von Milchkühen

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Überwachung des Gesundheitszustands von Milchkühen, insbesondere von ganzen Milchkuhbeständen. Das Verfahren basiert auf der Analyse der Biomarker Haptoglobin (HP) und einem Teil des polyme- ren Immunglobulinrezeptors (PIGR), der sekretorischen Komponente (Secretory Component, SC), in einer Milchprobe. Insbesondere ermöglicht das beanspruchte Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung auf Grundlage der hier beschriebenen Protein Biomarker eine Diagnose einer Mastitis oder systemischer Erkrankungen die außerhalb des Euters auftreten. Somit ermöglicht die Erfindung den generellen Gesundheitszustand eines Milchkuhbestands regelmäßig zu überwachen. Die vorliegende Erfindung betrifft nicht-invasive diagnostische Verfahren, sowie Vorrichtungen und diagnostische Kits zur Durchführung dieser Verfahren.

BESCHREIBUNG

Mit den neuesten technischen Methoden werden immer größere Milchviehbestände kosteneffizient bewirtschaftet. Zudem kann der personelle Aufwand beispielsweise durch den Einsatz von automatischen Melksystemen drastisch reduziert werden. Die tägliche Gesundheitskontrolle der Kühe kann dadurch jedoch nur eingeschränkt oder gar nicht mehr stattfinden. Eine Lösung dieses Problems wäre die Automatisierung der Gesundheitsüberwachung. Das kann über den Nachweis von bestimmten Gesundheitsmarkern in der Milch erfolgen. Als solche Marker bieten sich Akut-Phase-Proteine wie HP an, da deren Konzentrationen schon in der frühen Phase einer Immunantwort sehr schnell ansteigen. Die Messung von HP in Milch wird bisher weder in der Landwirtschaft noch in der veterinärmedizinischen Labordiagnostik routinemäßig eingesetzt.

Die Gesundheitsüberwachung nach der Kalbung wird über eine klinische Untersuchung 7-10 Tage nach der Kalbung sowie die Puerperalkontrolle (zwischen Tag 20 und 28 nach der Kalbung) durch den Herdenmanager oder geschultes Stallpersonal realisiert. Es werden Allgemeinbefinden, Körpertemperatur, Lochien, Milchproduktion und ggf. Milch- oder Harnketone beurteilt. Die Kontrolle der Eutergesundheit erfolgt täglich im Melkstand durch das Melkpersonal. Bei der monatlichen Milchleistungsprüfung werden Parameter wie Zellzahl, Harnstoff- gehalt, Fett- und Eiweißgehalt der Milch zum Einschätzen der Eutergesundheit und des Stoffwechselzustandes des individuellen Tiers und der Herde erhoben. Immer mehr Betriebe können am automatischen Melksystem bei jedem Melkvorgang die Zellzahl erfassen. Es gibt Ansätze für die routinemäßige Erfassung von Gesundheitsparametern mittels verschiedener Methoden. Diese können jedoch nur eine Aussage über den Stoffwechselzustand, eine spezielle Erkrankung oder die Eutergesundheit des Tieres liefern.

Die betriebliche Gesundheitsüberwachung stellt sich somit sehr subjektiv und aufwändig dar. Lösungsansätze bieten bisher Aufnahme und Auswertungen von Parameterkombinationen (Leitfähigkeit der Milch, Milchleistung, Bewegungsmuster, Liegezeiten, Progesteronkonzentration, Ketokörper, Laktatdehydrogenase, Fett, Eiweiß, Laktose und Harnstoff in der Milch) mittels entsprechender Messtechnik und multifunktionaler Herdenmanagementprogramme, wie z.B. FullExpert (Lemmer-Fullwood). Das ermöglicht die Detektion von auffälligen Tieren (Brunst, Lahmheit, Fehlgeburt, Labmagenverlagerung (LMV), Ketose, Mastitis). Diese Systeme sind jedoch aufwändig und preisintensiv in der Anschaffung. Bei kritischen Befunden wird ein Tierarzt hinzugezogen. Die Messung klinisch-chemischer, metabolischer und endokrinologischer Parameter im Blut der Tiere gehört in der veterinärmedizinischen Labordiagnostik zur Routineuntersuchung, kann jedoch nur an ausgewählten, auffälligen oder bereits erkrankten Tieren durch den Tierarzt durchgeführt werden. Routinemäßig genutzte Parameter in der klinischen Chemie können nur in Kombination eine Gesamtaussage über den Zustand des Rindes geben.

Es existieren bereits Ansätze, den Gesundheitszustand eines Milchrindes einfacher, schneller und objektiver zu beurteilen. Das erfolgt über die Messung von Akut-Phase-Proteinen im Blut oder in der Milch. HP ist das meistuntersuchte Akut-Phase-Protein im Rind. Während einer Mastitis ist auch in der Milch die HP-Konzentration stark erhöht. HP in der Milch wurde aber bisher nur als potenzieller Indikator für die Mastitis diskutiert.

