CUI HAN (CN)
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北京润泽恒知识产权代理有限公司 (CN)
| 1、 激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在于： a )通过激发光束产生系统（ 1 )产生激发光， 经过第一分光系统（8 )、 物镜（ 10 )后， 聚焦在被测样品（ 11 )上， 并激发出瑞利光和载有被测样品 ( 11 )光语特性的拉曼散射光， 激发出的拉曼散射光和瑞利光被系统收集回 光路中， 经过物镜（ 10 )后被第一分光系统（ 8 )反射至二向色分光系统（ 13 ), 经二向色分光系统（13 )分光后， 拉曼散射光和瑞利光相互分离， 瑞利光被 反射进入差动共焦探测系统 （ 14 ) , 拉曼散射光透射进入光谱探测系统 ( 22 ) , 利用差动共焦曲线（43 )过零点与焦点位置精确对应这一特性， 通 过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息， 实现高空间分辨的 光谱探测； b ) 只对接收到的瑞利光信号进行差动相减处理时， 系统可以进行高空 间分辨的三维尺度层析成像； 只对接收到的拉曼散射光的光谱信号进行处 理时， 系统可以进行光谱探测； 同时对接收到的瑞利光和拉曼散射光的信 号进行处理时， 系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像， 即被测样 品几何位置信息和光语信息的高空间分辨的 "图谱合一" ； c) 差动共焦曲线 ( 43 )过零点处精确对应物镜 ( 10 )的焦点 0, 测量过 程中可以实时对被测样品 ( 11 )进行精确跟踪定焦， 保证被测样品（ 11 )在 整个测量过程中始终处于焦点位置， 抑制环境温度和振动等因素对光谱测 量的影响， 从而提高测量精度； d )差动共焦曲线（43 )过零点处对应测量物镜（10 ) 焦点 0, 此处聚 焦光斑尺寸最小， 探测的区域最小， 线性区域 BB'其他位置对应物镜（ 10 ) 的离焦区域， 在焦前或焦后 BB'区域内的聚焦光斑尺寸随离焦量增大而增 大， 利用此特点， 通过调整样品的 z向离焦量， 并根据实际测量精度需求来 控制聚焦光斑的尺寸， 实现对样品探测区域大小可控。 2、 根据权利 1所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在于： 激发光束是偏振光束： 线偏光、 圓偏光、 径向偏振光； 或是由光瞳滤波技 术生成的结构光束， 其与光瞳滤波技术联用可以压缩测量聚焦光斑尺寸， 提高系统横向分辨力。 3、 根据权利 1所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在于： 该系统还用于探测散射光谱,所述散射光谱包括探测荧光、 布里渊散射光、 康普顿散射光的散射光谱。 4、 激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于： 包括激发光束产生系统（ 1 ) 、 第一分光系统（8) 、 物镜（ 10) 、 三维 扫描工作台 （12) 、 二向色分光系统（13) 、 光语探测系统（22) 、 差动共 焦探测系统（14)及数据处理模块（34) ； 其中， 第一分光系统（8) 、 物镜（10) 、 三维扫描工作台 （12) 沿光 路依次放置在激发光束产生系统（1 ) 出射方向， 二向色分光系统（13)位 于第一分光系统（8) 的反射方向， 光谱探测系统（22)位于二向色分光系 统（13) 的透射方向， 差动共焦探测系统（14)位于二向色分光系统（13) 的反射方向， 数据处理模块（34)与光语探测系统（22)和差动共焦探测系 统（ 14 )连接； 或者,激发光束产生系统（1 )放在第一分光系统（8)的反射方向， 二向 色分光系统（13) 沿光路依次放在第一分光系统（8) 的透射方向， 光语探 测系统（ 22 )位于二向色分光系统（ 13 )的透射方向， 差动共焦探测系统（ 14 ) 位于二向色分光系统（13)的反射方向， 数据处理模块（34)连接差动共焦 探测系统 ( 14)与光语探测系统（22)；所述数据处理模块（34)配置为融合 并处理光语探测系统（22) 与差动共焦探测系统（14)采集到的数据。 5、 根据权利 4所述的激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于： 所述光谱探测系统（22)是普通光谱探测系统， 包括沿光路依次放置的第七 聚光镜（46) 、 位于第七聚光镜（46)焦点位置的第二光语仪 (47)及位于 第二光语仪 (47)后的第五探测器（48) ， 所述普通光语探测系统配置为被 测样品的表层光谱探测； 或者，所述光谱探测系统（22)是共焦光语探测系统， 包括沿光路依次 放置的第四聚光镜（ 23 )、 位于第四聚光镜（ 23 )焦点位置的第四针孔（ 24 )、 位于第四针孔（24)后的第五聚光镜（25) 、 位于第五聚光镜（25)焦点位 置的第一光语仪 (26)及位于第一光语仪 (26)后的第三探测器（33) , 所 述共焦光谱探测系统配置为提高系统信噪比和空间分辨力， 以及对被测样 品的层析光语探测。 6、 根据权利 4所述的激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于： 激发光束产生系统（1 )还包括偏振调制器（6)及光瞳滤波器（7) , 所述 偏振调制器（6)配置为产生偏振光,所述光瞳滤波器（7)配置为产生结构光 束。 7、 根据权利 6所述的激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于： 设置为压缩激发光斑的光瞳滤波器（7)可以位于偏振调制器（6)与第一分 光系统（8)之间， 还可以位于第一分光系统（8)与物镜（10)之间。 8、 根据权利 4所述的激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于： 还包括第四分光系统（40)及位于第四分光系统（40)反射方向的显 观察 系统（37) , 所述显微观察系统（37)配置为被测样品粗瞄； 其中， 第四分 光系统（40)可以位于激发光束产生系统（1 )与第一分光系统（8)之间， 或者位于第一分光系统（8)与物镜（10)之间。 