 15mm ³ (P1) 및 18mm ³ (P2)인 조직을 사용하여， 상기 기재한 방법으로 얻어진 각 조직 용해물에 대하여 10개의 서로 다른 PPI level (posi t ive control에서의 PPI complex를 1.0으로 하였을 때의 P1 및

P2에서의 PPI complex의 상대값) 및 1◦개의 서로다른단백질 및 PTM(post- translat ional modi f icat ions) 수준 (발현량)을 즉정 (실시예 9.5의 immunolabel ing참조)하였다 (도 24b) . 양성 대조군으로서 PC9세포 ( for EGFR), HCC827세포 (for MET), 및 SKBR3세포 (for HER2및 HER3)가각각 사용하였다.

두종양조직에및 P2)모두 EGFR유전자에 exonl9돌연변이 (exonl9 결실 변이)를 갖고 있었지만， 샘플 만이 유의미한 EGFR PPI complex counts를나타냈다 (도 24b, c및 표 4) .

[표 4]

Biopsy type Deposite date EGFR genotype Treatment Response

(PR=Partial response, PD=Pr ogress ive disease)

다른 수용체인 HER 수용체와 MET 수용체에 대해서는 두 샘플 모두에서 의미있는 PPI counts가관찰되지 않았다 (도 24b, c).

Patient P1은진행성 질환 (progressive disease； PD) 진단 전에 약 1년 반동안 gefitinib치료에 대한부분적 반응성 (partial response； PR； 고형 종양에서의 반응성 평가 기준 (response evaluation criteria in solid tumors； RECIST)에 따른 부분적 반응성)을 유지한 반면， Patient P2는 PD designation 전에 1년 동안 stable disease (SD) diagnosis를 유지하였다.

마지막으로， 가장높은활성의 EGFR신호를보이는 PDTX-A1및 인간 환자 샘플 P1으로부터 유래된 mutant EGFR (exon 19 결실)에 대하여 PTPN1를처리하여 in vitro탈인산화를수행하였다 (도 24d) .

탈인산화 후， eGFP- labeled PLCgamma 및 Grb2와, mutant EGFR 복합체와의 결합을 측정하여 도 24d에 나타내었다. 도 24d에 나타난 바와 같이, 탈인산화 (+PTPN1)에 의하여, pTyr-SH2 도메인 상호작용에 전적으로 의존하는 PLCga_as _H 2의 결합은거의 완전하게 중지되는반면， Grb2 binding ccxints의 경우에는 50% 이상 및 80% 이상이 탈인산화 후에도 유지되었다. 이러한 결과는 mutant EGFR의 pTyr- independent signaling median ism이 PDTX모델과외과적 종양조직에서 실제로작동함을제안한다.

실시예 12:면역단백질 PD-1및 PD-L1의준비

抑- 1은 GFP로표지하여 GFP labeled卵 -1형태로, PD-L1은 mcherry로 표지하여 mcherry labeled PD-L1형태로각각준비하였다.

卵-1-GFP는 human 卵-1 (NP_005009.2)고유의 신호 서열 (Signal sequence)을 포함한， 1번부터 288번까지의 단백질 서열 및 상기 아미노산 서열의 카복시 말단 (C-teminal)에 연결된 GFP (아미노산 서열: MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTL VTTLTYGVQ

CFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGH KLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMVLLEFVTMGITLGMDELYK)로 구성되며， 상기 두 단백질은 19개 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커에 의하여 연결되도록 준비하였다 (N terminal쪽: PD-1, C terminal쪽: GFP) .

상기 PD-1-GFP 사이에 사용된 링커의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는핵산서열은다음과같다:

핵산서열:

5 ¹ -AGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGGATCTGG TAGT-3' ; 아미노산서열:

N'-RILQSTVPRARDPPVGSGS-C .

단,상기 링커의 길이 및서열은단지 예시에 불과하다.

링커의 길이가 특정 개수， 예를 들어 아미노산 개수 기준으로 8개 (아미노산 기준) 미만으로 짧아지게 되거나， 또는 rigid및/또는 bulky한 아미노산으로 구성될 경우, 앞부분(N-말단 부분)의 卵-1과 뒷부분(C-말단 부분)의 GFP사이에 clash가 생겨서 단백질이 misfolding이 되거나， 쉽게 degradation이 일어날수 있어 PPI즉정에 영향을미치는문제가발생할수 있다. 상기 링커는 하나 이상의 G(글라이신) 및/또는 하나 이상의 S(세린)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 글라이신과 세린은 다른 아미노산들과 비교하여 상대적으로 flexible하기 때문에 단백질의 folding및 PPI측정에 유리할수있다.

PD-Ll-mcherry는 human PD-L1 (NP_054862.1) 고유의 신호서열 (Signal sequence)을 포함한， 1번부터 290번까지의 단백질 서열과 상기 단백질서열의 카복시 말단 (C-terminal )에 연결된 mcherry (아미노산서열: MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLP FAffDILSPQF

MYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGWTVTQDSSLQDGEFIYKVK LRGTNFPSDGPV MQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNV NIKLDITSHN EDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK) 로 구성되며, 상기 두 단백질은 16개 아미노산으로 구성된 핍타이드 링커에 의하여 연결되도록 준비하였다 （N terminal쪽: PD-L1, C terminal쪽: mcherry） .

상기 PD-Ll-mcherry 사이에 사용된 링커의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는핵산서열은다음과같다:

핵산서열:

5 ' -TACCCAACTTTCTTGTACAAAGTGGTTGATCCGGTACCGGTCGCCACC-3 ' ;

아미노산서열:

N'-YPTFLYKWDPVPVAT-C .

단, 상기 링커의 길이 및서열은단지 예시에 불과하다.

상기 사용된 링커는 16개의 아미노산으로 구성된 구조이며， N terminal의 PD-L1과 C terminal의 mcherry를연결하고 있다. 링커의 길이가 특정 개수， 예를 들어 아미노산 개수 기준으로 8개 （아미노산 기준） 미만으로 짧아지게 되거나， 또는 r igid 및/또는 bulky한 아미노산으로 구성될 경우, 앞부분（N-말단 부분）의 PD-1과 뒷부분（C-말단 부분）의 GFP사이에 clash가 생겨서 단백질이 mi sfolding이 되거나， 쉽게 degradat ion이 일어날수 있어 PPI 측정에 영향을미치는문제가발생할수 있다. 상기 링커는 하나 이상의 G（글라이신） 및/또는 하나 이상의 S（세린）을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 글라이신과 세린은 다른 아미노산들과 비교하여 상대적으로 f lexible하기 때문에 단백질의 folding및 PPI 측정에 유리할수 있다. 여기에 더하여， 링커가 너무 짧아지게 될 경우 C-terminus를 epi tope로 사용하고 있는 PD_L1 항체（예컨대， 9A11 （Cel l Signal ing Technology, #29122S） 등）와의 binding이 심각하게 저해되고 pul 1-down효율이 많이 떨어질 수 있어, PPI 측정에 영향을미칠수있다.

단, 기판에 고정되는 （즉, 제 1 단백질로 사용되는） PD-L1에 결합된 표지 （본실시예의 경우 mcherry）는 PPI측정에 필수적인 것은아니며， PD- L1에 mcherry부착없이도抑- 1/PD-L1의 상호작용을측정할수있다.

한편， 제 1 단백질로 사용되는 PD-L1에 표지 （예컨대， mcherry）를 붙이면 기판에 부착된 PD-L1을 정량할수 있다는 장점이 있다. 이 경우， Spectrophotometer를 이용한 형광 정량이 가능하기 때문에， 목적하는 농도의 PD-L1을 기판에 코팅할 수 있으며, 반대로， 해당 조건에서 기판에 코팅되는 PD-L1의 개수를정량적으로추적할수도있다.

PD-L1의 개수를 정량추적할 경우의 장점은 다음과 같이 예시할 수 있다:

기판에 코팅되는 PD-L1의 수를 추적하면 drug screening을 할 경우 inhibi tor의 negat ive select ion에 도움이 될 수 있다. Tube react ion을 통하여 1)-1 _*(* 는 형광표지)/ PD-L1/ inhibi tor mixture를 기판에 incubat ion하고 PD-1 _* 를 count하게 되면 PEKL과 PD-L1의 상호작용을 저해하는 약물을선별할수 있지만, 간혹 PD-L1과항- PD-L1항체의 결합을 저해하는 약물도 잘못 선별될 수 있다. 이때 기판에 결합된 PD-L1의 수를 관찰하면 이와같이 잘못선별된 약물들을다시 골라낼수있다.

한편， 표지되지 않은 PD-L1을 사용하는 경우에도 negat ive select ion이 불가능한것은아니다. PD-L1 ELISA를통하여 관찰할수 있다. 다만， 표지된 (예컨대, mcherry로 표지된) PD-L1을 사용하게 되면 해당 과정을 one-step으로진행할수있다.

卵 -1-GFP와卵 Ll-mcherry를 암호화하는두유전자를각각 pCDNA 3.1 backbone에 삽입하고， HEK293T세포에 도입하여， 단백질로발현시켰다.

유전자의 숙주세포내도입을위하여， 통상적으로사용가능한모든 수단， 예컨대， PEI(polyethyleneimine)을 이용하는 형질도입， 1 ipofectamine 등을 이용하는 1 ipofect ion, electroporat ion 등의 방법이 사용될수있다.