SC ist kein Akut-Phase-Protein, sondern ein Teil eines Transmembranrezeptors für polymere Immunglobuline, dem PIGR, auf sekretorischen Epithelzellen der Schleimhäute und auch im Euter. Bei Bindung von polymerem Immunglobulin (Ig)A oder IgM wird der Antikörper- Rezeptor-Komplex über Transzytose von der lateralen zur apikalen Seite des Epithels geschleust. Dort wird der Rezeptor enzymatisch gespalten, sodass SC und IgA oder IgM frei werden. Auf diese Weise wird IgA in die Milch transportiert. Während der peripartalen Im- munsuppression und in der frühen Laktation sind Milchkühe auch besonders anfällig für Infektionserkrankungen, die nicht am Euter auftreten (systemische Erkrankungen) wie Uterus-, Klauen- oder Atemwegsinfektionen. Nicht selten tritt auch eine LMV auf. Diagnostische Untersuchungen bei diesen Erkrankungen werden routinemäßig bisher im Blut der Tiere durchgeführt. Dazu muss das Tier tierärztlich begutachtet und behandelt werden. Da eine Milchprobe mit wesentlich geringerem Aufwand genommen werden kann, ist es von wirtschaftlichem Interesse für den Landwirt, systemische Erkrankungen in diesem Probenmedium nachweisen zu können.

Das Gesundheitsmanagement wachsender Milchbetriebe sucht stetig nach alternativen Lösungen zur Überwachung der Herde. Es existieren in der Praxis mehrere Parameter, die es bei täglicher, automatischer Messung im Betrieb ermöglichen, auffällige Kühe zu detektieren (Brunst, Lahmheit, Fehlgeburt, LMV, Ketose, Mastitis). Für die Milch existiert bisher kein validierter Biomarker zur Analyse des allgemeinen Gesundheitszustandes. Die Analyse in der Milch vereinfacht erheblich die Probenahme, dadurch wird eine Messung im Betrieb ermöglicht. Besonders herauszustellen ist, dass hierfür im Gegensatz zur Blutentnahme kein Tierarzt erforderlich ist, was sich positiv auf die Kosten auswirkt und den Gesamtablauf im landwirtschaftlichen Produktionsprozess weniger behindert. Demnach ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Ansätze zur Gesundheitsüberwachung von Milchkuhbeständen bereitzustellen, die eine vereinfachte und routinemäßige Kontrolle großer Milchrindherden ohne Hinzuziehen eines Veterinärmediziners ermöglicht.

In einem ersten Aspekt wird die gestellte Aufgabe durch ein nicht-invasives Verfahren zur Überwachung des Gesundheitszustandes einer Milchkuh gelöst, umfassend der Schritte:

(a) Bereitstellen einer Milchprobe der Milchkuh,

(b) Messen der Konzentration zumindest eines Biomarkers ausgesucht aus HP und PIGR (bevorzugt SC) in der Milchprobe,

(c) Vergleich der gemessenen Konzentration aus (b) mit einem Referenzwert des zumindest einen gemessenen Biomarkers, wobei eine Abweichung der gemessenen Konzentration von dem Referenzwert einen nicht gesunden Zustand der Milchkuh anzeigt.

Die Bestimmung des Markers PIGR in einer Milchprobe umfasst im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt die Bestimmung der SC des PIGR. Daher ist es bevorzugt, dass das Messen der Konzentration des Biomarkers PIGR in Schritt (b) das Messen der Konzentration der sekretorischen Komponente (SC) des PIGR umfasst.

Vorzugsweise wird das nicht-invasive Verfahren vollständig ex vivo oder in vitro durchgeführt. Dabei ist insbesondere herauszustellen, dass die Biomarker der vorliegenden Erfindung in einer Milchprobe untersucht werden, sodass die Durchführung des Verfahrens unabhängig von einer invasiven Probeentnahme und damit unabhängig von einem Tierarzt ist. Dies ermöglicht es dem vorliegenden Verfahren auf große Milchkuhbestände und auf regelmäßige (monatliche) Testungen ausgeweitet zur werden, was beispielsweise durch die Überprüfung von Biomarkern in einer Blutprobe nicht wirtschaftlich durchführbar ist.

Die Begriffe„Protein-Biomarker",„Biomarker" und„Marker" werden für die vorliegende Beschreibung synonym verwendet. Die Begriffe bezeichnen bevorzugt die Konzentration einzelner, oder Kombinationen, biologischer Moleküle, wie Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate usw. Insbesondere beschäftigt sich die vorliegende Offenbarung mit Proteinen als Biomarker. Soweit sich die Offenbarung auf eine Messung der Konzentration der Biomarker bezieht, soll sowohl eine direkte Messung der Konzentration (der Anzahl der Proteinmoleküle/Volumen oder Gewicht) als auch die indirekte Messung umfasst sein. So können auch Abbauprodukte der Proteinmarker der Erfindung gemessen werden, oder alternativ auf Basis der biochemischen Charakteristika der Biomarker auf deren Konzentration zurückgeschlossen werden. Enzyme können beispielweise über Nachweis ihrer enzymatischen Aktivität bestimmt werden.

Soweit erforderlich kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung optional in Schritt (b) das Messen zumindest eines weiteren Biomarkers umfassen. Der zumindest eine weitere Biomarker wird hierzu vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus S100 Kalzium-bindendem Protein A9 (S100A9), Interleukin (IL-) 18, Tumornekrosefaktor (TNF-) alpha, Laktoferrin (LTF), und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ausgesucht.

Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, worin Schritt (b) das Messen einer Kombination von mindestens zwei Biomarkern umfasst, und die Kombination der zumindest zwei Biomarker ausgewählt wird aus den Kombinationen (i) HP und VEGF, (ii) HP und PIGR (bevorzugt SC), (iii) HP und LTF, (iv) VEGF und PIGR (bevorzugt SC), (v) LTF und PIGR (bevorzugt SC), und (vi) LTF und VEGF. Als besonders vorteilhaft hat sich die Kombination der Marker HP und PIGR (bevorzugt SC) erwiesen, die daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen darstellt.