9、 根据权利 4所述的激光差动共焦图谱显微成像装置， 其特征在于,数 据处理模块（34) 包括:配置为处理位置信息的差动相减模块（35)，和配置 为融合位置信息与光谱信息的数据融合模块（36) 。 10、 激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在于,包括： A、 在横向扫描被测样品 （11)的过程中： 实时针对每个确定的扫描 点， 根据轴向探测的一组差动共焦强度响应信号对物镜 ( 10)进行精确跟踪 定焦； 在定焦后， 利用差动共焦曲线（43)过零点与焦点位置精确对应这一 特性 , 通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光语信号； 其中， 所述差动共焦信号和光语信号通过以下步骤获得： 通过激发光束产生系统 (1)产生激发光束， 所述激发光束经过按先后顺 序排列的第一分光系统（8)和物镜（ 10)后， 聚焦在被测样品 （ 11 )上， 并激发出瑞利光和载有被测样品 ( 11 )光语特性的拉曼散射光； 所述瑞利光 和拉曼散射光被系统收集回光路中， 经过物镜（10)和第一分光系统（8) 后,进入二向色分光系统（ 13 )进行分光， 所述瑞利光被反射进入差动共焦探 测系统（ 14 ) , 通过差动共焦探测系统（ 14 )获得载有被测样品（ 11 )几何 位置信息的差动共焦强度响应信号， 所述拉曼散射光透射进入光谱探测系 统（22 ) , 通过光语探测系统（22 )获得载有被测样品（11 )光语特性的光 谱信号； Β, 在对被测样品（11 )的横向上的每个扫描点,按上述步骤进行实时跟 踪定焦再精确捕获扫描点的光语信号后， 获得一组载有被测样品 ( 11 )几何 位置信息的差动共焦信号和载有被测样品 ( 11 )光语特性的光语信号， 将信 号传送至数据处理系统（34 )进行处理;其中,所述处理包括： 只对差动共焦 信号进行处理， 系统进行高空间分辨的三维尺度层析成像； 和 /或， 只对光 谱信号进行处理， 系统进行光谱探测； 和 /或， 同时对差动共焦信号和光谱 信号进行处理， 系统进行高空间分辨的微区图谱层析成像， 所述微区图谱 层析成像为被测样品几何位置信息和光谱信息同时探测的高空间分辨的 "图谱合一" ； 其中， 在精确捕获光谱信号的过程中， 还包括： 利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺 寸。 11、 根据权利 10 所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在 于， 所述实时针对每个确定的扫描点， 根据轴向探测的一组差动共焦强度 响应信号对物镜（10 )进行精确跟踪定焦,包括： A1 , 在所述扫描点所在横向平面位置， 进行轴向扫描， 获得一组差动 共焦强度响应信号， 将所述差动共焦强度响应信号传送至数据处理系统 ( 34 ) , 数据处理系统（34 )将差动共焦强度响应信号拟合成差动共焦曲线 ( 43 ) , 根据所述差动共焦曲线确定物镜（10 ) 的焦点。 12、 根据权利 10或 11所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征 在于， 所述在定焦后， 利用差动共焦曲线（43 )过零点与焦点位置精确对应 这一特性， 通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光语信号包括： Α2, 根据所述定焦后的物镜（10 ) 的焦点， 将所述物镜（10 )和 /或被 测样品（ 11 )进行轴向移动， 使被测样品（ 11 )处于物镜（ 10 )的焦点位置； A3 , 捕获被测样品（ 11 )在焦点位置的拉曼散射光， 收集回光路， 并通 过光语探测系统（22 )获得载有被测样品 （11 )光谱特性的光语信号。 13、 根据权利 10 所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在 于， 所述利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据实际测量 精度需求来控制聚焦光斑的尺寸具体包括： 根据差动共焦曲线 （43 ) 线性区域 BB'的非焦点位置对应物镜（10 ) 的 离焦区域， 并且在 BB'区域内的焦前或焦后位置聚焦光斑尺寸随离焦量增大 而增大的特点， 利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据实 际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸， 实现对样品探测区域大小可控。 14、 根据权利 10 所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在 于： 所述激发光束是偏振光束,所述偏振光束包括： 线偏光、 圓偏光、 径向 偏振光； 或是由光瞳滤波技术生成的结构光束， 所述由光瞳滤波技术生成 的结构光束用于压缩测量聚焦光斑尺寸， 提高系统横向分辨力。 15、 根据权利 10 所述的激光差动共焦图谱显微成像方法， 其特征在 于： 还能够探测散射光谱，所述散射光谱包括荧光、 布里渊散射光、 康普顿 散射光的散射光谱。 |
技术领域
本申请属于光学显微成像及光谱测量技术领域 ， 涉及一种激光差动共 焦图谱显微成像方法与装置， 可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱 探测。 技术背景
1990年 G. J. Puppels等在 Nature期刊报道其发明的将拉曼光谱探测技术 与激光共焦显微技术结合的激光共焦拉曼光谱 显微技术， 是拉曼技术的一 次革命性突破。 该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像 特征， 又可 以对样品进行光谱分析， 因此可以实现对样品微区光谱的高分辨层析探 测。 此显著优点使激光共焦拉曼光谱显微技术在光 谱测试领域独树一帜， 并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成 分分析的重要手段，使之广泛 应用于化学、 生物学、 医学、 物理学、 地质学、 法庭取证、 刑侦学等学科 的前沿基石出研究中。