본 실시예에서는, 예시적으로 PEI를 이용한 transfect ion을 수행하였다. PEI는 highly posi t ive charge를 갖는 물질로, DNA를 머금고 세포 안으로침투하여， 단백질로발현시킨다. PEI를 이용한 transfect ion의 구체적 과정은다음과같다:

100mm di sh를 기준으로 50만개의 HEK293T세포 (ATCC [293T (ATCC® CRL-3216™)] )를준비하였다. Opt i -MEM buf fer (Thermo Fi sher Scient i f ic) 2ml을 준비하여， 1ml은 DNA (앞서 준비된 卵 -1-GFP와 PDLl-mcherry 유전자를 포함하는 벡터) 20ug과, 나머지 1ml은 PEI 50ug과 각각 혼합하였다. 5분 후， DNA와 PEI를 서로 혼합하고， 추가로 20분 동안 배양하였다. DNA와 PEI 혼합물을 상기 준비된 HEK293T 세포에 처리하고, 48시간동안배양한후， 세포를수집하였다.

세포용해 과정에 사용된 용해 버퍼 (Lysi s buf fer )의 조성은다음과 같다.

【표 5]

수집한 세포의 양에 맞게 용해 버퍼를 첨가한 투, re-suspension, ice에서 30분 incubation한후， 14000g이상에서 15분동안원심분리하였다. 이때 protease inhibitor (Sigma-Aldr ich (11836170001) ) , phosphatase inhibitor (Sigma-Aldr ich (P5726))를 첨가하였다. 상등액을 취하여, Fluoremeter를이용하여 형광농도를측정한후보관하였다.

실시예 13.기판의준비

Covers lip을 K0H 1M 용액에 침지시킨 후， sonicator에 담아서 세척하였다 (20-30 min). 그 후, 3차 증류수로 잘 씻은 후， piranha solution (황산:과산화수소 = 2:1 3:1 ( _\ "v))을 이용하여 세척하였다. 세척한 covers 1 ip 표면에 대하여 aminopropylsi lane와 PEG(polyethylene glycol)를차례로처리하여 코팅을수행하였다.

2시간 반응후， 3차증류수로 세척한뒤 PEG코팅된 면이 접촉되지 않게 하여 -20°C에서사용시까지 보관하였다.

동시에 석영 재질의 channel 형태의 기판또는 아크릴 재질의 well 형태의 기판을 준비하였다. 석영 재질의 기판의 경우, 앞서 설명한 cover si ip처리 과정을참조로세척 및 PEG코팅 과정을수행하였다.

아크릴 재질의 기판의 경우， 제작 후 3차 증류수에 침지시킨 후 sonication하여 세척하였다. 세척된 아크릴 재질의 기판을 5% BSA용액에 침지시키고 2시간 반응시켜 비특이적 단백질 흡착 (nonspecific protein adsorption)을방지하고， -20C에서사용시까지 보관하였다.

하기 시험에서는 상기 준비된 covers lip과 아크릴 재질의 기판을 사용하였으며， 시험 전에 상기 coverslip과아크릴 재질의 기판을해동하여 조립하거나， PEG 코팅이 끝난 뒤 미리 조립하고， 조립된 형태로 -20°C에 보관하여사용전에 해동하여사용하였다 _.

실시예 14. PD-L1과 PD-1간단백질-단백질상호작용측정

PD-L1과 PD-1간단백질-단백질상호작용유도

상기 실시예 13에서 준비된 기판에 Avidin 계열의 단백질인 Neutravidin (Thermo , A2666)을 0.1 mg/ml 농도로 투입하였다. 상온에서 5분반응시킨후 PBS buf fer 30 ul를이용하여 2회 기판을세척하였다. 제 1단백질로서 PD-L1또는卵 -1을사용한경우를 예시하기 위하여， 상기 준비된 기판에 상기 제 1 단백질에 대한 항체를 처리하였다. 이 때， 사용되는 항체는 biot in이 접합된 형태인 것으로 준비하였다. 항체의 농도는 항체-항원의 af f ini ty (di ssoci at ion constant , KD)에 따라 적절히 조절될 수 있으며， 본 실험예에서는 2 ug/ml 정도로 사용하였으며, 반응시간은 5분정도로하였다. 만약 Biot in이 접합되어 있지 않은항체를 사용하는 경우에는 이차항체를 이용하여 제 1단백질의 항체를부착할수 있다.

본 실시예에서 사용된 제 1 단백질에 대한 항체를 다음의 표 6에 정리하였다:

【표 6】

상기 표 6에 예시된 항 PD-L1 항체 (9A11 또는 湖 8T4X)가 처리된 기판을 PBS buf fer 30 를이용하여 2회 세척하였다. 상기 준비된 기판에 앞서 실시예 12에서 준비한 PD-L1단백질 용해액 (mCherry-PD-Ll발현세포 용해액의 원심분리 후의 상등액; 제 1 단백질로 사용)을 투입하여， 기판에 PD-L1을 고정화시켰다. 항원-항체 반응의 경우 15분까지는 계속 증가할 수 있고 15분을초과하면서 시간대비 항원-항체 반응효율이 낮아질수 있어서， 반응시간을 15분 정도로 설정하였다. 반응 후， 기판을 PBS에 tween 20이 0.05%(v/v) 포함된 버퍼를 이용하여 세척하였다. Tween 20 0.05%는 nonspeci f ic binding을줄여주는동시에， 막단백질의 hydrophobic region이 망가지지 않도록도와준다.

그 후, 상기 얻어진 표면에 PD-L1 단백질이 고정된 기판에 실시예

12에서 얻어진 PD-1단백질용해액 (GFP-PD-1발현 세포용해액의 원심분리 후의 상등액; 제 2 단백질로 사용)을 투입하였다. PD-L1 단백질은 10nM 농도로사용하고， 卵 -1단백질은 10nM, 30nM, 또는 50nM농도로사용하였다. 상기 시험 과정을도 27a에 모식적으로나타내었다.

단백질단백질상호작용에 의한복합체 (PPI complex)의 이미징

단백질복합체 (PPI complex) 이미징 과정은다음과같다:

상기 준비된 기판 (well type 또는 quartz slide 중 어느 것을 사용하여도 무방함)을 전반사 형광현미경 (Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscope) 위에 고정시켰다. eGFP의 형광신호를 관측하기 때문에， 488 nm 의 파장을 이용하였으나， 이에 제한되지 않고 eGFP를 발광 시킬 수 있는 어떠한 파장의 레이저를 사용해도 무방하다 (레이저 파장 범위: 460 500 nm). 형광 이미지는 EMCCD (Electron- multiplying charge-coupled device； Andor iXon Ultra 897 EX2 (DU-897U- CS0-EXF))카메라를사용하여 얻었다.

예시적으로,이미징을위한 EMCCD카메라의 각종수치를다음과같이 조정하였다:

a. 레이저 파워 : 2 mW

레이저 파워가너무높으면 eGFP가빨리 형광신호를잃어버리게 되고 ( phot ob leaching) ,너무낮으면 EMCCD에 의해 신호를관측하기 어려워진다. 상기 레이저 파워 범위는 _e GFP의 발광시간 (lifetime)을 11초 정도로 유지시켜 주는범위이다.

b. EMCCD카메라의 1프레임 당노출시간 (exposure time) : 0.1초

1 프레임 당 노출시간이 짧을수록 1 프레임에 누적되는 신호가 줄어들게 되므로， 이를 극복하기 위해서 레이저 파워를 높이거나， EMCCD의 감도를높여야한다.

c. EMCCD의 gain (gain이 클수록 측정된 신호가 증폭되고 동시에 노이즈도증가함) : 40

eGFP에서 생성된 광자 (photon)는 EMCCD의 소자를 통해 전자로 바뀌어 계측된다 (광전효과， photoelectric effect) . 이 때， 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수를 gain 값을 통해 변경할 수 있다. 설정된 gain이 높을수록 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수가 늘어나서， EMCCD의 감도가 높아진다. 동시에 background noise도 함께 증가하므로 signal-to-noise 비율이 중요하다. 따라서， 본 실시예에서는 EMC抑의 gain을 40으로 조정하였지만, 이에 제한되는 것은 아니고， 앞서 설명한 내용을 근거로 적절히 변경할수있다. d. 총촬영 프레임 : 10프레임

10 프레임 촬영을 하게 되면 현재 노출시간을 기준으로 1초동안의 PPI 변화를관찰할수 있다. 본실시예에서는 30분 간의 tube incubat ion, 15분 간의 기판에서의 incubat ion, washing step을 차례로 진행한 투, 이미징을 진행하므로， 이미징에서 관찰되는 신호의 세기 및 강도는 굉장히 안정적이다. 따라서 실험시간의 단축을 위하여 10프레임으로 고정하여 사용하고 있으며 분석은주로 (5-7)프레임을진행한다. 다만, 10프레임 중 초기 프레임 (1-3)， 후반프레임 (8-10)을 측정하더라도 비슷한 값을 확보할 수있다.

한 조건에 대해 (하나의 wel l 혹은 하나의 channel ) , 위치를 옮겨가며 각각 다른 위치에서 최소 10장의 이미지를 얻고 상기 얻어진 10장의 이미지를각각분석한후, 평균과표준편차를각조건의 대표값으로 설정하였다. 10장은 최소 기준이며, 장 수가 많을수록 통계적 정확도가 높아진다. 한 조건에서 모든 이미지를 얻고 나면 다음으로 이동하여 (다음 wel l혹은다음 channel )동일한동작을반복하였다.