Eine weitere optionale und bevorzugte Weiterbildung der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren dar, worin Schritt (b) das Messen einer Kombination von mindestens drei Biomar- ker umfasst, nämlich HP, PIGR (bevorzugt SC) und einen dritten Biomarker ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus S100A9, IL-18, TNF-alpha, LTF, und VEGF. Durch die Messung weiterer Biomarker kann die Spezifität und Sensitivität des Verfahrens weiter verbessert werden.

Bevorzugt ist ein hier beschriebenes Verfahren, wobei eine Abweichung der gemessenen Konzentration des Biomarkers von dem Referenzwert eine Mastitis oder eine systemische Erkrankung der Milchkuh anzeigt, vorzugsweise eine systemische Erkrankung die nicht oder nicht-ausschließlich am Euter auftritt, beispielsweise leichte systemische Erkrankung, leichte systemische Erkrankung mit LMV, schwere systemische Erkrankung, oder Kombinationen dieser Erkrankungen. Vorzugsweise handelt es sich bei der gemessenen Abweichung um eine Erhöhung der Konzentration des Biomarkers in der Probe einer erkrankten Kuh im Vergleich zu einer gesunden Kuh.

Die vorliegende Erfindung kann anhand der offenbarten Biomarker in einem Aspekt eine systemische Erkrankung, vorzugsweise außerhalb des Euters diagnostiziert werden. Alternativ betrifft die Erfindung jedoch auch die Diagnose einer Mastitis anhand der offenbarten Biomarker. Für diesen Aspekt ist es in einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugt, dass eine Diagnose der Mastitis bei einer Milchkuh mittels Bestimmung einer Kombination der Biomarker HP und PIGR (bevorzugt SC), oder auch nur anhand des Markers PIGR (bevorzugt SC), durchgeführt wird.

Der Begriff„Referenzwert" soll hier weit ausgelegt werden und eine Vielzahl möglicher Vergleichswerte umfassen. Je nach diagnostischem Ziel wird ein angemessener Referenzwert ausgesucht. Zu Erkennung erkrankter Tiere kann es sich bei dem Referenzwert beispielsweise um einen Wert des Biomarkers in einer gesunden Kuh handeln. Wird das Verfahren jedoch zur Überwachung eines Krankheitsverlaufs oder zur Überwachung einer Therapie einer erkrankten Kuh eingesetzt, kann der Referenzwert auch eine Konzentration des Biomarkers in der Milch der überwachten Kuh zu einem früheren Zeitpunkt - beispielsweise vor Beginn der Therapie - darstellen. Insbesondere ist jedoch bevorzugt, dass der Referenzwert ein Grenzwert (Cut-Off) ist und wobei, wenn die gemessene Konzentration des Biomarkers den Grenzwert überschreitet, ein nicht gesunder Zustand der Milchkuh festgestellt wird. Je nachdem wie der Cut-Off Wert gewählt ist, kann ein nicht gesunder Zustand bei einem Testwert größer als, oder größer/gleich als der Cut-off festgestellt werden. Ein Grenzwert kann zudem herdenspezifisch ermittelt werden, wobei eine zu überwachende gesunde Milchkuhherde regelmäßig auf den Biomarker getestet wird und anhand dieser Werte ein„gesunder" Referenzwert spezifisch für die Herde ermittelt wird. Fällt nun bei der regelmäßigen Überwachung der Herde eine Kuh durch eine erhöhte Konzentration des Biomarkers auf, ist ein nicht gesunder Zustand der Kuh anzunehmen.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Grenzwerte (Cut- Off) zur Unterscheidung gesunder von kranken Tieren so gewählt werden, dass der entsprechende Biomarker zumindest 90% Spezifität oder höher, vorzugsweise 92%, weiter vorzugsweise 94% oder höher aufweist, bei einer Sensitivität von zumindest 50%, vorzugsweise mindestens 60%, 70% oder zumindest 80%. So kann der Grenzwert für den Marker HP beispielsweise ungefähr 0,4 μg/ml betragen, vorzugsweise ungefähr 0,5 μg/ml und meist bevorzugt ungefähr 0,58 ^πύ. Der Grenzwert für den Marker PIGR (bevorzugt SC) kann beispielsweise ungefähr 5 μg/ml betragen, vorzugsweise ungefähr 8 μg/ml und meist bevorzugt ungefähr 8,2 μg/ml. Der Grenzwert für den Marker LTF kann beispielsweise ungefähr 80 μg/ml betragen, vorzugsweise ungefähr 100 μg/ml und meist bevorzugt ungefähr 120 μg/ml. Der Grenzwert für den Marker VEGF kann beispielsweise ungefähr 7 μg/ml betragen, vorzugsweise ungefähr 9 μg/ml und meist bevorzugt ungefähr 9,5 μg/ml. Der Begriff„ungefähr" in Zusammenhang mit numerischen Angaben lässt bevorzugter Weise eine Abweichung +/- 20% des angegebenen Wertes zu, weiter bevorzugt eine Abweichung von +/- 15%, +/-10%, und meist bevorzugt +/-5%.