目前， 典型的激光共焦拉曼光语探测仪的原理如图 2所示， 激光沿光路 依次经过第一聚光镜、 第一针孔、 第八聚光镜、 第一分光系统、 四分之一 波片、 物镜后， 聚焦在被测样品上， 激发出载有样品光谱特性的拉曼散射 光； 移动被测样品， 使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通 过四分 之一波片并被第一分光系统反射， 经过第四聚光镜、 第四针孔、 第五聚光 镜后聚焦进入第一光谱仪进行光谱探测。
现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空 间分辨探测能力提出了 更高的要求， 若要提高空间分辨力， 必须对系统进行精确定焦。 在光学探 测系统中， 当测量聚焦光斑位于焦点时其尺寸最小， 激发光强最强， 因此 为了获得高空间分辨力， 必须能够捕获到激发光强最强处的光谱， 从而获 得其最佳空间分辨力和最优的光语探测能力。 如图 1所示， 现有的共焦显微 技术在激光激发焦点 0附近的 BB'区域（与过零点斜率差不大于 10%的区域） 内， 均能激发出样品的拉曼光谱， 并能被针孔后的光谱探测系统探测。 因 而共焦拉曼光谱显微技术的实际探测位置往往 处于共焦曲线中离焦的 BA 和 A'B'区， 从而导致实际探测的"微区"远大于测量光束焦 0 处光斑尺 寸， 同时， 应用拉曼光谱进行共焦定位信噪比较低， 并且由于针孔的遮挡 作用会进一步降低拉曼光谱的能量， 而扩大针孔尺寸提高光谱通过率则会 增加共焦轴向定位曲线的半高宽， 降低其定位精度， 而现有共焦拉曼系统 中的共焦针孔尺寸通常在 150μη！〜 200μιη之间， 所用针孔尺寸相对较大， 亦 不能很好的起到定焦作用。 上述原因限制了共焦拉曼光谱显微系统探测微 区光谱的能力， 制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中 的应用， 因 而提高系统的定焦精度是提高其空间分辨力的 关键。
1996年 Kimberley F等人在《Description and Theory of a Fiber- Optic Confocal and Super-Focal Raman Microspectrometer》 中提出用光乡千束代替共 焦拉曼光谱显微镜的针孔的方法， 实现"针孔"尺寸的非机械调节， 其在扩 大"针孔"时， 并不降低系统的光谱分辨力； 2007 年 E Kenwood Blvd等在 《 Very efficient fluorescent background suppression in confocal Raman microscopy Department of Physics》 中提出通过使用 3-4ps的皮秒激光器结合 相应的瞬时曝光技术使样品测量的荧光背景降 低了约 3个数量级， 提高了共 焦拉曼光语显微术的分辨力； 2008 年 N.Everall 等在 《The Influence of Out-of-Focus Sample Regions on the Surface Specificity of Confocal Raman Microscopy》中指出采用大数值孔径（NA=1.4 )油浸物镜， 可获得了比传统 共焦拉曼光谱仪更高的轴向分辨力和信噪比， 但是这种方法需要对样品进 行制片， 不能实现非接触和无损测量， 限制了系统的应用范围； 2009年 M. J. Pelletier和 Neil J. Everall等在 《Control of Out-of-Focus Light Intensity in Confocal Raman microscopy using optical preprocessing》 中提出利用校正物镜 或结构光瞳掩模消除了离焦位置拉曼散射的光 谱强度的干扰， 提高了光谱 探测效率， 大大降低了共焦拉曼系统离焦拉曼光谱对其有 效深度分辨力的 影响。
上述研究， 主要集中在共焦拉曼光谱显微系统涉及的光源 系统、 光谱 探测系统、 聚焦物镜系统、 光谱信息处理等方面， 虽然改善了光谱系统的 总体性能， 但在共焦拉曼光谱系统空间分辨能力的方面却 没显著改善， 提 高拉曼光语系统的空间分辨力仍是悬而未决的 问题。
在物理化学、 生物医学、 薄膜和药物等研究领域， 分析样品的化学成 分、 空间分布、 表面物理化学性质时常以图像的形式来获取样 品更多的信 息， 因此需要将拉曼光谱探测由单点分析方式拓展 到对一定区域范围内样 品进行探测分析， 即拉曼光谱成像。 然而， 为了获得更精确、 更丰富的测 量信息， 拉曼光谱成像时既需较长的单点激发拉曼光谱 探测时间， 又需对 样品进行多点拉曼光谱探测， 其结果势必使拉曼光谱成像需要较长的探测 时间， 常达几个小时才能完成成像。 但是， 仪器长时间成像过程中受环境 温度、 振动、 空气抖动等的影响较大， 易使仪器系统产生漂移， 从而导致 样品被探测位置离焦； 由于现有共焦拉曼光谱探测技术不具备实时焦 点跟 踪能力， 因而在整个成像过程中， 无法补偿样品的探测位置偏移引入的离 焦误差， 制约了共焦拉曼光谱成像技术空间分辨能力的 提高。
共焦拉曼光谱探测技术在毒品探测、 宝玉石真伪鉴别、 油气勘探、 化 学分析以及考古等研究领域对其探测聚焦光斑 的尺寸要求有所差异， 而现 有的共焦拉曼探测技术无法精确控制聚焦光斑 尺寸的大小， 其结果亦限制 了共焦拉曼光语成像技术在各领域中的应用。
现有共焦拉曼光谱探测仪器中， 系统收集到的样品散射光束中包含的 拉曼散射光极其微弱， 只有系统收集到的样品散射光束中包含的瑞利 光束 的 ιο- 3 ~ ιο- 6 倍， 因此， 在共焦拉曼光语探测中如何利用现有光语探测 系统 中遗弃的强于拉曼散射光 10 3 ~ 10 6 倍的瑞利光束进行辅助探测是改善共焦 拉曼光语探测技术空间分辨力的新途径。
基于上述情况， 本申请提出差动共焦探测系统利用现有共焦拉 曼光谱 探测系统收集到的样品散射光中遗弃的强于样 品拉曼散射光 10 3 ~ 10 6 倍的 瑞利光束进行高精度探测， 使其与光谱探测系统有机融合， 进行空间位置 信息和光谱信息的同时探测， 以期实现高空间分辨力、 测量聚焦光斑尺寸 可控的 "图谱合一"的差动共焦图谱成像与探测， 而实现高空间分辨力的光 谱探测是目前光谱显微测试领域亟待解决的问 题， 具有极其重要的理论和 学术价值。