앞서 설명한바와같이， PD-L1을기판에 고정하는경우, PPI 신호가 cluster를 형성할수 있다. 이 경우, 레이저 파워를 줄이거나 gain수를 줄이면 spot의 형광신호 세기가 줄어들어， single GFP spot은 거의 안보이고, cluster의 신호만을 남길 수 있고， Cluster에 대한 분석만을 진행하거나, 또는 single molecule 만을 분석하고자 할 때， 또는 상관관계를 분석하고자 할 때 해당 step을 추가적으로 진행할 수도 있을 것으로생각된다.

PPI complex분석

상기와 같이 이미징된 단백질 복합체 (PPI comp lex)는 다음의 과정으로분석하였다:

본 실시예에서는 Mat lab 프로그램 (MathWorks 제공)에서 제공되는 toolki t에 기반하여 단백질복합체를분석하였다.

1. 상기 얻어진 형광이미지는 16bi t uns i gned integer 형식으로 저장하였다. PD-1-PDL1 분석에 있어서， 5-7 프레임의 총 3개의 프레임을 사용하여 아래 과정을수행하였다. 앞서 기재한바와 같이 washing과정이 포함되기 때문에 이미징에서 보이는신호의 세기， 안정성이 매우우수하고， 10개의 프레임 중에서 1-3 프레임을 분석한 결과와 8-10 프레암을 분석한 결과, 1-10 프레임을 모두 분석한 결과를 비교해도 큰 차이가 없었다. 이 구간은이미징 조건/장비구축상태에 따라서 달라질수있다.

2. 노이즈를 제거하기 위해， 각 프레임 마다 아래와 같은 절차를 수행하였다:

a. 최초 시작은 왼쪽상단에서 시작한다. 1 프레임은 512x512 개의 픽셀로구성되어 있다. 기준픽셀을기준으로오른쪽으로 11개, 아래쪽으로

11개인 11x11개의 픽셀에서 median 값을 구하고, 이 medi an 값을 기준 픽셀의 수치에서 빼주었다 [(Intensi ty_pixel) -

(medi anIntensi ty_llxllneighborhood)] . 512x512의 모든 픽셀에 대해서 위 절차를 수행하였다. Medi an f i l ter ing을 통해서 pepper & sal t noi se를 제거하였다.

b. 위의 처리된 이미지에서 sigma^O.?, si ze=5 x 5의 Gaussi an smoothing을수행하였다. 이를통해 이미지를부드럽게 만들어 주었다. c. Threshold를 설정하였다. Threshold는 전체 이미지에서 pixel intensi ty가 threshold 이하가 되는 pixel의 값을 threshold 값으로 모두 만들어 주었다. 이를 통해 이미지에서 형광신호에 의해서 만들어지지 않은 국소극대값 ( local maximum)을 제거할 수 있다. 본 실시예에서 이미징 조건에서사용되는 threshold값은 70이다.

3. 형광단백질로부터 나오는 신호는 특정 위치에 모여있는 형태로 발생한다 ( local i zed point spread funct ion (PSF)) . 즉 이 PSF (물리적인 값)가관측하고자하는 PPI complex (생물학적인 값)이다. 아래 단계는 이 PSF를판별하기 위한과정이다:

a. Local maximum의 위치를구하였다 (예를들어, i번째 row, j번째 column pixel) . 앞서 기술한 바와 같아 단분자 형광신호는 512x512픽셀 중에서 특정 위치에 (현재 관측장비 하에서 대략 5x5픽셀사이즈, 1 pixel = 0.167 마이크로미터) 모여 형성되므로， local maximum을 찾으면 개별

PSF를 선별할 수 있다. 이는 Mat lab에서 제공되는 toolki t을 이용하여 구할수있다.

b. 위에서 구한 local maximum이 실제 PSF로부터 발생한 것인지에 대한 판별과정을 수행하였다. 우선 local maximum의 최소값을 정의하고 (minimum intensi ty value) , 얻어진 local maximum 중에서 이 최소값보다 큰 경우만 분석에 사용하였다. 본 실시예에서는 최소값을 75로 정의하였으며， 이는 레이저 파워/노출시간/장비구축 상황에 따라서 달라질 수 있다. 최종적으로 얻어진 local maximum 좌표를 중심으로 5x5 픽셀의 정보를불러오고， 이 5x5픽셀에서 밝기에 대한중심을구하였다（centroid of intensi ty） . 이 때， 구해진 밝기 중심이 기존 local maximum 좌표에 대하 0.5 pixel 이상벗어나게 되면 （PSF모양에 대한 2D대칭이 사라지면）， 정상적이지 않은형광신호라고판단하고분석에서 제거하였다.

c. 모든 조건을 통과한 PSF 만 최종적으로 분류하여 좌표와 전체 개수를구하였다.

모든 파일에 대해 상기 1-3의 과정을 수행하면서 PPI complex의 개수를 구하였다. 같은 조건하에서 촬영된 각 파일의 정보를 취합하여 평균과 표준편차를 구하였다. 이 값이 최종적으로 특정 조건에서 PPI complex의 개수를나타내는값이 된다.

상기 얻어진 PPI complex의 개수는 PPI신호의 count를구한것이나, 그 외에도 PPI 신호의 intensi ty의 합을 구하거나, 측정 영역에서 spot의 rat io등을측정하여 분석할수도있다.

일 예에서， cluster의 신호만을 측정한 경우, 레이저 파워， gain 수를 조절하여， Cluster 신호의 크기가 줄어들면， 즉 형광의 세기가 너무 진한 spot이 줄어들게 되고, PSF의 정확한 계산에 조금 더 유리하게 된다 （local maximum이 줄어들기 때문도 있고, 겹쳐진 spot이 구분되는 경우도 있다）. cluster intensi ty를 측정함으로써， 약물의 특성을좀 더 면밀하게 파악할수 있을것이다. 어떤 약물의 경우에는 PD-1과 PD-1의 cluster ing을 억제하는 약물이 있다. 해당 약물의 경우 single spot의 count는 오히려 늘어나거나 비슷하겠지만, cluster의 개수는 줄어들게 될 것이고, 실제적으로 cluster ing을 동반한 체내의 PD-1-PDL1 interact ion은 효과적으로억제할수 있을것이다. 따라서 c luster의 분포， 수를분석하는 것이 의미가있을것이다.

또한， 전체 intensi ty에서 cluster intensi ty를 빼면 single molecule만의 intensi ty를도출할수았다.

cluster를 특정하여 접근하는 경우 특정 threshold 이상의 cluster intensi ty를 갖는 신호의 count 또는 sum으로 분석할 수 있고， 또는 cluster rat io를 분석할수도 있다. Single molecule을 특정하여 분석하는 경우도마찬가지이다.

PD-L1 _* 의 형광신호대비 PD-1 _* 의 형광신호값분석

1） mcherry가 부착된 PD-L1을 기판에 공급한 후， mcherry에 의해 형성되는 신호 중 특정 threshold 이상에서 형성되는 형광신호 a를 검출한다.

2) GFP가 부착된 抑- 1을 공급한 후 GFP에 의해 형성되는 신호 중 특정 threshold이상에서 형성되는형광신호 b를검출한다.

3) 형광신호 a값에 대한형광신호 b값을분석한다. 상기 형광신호 값은 PPI count , sum, rat io등일수있다.

형광신호 a값에 대한 형광신호 b값을 분석함으로써， 형광신호 b값만을 분석하는 경우보다 더 정성적인 데이터를 확인할 수 있다. 형광신호 a값을 측정하면， 특정 농도의 mcherry-PDLl을 기판에 주입하였으나 기판에 부착되지 않은 PDL1*에 대한 영향도고려할수 있다. 또한， PD-L1과 PD-1*의 상호작용을정량화함에도정확도가향상될수 있다.

비교예

비교를 위하여, 抑- 1과 PD-L1의 결합을 저해하는 PD-1 돌연변이인 K78A를포함하는 PD-1변이체, 또는卵 -1과 PD-L1의 결합을저해하는 PD-L1 돌연변이인 D122A+K124A를 포함하는 PD-L1 변이체, 또는 卵 -1과 PD-L1의 결합을 증대시키는 PD-1 돌연변이인 A132L을 포함하는 卵 -1 변이체를 사용하여, 상기와동일한시험을수행하였다.

결과

상기 기판에 항 PD-L1 항체인 9A11(#CST-29122； Cel l Signal ing Technology)를사용하여 얻어진 형광이미지를도 27b에， 이를정량한결과 (PPI complex 개수; F-counts)를 도 27c에 각각 나타내었다. 도 27b 및 27c에 나타난바와같이， PD-1과 PD-L1을모두야생형 (WT)인 것으로사용할 경우， 정상적으로 PD-L1에 PD-1이 결합하면서 抑- 1의 농도 의존적으로 GFP 신호가 관찰된 반면, PD-1과 PD-L1의 결합을 저해하는 돌연변이인 卵 -1 K78A변이체 또는 PD-L1 D122A+K124A변이체를사용한경우， PD-1의 농도와 상관없이, GFP 신호를 관찰할 수 없었으며, 抑- 1과 卵 -L1의 결합력을 증대시키는 PD-1 A132L 변이체를 사용할 경우에는 WT과 비교하여 더 많은 신호를 관찰할 수 있었다. 상기 결과는 본 실시예에서 수행된 방법에 의하여 卵 -1과 PD-L1간의 단백질-단백질 상호작용 (PD-L1/PD-1상호작용)을 정확하게측정할수있음을확인시키는것이다 _.