Die hier beschriebenen Biomarker und Biomarkerkombinationen haben sich insbesondere als vorteilhaft zur Diagnose von systemischen Erkrankungen erwiesen. Daher wird in einigen Ausführungsformen das Verfahren insbesondere nicht zur Diagnose einer Mastitis angewendet, sondern nur zur Erkennung von systemischen Erkrankungen. Dabei können die Erkrankungen in einigen Ausführungsformen bevorzugt in frühen Stadien erkannt werden. Wie oben erwähnt eignet sich das erfinderische nicht-invasive Verfahren zur Überwachung einer Therapie einer Milchkuh, wobei eine Verringerung der Konzentration des Biomarkers während oder nach einer Therapie einen Therapieerfolg anzeigt. Da die Erhöhung der hier beschriebenen Biomarker in der Milch mit einer Verschlechterung des Gesundheitszustands einer Milchkuh korreliert, kann das Verfahren auch angewendet werden um den Therapieerfolg einzelner erkrankter Tiere zu überwachen. Dabei ist der Referenzwert, mit dem eine gemessene Konzentration des oder der Biomarker der Erfindung in der Milchprobe verglichen wird, beispielsweise eine Konzentration des oder der Biomarker in der Milch derselben Kuh an einem früheren Zeitpunkt, beispielsweise zu Beginn der Therapie.

Insbesondere wird für die vorliegende Erfindung bevorzugt, dass in Schritt (b) sowohl HP als auch PIGR (bevorzugt SC) gemessen werden.

In einigen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass die Konzentration des Biomarkers HP in einer unverdünnten Milchprobe bestimmt wird. In anderen Ausführungsformen ist die Milchprobe eine mit Konservierungsstoffen versetzte Milchprobe z.B. bei der Milchleistungsprü- f ng).

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann insbesondere routinemäßig zur Überwachung einer Milchkuh, oder Milchkuhherde eingesetzt werden. Daher ist es bevorzugt, dass das nicht-invasive Verfahren regelmäßig ausgeführt wird, vorzugsweise monatlich, weiter vorzugsweise wöchentlich, noch weiter vorzugsweise mehrmals pro Woche, bis täglich.

Die zu untersuchende Milchprobe der Milchkuh wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise während eines Melkvorgangs aus der gemolkenen Milch (nicht-invasiv) entnommen. Bei vollautomatisierten Melkvorrichtungen kann die Milchprobe einer Milchkuh direkt aus der gemolkenen Milch (automatisiert) abgezweigt werden. Die so bereitgestellte Milchprobe wird dann für das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt.

Zur Messung der Konzentration der Biomarker der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene dem Fachmann bekannte technische Verfahren zurückgegriffen werden. Insbesondere soll die vorliegende Offenbarung als nicht auf einzelne Analyseverfahren beschränkt angesehen werden. Die Bestimmung der Konzentration von Biomarkern in einer Milchprobe kann das Messen der Konzentration biochemisch mittels eines Verfahrens ausgesucht aus &J/MW-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) umfassen, oder das Messen der Konzentration immunologisch mittels eines Verfahrens ausgesucht aus Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzym-Immuno-Assay (EIA), Fluoreszenz- Immuno-Assay (FIA), Chemilumineszenz-Immuno-Assay (CIA), Radio-Immuno-Assay (RIA), Western-Blot, und Peptid- Arrays umfassen, oder das Messen der Konzentration spekt- rometrisch mittels eines Verfahrens ausgesucht aus Swr ace-Plasmon-Resonanz (SPR), Mat- rix-assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI) oder Electrospray Ionization (ESI) umfassen. Besonders bevorzugt sind immunologische Verfahren, beispielsweise mittels monoklonaler (bevorzugt) oder polyklonaler Antikörper, beispielsweise in einem ELISA.

Das beschriebene Verfahren soll insbesondere zur Überwachung des Gesundheitszustands einer oder mehrerer Milchkühe verwendet werden. Daher ist es in einigen Ausführungsformen beabsichtigt, dass das Verfahren zur Feststellung eines nicht gesunden Zustands einer Milchkuh verwendet wird. Eine konkretisierte Diagnose der vorliegenden Erkrankung der als nicht gesund klassifizierten Milchkuh ist in dieser Ausführungsform nicht zwingend notwendig. Vielmehr soll mittels Durchführung weiterer anschließender Diagnoseverfahren ermittelt werden, an welcher Erkrankung die identifizierte nicht-gesunde Milchkuh leidet. In diesen Ausführungsformen richtet sich das Verfahren der vorliegenden Offenbarung auf die möglichst frühe Erkennung auffälliger Tiere durch regelmäßige Untersuchungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Im Falle eines festgestellten nicht gesunden Zustands kann im Nachhinein ein Tierarzt zur Etablierung einer spezifischen Diagnose hinzugezogen werden.

In einigen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Offenbarung ein nicht-invasives Verfahren zur Überwachung des Gesundheitszustands einer Milchkuhherde in einem Milchbetrieb, umfassend ein regelmäßiges Durchfuhren eines Verfahrens zur Überwachung des Gesundheitszustandes mindestens einer, vorzugsweise jeder, Milchkuh der Milchkuhherde gemäß des hier beschriebenen nicht-invasiven Verfahrens zur Überwachung des Gesundheitszustandes einer Milchkuh.