本申请专利的具体思路是： 将激光差动共焦技术与光谱探测技术有机 结合， 差动共焦系统利用系统收集到的样品散射光中 的瑞利光束对聚焦光 斑的焦点进行实时跟踪与空间位置探测， 光谱探测系统利用系统收集到的 样品的散射光中的拉曼散射光进行光谱探测， 然后再将差动共焦探测系统 信号与拉曼光谱探测系统信号有机融合， 从而实现激光差动共焦拉曼光谱 系统的焦点跟踪探测和光斑尺寸可控探测， 即实现拉曼光谱的高空间分辨 探测。 发明内容
本申请的目的之一是为了克服现有共焦拉曼光 谱探测技术空间分辨力 难以提高的不足， 提出一种具有高空间分辨力的激光差动共焦图 谱显微层 析成像方法和装置。
本申请提供的激光差动共焦图谱显微成像方法 ， 包括：
a )通过激发光束产生系统（ 1 )产生激发光， 经过第一分光系统（8 ) 、 物镜（ 10 )后， 聚焦在被测样品（ 11 )上， 并激发出瑞利光和载有被测样品
( 11 )光语特性的拉曼散射光， 激发出的拉曼散射光和瑞利光被系统收集回 光路中， 经过物镜（ 10 )后被第一分光系统（ 8 )反射至二向色分光系统（ 13 ), 经二向色分光系统（13 )分光后， 拉曼散射光和瑞利光相互分离， 瑞利光被 反射进入差动共焦探测系统 （ 14 ) , 拉曼散射光透射进入光谱探测系统
( 22 ) , 利用差动共焦曲线（43 )过零点与焦点位置精确对应这一特性， 通 过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的光 谱信息， 实现高空间分辨的 光谱探测；
b ) 只对接收到的瑞利光信号进行差动相减处理时 ， 系统可以进行高空 间分辨的三维尺度层析成像； 只对接收到的拉曼散射光的光谱信号进行处 理时， 系统可以进行光谱探测； 同时对接收到的瑞利光和拉曼散射光的信 号进行处理时， 系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像 ， 即被测样 品几何位置信息和光语信息的高空间分辨的 "图谱合一" ；
c) 差动共焦曲线 ( 43 )过零点处精确对应物镜 ( 10 )的焦点 0, 测量过 程中可以实时对被测样品 ( 11 )进行精确跟踪定焦， 保证被测样品（ 11 )在 整个测量过程中始终处于焦点位置， 抑制环境温度和振动等因素对光谱测 量的影响， 从而提高测量精度；
d)差动共焦曲线（43)过零点处对应测量物镜（1 0) 焦点 0, 此处聚 焦光斑尺寸最小， 探测的区域最小， 线性区域 BB'其他位置对应物镜（ 10) 的离焦区域， 在焦前或焦后 BB'区域内的聚焦光斑尺寸随离焦量增大而增 大， 利用此特点， 通过调整样品的 z向离焦量， 并根据实际测量精度需求来 控制聚焦光斑的尺寸， 实现对样品探测区域大小可控。
优选的，所述激发光束是偏振光束： 线偏光、 圓偏光、 径向偏振光； 或 是由光瞳滤波技术生成的结构光束， 其与光瞳滤波技术联用可以压缩测量 聚焦光斑尺寸， 提高系统横向分辨力。
优选的， 该系统还用于探测散射光谱，所述散射光谱包 括探测荧光、 布 里渊散射光、 康普顿散射光的散射光谱。
本申请还公开了一种激光差动共焦图谱显微成 像装置， 包括激发光束 产生系统（1)、 第一分光系统（8)、 物镜（10)、 三维扫描工作台（12)、 二向色分光系统（13) 、 光语探测系统（22) 、 差动共焦探测系统（14)及 数据处理模块（ 34 ) ；
其中， 第一分光系统（8) 、 物镜（10) 、 三维扫描工作台 （12) 沿光 路依次放置在激发光束产生系统（1 ) 出射方向， 二向色分光系统（13)位 于第一分光系统（8) 的反射方向， 光谱探测系统（22)位于二向色分光系 统（13) 的透射方向， 差动共焦探测系统（14)位于二向色分光系统（ 13) 的反射方向， 数据处理模块（34)与光语探测系统（22)和差动 共焦探测系 统（ 14 )连接；
或者,激发光束产生系统（1 )放在第一分光系统（8)的反射方向， 二向 色分光系统（13) 沿光路依次放在第一分光系统（8) 的透射方向， 光语探 测系统（ 22 )位于二向色分光系统（ 13 )的透射方向， 差动共焦探测系统（ 14 ) 位于二向色分光系统（13)的反射方向， 数据处理模块（34)连接差动共焦 探测系统 ( 14)与光语探测系统（22)；所述数据处理模块（ 34)配置为融合 并处理光语探测系统（22) 与差动共焦探测系统（14)采集到的数据。
优选的， 所述光谱探测系统（ 22 )是普通光谱探测系统， 包括沿光路依 次放置的第七聚光镜（46) 、 位于第七聚光镜（46)焦点位置的第二光语仪 (47)及位于第二光语仪 (47)后的第五探测器（48) , 所述普通光语探测 系统配置为被测样品的表层光谱探测；
或者，所述光谱探测系统（22)是共焦光语探测 系统， 包括沿光路依次 放置的第四聚光镜（ 23 )、 位于第四聚光镜（ 23 )焦点位置的第四针孔（ 24 )、 位于第四针孔（24)后的第五聚光镜（25) 、 位于第五聚光镜（25)焦点位 置的第一光语仪 (26)及位于第一光语仪 (26)后的第三探测器（33) , 所 述共焦光谱探测系统配置为提高系统信噪比和 空间分辨力， 以及对被测样 品的层析光语探测。
优选的， 激发光束产生系统（ 1 )还包括偏振调制器（ 6 )及光瞳滤波器 (7) , 所述偏振调制器（6) 配置为产生偏振光,所述光瞳滤波器（7) 配置 为产生结构光束。
优选的， 设置为压缩激发光斑的光瞳滤波器（7)可以位 偏振调制器 ( 6 )与第一分光系统（ 8 )之间， 还可以位于第一分光系统（ 8 )与物镜（ 10 ) 之间。
优选的， 还包括第四分光系统（ 40 )及位于第四分光系统（ 40 )反射方 向的显微观察系统（37) , 所述显微观察系统（37)配置为被测样品粗瞄； 其中， 第四分光系统（40)可以位于激发光束产生系统 （1 )与第一分光系 统（8)之间， 或者位于第一分光系统（8)与物镜（10)之间。
优选的， 其特征在于,数据处理模块（34) 包括:配置为处理位置信息的 差动相减模块 （35 ) ，和配置为融合位置信息与光谱信息的数据融 合模块
(36) 。
本申请还公开了一种激光差动共焦图谱显微成 像方法， 包括：
A、 在横向扫描被测样品（11)的过程中： 实时针对每个确定的扫描点， 根据轴向探测的一组差动共焦强度响应信号对 物镜（10 ) 进行精确跟踪定 焦； 在定焦后， 利用差动共焦曲线（43 )过零点与焦点位置精确对应这一特 性， 通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的 光语信号；