PD-L1/PD-1 상호작용 측정에 있어서， 기판에 항- PD-L1 항체를 고정하여 시험하는 경우， 형광신호에서 duster로 보이는 spot이 관찰되는 반면， 반대로， 제 1 단백질로서 卵 -1을 제 2 단백질로서 PD-L1을 각각 사용하고， 항 PDᅳ 1 항체를 기판에 고정하여， 상기와 동일한 과정으로 시험한결과, cluster가전혀 관찰되지 않고, single GFP spot으로보이는 이미지가관찰되었다.

따라서， physiologic condi t ion에서 nanocul ster를 이루는 PD-1/PD- L1의 특성상 PD-L1 항체를 사용하여 PD-L1를 기판에 고정화하여 사용하는 조건이 inhibi tor의 효능에 대한정량분석 등의 다양한분석에 접근하는데 보다유리할수있다고예측되었다.

기판에 항 PD-1항체를처리하여 PD-1를고정화하여 PPI를측정하는 것을 배제하는 것은 아니다. 그런 경우， 卵 -1-mcherry 및 抑 L1-GFP로 단백질이 재조합되는 것 이외에， 상기한 PPI 측정 방법에 차이가 없다. 다만， cluster 형성에 의한 신호 발생의 차이가 있으므로， 이에 따라서 분석 방법을적절하게 변경 적용할수있다.

또한, 기판에 PD-L1이 고정화되도록설계할때， PD-L1의 특정 도메인 (卵 -1과 binding하는 부위)이 노출되도록 하기 위하여， PD-L1을 기판에 고정화하는데사용되는항체를적절히 선택할수있다.

상기 표 6에 예시된 항- PD-L1 항체 중， 9A11(#CST-29122； Cel l

Signal ing Technology)는 PD-L1의 C_말단에 결합하는 항체이고, #D8T4X (Cel l Signal ing Technology)는 PD-L1의 N_말단에 결합하는 항체이며, 항- 卵 -1 항체 중， D4W2J(Cel l Signal ing Technology)는 卵 -1의 C-말단에 결합하는항체이고， NAT105 (Abeam)는卵 -1의 N-말단에 결합하는항체이다. 이들항 PD-L1항체를기판에 고정하여 상기한시험을수행 한결과 얻어진 PPI complex 개수 (F-counts)를 도 29에 나타내었다. 도 29에서， 항- PD-L1 항체를 사용하여 시험한 경우， PD-L1의 농도는 5nM로 고정하고， PD-1 농도를 0 nM, 5 nM, 및 15 쌔로 증가시키면서 시험하고， 항- PD-1 항체를 사용하여 시험한 경우， PD-1의 농도는 5nM로 고정하고， PD-L1 농도를 0 nM, 5 nM, 및 15 nM로증가시키면서 시험하였다.

도 29에 나타난 바와 같이, PD-L1의 N-말단에 결합하는 항체인 #D8T4X (Cel l Signal ing Technology)를 사용하는 경우， C_말단에 결합하는 항체인 9A11 (CST#29122； Cel l Signal ing Technology)을 사용하는 경우와 비교하여， 卵 -1/PD-L1 상호 작용이 조건에서 적게 count ing되는 것을 확인할수있다.

상기 결과는,卵 -1과 PD-L1이 상호작용을하는계면이 N-말단부위로 한정되어 있기 때문에, 기판쪽으로 PD-L1의 C-말단부위를 고정하는 것이, 안정적인 PD-1및 PDL1간상호작용을유도하는것에 유리함을보여준다. 실시예 15. PD-1/PD-L1상호작용억제 약물스크리닝에의 적용

상기 실시예 13에서 준비된 기판에 Avidin 계열의 단백질인 Neutravidin (Thermo, A2666)을 0.1 mg/ml 농도로 투입하였다. 상온에서 5분반응시킨후 PBS buf fer 30 를이용하여 2회 기판을세척하였다. 상기 준비된 기판에 상기 실시예 14 및 도 29에서 우수한 효과를 갖는 것으로 확인된 항 PD-L1 항체 9A11 (CST#29122)를 처리하여 2 ug/ml 정도의 양으로 약 5분 간처리하여， 표면에 항 PD-L1항체 (9A11)가코팅된 기판을준비하였다. 상기 준비된 기판을 PBS buf fer 30 ul를이용하여 2회 세척하여 이후시험에사용하였다.

실시예 12에서 준비된 GFP-PD-l(lOnM)과 mcherry-卵 -Ll(30nM) (PD-

L1의 경우 mcherry가 부착되지 않은 형태로도 사용 가능함)를 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 후보 물질과 함께 tube에서 30분동안 반응시킨 반응물을 20ul의 양으로상기 준비된기판에 가하여 15분간반응시켰다.

PD-L1, PD-MGFP 표지된 PD-1) , 및 후보 약물을 tube에서 동시에 반응 (one-step react ion)시킨 반응물을 기판에 처리하는 이유 (즉， 순차적으로처리하지 않은이유)는다음과같다:

억제제가 PD-L1/PD-1 _* 의 상호작용을 저해하는 경우는 크게 3가지로 구분할 수 있다: 1) 억제제가 PD-L1과 PD-1의 binding inter face에 강한 세기로 결합하는 경우; 2) 억제제가 (PD-1 independent ly) PD-L1의 특정 부위에 결합하여 PD-L1의 구조변화를유도하는경우; 및 3) 억제제가 (PD-

L1 independent ly) PD-1의 특정 부위에 결합하여 PD-1의 구조 변화를 유도하는경우.

본 시험을 one-step react ion ⁰ ] 아닌 stepwi se react ion (PD-L1 , inhibi tor , PD_1을 순차적으로 washing/binding 과정을 통하여 결합)에 의하여 수행하는 경우， 상기 1)번의 경우는 효과적으로 선별할 수 있는 반면， 2) 및 3) 번의 경우는， 약물과 target의 col l i sion자체가유도되지 않을수 있기 때문에， 검출에서 놓치는 populat ion이 생기게 되어, 정확한 억제 효과를 시험하는데 한계가 있다. 또한 one-step react ion을 하는 경우가시간적인 면에서도 효율적이므로, 본 실시예에서는 tube (Standard 1.5ml ep-tube)에서의 one-step react ion방식을채택하였다.

이후의 시험 과정은상기 실시예 16의 PPI complex의 이미징 (488 nm) 및 PPI complex분석 과정과동일하게수행하였다.

도 28a는본실시예의 억제제후보약물스크리닝 과정을모식적으로 보여준다.

도 28b는 tube에서의 one- step react ion의 반응 조건을 최적화하기 위한 시험 결과를 보여주는 것으로, 실시예 12에서 준비된 GFP-卵 -1와 mcherry-PD-Ll을 tube에서 혼합한후 30분또는 2시간동안 incubat ion하고, Fluorescence counts (F-counts)를추적한결과를보여주는그래프이다. 도 28b에서， 'Negat ive '는 tube에 mch-PDLl을 첨가하지 않은 반응물,

'Negat ived는 tube에 GFP-PD1을 첨가하지 않은 반응물을 각각 의미한다. 도 28b에서 확인되는 바와 같이， 30분 incubat ion을 진행한 경우와 2시간 incubat ion을 진행한 경우에서 PPI complex 개수는 큰 차이를 보이지 않았다.

卵 -1/PD-L1 상호작용 억제제 후보 물질로서 시판중인 두 종의 PD- 1/PD-L1 억제제인 BMS202 및 S7911 (이상， Sel leck Chem에서 구입)을 사용하여 얻어진 PPI complex 개수 (F-counts)를 도 28c에 나타내었다. 도 28c에서， PD-1/PD-L1 complex가 상기 억제제 처리 농도 의존적으로 감소하는것을확인할수 있다. 또한, BMS202의 경우에는, 정제된 단백질을 사용하여 계산된 IC5◦값과 유사한 정도의 IC50 값 (18nM)을 보이는 것을 확인하였다. 상기 결과는 본 실시예에서 수행된 PD-1/PD-L1 상호작용 측정에 의하여 PD-1/PD-L1억제제를정확하게판별할수있음을보� �준다.

PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 후보 물질로서 PPI l ibrary screening (http:/八 vww. asinex.com/ppi/)에서 제공하는 non-macrocycl ic PPI drug l ibrary 중에서 샘플링한 80개의 화합물을 luM의 양으로 사용하여 얻어진 PPI complex 개수 (F-counts)를 도 28d에 나타내었다. 도 28d의 결과에서, PD-1/PD-L1 complex 개수가 Control count 150개보다 적은 (예컨대， 100개 미만인) 약물 4종을 선별하였다 (플레이트 번호: Bl, B2, B3, 및 E2； 화합물 구조는 도 33 참조) . 약물 대신 DMS0를 처리하여 Negat ive control로사용하였고, BMS202를처리하여 posi t ive control로사용하였다. 상기 선별된 4종의 약물 (Bl, B2, B3, 및 E2)을 대상으로 t i trat ion을 진행하여 그 결과를 도 28e에 나타내었다 (각 약물에 표시된 4개의 눈금은 왼쪽부터 순서대로 lmM, 10uM, 100nM, InM를 나타내며, P는 약물 대신 DMS0를 처리하여 정상적으로 존재하는 PPI level을 확인한 결과를나타내고， 은 mch-PDLl을 coat ing하지 않은경우의 결과를나타냄) . 도 28e에 나타난 바와 같이， 대조 약물로 사용된 약물 A1의 경우 전혀 효능을보이지 않은반면， 선별된 4종의 약물 (Bl, B2, B3, 및 E2)은모두 농도 의존적으로 PD-1/PD-L1 상호작용 억제 효과를 나타내었다. 특히， B2가가장좋은효능을보였으며， 이는 시판 약물인 BMS202의 효능과동등 이상인정도로확인되었다.