Als Milchkuhherde soll ein Milchkuhbestand innerhalb eines Milchbetriebes von vorzugsweise mindestens zwei Tieren, weiter vorzugsweise von mindestens 5 Tieren, 10 Tieren, 15 Tie- ren, 20 Tieren, 50 Tieren oder mehr verstanden werden. Die vorliegende Erfindung ist besonders hilfreich zur Überwachung von Milchkuhherden mit mehr als 10 Tieren.

Die vorgenannte Aufgabe wird zudem in einem weiteren Aspekt durch ein nicht-invasives System und/oder Vorrichtung zur Überwachung des Gesundheitszustandes einer Milchkuh, umfassend:

(a) Mittel zur Aufnahme einer Milchprobe der Milchkuh,

(b) Mittel zur Messung der Konzentration mindestens eines Biomarkers ausgesucht aus HP und/oder PIGR (bevorzugt SC) in der Milchprobe,

(c) Mittel zum Vergleich der gemessenen Konzentration aus (b) mit einem Referenzwert des gemessenen Biomarkers, wobei eine Abweichung der gemessenen Konzentration von dem Referenzwert einen nicht gesunden Zustand der Milchkuh anzeigt,

gelöst.

In einigen Ausführungsformen kann das nicht- invasive System und/oder Vorrichtung weiter Mittel zur Speicherung von Daten und/oder Mittel zur optischen Anzeige von Daten, wie beispielsweise ein Bildschirm, umfassen.

In einigen Ausführungsformen umfasst das nicht-invasive System und/oder Vorrichtung Mittel zur Ausgabe einer Information. Die Mittel zur Ausgabe einer Information sind dabei geeignet im Falle einer Feststellung eines nicht-gesunden Zustands einer Milchkuh, durch geeignete Mittel auszugeben. Beispielsweise kann bei Feststellung eines nicht gesunden ZuStands einer Milchkuh ein optischer oder akustischer Alarm ausgelöst werden. Vorzugsweise wird zumindest eine Information über die Identität der identifizierten nicht-gesunden Milchkuh bereitgestellt.

Vorzugsweise ist das hier beschriebene System und/oder Vorrichtung an eine Melkanlage (Melksystem) angeschlossen, und umfasst Mittel, die während eines Melkvorgangs eine Milchprobe der Milchkuh von der Melkanlage an die Mittel zur Aufnahme einer Milchprobe abgeben. Automatisierte Melkanlagen, die Milchprobeentnahmen ermöglichen sind dem Fachmann bekannt. Das nicht-invasive System und/oder Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt weiter Mittel zum Messen zumindest eines weiteren Biomarkers ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus S100A9, IL-18, TNF-alpha, LTF, und VEGF. Weiter vorzugsweise umfasst das System und/oder Vorrichtung Mittel zur Messung der Konzentration des/der Biomarkers) HP und/oder PIG (bevorzugt SC) in der Milchprobe.

In einigen Ausfuhrungsformen werden die Mittel zur Messung der Konzentration eines Biomarkers ausgesucht aus Mitteln zur Durchführung eines der Verfahren SDS-PAGE, FPLC, und HPLC, oder EIA, FIA, CIA, RIA, Western-Blot, und Peptid-Arrays, oder SPR, MALDI oder ESI. Insbesondere wird bevorzugt, dass das nicht-invasive System und/oder Vorrichtung der Erfindung Antikörper zur Messung der Konzentration der genannten Biomarker umfasst.

Das nicht-invasive System und/oder Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher geeignet zur Durchführung eines hier beschrieben Verfahrens.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiter durch ein diagnostisches Kit zur Überwachung des Gesundheitszustands einer Milchkuh gelöst, umfassend Mittel zur Bestimmung der Konzentration eines Biomarker(s) ausgesucht aus HP und/oder PIGR (bevorzugt SC) in einer Milchprobe.

Das diagnostische Kit gemäß der Erfindung umfasst in einigen Ausführungsformen Mittel zur Durchführung eines Verfahrens ausgesucht aus SDS-PAGE, FPLC, und HPLC, oder EIA, FIA, CIA, RIA, Western-Blot, und Peptid-Arrays, oder SPR, MALDI oder ESI. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit Antikörper zur Detektion oder Messung der Konzentration eines der genannten Biomarker. Insbesondere ist das diagnostische Kit geeignet zur Durchführung eines hier beschriebenen Verfahrens zur Überwachung des Gesundheitszustands von Milchkühen.

Die vorliegende Erfindung wird nun mittels nicht einschränkender Beispiele weiter beschrieben.

In den Abbildungen wird gezeigt: Abbildung 1: mRNA-Expression ausgesuchter Marker in Milchzellen (MZ) und Blutleukozyten (BL) von Kühen in unterschiedlichen Krankheitszuständen. Die Konzentration der Marker wurde mittels qPCR ermittelt und ist als Prozent der Expression der Referenzgene Cyclophilin B (PPIB) und ubiquitär exprimiertes Transkript (UXT) angegeben. System.: systemisch; Erkrank.: Erkrankung; MZ: Milchzellen; BL: Blutleukozyten; * 0,05 > p > 0,01, und ** p < 0,01.

Abbildung 2: Konzentrationen potenzieller Protein-Biomarker in Milch. Die Konzentrationen wurden mittels kommerziell erhältlicher ELISA-Kits bestimmt, n.d. = nicht detektierbar; System.: systemisch; Erkrank.: Erkrankung; * 0,05 > p > 0,01, und ** p < 0,01.