其中， 所述差动共焦信号和光语信号通过以下步骤获 得：
通过激发光束产生系统 (1)产生激发光束， 所述激发光束经过按先后顺 序排列的第一分光系统（8 )和物镜（ 10 )后， 聚焦在被测样品 （ 11 )上， 并激发出瑞利光和载有被测样品 ( 11 )光语特性的拉曼散射光； 所述瑞利光 和拉曼散射光被系统收集回光路中， 经过物镜（10 )和第一分光系统（8 ) 后,进入二向色分光系统（ 13 )进行分光， 所述瑞利光被反射进入差动共焦探 测系统（ 14 ) , 通过差动共焦探测系统 ( 14 )获得载有被测样品（ 11 )几何 位置信息的差动共焦强度响应信号， 所述拉曼散射光透射进入光谱探测系 统（22 ) , 通过光语探测系统（22 )获得载有被测样品（11 )光语特性的光 谱信号；
B, 在对被测样品（11 )的横向上的每个扫描点,按上述步骤进行实时 踪定焦再精确捕获扫描点的光语信号后， 获得一组载有被测样品 ( 11 )几何 位置信息的差动共焦信号和载有被测样品 ( 11 )光语特性的光语信号， 将信 号传送至数据处理系统（34 )进行处理， 其中： 所述处理包括： 只对差动共 焦信号进行处理， 系统进行高空间分辨的三维尺度层析成像； 和 /或， 只对 光谱信号进行处理， 系统进行光谱探测； 和 /或， 同时对差动共焦信号和光 谱信号进行处理， 系统进行高空间分辨的微区图谱层析成像， 所述微区图 谱层析成像为被测样品几何位置信息和光谱信 息同时探测的高空间分辨的 "图谱合一" ；
其中， 在精确捕获光谱信号的过程中， 还包括： 利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺 寸。
优选的， 所述实时针对每个确定的扫描点， 根据轴向探测的一组差动 共焦强度响应信号对物镜（10 )进行精确跟踪定焦； 包括：
A1 , 在所述扫描点所在横向平面位置， 进行轴向扫描， 获得一组差动 共焦强度响应信号， 将所述差动共焦强度响应信号传送至数据处理 系统
( 34 ) , 数据处理系统（34 )将差动共焦强度响应信号拟合成差动共焦曲
( 43 ) , 根据所述差动共焦曲线确定物镜（10 ) 的焦点。
优选的， 所述在定焦后， 利用差动共焦曲线（43 )过零点与焦点位置精 确对应这一特性， 通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的 光谱信号 包括：
A2, 根据所述定焦后的物镜（10 ) 的焦点， 将所述物镜（10 )和 /或被 测样品 ( 11 )进行轴向移动， 使被测样品 ( 11 )处于物镜 ( 10 )的焦点位置；
A3 , 捕获被测样品（ 11 )在焦点位置的拉曼散射光， 收集回光路， 并通 过光语探测系统（22 )获得载有被测样品 （11 )光谱特性的光语信号。
优选的， 所述利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据 实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸具体 包括：
根据差动共焦曲线 （43 ) 线性区域 BB'的非焦点位置对应物镜（10 ) 的 离焦区域， 并且在 BB'区域内的焦前或焦后位置聚焦光斑尺寸随离 焦量增大 而增大的特点， 利用差动共焦曲线， 通过调整样品的轴向离焦量， 根据实 际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸， 实现对样品探测区域大小可控。
优选的， 所述激发光束是偏振光束,所述偏振光束包括 线偏光、 圓偏 光、 径向偏振光； 或是由光瞳滤波技术生成的结构光束， 所述由光瞳滤波 技术生成的结构光束用于压缩测量聚焦光斑尺 寸， 提高系统横向分辨力。
优选的， 还能够探测散射光谱，所述散射光谱包括荧光 、 布里渊散射 光、 康普顿散射光的散射光谱。
有益效果
本申请对比已有技术具有以下创新点：
1 ) 利用差动共焦系统轴向响应曲线的过零点与焦 点位置精确对应这一特 性， 通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的 光语信息， 实现高空 间分辨的光谱探测。
2) 利用二向色分光装置对系统收集到的瑞利光和 载有被测样品信息的拉曼 散射光进行分光， 瑞利光进入差动共焦探测系统， 拉曼散射光进入拉曼 光谱探测系统， 实现光能的完全利用， 使微弱的拉曼散射光能够的进入 拉曼光谱探测系统， 提高系统光谱探测灵敏度， 实现样品几何位置信息 和光语信息的高空间分辨 "图语合一" 。
) 利用差动共焦技术对测量聚焦光斑进行高精度 定位， 并对焦点位置进行 实时跟踪， 消除温度和振动等环境影响， 实现调控并使拉曼光谱系统探 测可以始终精确对应最小激发聚焦光斑区域的 样品光语， 大幅提高现有 共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力和几 何位置探测能力， 即实现 高空间分辨。
) 利用差动共焦响应曲线线性区域对应不同聚焦 光斑尺寸的特性， 对聚焦 光斑位置进行精确调控， 进而控制测量聚焦光斑的尺寸， 便于对不同测 试需求的样品进行测试与分析， 即实现测量聚焦光斑尺寸可调。
) 将差动共焦显微系统与拉曼光谱成像系统在结 构和功能上相融合， 既可 实现样品微区几何参数的层析成像， 又可实现样品微区的光谱探测， 即 同时实现微尺度层析成像、 图谱层析成像和光谱测试三种成像模式， 并 显著改善成像测试系统的抗干扰能力、 线性和离焦特性。
本申请对比已有技术具有以下显著优点：
) 融合差动共焦技术和光谱探测技术， 利用差动共焦系统对焦点的精确定 位， 大幅提高光语探测的空间分辨力。
) 利用差动共焦响应曲线的离焦区域， 调控聚焦光斑尺寸， 可满足不同测 试需求， 使系统具有通用性。
) 差动共焦焦点触发探测技术， 可显著抑制系统的非线性、 样品反射率和 表面倾斜等对测量结果的影响， 以利于实现微细结构高分辨力、 高抗干 扰能力、 高精度和高层析能力的测量等。 附图说明
图 1为差动共焦与共焦显 轴向响应示意图；
图 2为共焦拉曼光语成像方法示意图；
图 3为激光差动共焦图谱显微成像方法示意图； 图 4为激光差动共焦图谱显微成像装置示意图；