실시예 16. 기판에 PD-1을고정시킨경우와 PD-L1을고정시킨경우의 비교

실시예 12내지 14의 과정을참조하여， 기판에 GFP PD-L1을고정시킨 경우와， GFP-PD-1을 고정시킨 경우의 PD-L1와 PD-1 간 단백질-단백질 상호작용（형광 complex개수: F counts）을측정하였다.

Total GFP- labeled count 및 형광 이미지를 도 30a에 나타내었다 （PSF cut of f >150）. 도 30a에 나타난 바와 같이， 기판에 GFP PD-L1을 고정시킨 조건과 GFP-抑- 1을 고정시킨 조건에서 유사한 결과를 나타냄을 확인할수있다.

GFP PD-L1및 GFP PD-1의 cluster rat io（%） （calculated by [Count @ PSF cut of f >350/Count @ PSF cut of f >150]）를 도 30b에 나타내었다. 상기 Cluster rat io %）는 PSF （point spread funct ion） cut of f 350이상으로 정의한 cluster populat ion을 cut of f 150이상의 total count로 나눈 값을 백분율로 표시한 값이다. 도 30b에 나타난 바와 같이， 기판에 GFP PD-L1을 고정시킨 조건에서, GFP-卵 -1을 고정시킨 조건과 비교하여， 40%이상증가한 cluster rat io를보이는것을확인할수있다.

실시예 17.항 PD-L1항체의 에피토프맵핑

PD-L1를 기판에 고정시키기에 적합한 항 PD-L1 항체의 에피토프 맵핑을 위하여， PD-L1 mutant construct를 설계하였다 （도 31a 참조）. 구체적으로, PD-L1 cytosol i c domain target ing ant ibody의 epi tope을 확인하기 위하여, PD-L1 cytosol ic domain delet ion mutant construct를 설계하였으며， 상기 mutant는 PD-L1 아미노산 서열 （ NP_001300958.1） 중, 아미노산 260-290번에 해당하는 cytosol ic part를 10개 단위로 나누어， 각각 d280 （281번째 이후의 아미노산 부위 결실） 또는 d270 （2기번째 이후의 아미노산부위 결실）의 변이를포함하는단백질을생산하였다.

실시예 12 내지 14를 참조하여, PD-L1 pul 1-down assay를 통하여， 앞서 （도 29 참조） PD-L1/PD-1 상호작용 측정에 효과적인 것으로 나타난 PD-L1 ant ibody （9A11）의 PD-L1 WT （야생형）, d280, 또는 d270 변이체에 대한 결합 정도 （항체와 PD-L1 간 결합에 의한 형광 complex 개수: F- counts）를 측정하여， 도 31b에 나타내었다. 도 31b에 나타난 바와 같이， PD-L1의 d280또는 d270변이체의 경우, 항체와전혀 결합하지 않는 반면， 의 경우에는 항체와 민감하게 결합하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여， PD-L1의 아미노산 280-290번에 해당하는 서열이 抑- L1/卵 -1 상호작용 측정에서 PD-L1을 기판에 고정화하기 위하여 사용되는 항체와의 반응에 중요하게 작용할것임을예측할수있다.

또한， PD-L1의 d280또는 d270 변이가 PD-1과의 상호작용에 미치는 영향을시험하기 위하여， PD-1/PD-L1상호작용을기반으로한면역침강실험 (실시예 14 참조)에 의하여 PD-1 (항 PD-1 항체를 이용하여 기판에 고정시킴)와 PD-Ll WT, d280, 또는 d270 변이체 간의 단백질-단백질 상호작용 정도를 측정하여， 도 31c에 나타내었다. 도 31c에 나타난 바와 같이， PD-L1의 d270변이체 및 d280변이체의 경우, 1T대비 약 70%정도의 수준으로 PD-1과의 결합력을보임을확인할수있다.

실시예 18 : HER2-HER3 heterodimer형성

HER3의 세포내 도메인 말단에 eGFP가 연결된 HER3_eGFP 재조합 유전자 (四 R3: NM_001982.3 BC082992.1, eGFP： MH087225 링커:

PTFLYKWDPVPVAT 또는 GGGSGGGT, 벡터: pEGFP-Nl addgene, pEGFP-Nl- FLAG))를 HER2-ove rexpressing SKBR3 breast cancer cel Is (한국세포주은행 또는 ATCC)에 electroporat ion을통해 주입하여, HER3의 과발현을유도한다. 5X1CT6개의 SKBR3 세포에 30ug의 HER3_eGFP pi asm id를 전기 천공법 (electroporat ion) 을 이용하여 transfect ion 한다 (전기 천공법 조건:

950V, 35ms , 2 pul se) . 90mm cul ture di sh에 1일동안배양하여 (RPMI1640, FBS 10%) SKBR3가 HER3_eGFP를 발현할 수 있도록 하였다. 기존의 배지를 제거하고 FBS를 넣지 않은 배지 (RPMI1640) 로 12 18시간동안 배양하여 불특정한생장인자의 영향을제거하였다.

상기 준비된 SKBR3에 NRGbl (lOOng/ml)을 투입하여 10분동안 incubat ion 하여， 세포 표면에서의 HER2 단백질과 HER3_eGFP 단백질의 헤테로다이머를형성을유도하였다 (도 34a참조) .

HER3-eGFP 발현량에 따른 HER2-HER3_eGFP heterodimer 생성 수준을 전반사 단분자 형광현미경 (single-molecule Total Internal Ref lect ion Fluorescence Mi croscope)으로 즉정하여， 그 결과를 도 34b에 나타내었다. 도 34b에 나타난 바와 같이， SKBR3에 HER3-eGFP plasmid를 도입시킨 후 NRGbl를 처리하지 않은 경우 HER2-HER3 heterodimer가거의 생성되지 않은 것에 반하여, NRGbl를 처리한 경우， HER2-HER3 heterodimer가 HER3-eGFP 발현량에 비례하여 증가함을 확인할 수 있다. 상기 결과는 NRGbl을 투입하여야, HER2-HER3 heterodimer를생성시킬수있음을보여준다.

또한， NRGbl를 세포 용해 전에 처리한 경우와 세포 용해 이후에 처리한 경우의 HER2-HER3 heterodimer 생성 수준을 전반사 단분자 형광현미경 (s ingl e-molecule Total Internal Ref lect ion Fluorescence

Mi croscope)으로측정하여， 그 결과를도 34c에 나타내었다. 세포용해는 용해 버퍼 ( 1% Digi tonin또는 1% GDN , 10% glycerol , 50mM HEPES-NaOH [pH 7.4] , 150mM NaCl , 2% protease inhibi tor cocktai l (Sigmaaldr i ch

P8340) %농도는 모두 w八 0를 사용하여 수행하였다. 도 34c에서와 바와 같이, NRGbl를 세포 용해 후에 처리한 경우 (즉, 세포 용해물에 NRGbl를 처리; Extract+NRGbl) , HER2-HER3 heterodimer가 NRGbl를 처리하지 않은 경우와유사한정도로거의 생성되지 않은 것에 반하여， ■Gbl를세포용해 전에 처리한 경우， HER2-HER3 heterodimer 생성 수준이 현저하게 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 rnGbl를 세포 용해 이전에 투여하여야 HER2-HER3 heterodimer를 생성시킬 수 있으며， 세포 용해와 동시 또는 그 이후에 NRGbl를투여하는경우 HER2-HER3 heterodimer를유의미한수준으로 생성시킬수없음을보여준다.

상기와 같은 세포 용해 이후에, 상기 세포 용해물을 기판에 처리해 HER2-HER3 heterodimer를 기판에 부착한 뒤 detergent로 세척하였다. detergent 종류에 따른 HER3 활성화 정도를 시험하기 위하여, detergent로서， DGTN(digi tonin) 0. 10%(w/v) , GDN 0.01%(w/v) , CHAPS0 (3- ( [ 3-Cho 1 am i dopropy "dimethyl ammon i o ) -2-hydroxy- 1-pr opanesu 1 f onat e ) 1.00%(w/v) , 0G(n-octy卜 P -D-glucos i de) 1.00%(w/v) , DDM(n-Dodecyl P -D- mal tos ide) 0.01%(w/v) , 및 TX100 0. 10%(w八 0를 각각사용하여 세척한후, HER3의 Y1289의 인산화정도를 전반사단분자형광현미경 (s ingle-mo lecule

Total Internal Ref l ect ion Fluorescence Mi croscope)으로 즉정하여， 그 결과를도 35e에 나타내었다.

도 35e에서와같이， 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를세척시， detergent로서 digi tonin 또는 를 사용하는 경우， HER3의 Y1289의 인산화 정도가 높게 나타난 반면， CHAPS0 , 0G , DDM , 및 TX100를 사용한 경우에는낮게나타남을알수있다.

또한， detergent 농도에 따른 HER3활성화정도를시험하기 위하여 , 대표적으로 digi tonin를 0. l%(w/v) , 0.05%(w/v) , 0.01%(w/v) 및 0.0%(W八) (무처리) 등의 다양한 농도로 사용하여 세포 용해물을 세척한 경우의 HER3의 Y1289의 인산화 정도를 전반사 단분자 형광현미경 (single molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 측정하여 , 그결과를도 35c및 35d에 나타내었다. 도 35c및 35d에 나타난 바와 같이， digitonin의 경우, 세포 세척시의 사용 농도를 약 0.05%(w/v) 이상으로 하는 경우에 HER3 활성화 정도가 우수하고， 이보다 낮은 경우, 활성화정도가감소함을확인할수있다.