Abbildung 3: Korrelationen der Konzentrationen der Biomarker HP und LTF in

Milch und Plasma. Die Konzentrationen wurden mittels kommerziell erhältlicher ELISA-Kits bestimmt. Positive Korrelationen werden durch die Regressionsgeraden angezeigt.

Abbildung 4: ROC-Kurven von ausgesuchten Milch-Biomarkern. A: ROC-Analyse der einzelnen Marker bei verschiedenen Krankheitszuständen. B: Zu- sammengefasste ROC-Analyse aller erkrankten Tiere. System.: systemisch; Erkrank.: Erkrankung

BEISPIELE

Material und Methoden:

Quantifizierung von Protein-Biomarkern in Milch und Plasma

Ausgewählte Proteine in Milch und Plasma wurden mit im Handel erhältlichen ELISA-Kits quantifiziert. Alle HP-Messungen wurden in unverdünnten Proben durchgeführt, da dies ausreicht, um Schwankungen des Markers HP in verschiedenen Stadien der Erkrankung zu erkennen. Vorbeschichtete Platten wurden mit 100 μΐ Probe (30 min, Raumtemperatur (RT)) inkubiert. Gereinigtes HP (LeeBio Solutions, St. Louis, Missouri, USA) wurde als Standard in einem Bereich von 8 bis 0,125 μg/ml eingesetzt. Die Platte wurde 3-mal in Assay- Waschpuffer gewaschen und dann mit 100 μΐ 1:40 verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti- HP-Antikörper (30 min, RT) inkubiert. Nach 3 Waschschritten wurden 100 μί gebrauchsfertige Tetramethylbenzidinsubstratlösung (Moss Inc., Pasadena, Maryland, USA) hinzugefügt, und 10 bis 30 Minuten bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde mit 50 μΐ 9,9% H ₃ P0 ₄ gestoppt.

PIGR (SC) wurde mit einem ELISA-Kit zum Nachweis von bovinem PIGR (Life Science USCN Inc.) nach Angaben des Herstellers quantifiziert. Milch wurde jeweils 1:300 bis 1:1.000 für die Kontrollproben und 1:5.000 bis 1:10.0000 für Proben von erkrankten Kühen verdünnt. Plasmaproben wurden 1:100.000 verdünnt.

Statistische Analyse

Die Analyse der Unterschiede zwischen den Gruppen, Spearman-Rangkorrelationen, Recei- ver-Operating-Characteristic (ROC)-Analyse und Visualisierung der Ergebnisse wurden mittels SigmaPlotll Software (Systat Software, Erkrath, Deutschland) durchgeführt. Um ungewollte statistische Neigungen zu vermeiden, wurden Proben der Tiere nach dem Zufallsprinzip für die Analyse durch quantitative real-time-RT -PCR (qPCR) oder ELISA ausgewählt. Datensätze wurden auf Normalverteilung analysiert. Wenn der Shapiro-Wilk-Test positiv absolviert wurde, wurde ein t-Test durchgeführt. Falls Daten nicht normal verteilt waren, wurde der Mann- Whitney-Rangsummentest verwendet. Alle erkrankten Gruppen wurden mit der Kontrollgruppe verglichen. Die Daten verschiedener Erkrankungen außerhalb des Euters wurden kombiniert, wenn eine geringe Anzahl von Proben getestet wurde. P- Werte sind folgendermaßen definiert: * 0,05 > p > 0,01, und ** p < 0,01.

Auswahl und Evaluation potenzieller Biomarker

Die ROC-Analyse wurde verwendet, um das Abgrenzungsvermögen der Biomarker zu bewerten. Eine Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve, AUC) > 0,9 wurde als hoch diskriminierend und AUC-Werte < 0,6 als nicht diskriminierend betrachtet. Biomarker wurden anhand der besten Unterscheidung zwischen leichter systemischer Erkrankung und der Kontrollgruppe ausgewählt. Statistische Auswertung von Biomarkern und Markerkombinationen wurde mit der Open-Source Data Mining Software TANAGRA durchgeführt. Um ein mögliches Overfitting zu verhindern wurde eine Kreuzvalidierung (Cross Validation, CV) durchgeführt (10-fach, 1 Wiederholung). Die Werte für die Sensitivität, Spezifität und Resubstituti- onsfehlerrate wurden aus der CV übernommen. Die verschiedenen Erkrankungen wurden zu einer Gruppe zusammengefasst. Die Biomarker oder deren Kombinationen wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Abgrenzung erkrankter Kühe ausgewertet.

Beispiel 1: Differentielle Genexpression von Biomarkern in Milch

Die mRNA-Expression einzelner Biomarker in in Milchzellen wurde mittels qPCR analysiert. Um die systemische Bedeutung möglicher Biomarker aus der örtlichen Umgebung der Brustdrüse zu bestätigen, wurde auch das Expressionsmuster der Biomarker in peripheren Blutleukozyten überprüft. Daten aus leichten und schweren systemischen Erkrankungsgruppen wurden im Falle einer geringen Probenzahl in einer systemischen Erkrankungsgruppe zusammengefasst und getestet. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der relevantesten Biomarker.