图 5为具有非共焦光语探测系统的激光差动共焦 谱显微成像装置示意 图；
图 6为具有显微功能的激光差动共焦图谱显微成 装置示意图； 图 7为具有显微功能的反射式激光差动共焦图谱 微成像装置示意图； 图 8为激光差动共焦图谱显微成像方法与装置实 例图；
其中， 1-激发光束产生系统， 2-激光器， 3-第一聚光镜、 4-第一针孔、 5-第八聚光镜、 6-偏振调制器， 7-光瞳滤波器， 8-第一分光系统、 9-1/4 波 片， 10-物镜， 11-被测样品， 12-三维扫描工作台， 13-二向色分光系统， 14- 差动共焦探测系统， 15-第二分光系统、 16-第二聚光镜、 17-第二针孔、 18- 第一探测器、 19-第三聚光镜、 20-第三针孔、 21-第二探测器、 22-光谱探测 系统、 23-第四聚光镜、 4-第四针孔， 25-第五聚光镜、 26-第一光谱仪、 27- 入射狭缝， 28-平面反射镜， 29-第一凹面反射聚光镜、 30-光谱光栅、 31-第 二凹面反射聚光镜， 32-出射狭缝、 33-第三探测器、 34-数据处理模块、 35- 差动相减模块、 36-数据融合模块、 37-显微观察系统、 38-柯勒照明系统， 39-第三分光系统、 40-第四分光系统、 41-第六聚光镜、 42-第四探测器、 43- 差动共焦曲线、 44-共焦拉曼曲线、 45-共焦曲线、 46-第七聚光镜、 47-第二 光谱仪、 48-第五探测器。 具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明 。
本发明的基本思想是利用差动共焦探测和光语 探测相结合实现 "图语合 一" 的光谱探测。
如图 3所示， 激发光束产生系统 1产生激发光， 经过第一分光系统 8、 物镜 10后， 聚焦在被测样品 11上， 并激发出瑞利光和载有被测样品 1 1光 谱特性的拉曼散射光， 激发出的拉曼散射光和瑞利光被系统收集回光 路中， 经过物镜 1 0后被第一分光系统 8反射至二向色分光系统 1 3 , 经二向色分光 系统 1 3分光后， 拉曼散射光和瑞利光相互分离， 瑞利光被反射进入差动共 焦探测系统 14进行位置探测，拉曼散射光透射进入光谱探 系统 22进行光 谱探测。
如图 4所示， 本装置包括沿光路依次放置的激发光束产生系 统 1、 第一 分光系统 8、 物镜 10、 被测样品 11、 三维扫描工作台 12 , 位于第一分光系 统 8反射方向的二向色分光系统 13 , 位于二向色分光系统 13透射方向的光 语探测系统 22及反射方向的差动共焦探测系统 14 , 还包括连接光语探测系 统 22和差动共焦探测系统 14的数据处理模块 34。
把图 4 中光语探测系统 22替换为包括第七聚光镜 46、 第二光语仪 47 及第五探测器 48的普通光谱系统， 即构成图 5。
在图 4中第一分光系统 8与物镜 10之间添加第四分光系统 40, 第四分 光系统 40反射方向添加显微观察系统 37 , 即构成图 6。
把图 6中的激发光束产生系统 1放置于第一分光系统 8的反射方向，二 向色分光系统 13放置于第一分光系统 8的透射方向， 即构成图 7。
本实施例中， 偏振调制器 6为径向偏振光产生器， 第一分光系统 8为保 偏分光棱镜， 第二分光系统 15为保偏分光棱镜， 第三分光系统 39为宽带分 光棱镜， 第四分光系统 40 为保偏分光棱镜， 二向色分光系统 13 为 Notch filter, 光谱探测系统 22为拉曼光谱探测系统。
如图 8所示， 激光差动共焦图谱显微成像方法， 其测试步骤如下： 首先， 柯勒照明系统 38产生均匀白光， 白光透过宽带分光棱镜 39后， 被保偏分光棱镜 40反射， 经过物镜 10聚焦在被测样品 11上， 白光被反射 回原光路， 经物镜 10后被保偏分光棱镜 40、 宽带分光棱镜 39分别反射后， 经过第六聚光镜 41后进入第四探测器 42, 通过观察第四探测器 42中的图像 对测样品 11进行粗瞄， 以确定被测样品 11 需要观测的区域对被测样品 11 进行粗定位。
然后， 激光器 2发出的光束经第一聚光镜 3、 第一针孔 4、 第八聚光镜 后 5准直扩束为平行光， 光束经过径向偏振光产生器 6后成为径向偏振光， 径向偏振光经光瞳滤波器 7后光束被调制， 透过保偏分光棱镜 8后， 通过物 镜 10形成压缩光斑聚焦在被测样品 11上， 并激发出瑞利光和载有被测样品 11光谱特性的拉曼散射光， 被测样品 11可通过增强拉曼光谱纳米粒子等拉 曼增强技术进行处理， 以提高拉曼散射光的强度。
移动被测样品 11 , 使瑞利光及对应被测样品 11不同区域的拉曼散射光 被系统收集回原光路， 经过物镜 10并透射过保偏分光棱镜 40后， 被保偏分 光棱镜 8反射进入探测部分， 其中， 拉曼散射光透射过 Notch filterl3进入拉 曼光语探测系统 22, 拉曼光普探测系统 22为共焦拉曼光 "普探测系统， 拉曼 散射光被第四聚光镜 23会聚到第四针孔 24 , 经过第五聚光镜 25会聚进入第 一光语仪 26, 拉曼散射光经入射狭缝 27 , 平面反射镜 28和第一凹面反射聚 光镜 29反射后到达光谱光栅 30, 光束经过光谱光栅 30衍射后， 被第二凹面 反射聚光镜 31反射聚焦到出射狭缝 32上， 最后入射到第三探测器 33。 由于 光栅的衍射作用， 拉曼光语中不同波长的光相互分离， 从出射狭缝 32 出来 的光线为单色光， 当光语光栅 30转动时， 从出射狭缝 32 出射的光波长不 同， 通过监测第三探测器 33 的响应值和光栅旋转的角度即可得到被测样品 11的拉曼光语； 瑞利光被 Notch filterl3反射进入差动共焦探测系统 14, 经 保偏分光棱镜 15透射的瑞利光被分为两束， 经保偏分光棱镜 15反射的瑞利 光被第二聚光镜 16聚焦， 进入距第二聚光镜 16焦点前距离为 M位置的第 二针孔 17后被第一探测器 18接收； 经保偏分光棱镜 15透射的瑞利光被第 三聚光镜 19聚焦， 进入距第三聚光镜 19焦点后距离为 M的第三针孔 20, 继而被第三针孔 20后的第二探测器 21接收。
测量过程中， 对被测样品 11 进行轴向和横向扫描时， 差动共焦探测系 统 14中两个探测器：第二探测器 21和第一探测器 18 , 分别测得反应被测样 品 11 凹凸变化的强度响应为 ( v,u,+u M )和 I 2 ( v,u,-u M ) , 将所得强度响应 ( v,u,+u M )和 / 2 ( v,u,-u M )传送到差动相减模块 35进行差动相减处理， 获 得差动共焦强度响应 / ( V，M,M M ) ：