상기와 같이 얻어진 HER2-HER3 heterodimer를 기판에 부착시켰다. 이를 위하여， 기판 (substrate)에 PEG, neutravidin, biotin, 및 anti_HER3 antibody를 표면처리 한 후 (아래 참조), 세포 용해물을 주입하여 HER2-

HER3 heterodimer를 기판 표면에 부착한 뒤， digitonin (0.1%(w八 0)로 세척한다.

(1) PEG표면처리

a. Coverslip과 quartz slide를 황산과 과산화수소 2:1 용액 (piranha 용액) 에 30분동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 증류수에

10분동안중화시켰다.

b. 중화된 coverslip과 slide를 18 M요 증류수에 5회 이상 세척하였다.

c . Coverslip과 slide를 ami nos i lane 용액 (3ml N_[3_ (Tr imethoxysi lyl )propyl ] ethyl enedi amine, 5m 1 acetic acid, 92ml methanol ) 에 20분동안 반응시키고, 반응이 끝나면 methanol로 2회 세척하고 methanol에 완전히 잠기게두었다.

d. 압축질소가스를이용해 준비된 coverslip과 slide를건조시켰다. PEG버퍼 (42mg Sodium bicarbonate, 347.5mg potassium sulfate을 5m 1 18 MQ 증류수에 용해)를준비하였다.

e. Slide에 PEG용액 (3mg biotin-PEG, lOOmg mPEG, at lml of PEG 버퍼에 용해)을도포한 뒤， coverslip으로 덮어 slide와 coverslip사이에 PEG용액이 골고루묻게하고， 2시간동안반응시켰다.

f . 반응이 끝난 coverslip과 slide를 18 증류수로 씻어 내고 압축 질소 가스로 건조시켰다. 완성된 coverslip과 slide는 PEG용액이 처리된 면이 접촉되지 않도록 50ml tube에 넣어 진공 포장 후 냉동하였다 (-20 ^° C). Coverslip과 slide의 PEG용액이 처리된 면에 어떠한 접촉도 없도록하였다. (2)조립 및사용

a. 얼려두었던 coverslip과 slide를 37 ^° C 인큐베이터에서 녹여 물방울이 맺히지 않도록하였다.

b. PEG처리된 coverslip과 slide의 면이 서로마주보도록하여 양면 테잎과 에폭시등을 이용하여 covers Lip과 slide 사이에 반응 chamber를 만들었다.

c. 에폭시가충분히 굳으면 neutravidin용액 (lOOug/ml neutravidin,

PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을 chamber에 넣고 5분동안반응시켰다.

d. Chamber에 남아있는 neutravidin용액을 PBS로 씻어내고 biotin conjugated된 항 HER2항체 (eBioscience, Cat .No. BMS120BT, clone 2G11) 또는 항 HER3 항체 (R&D systems , Cat .No. BAM348 , clone: #66201) (2~5ug/ml , PBS또는 0.1% Tr iton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 를넣고, 5분동안반응시켰다.

e. Chamber에 남아있는항체를 PBS로씻어내고， 상기 ,세포용해물을 주입한후, 15분동안반응시켰다.

f . Chamber에 남아있는 용해물을 washing buffer (0.1% digitonin, 또는 0.01% GDN, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol)로 세척하였다.

실시예 19. HER2-HER2 homodimer형성

실시예 18의 방법을 참조하여， HER2의 세포내 도메인 말단에 eGFP가 연결된 HER2-eGFP 재조합 유전자 (HER2: NMJ304448, 링커 PTFLYKWDPVPVAT 또는 GGGSGGGT, eGFP： MH087225, 벡터: pEGFP-Nl addgene pEGFP-Nl-FLAG)를 HEK293T 세포주 (한국세포주은행， 또는 ATCC)에 electroporation을 통해 주입하여， HER2의 과발현을 유도하고, 상기 세포 표면에서의 HER2-HER2 homodimer (HER2 homodimer로도표시함)의 형성을유도하였다 (도 34g참조). 상기 준비된 HER2 homodimer 형성 세포를용해 (lysis)한후， 기판에 처리해 HER2 homodimer를 부착한다. 부착된 HER2 homodimer를 detergent를 이용해 세척한다. 실시예 18의 시험과정을 참조하여， 다양한 detergent를 다양한농도로사용하여 부착된 HER2 homodimer를세척한결과얻어진 HER2 Y1196의 인산화 수준 (활성화 정도)을 도 35i에 나타내었다. 도 35i에서와 같이， detergent로서 DGTN(digitonin)를 0.05%(w/v) 이상 또는 0.10%(w/v) 이상을 사용하거나, GDN 0.01%(w/v) 이상 사용하여 부착된 HER2 homodimer를세척한경우, HER2활성화정도가높은것으로나타났다.

실시예 18의 과정을참조하여, 기판(substrate)에 PEG, neutravidin, biotin, 및 ant i-HER2 antibody를표면처리 한후， 세포용해물을주입하여, HER2 homodimer를 기판 표면에 부착시킨 뒤, 상기 DGTN(digitonin) 0.1%(w八0로세척했다.

이 때 얻어진 형광신호를 도 34h에 나타내었다. 도 34h에서， 1- step으로 형광 세기가 감소하는 경우는 monomer에 해당하고, 2-step으로 형광신호가감소하는 경우는 dimer에 해당한다. 도 34h에서， 상대적으로 monomer로존재할가능성이 높은 eGFP와 HER3_eGFP와비교하여 HER2_eGFP는 2-step의 비율이 높게 나왔으므로 HER2-eGFP homodimer의 생성을증명할수 있다.

Hidden Markov Model에 기반하여 raw data로부터 가장가능성이 높은 step (recursive calculation이 수렴하는 step)을정하여 분석하였다.

실시예 20. HER2-HER3 heterodimer의 tyrosine kinase의 활성도(activity)측정

면역 침전된 HER2-HER3 heterodimer (실시예 18에서 기판에 처리된 항체에 결합한 HER2-HER3 heterodimer)의 반응 챔버에 ATP와 ¾¾ ²⁺ 를 추가하고 5분동안배양하여, Tyr 인산화를유도하였다. 이후 pTyr-specific antibodies로 single-molecule immunolabel ing하여 HER3 pTyr levels의 변화를 관찰하였다. 상기 시험 과정을 도 35a에 모식적으로 나타내었으며 (1. 세포용해, 2. 기판에 dimer 부착, 3. 부착된 dimer 세척 , 4. ATP와 Mg2+을처리해 인산화， 5. HER3또는 HER2의 인산화 Tyr결합항체 처리， 6. 형광신호검출)， 그구체적인시험 방법은다음과같다:

실시예 18의 (2) 조립 및 사용에서， biotin conjugated HER3 antibody를 이용해 설명한 방법을 참조하여， 세포 용해물 (1~4 mg/ml)로부터 HER2-HER3 heterodimer를 표면에 pull-down한 뒤, 0.1% DGTN 또는 0.01% GDN, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl , 1% glycerol 를 이용해 남은 세포 용해물을 씻어내고， kinase assay용액 (0.1% DGTN또는 0.01¾» GDN, 200uM ATP, 10mM magnesium chloride, 50mM HEPES[pH 7.4] , 150mM NaCl, 1% glycerol)을처리하여 5분동안반응시켰다.

b. 남은 kinase assay 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고， HER3 pTyr antibody 용액 (HER3 pTyr antibody (monoclonal rabbit host) (Cell Signal ing Technology, Cat. No. #479 IS, clone：21D3) ~2ug/ml， PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을처리해 5분동안반응시켰다.

c. 남은 HER3 pTyr antibody용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4] , 150mM NaCl)로씻어내고, cy3 conjugated anti -rabbit FC antibody 용액 (polyclonal goat host ant i -rabbit FC antibody

(Jackson ImmunoResearch Labs, Cat .No.111-165-046) at 5nM, PBS또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을 처리하고, 5분 동안 반응시켰다.

d. 남은 cy3 conjugated anti -rabbit FC antibody용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고 Total

Internal Reflection Microscope을이용해 이미징 및 정량하였다.

이와 같이 얻어진 HER3 pTyr levels을 도 35b에 나타내었다. HER3 tail의 Tyr residues는총 9개이고， 본실시예에서는 Y1197, Y1222, Y1276, Y1289, 및 Y1328의 총 5개의 Tyr 잔기를 시험하였다. 도 35b에 나타난 바와 같이, pTyr 잔기 모두 ATP와 Mg2 ⁺ 배양에 의해 인산화 정도가 증가하였다.