Beispiel 2: Quantifizierung und Auswahl der Biomarker

Auf Basis der Ergebnisse vorangegangener Experimente (Microarray, qPCR, und andere) wurden potenzielle Biomarker selektiert und auf Proteinebene mit kommerziellen ELISA-Kits quantifiziert. Es wurden erhöhte Konzentrationen von IL-18, LTF, PIGR (SC), TNF-alpha und VEGF in Milch bei LMV, schwerer systemischer Erkrankung, Mastitis und Kombinationen der Erkrankungen festgestellt. Allerdings zeigten HP und S100A9 erhöhte Werte bei leichter systemischer Erkrankung (Abbildung 2). Expressionsmuster von HP, IL-18 und LTF wurden auch im Plasma bestimmt, um die Aussagekraft der Marker für systemische Erkrankungen festzustellen. Die Korrelation von Milch- und Plasma-HP- und -LTF-Konzentrationen sind in Abbildung 3 gezeigt. Die positiven Spearman Korrelationskoeffizienten (Spearman p) zeigen den Zusammenhang von Milch- und Plasmaproteinkonzentrationen. Zusätzlich wurde die Korrelation der stärksten Biomarker in der Milch untersucht. Alle Proteine zeigten eine positive Korrelation der Konzentration in der Milch bei Erkrankungen (Tabelle 1). Die besten Marker wurden weiter statistisch evaluiert.

Tabelle 1: Korrelationen von Protein-Biomarkern in Milch und Plasma

Spearman Korrelati¬

Korrelation von

onskoeffizient P n

Korrelation in Milch

Milch HP und Milch PIGR

0,67 0,001 71

(SC)

Milch LTF und Milch

0,61 0,001 79

PIGR (SC)

Milch HP und Milch LTF 0,59 0,001 142

Milch HP und Milch

0,58 0,001 120

VEGF

Milch LTF und Milch

0,54 0,001 132

VEGF

Milch VEGF und Milch

0,41 0,001 79

PIGR (SC)

Korrelation in Milch und Plasma

Milch HP und Plasma HP 0,78 0,001 121

Milch IL- 18 und Plasma

0,38 0,088 21

IL- 18

Milch LTF und Plasma

0,33 0,005 69

LTF

Korrelation in Plasma

Plasma HP und Plasma

0,59 0,001 63

LTF

Beispiel 3: Statistische Auswertung der Biomarker

Zur statistischen Auswertung wurden die stark regulierten und hoch konzentrierten Milch- Biomarker HP, PIGR (SC), LTF und VEGF ausgewählt. Eine Untergruppe der Proben, bei denen alle vier Marker bestimmt worden waren, wurde verwendet, um einen direkten Vergleich der Ergebnisse zu ermöglichen. Die Biomarker allein und Kombinationen von zwei Bio markern wurden bewertet. Dabei wurden 17 Kontrollproben und 49 Proben von erkrank- ten Kühen verwendet. Das Abgrenzungsvermögen für jede Erkrankungsgruppe wurde mittels ROC-Analyse (Abbildung 4A, Tabelle 2) bestimmt. HP und PIGR (SC) zeigten die beste Unterscheidung von leichter systemischer Erkrankung mit einer AUC von 0,69 und 0,68. Alle Proteine waren hoch diskriminierend für schwere systemische Erkrankungen und Mastitis (AUC > 0,9).

Tabelle 2: Abgrenzungsvermögen von Milchbio markern für verschiedene Erkrankungen. Die Daten wurden mittels ROC-Analyse generiert. (Kontrolle: n = 17, Leichte systemische (System.) Erkrankung (Erkrank.): n = 17, LMV (+ Stoffwechselerkrank.): n = 8, Schwere System. Erkrank.: n = 5, Schwere System. Erkrank.+ LMV: n = 8, Mastitis: n = 11)

95% Konfidenzin¬

Kontrolle vs. Erkrankungsgruppe AUC

tervall

HP

Leichte System. Erkrank. 0,69 0,48 - 0,89 0,065

LMV (+ Stoffwechselerkrank.) 0,96 0,89 - 1,03 0,001

Schwere System. Erkrank. 0,99 0,95 - 1,03 0,001

Schwere System. Erkrank.+ LMV 0,99 0,95 - 1,02 0,001

Mastitis 1,00 1,00 - 1,00 0,001

PIGR (SC)

Leichte System. Erkrank. 0,68 0,49 - 0,87 0,071

LMV (+Stoffwechselerkrank.) 0,84 0,64 - 1,04 0,05

Schwere System. Erkrank. 0,95 0,87 - 1,04 0,05

Schwere System. Erkrank..+ LMV 0,80 0,61 - 0,99 0,05

Mastitis 0,99 0,98 - 1,01 0,001

LTF

Leichte System. Erkrank. 0,67 0,48 - 0,86 0,088

LMV (+ Stoffwechselerkrank.) 0,82 0,62 - 1,03 0,05

Schwere System. Erkrank. 0,95 0,86 - 1,05 0,05

Schwere System. Erkrank..+ LMV 0,93 0,84 - 1,03 0,001

Mastitis 0,98 0,95 - 1,02 0,001

VEGF

Leichte System. Erkrank. 0,57 0,38 - 0,77 0,459

LMV (+Stoffwechselerkrank.) 0,99 0,96 - 1,02 0,001

Schwere System. Erkrank. 0,84 0,58 - 1,08 0,05

Schwere System. Erkrank..+ LMV 0,96 0,90 - 1,03 0,001

Mastitis 0,97 0,91 - 1,03 0,001

Markerkombinationen wurden zur Diskriminierung zwischen kranken und Kontrolltieren mit zwei statistischen Klassifikationsverfahren, der multinominalen logistischen Regression (MLR) und der k-nächste-Nachbarn-Klassifikation (K- N) (Tabelle 4), ausgewertet. Ein zweites statistisches Modell wurde angewendet, um mögliche Verzerrungen der Ergebnisse zu vermeiden. HP ist die beste Wahl für den Einsatz als Einzelbiomarker. In Kombination mit PIGR (SC) oder LTF kann eine leichte Steigerung der Sensitivität oder Spezifität erzielt werden. Diese Kombinationen zeigten die besten Ergebnisse zur Detektion von erkrankten Tieren.