I( v,u,u M )= i v,u,+u M )~ h( v,u,-u M ) ( 1 ) 其中： 在上述定焦理论中， 定焦只与轴向 （即附图中的 Z轴所指方向） 响应有关， 与横向（即附图中 X轴和 y轴所确定的平面方向）响应无关， 因 此公式（1 ) 所指扫描实质上为轴向扫描。 从而实现被测样品 11几何位置的显微层析成像， 式（1) 中， V为横向 归一化光学坐标， M为轴向归一化光学坐标， w M 为针孔的离焦量；
拉曼光语探测系统 22中第三探测器 33探测到的载有被测样品 11光谱 信息的拉曼散射光光语信号为 / ( ) U为波长） 。
将 / 、 I (v,u,u M )传送到数据融合模块 36进行数据处理， 从而获 得包含被测样品 11位置信息 I ( v,u,u M )和光语信息 / ( 1) 的四维测量信息 I ( v,u, λ )
对被测样品 11沿 χ、 向扫描， 物镜 10沿 ζ向扫描， 重复上述步骤， 测 得对应物镜焦点位置附近的一组 i个包含位置信息 I (v,u,u M )和光语信息 I U) 的序列测量信息 U. U) , Ii (v,u) };
利用可分辨区域 对应的位置信息 ( v,w,w M ) , 找出对应 区域的光 语信息 U)值， 再依据 V与横向位置坐标（x,_y ) 的关系以及 u与轴向位 置坐标 z的关系， 重构反映被测样品 11微区 三维尺度和光普特性的信息 ( Xi,yi,z i ) ；
对应最小可分辨区域 5 mi 三维尺度和光谱特性可由式（2)确定： ( x ^y^ z ^) = ^( x ^y^ z ^) {v,u)^),i x (v,u,^ M )≠o,i 2 (v,u,-u M )≠o ( 2 ) 这样即可实现纳米级微区激光差动共焦图谱显 微成像。
同时， 可以利用差动共焦轴向响应曲线 BB'段的不同测量值 确定 对应不同测量值位置的光语特性 , 即可实现激发焦点附近可控微 区的光 "普特性测试。
从图 8中可以看出， 通过差动共焦探测系统 14的绝对零点 0, 可精确 捕获激发光斑的焦点位置， 从测量序列数据 ½ , /,· ( ν,Μ ) ) }中， 抽取对 应焦点位置 0的激发光语， 即实现了微区 5 mm 的光语探测和三维几何位置 探测。
微区图谱层析成像
ΐ χ,γ,ζ) ， 三维尺度层析成像
1(λ) ， 光谱测试 ... ... ( 3 ) 通过对测量信息 {/,· ( λ ) ， It ( v,u ) }的融合处理， 可实现式（3 )所示的 三种测量模式， 即： 微区图谱层析成像测试、 三维尺度层析成像和光谱测 试。
如图 8所示， 激光差动共焦图谱显微成像装置包括沿光路依 次放置的激 发光束产生系统 1、 位于激发光束产生系统 1 出射方向的保偏分光棱镜 8、 物镜 10、 被测样品 11、 三维扫描工作台 12及位于保偏分光棱镜 8反射方向 的 Notch filterl3、 位于 Notch filterl3透射方向的拉曼光语探测系统 22、 位于 Notch filterl3反射方向的差动共焦探测系统 14及位于差动共焦探测系统 14 与拉曼光语探测系统 22连接处的数据处理模块 34; 其中， 激发光束产生系 统 1用于产生激发光束， 包括沿光路依次放置激光器 2、 第一聚光镜 3、 位 于第一聚光镜 3焦点位置的第一针孔 4、 第八聚光镜 5、 径向偏振光产生器 6 及光瞳滤波器 7; 拉曼光 "普探测系统包括沿光路依次放置的第四聚光 23、 位于第四聚光镜 23焦点位置的第四针孔 24、 位于第四针孔 24后的第五聚光 镜 25、 位于第五聚光镜 25焦点位置的第一光语仪 26及位于第一光语仪 26 后的第三探测器 33 , 其中， 第一光语仪 26包括沿光路依次放置的入射狭缝 27、 平面反射镜 28、 第一凹面反射聚光镜 29、 光谱光栅 30、 第二凹面反射 聚光镜 31和出射狭缝 32; 差动共焦探测系统 14包括保偏分光棱镜 15、 位 于保偏分光棱镜 15透射方向的第三聚光镜 19、 第三针孔 20、 第二探测器 21、 位于保偏分光棱镜 15透射方向的第二聚光镜 16、 第二针孔 17、 第一探 测器 18 , 其中， 第三针孔 20位于第三聚光镜 19焦后距离 M处， 第二针孔 17位于第二聚光镜 16焦前距离 M处； 数据处理模块 34包括差动相减模块 35及数据融合模块 36 , 用于融合处理采集到的数据。
下面以图 8所示实施例为基础， 进一步介绍本发明的测试步骤： 步骤 S 110 , 如前所述， 先通过显微镜观察系统 37对被测样品 11粗定 位。
步骤 S 120 , 激光器 2发出的光束经第一聚光镜 3、 第一针孔 4、 第八聚 光镜后 5准直扩束为平行光， 光束经过径向偏振光产生器 6后成为径向偏振 光， 径向偏振光经光瞳滤波器 7后光束被调制， 透过保偏分光棱镜 8后， 通 过物镜 10形成压缩光斑聚焦在被测样品 11上， 并激发出瑞利光和载有被测 样品 11光谱特性的拉曼散射光， 被测样品 11可通过增强拉曼光语纳米粒子 等拉曼增强技术进行处理， 以提高拉曼散射光的强度。
步骤 S 130, 轴向移动三维扫描工作台 12或者物镜 10 , 轴向扫描被测样 品 11 ; 移动时使瑞利光及对应被测样品 11不同区域的拉曼散射光被系统收 集回原光路， 经过物镜 10并透射过保偏分光棱镜 40后， 被保偏分光棱镜 8 反射进入探测部分。 其中， 拉曼散射光透射过 Notch filter 13 进入拉曼光谱 探测系统 22 , 拉曼光语探测系统 22 为共焦拉曼光谱探测系统； 瑞利光被 Notch filter 13反射进入差动共焦探测系统 14。
其中， 拉曼光 "普探测系统 22和差动共焦探测系统 14的工作过程与前述 类似， 在此不再贅叙。
测量过程中， 对被测样品 11进行轴向 (即图 8中的 z向）扫描时， 差 动共焦探测系统 14中两个探测器：第二探测器 21和第一探测器 18 , 分别测 得反应被测样品 11凹凸变化的强度响应为 ( v,u,+u M )和 / 2 ( V,M,-M m ) , 将 所得强度响应 Ii ( v,u,+u M )和 ( v,u,-u M )传送到差动相减模块 35进行差动 相减处理， 获得差动共焦强度响应 / ( V，M,M M ) ：
I( v,u,u M )= i v,u,+u M )~ h( v,u,-u M ) ( 1 ) 式（1 )中， V为横向归一化光学坐标， w为轴向归一化光学坐标， u M 为 针孔的离焦量；
其中： 在上述定焦理论中， 定焦只与轴向 （即附图中的 z轴所指方向） 响应有关， 与横向（即附图中 X轴和 y轴所确定的平面方向）响应无关， 因 此公式（1 ) 所指扫描实质上为轴向扫描。
根据公式（1 ) 的结果拟合出相应差动共焦曲线 43 , 利用差动共焦曲线 ( 43 )过零点与焦点位置精确对应的特性， 获取物镜 10的焦点 0位置， 并 通过三维扫描工作台 12 (或者移动物镜 10 )将被测样品 11移动至该焦点 0 位置。 那么此时可重新捕获被测样品 11在焦点 0处的拉曼散射光。
利用拉曼光语探测系统 22对处于焦点 0处的被测样品 11进行光语采 集， 第三探测器 33探测到载有被测样品 11光语信息的拉曼散射光光语信号 为 / U) U为波长） 。
将 / 、 I (v,u,u M )传送到数据融合模块 36进行数据处理， 从而获 得包含被测样品 11位置信息 I ( v,u,u M )和光语信息 / ( 1) 的四维测量信息 I ( V,U, λ ) 。
对于焦点 0所对应的被测样品 11样品 区 δ 再依据 V与横向位置坐标 ( x,_y )的关系以及 M与轴向位置坐标 z的关系， 重构反映焦点 0所对应的被 测样品 11样品微区 三维尺度和光谱特性的信息 / (χ,γ,ζ,λ) ；
被测样品 11的样品微区 ^三维尺度和光语特性的信息 / (x,j, z ,/l)， 可 利 用 公 式 （ 4 ) 确 定 ：
^aj ( ' ' = ' ( Ζ ， ) I t (v, M )=0J! {v,u,+u M )≠0J 2 {v,u,-u M )≠0 (4) 即可实现纳米级微区激光差动共焦图谱显微成 像。
完成上述步骤后， 利用三维扫描工作台对被测样品 11进行横向扫描（即 图中的 X、 ； 方向） ， 移动到下一个点后， 利用三维扫描工作台 （或者物镜 上的物镜驱动器）对被测样品 11进行轴向扫描 (即图中的 Z方向） ， 获取 物镜 10的焦点 0位置后， 将被测样品 11移动到焦点 0处， 并获取光语信 息。
那么通过上述过程， 即可获得精确的光谱信息， 实现焦点位置的光谱 探测和三维几何位置探测， 其中， 通过对测量信息 {/ (Λ) , Ii (v,u) }的融 合处理， 可实现式（5)所示的三种测量模式， 即： 微区图谱层析成像测试、 三维尺度层析成像和光语测试。
， 躯随漏成像
， 纖赋
(5) 另外， 本申请在步骤 S130中， 还可以: 在移动三维扫描工作台 12或者物镜 10, 捕获被测样品 11 的瑞利光时 (该组瑞利光用于获得差动共焦曲线） 。 那么在轴向扫描被测样品 11 的过 程中， 除了会获得差动共焦曲线外， 还可测得对应物镜焦点 0位置附近的 一组 个包含位置信息 /( v,w,w M )和光语信息 /( 1)的序列测量信息 { /,·( /1) , /,· ( v,u ) }; 每个 i对应轴向扫描过程中的一个光斑照射的可分 区域
再利用可分辨区域 对应的位置信息 /,· (v,w,w M ) , 找出对应 区域的 光语信息 (λ)值， 再依据 V与横向位置坐标（x,_y) 的关系以及 u与轴向 位置坐标 z的关系， 重构反映被测样品 11样品微区 三维尺度和光谱特性 的信息 /,· ( Χι,γ^ι,λι ) ；
对应最小可分 5 mi 三维尺度和光谱特性可由式（2)确定： n ( ， Z ， ) ( 2 ) 这样即可实现纳米级微区激光差动共焦图谱显 微成像。 其中最小可分 辨区域 5 min 也即焦点 0对应的区域。
另外， 在上述过程中， 可以利用差动共焦轴向响应曲线 BB'段的不同测 量值 确定对应不同测量值位置的光语特性 , 即可实现激发 焦点附近可控微区的光语特性测试。
如前所述， 从图 8中可以看出， 通过差动共焦探测系统 14的绝对零点 0, 可精确捕获激发光斑的焦点位置， 从测量序列数据 {/,· , /,· (v,u)) } 中， 抽取对应焦点位置 0的激发光语， 即实现了微区 5 min 的光语探测和三 维几何位置探测。
/ ; (x, y, z, X)
L(x,y,z) ， 三维尺度层析成像
ΐ ) ， 光谱测试
(3) 通过对测量信息 {/,· (λ) ， It ( v,u ) }的融合处理， 可实现式（3)所示的 三种测量模式， 即： 微区图谱层析成像测试、 三维尺度层析成像和光谱测 试。 本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描 述， 每个实施例重点说 明的都是与其他实施例的不同之处， 各个实施例之间相同相似的部分互相 参见即可。
最后， 还需要说明的是， 在本文中， 诸如第一和第二等之类的关系术 语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体 或操作区分开来， 而不一定 要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这 种实际的关系或者顺序。 而 且， 术语 "包括" 、 "包含" 或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包 含， 从而使得包括一系列要素的过程、 方法、 商品或者设备不仅包括那些 要素， 而且还包括没有明确列出的其他要素， 或者是还包括为这种过程、 方法、 商品或者设备所固有的要素。 在没有更多限制的情况下， 由语句 "包括一个 ... ... " 限定的要素， 并不排除在包括所述要素的过程、 方法、 商品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上对本申请所提供的一种激光差动共焦图谱 显微成像方法与装置， 进行了详细介绍， 本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施 方式进行 了阐述， 以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的 方法及其核心思 想； 同时， 对于本领域的一般技术人员， 依据本申请的思想， 在具体实施 方式及应用范围上均会有改变之处， 综上所述， 本说明书内容不应理解为 对本申请的限制。