실시예 21. HER2-HER2 homodimer의 tyrosine kinase의 활성도 (activity)측정

면역 침전된 HER2-HER2 heterodimer (실시예 19에서 기판에 처리된 항체에 결합한 HER2-HER2 homodimer)의 반응 챔버에 ATP와 Mf ⁺ 를추가하고 5분동안 배양하여, Tyr 인산화를 유도하였다. 이후 pTyr-specif ic antibodies로 single-molecule immunolabel ing하여 HER2 pTyr levels의 변화를관찰하였다. 상기 시험 과정을도 35g에 모식적으로나타내었으며， 그구체적인시험 방법은다음과같다:

a. 실시예 18의 (2) 조립 및 사용에서， biotin conjugated HER2 antibody를 이용해 설명한 방법을 참조하여, 세포 용해물로부터 HER2 homodimer를 표면에 pull-down한 뒤, 0.1% DGTN 또는 0.01% GDN 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol 를 이용해 남은 세포 용해물을 씻어내고， kinase assay용액 (0.1% DGTN또는 0.01% GDN, 200uM ATP, lOmM magnesium chloride, 50mM HEPES[pH 7.4] , 150mM NaCl , 1% glycerol ) 을 처리하여 5분동안반응시켰다.

b. 남은 kinase assay 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고, HER2 pTyr antibody용액 (HER2 pTyr antibody (monoclonal rabbit host) (Cell Signaling Technology, Cat.No.#6942S, clone:D66B7) ~2ug/ml , PBS또는 0.1% Tr iton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을처리해 5분동안반응시켰다.

c. 남은 HER2 pTyr antibody용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4] , 150mM NaCl)로씻어내고, cy3 conjugated anti -rabbit FC antibody 용액 (polyclonal goat host anti -rabbit FC antibody (Jackson ImmunoResearch Labs , Cat .No.111-165-046) at 5nM, PBS또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPEStpH 7.4], 150mM NaCl)을 처리하고, 5분 동안 반응시켰다.

d. 남은 cy3 conjugated anti -rabbit FC antibody용액을 PBS (또는

0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 로 씻어내고 Total Internal Reflection Microscope을이용해 이미징 및정량하였다.

이와 같이 얻어진 HER2 pTyr level크을 도 35h에 나타내었다. 도 35h에 나타난 바와 같이, HER2 tail의 Tyr residues Y1139, Y1196, Y1121/1222 및 Y1248의 거의 대부분에서 ATP와 Mg2 ⁺ 배양에 의해 인산화가 증가하였다 (인산화증가정도: Y1139의 경우， 대조군 (ATP+EDTA) 대비 약 23배; Y1196의 경우, 대조군 대비 약 13배， Y1121/1222의 경우， 대조군 대비 약 10배, 및 Y1248의 경우， 대조군대비 약 13배).

실시예 22. HER2-HER3 heterodimer의신호전달시험

도 36a에 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을보여주는모식적으로나타내었다.

실시예 20또는 21의 방법을참조하여 , HER2-HER3 heterodimer또는 HER2 homodimer의 신호전달정도를측정하였다.

하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과상호작용하는지를 형광신호의 크기로측정하여 도 36b에 나타내었다.

하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 측정하여 도 36c에 나타내었다 (black: ATP+EDTA, white: ATP+MgCh) .

하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 측정하여 도 36d에 나타내었다.

하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 측정하여 도 36e에 나타내었다 (black: ATP+EDTA, whi te: ATP+MgCh) .

하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85 alpha - pllO alpha complex)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로측정하여 도 36f에 나타내었다.

도 36g에 기판에 부착된 HER2 homodimer가인산화과정을거쳤을때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는모식적으로나타내었다.

하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질

(PLC gamma 1)과상호작용하는지를형광신호의 크기로측정하여 도 36h는에 나타내었다.

하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질

(PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 측정하여 도 36i에 나타내었다 (bl ack: ATP+EDTA, whi te： ATP+MgCl _{2) .}

하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 측정하여 도 36j에 나타내었다.

하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질

(p85 alpha)과 상호작용하는지를 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 측정하여 도 36k에 나타내었다 (black: ATP+EDTA, whi te： ATP+MgCl ₂₎ .

실시예 23. HER2-HER3 heterodimer와 HER2-HER2 homodimer의 인산화 속도비교

HER2-HER3 heterodimer를 사용한 실시예 20의 방법을 참조하여， 시간에 따른 HER3 Y1289의 인산화정도를 측정하여, 도 37a에 나타내었다. HER2-HER3 heterodimer가 세포의 prol i ferat ion을 강하게 유도한다는 것은 알려져 있었지만 효소적 특성은 알려지지 않았다. 도 37a는 HER2-HER3 heterodimer의 효소적 성능을 측정한 것이라고 할 수 있다 (인산화에 사용되는 연료인 의 특정한 농도에서 HER2-HER3 heterodimer가 얼마나 2019/132517 1»（：1^1{2018/016675

빨리 인산화를진행하는지 보여줌）. 도 37 ₃ 에서 X축은 인산화에 걸린시간, V축은해당시간동안인산화 양을나타낸다.

또한， 抑요2 -四묘31 ₁ 라 ₀ （1 _61' 를사용한실시예 20의 방법을참조하여， ? 농도를 증가시키면서 ｝世1?3 잔기의 인산화 속도를 측정하였다. 이는 ! ³ 의 농도에 따라 1 _{1 610} （1^ _61· 가인산화하는속도가어떻게 변하는지 알아보기 위한 것이다. 다양한 꾸 농도에서 인산화 속도를 측정하면 나타내는 척도인 ¾（마이캘리스 상수）과 （최대 측정할 수 있다. ¾은 인산화 속도가 최대 인산화 속도의 농도이며， ■에 해당하는 ^TP 농도에서 인산화 속도를 측정하면 최대 인산화 속도의 절반이 얻어지고， 최대 인산화 속도로 ₁₁₃₃₆ 가도달할수있는최대 인산화속도이다.

상기 얻어진 결과를 도 371）에 나타내었다 （점선은 붉은 선이 수렴하는 값을나타냄）. 도 371）의 데이터는주로 1?3의 1289를측정한 것으로， 다른 （1197， 1222, 1276, 1328）을 측정했을 때에도 비슷한 수준의 인산화 속도가 측정되는 것으로 보아 측정된 값이 특정 해당하는 것이 아님을 알 수 있다. 도 371）에서와 같이， 농도가 증가함에 따라서， 四묘3 잔기의 인산화속도도증가함을확인할수 있다. 비교를 위하여， 四묘2 -四요21 ₁₀₁₁₁₀ （1 _161· 를 사용한 실시예 21의 과정을 참조하여 , ?농도를증가시키면서 四요2 打 잔기 （凡196）의 언산화속도， ¾， 측정하여， 도 37（：에 나타내었다.

도 3개 및 37（：의 비교로부터 알 수 있는 바와 같이， ｝恨1?2- ，

100배 이상 빠르다는 것을 의미한다. 반면， 四묘2 -四묘3 느 근대 !"에서의 인산화의 ¾ ₁ 은 1?2-]101110 11161'와 비교하여 2배 이하의

[世1?2억제제인 18에서 기판에 부착된

1 _{1 61'0 11161·} 와 실시예 부착된 ｝世묘2 1 _{101110 111} 아 에 각각 처리한후， 실시예 20및 21의 과정을 참조하여, （100 ₁ 虛）와 ₁ 卵 _{63 1111} （±1 _0: ^（1 ₆ （10 ₁ ）를 처리하고 （이 때에도 0끄은 0.1%로, 0.01%로 유지해야함）， 각 HER2 dimer들의 활성화정도를측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 37d에 나타내었다. 도 37d에서， x축은 사용한 Lapat inib의 농도를 나타내고, y축은 표준화된 인산화 정도를 나타낸다. HER2-HER3 heterodimer의 활성화는 HER3 pY1289 항체를 이용해 측정한 것으로 Lapat inib이 없을 때를 100%로 하여 표준화하였고， HER2 homodimer의 활성화는 HER2 pY1196 항체를 이용하여 측정한 것으로 Lapat inib이 없을 때를 100%로 하여 표준화한 값이다. 도 37d에 나타난 바와 같이，

Lapat inib은 Lapat inib에 저항성이 없는 HER2 -homodimer와 HER2-HER3 heterodimer에 유사한저해곡선을보이는것으로확인돠었다.

실시예 18에서 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer와 실시예

19에서 기판에 부착된 HER2 homodimer에， Lapat inib, ATP （lOOuM） , 및 magnesium chlor ide（10mM）를 함께 처리하고（이 때에도 DGTN은 0.1%로, GDN은 0.0B로 유지해야 함）， HER2의 활성화 정도를 측정하여， 그 결과를 도 37e에 나타내었다. 도 37e에서와 같이, HER2 homodimer와 비교하여， HER2-HER3 heterodimer의 경우, HER2 homodimer와 비교하여, Lapat inib에 의한 저해 효과가 낮게 나타났다. 이러한 결과는 HER2-HER3 heterodimer 발현 세포가 ATP와 magnesium 존재 하에서 （Tyr 인산화 가능한 경우）

Lapat inib에 대하여 저항성을 가짐을 보여준다. 앞서 HER2-HER3 heterodimer가 HER2 -homodimer와 비교하여 인산화 속도가 현저히 빠르다는 것이 확인되었으므로， 이러한 인산화 속도가 저해제 （Lapat inib）에 대한 저항성과 관련이 있다고 할 수 있다 （즉， 인산화 속도가 빠를수록 저해제 저항성이 잘나타난다고볼수있음） .

인산화 속도와 저해제 저항성 간의 상관 관계를 보다 명확하게 확인하기 위하여， HER2-HER3 heterodimer 발현 세포 용해액에， Lapat inib, ATP （lOOuM）, 및 magnesium chlor ide（10mM）와 함께（이 때에도 DGTN은

0.1%로, GDN은 0.01%로 유지해야 함）, PTPN1 （Protein Tyrosine Phosphatase, Non-receptor type 1; ProSpecbio, Cat .No. PKA-219）을 처리하고， HER3 Y1289의 인산화 수준을 측정하여, 도 37f에 나타내었다. PTPN1는 탈인산화 효소로서， Tyr 인산화와 탈인산화 과정 사이의 평형을 형성하고， HER2-HER3 heterodimer를 구조으로는 변화시키지 않으면서 실질적 인산화 속도를 효과적으로 늦추는 역할을 한다. 도 37f에 나타난 바와 같이， PTPN1의 처리 농도가 높아짐에 따라 （도 37f에서 붉은색 그래프（가장 오른쪽）에서 보라색 그래프（가장 왼쪽）로 갈수록）， 실질적인 인산화속도가느려지며, Lapatinib에 의한인산화저해 효과는증가담 (즉， 더 낮은농도의 Lapatinib에도인산화가저해 됨)을확인할수있다.

실시예 25. 이종이식동물모델및 인간환자시료에 대한단일분자 면역 표지 (Single-molecule immunolabelin) 및 co-IP 프로파일링 (co-IP profiling)

모든 동물 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee (IA⑶ C)으로부터 승인받은 지침에 따라 수행하였다. 6 내지 8주령의 암컷 마우스 (severe combined immunodef icient (NOG) and nude (nu/nu) mice； OrientBio)를사용하였다. 임상종양샘플 (폐선암종 (lung adenocarcinoma) 환자유래)을 ~3 nun ³ 크기의 조각으로절단한후， 상기 N0G마우스의 옆구리 내부로피하 이식 (subcutaneous implantation) 하였다. 이식 투 1~4개월 경과후， 이식된 부위에서 종양이 관찰되었다. caliper로 주 2회 종양의 체적을 측정하여 종양의 피하 성장률을 측정하였다. 종양 크기가 직경 1.5cm에 도달하였을 때, 종양 조직을 절제하고 작은 절편 (대략 5 mm ³ 크기)으로 절단하였다. 상기 절단된 조직을 다른 마우스 집단에 재이식하여 속발성 종양 (subsequent tumors)을 얻었다. 환자유래 종양을 갖는마우스세대를 F0이라명명하고, 이후의 후속세대는차례대로번호를 매겼다 (FI, F2, F3 등). 3세대 (F3) 마우스를 vehicle (Phosphata buffered saline, PBS) , osimert inib, 또는 gefitinib 처리 시험에 사용하였다 (PDTX-A1).

Patient PI은진행성 질환 (progressive disease； PD) 진단전에 약 1년 반동안 gefitinib치료에 대한부분적 반응성 (partial response； PR； 고형 종양에서의 반응성 평가 기준 (response evaluation criteria in solid tumors； RECIST) i 따른 부분적 반응성)을 유지한 반면, Patient P2는 PD designation 전에 1년 동안 stable disease (SD) diagnosis를 유지하였다.

상기 PDTX-A1 및 인간 환자 샘플 P1 (진행성 질환 (progressive disease； PD) 진단 전에 약 1년 반 동안 gefitinib 치료에 대한 부분적 반응성 (partial response； PR； 고형 종양에서의 반응성 평가 기준 (response evaluation criteria in sol id tumors; RECIST)에 따른 부분적 반응성)을유지하는폐선암종환자유래 암조직 시료; EGFR genotype : exon 19)로부터 유래된 mutant EGFR 복합체에 대하여 in vitro 탈인산화를 수행하였다 (도 38). 탈인산화 후， eGFP- labeled PLC-gammasH2 및 Grb2와, mutant EGFR 복합체와의 결합을 측정하였다 _. 탈인산화에 의하여， pTyr-SH2 도메인 상호작용에 전적으로 의존하는 PLC-gamma _SH2 의 결합은 거의 완전하게 중지되는 반면， Grb2 binding counts의 50%이상 및 80%이상은 탈인산화 후에도 유지되었다. 이렇나 결과는 mutant EGFR의 pTyr- independent signaling mechanism이 PDTX모델과외과적 종양조직에서 실제로작동함을 제안한다.

실시예 26. EGFR돌연변이의 Grb2와의상호작용에 대한영향시험 돌연변이된 EGFRs가 Grb2와 상호작용하는데 티로신키나아제 활성을 필요로 하는지 여부를 시험하기 위하여， EGFR에 특이적인 TKI 인 게피티닙을 24시간동안 EGFR돌연변이（pTyr 1068및 1086）를갖는 4종의 세포 （PC9， HCC827, HCC1006, H1975）에 처리하였다. 그 후, 게피티닙 처리된 세포를 용해시키고, EGFR ᅵ _{11111111110-1} ） （^ ₁ ）11 ₃₁ ^ ₀₁₁ 을 수행하였다. 게피티닙에 의한 EGFR 티로신키나아제 저해는 엑손 19결실 （gatekeeper mutations은 갖지 않음）을 갖는 3개의 세포에 대한 Grb2 결합을 거의 완전히 억제하였다（도 39a）. 일부 residual EGFR-Grb2 PPI count는 L858R 및 T790M gatekeeper 돌연변이를 갖는 H1975세포에서 관찰되었다. 또한， osimert inib （gatekeeper mutations을 갖는 EGFR에 똑같이 잘 결합하는 3 세대 TKI）를 처리함으로써 H1975세포에서 Grb2결합을 완전히 억제함을 확인했다（도 39a,파란색 점）.

앞서 살펴본 바와 같이， TKI 처리로 인해 Grb2와 돌연변이 EGFR 사이의 결합이 완전히 억제되었다.이러한현상을보다더 관찰하기 위하여, 우리는 single-molecule immunolabel 1 ing scheme을 사용하여 EGFR의 다른 알려진 상호 작용 파트너의 co-IP를시험하여 ,그 결과를그림 도 39b_g에 나타내었다.

우선， 내인성 HSP90（알파 isoform）의 co-IP 수준을 정량화하였다. HSP90의 association은돌연변이 EGFR에 대해 선택적으로관찰되었으며 （도 39b； 청색 대 흑색 막대）， 이러한 HSP90 association은 시험관내 탈인산화 처리에 내성을갖는것으로나타났다（도 39b； 흑색 대 붉은막대）.그러나, 24시간동안 TKI를 처리함으로써 돌연변이 EGFR에서 HSP90을 거의 완전히 분리시킬 수 있었다 （도 39b； 검은 색 대 노란색 바）. 게피티닙 처리 24 시간 후 돌연변이 EGFR과 관련된 GAPDH가 더 많았지만， MIG6（천연 EGFR 억제제） 및 GAPDH35에 대하여 유사한 패턴을 관찰하였다 （도 39c, d）. 대조적으로， Shbl （Grb2 결합 20에 대한 잘 알려진 지지체）은 WT 및 돌연변이 EGFR（도 39e）에 걸쳐 유사한수준의 결합을나타냈다.

시험관내 탈인산화후 Shcl과 WT EGFR의 상호 작용이 감소되었지만， 돌연변이 EGFR과의 결합은 HSP90, MIG6 및 GAPDH에서 관찰된 것과 유사한 정도의 시험 관내 탈인산화에 대한 저항성을 보였다. 또한, 24 시간의 게피티닙 처리로 인하여 Shcl과 WT 및 돌연변이 EGFR과의 연관성（associ at ion）이 안정화되거나 심지어 증가하였다. 이러한 결과는 Shcl이 돌연변이 EGFR과선택적으로 연관된 다른단백질과다르게 행동함을 나타낸다. 마지막으로， single molecule immunolabel 1 ing technique을 사용하여， TKI 치료가 전체 EGFR수준에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 （도 39f）.

상기 결과는， WT EGFR에 대한 Grb2의 결합은 일차적으로 표준 경로（canonical pathway）에 의해, 즉 pTyr 1068및 1086과 Grb2 SH2도메인 사이의 상호작용을통해, 매개된다는것을제안한다.

이와 대조적으로， 돌연변이 EGFR은 표면 노출 pTyr 잔기에 최소한 의존하는 근본적으로 다른 메카니즘을 이용한다. 돌연변이 EGFRs가 WT EGFR보다더 큰신호 전달복합체를 형성한다는 것을관찰하였다. 이러한 신호 전달복합체의 일부구성 요소는 Grb2에 대하여 pTyr 독립적인（pTyr- independent） 방식으로 인력을작용시킨다. 이러한비공식（non-canonical） 경로는 인산가수분해효소의 탈인산화 작용에 대하여 큰 저항성을 가지며

EGFR 돌연변이가 있는 암이 자극성 리간드가 없을 때 EGFR 신호 전달을 유지하는 방법을 설명할 수 있다. 또한， 돌연변이 EGFR과 c-Cbl （및 Cbl- b）의 co-IP수준이 WT EGFR보다현저하게 낮다는 것을 발견했다 （도 39g）. 이러한 결과는 돌연변이 EGFR에 특유의 신호 전달 복합체가 EGFR이 분해되는과정을방해한다는것을시사한다.

도 39a~g의 결과를 보면， EGFR로 침강하였을 때，

PC9/HCC827/HCC4006의 경우 HSP90a가 EGFR과함께 유난히 많이 나오는것을 볼 수 있다. 이는 해당 세포들이 EGFR 신호전달에 의존하는 동시에， HSP90a라는 accessory단백질도 동시에 사용함을 제안한다. 그러므로 EGFR 억제제와 HSP90a를 동시에 사용하거나, 혹은 HSP90a 억제제를 단독으로 사용시에도 어느 정도 소망하는 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 반면 EGFR이 정상형태인 H1666+세포주에서는전혀 작동하지 않음도확인할 수있다. 2019/132517 1»（：1/10公018/016675