Eine praktische Anwendung von Biomarkern verlangt hohe Spezifität des Tests, um das Auftreten von Erkrankungen in großen Milchviehbetrieben nicht zu überschätzen. Daher wurde eine ROC-Analyse kombiniert für alle Krankheitsgruppen vs. Kontrolle durchgeführt, um die Sensitivität („richtig positiv"), Spezifität („richtig negativ"), 1 -Sensitivität („falsch negativ") und 1 -Spezifität („falsch positiv") der Biomarker-Bestimmung in Milch bei unterschiedlichen Grenzwert(Cut-Off)-Konzentrationen zu bewerten. Tabelle 3 zeigt die Werte für mögliche Cut-Off- Konzentrationen bei einer hohen Spezifität von 94%. Dementsprechende ROC- Kurven sind in Abbildung 4B gezeigt. Bei einer Spezifität von 94%, würden 6% der eigentlich gesunden Kühe als krank erkannt werden. 18%, 41%, 45% und 33% der kranken Tiere würden bei der Ermittlung von HP, PIGR (SC), LTF und VEGF jeweils als gesund diagnostiziert werden.

Basierend auf dieser Analyse konnte daher gezeigt werden, dass die Bestimmung von HP für den Nachweis von Erkrankungen bei Milchkühen geeignet ist. Eine kombinierte Messung mit PIGR (SC) oder LTF ist auch möglich, um die Sensitivität oder Spezifität zu erhöhen.

Tabelle 3: Abgrenzungsvermögen von Milchbiomarkern für erkrankte Tiere. Die Daten den mittels ROC-Analyse generiert. (Kontrolle: n = 17, erkrankt: n = 49)

95 % Konfidenz- Cut-Off bei 94 % Sensitivität bei 94 %

AUC P

intervall Spezifität Spezifität / %

HP

0,88 0,80 - 0,96 <0,001 0,58 μ^πύ 82

PIGR (SC)

0,82 0,72 - 0,93 <0,001 8,20 μ^πύ 59

LTF

0,84 0,74 - 0,94 <0,001 120,7 μg/ml 55

VEGF

0,82 0,72 - 0,92 <0,001 9,50 ng/ml 67 Tabelle 4: Evaluation von Milchbiomarkern und deren Kombinationen. Die Klassifikation wurde mittels MLR und K-NN durchgeführt: Kontrolle (n=17) vs. erkrankt (n=49). Sensitivität, Spezifität und Resubstitutionsfehlerraten wurden aus der CV entnommen (10-fach, 1 Wiederholung).

Multinomiale logistische Regression k-nächste-Nachbarn Klassifikation (Kreuzvalidierung) / % (Kreuzvalidierung) / %

Marker

(Kombination) Sensitivität Spezifität Fehlerrate Sensitivität Spezifität Fehlerrate

Einzelmarker

HP 86 88 13 91 69 15

LTF 84 44 27 82 63 23

VEGF 84 38 28 73 31 38

PIGR (SC) 86 25 30 77 19 38

Markerkombinationen

HP & VEGF 86 88 13 80 94 17

HP & PIGR

(SC) 89 81 13 84 75 18

HP & LTF 89 69 17 86 81 15

VEGF &

PIGR (SC) 86 63 20 82 56 25

LTF & PIGR

(SC) 84 56 23 86 31 28

LTF& VEGF 82 56 25 84 44 27

Abkürzungsverzeichnis

AUC Area Under the Curve, Fläche unter der Kurve

BL Blutleukozyten

CIA Chemilumineszenz-Immuno-Assay

CV Cross Validation, Kreuzvalidierung

EIA Enzym-Immuno-Assay

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Erkrank. Erkrankung

ESI Electrospray Ionization

FIA Fluoreszenz-Immuno-Assay

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography HP Haptoglobin

HPLC High Performance Liquid Chromatography

ig Immunglobulin

IL Interleukin

K- k-nächste-Nachbarn-Klassifikation

LMV Labmagenverlagerung

LTF Laktoferrin

MALDI Matrix-assisted Laser Desorption / lonization

MLR multinominale logistische Regression

mR A Messenger Ribonukleinsäure

MZ Milchzellen

PIGR polymerer Immunglobulinrezeptor

PPIB Cyclophilin B (Referenzgen)

RIA Radio -Immuno - Assay

ROC Receiver Operating Characteristic

S100A9 S100 Kalzium-bindendes Protein A9

SC Secretory Component, sekretorische Komponente des PIGR

SDS-PAGE 5Ot z ^' wm-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SPR iSwr/ ce-Plasmon-Resonanz

System. systemisch

TNF-alpha Tumornekrosefaktor-alpha

UXT Ubiquitously-Expressed Transcript, ubiquitär exprimiertes Transkript

(Referenzgen)

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor