Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie sowie Anordnungen zur Ausführung dieses Verfahrens.

Die Lichtblattmikroskopie, auch als Lichtscheibenmikroskopie, Lichtscheibenfluoreszenz- Mikroskopie, Lightsheei Microscopy, Lightsheet Fluorescence icroscopy (LSFM) oder Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) bezeichnet, ist als jüngere Entwicklungslinie fluoreszenzmikroskopischer Verfahren und Anordnungen an sich bereits bekannt.

Im Vergleich zur konventionellen Fluoreszenzmikroskopie mit der Eigenschaft des optischen Schneidens, wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen- Mikroskopie, ermöglicht bei der Lichtblattmikroskopie die Beleuchtung einer dünnen, der Dicke eines Lichtblattes entsprechenden Schicht in der Probe die Messung und Darstellung eines optischen Schnittes bei gleichzeitiger Unterdrückung des Bildhintergrundes. Dabei werden negative Effekte durch Ausbleichen oder lichtinduzierten Stress in biologischen Proben bei deren Untersuchung reduziert. Da die Detektion im Weitfeld vorgenommen werden kann, lassen sich zudem auch größere Probenbereiche schnell erfassen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Sachgebiet der Lichtblattmikroskopie, bei dem das Lichtblatt eine Anregungsebene definiert, die mit der optischen Achse eines Detektionsob- jektivs einen Winkel δ 90° einschließt, wobei die Probe mit diesem Lichtblatt abgetastet wird.

Diesbezüglich ist in DE 10 2005 027 077 A1 ein Mikroskop mit einer Beleuchtungseinrichtung beschrieben, bei dem ein Lichtstreifen erzeugt wird, der die Probe in einer Ebene beleuchtet, die in einem von 90° verschiedenen Winkel gegen die Detektionsrichtung geneigt ist. Die Detek- tionsrichtung ist durch ein Objektiv definiert, durch welches hindurch das Detektionslicht zu einem Flächendetektor gelangt.

Die beleuchtete Ebene ist um eine Drehachse drehbar. In unterschiedlichen Ausgestaltungen ist entweder der Flächendetektor synchron zur Drehung der Beleuchtungsebene bewegbar, oder die räumliche Lage der Zwischenbild- oder Bildebene wird so beeinflusst, das sie unabhängig von der Orientierung der beleuchteten Ebene konstant gehalten wird.

Wird im ersten Fall die beleuchtete Ebene beispielsweise um eine zur optischen Achse parallele Achse gedreht, so muss der Flächendetektor ebenfalls um eine zu seiner optischen Achse pa- rallelen Achse gedreht werden. Wird der Winkel zwischen der beleuchteten Ebene und der De- tektionsrichtung verändert, muss der Winkel zwischen der Detektorfläche und der Ausbreitungsrichtung des auftreffenden Detektionslichtes dieser Winkeländerung nachgeführt werden.

Im zweiten Fall erfolgt die Beeinflussung der räumlichen Lage der Zwischenbild- oder Bildebene beispielsweise durch Synchronisation der Drehung von Prismen mit der Drehung der Beleuchtungsebene, um den beleuchteten Probenbereich stets auf der Detektorfläche abzubilden.

Nachteilig ist hierbei, dass die Erfüllung der Scheimpflug-Bedingung, wonach sich bei einer optischen Abbildung die Bild-, Objektiv- und Schärfeebene in einer gemeinsamen Geraden schneiden müssen, insbesondere für standardgemäße Abbildungsverhältnisse nicht möglich ist, da der Winkel zwischen der Detektorfläche und der optischen Achse sehr groß wird.

DE 10 2011 000 835 A1 beschreibt ein Abtastmikroskop in Auflicht-Konfiguration. Hierbei erzeugt ein Objektiv einen länglichen Beieuchtungsfokus in einem abzubildenden Objekt, und eine Abtastvorrichtung bewegt den Beleuchtungsfokus über einen zu beleuchtenden Zielbereich im Objekt durch Ändern der Einfallsrichtung, in der das Beleuchtungslicht in die Eintrittspupille des Objektivs fällt. Der Ort des Einfalls des Beleuchtungslichts in die Eintrittspupille ist zur Pupillenmitte dezentral versetzt. Dadurch erzeugt der Beieuchtungsfokus ein Lichtblatt, das aufgrund des dezentralen Eintritts des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille des Objektivs gegen die optische Achse schräggestellt ist.

Die aus dem mit dem Lichtblatt beleuchteten Zielbereich stammende Fluoreszenzstrahlung wird von dem Objektiv erfasst und in eine Detektionsoptik gelenkt. Die Detektionsoptik umfasst ein erstes Detektionsobjektiv, das einem Tubuslinsensystem nachgeordnet ist. Das Tubusiinsen- system besteht aus zwei Tubuslinsen, von denen eine erste dem Objektiv, die andere dem ersten Detektionsobjektiv zugeordnet ist. Die erste Tubuslinse erzeugt im Zusammenwirken mit dem Objektiv ein erstes Zwischenbild. Dabei steht die optische Achse des ersten Detektionsob- jektivs senkrecht zur optischen Achse des Objektivs. Da der mit dem Lichtblatt beleuchtete Zielbereich schräg zur optischen Achse des Objektivs angeordnet ist, liegt auch das erste Zwi- schenbild schräg zur optischen Achse des ersten Detektionsobjektivs. Das erste Detektionsobjektiv bildet im Zusammenwirken mit der zweiten Tubuslinse das erste Zwischenbild in ein zweites Zwischenbild ab, das ebenfalls schräg zur optischen Achse des ersten Detektionsobjektivs steht.

Die Detektionsoptik umfasst weiterhin ein zweites Detektionsobjektiv, welches das zweite Zwischenbild über eine weitere Tubuslinse auf die Deiektionsfläche eines Lichtdetektors abbildet. Die optische Achse des zweiten Detektionsobjektivs steht dabei sowohl senkrecht auf dem zweiten Zwischenbild als auch senkrecht auf der Deiektionsfläche. Durch das Zusammenwirken der beiden Detektionsobjektive wird auf der Detektionsfläche ein geradegestelltes Bild des abgetasteten Zielbereichs erzeugt.

Nachteilig ist hier der zur Abbildung zu beireibende umfangreiche technische und damit kostenintensive Aufwand, da zur Betrachtung des durch ein mikroskopisches Relaysystem erzeugten Zwischenbildes ein zweiter Lichtmikroskopaufbau notwendig ist.

Weiterhin ist die Detektionseffizienz gering, da die Sammel-NA aufgrund der erforderlichen Schrägstellung verschiedener Optiken, insbesondere des zweiten Detektionsobjektives mit hoher NA, limitiert und die Transmission des Gesamtsystems aufgrund der Vielzahl der erforderlichen Optiken gering ist. Auch die Flexibilität der Nutzung des Systems ist stark eingeschränkt, da die Objektiveigenschaften abhängig vom Gesamtaufbau sind und das Objektiv somit hinsichtlich verschiedener praktischer Anwendungsfälle nicht austauschbar ist. Desweiteren ist die betrachtete Probenebene nicht beliebig zur optischen Achse orientierbar, da die Anregungsgeometrie durch die Anordnung der Detektionsobjektive vorgegeben ist.

Bei beiden zitierten Veröffentlichen kommt hinzu, dass die beschriebenen technischen Lösungen mechanische Bewegungen erfordern und dadurch verschleiß- und störanfällig sind.

Davon ausgehend besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren zur Lichtbiattmikro- skopie zu schaffen, das die dargestellten Nachteile nicht mehr aufweist. Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, mindestens eine zur Ausübung des neuen Verfahrens geeignete Anordnung anzugeben.

Diese Aufgabe wird für ein Verfahren der eingangs genannten Art mit folgenden Verfahrensschritten gelöst:

abtasten eines abzubildenden Probenvolumens mit einem Lichtblatt, das mit der optischen Achse eines Objektivs einen Winkel δ Φ 90° einschließt, wobei

das Lichtblatt in Propagationsrichtung das gesamte abzubildende Probenvolumen durchdringt, und wobei

die Schärfentiefe S _obj des Objektivs kleiner ist als die Tiefe T dieses Probenvolumens in Richtung der optischen Achse,

erhöhen der Schärfentiefe S _obj im Detektionsstrahiengang auf eine Schärfentiefe S _eff[ die gleich oder größer ist als die Tiefe T dieses Probenvolumens,

positionieren des Probenvolumens innerhalb der Schärfentiefe 5 _Θ «,

wandeln der mit erhöhter Schärfentiefe S _ef{ gewonnenen optischen Bildsignale in elektronische Bildsignale unter Zuordnung zu ihren Ursprungsbereichen im Probenvolumen, und generieren von Abbildungen des abgetasteten Probenvolumens aus den elektronischen Bildsignalen. Das abzubildende Probenvolumen ist entweder das gesamte Volumen einer zu untersuchenden Probe oder ein zu untersuchender räumlicher Teil des Gesamtvolumens der Probe.

Als Schärfentiefe S _0bj gilt im Sinne der Erfindung die durch das Design des jeweils verwendeten Objektivs definierte nominale Schärfentiefe. Beispielsweise gilt für ein hochaperturiges aplanati- sches Objektiv mit dem Öffnungswinkel α des Objektivs, dem Brechungsindex n einer Immersiohsflüssigkeit und einer Numerischen Apertur NA gemäß α = arcsin(NA/n). Für ein Wasserimmersionsobjektiv mit einer NA von 1.2 erhält man eine Schärfentiefe S _obj von Δζ = S _obj = 0.83 μηι. Bei Standardobjektiven, wie sie für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar sind, liegt die Schärfentiefe So _bj im Bereich von 0,5 μηι bis 170 μηη.

Unter Schärfentiefe S _eff wird eine im Verlaufe des Detektionsstrahlengängs erzielte effektive Schärfentiefe verstanden, die größer ist als die Schärfentiefe S _0bj . Erfindungsgemäß gilt S _eff £ T.

Die Richtung der optischen Achse des Objektivs entspricht der Koordinatenrichtung z eines kartesischen Koordinatensystems. Die räumliche Ausrichtung des Lichtblattes ist im Sinne der Erfindung definiert durch die Propagationsrichtung des zu dem Lichtblatt geformten Beleuchtungslichtes. Das Lichtblatt ist der zur Beleuchtung des Probenvolumens vorgesehene Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs, in dem das Beleuchtungslicht eine in Detektionsrichtung bzw. in Richtung der optischen Achse des Objektivs gemessenen räumliche Ausdehnung von beispielsweise 10 μηι nicht überschreitet und daher zur Detektion bzw. Messung eines Probenvolumens nach dem Prinzip der Lichtblattmikroskopie geeignet ist.

Das Lichtblatt kann in verschiedenen Verfahrensweisen entweder in Form eines aufgeweiteten kollimierten, beispielsweise mittels einer Zylinderlinse in nur einer Richtung fokussierten Laserstrahls in das Probenvolumen hinein projiziert oder mit einem scannend bewegten punktförmigen Laserfokus erzeugt werden. Denkbar ist auch, das Lichtblatt mittels lichtformender Elemente, wie zum Beispiel SLM (spatial light modulator), zu generieren.

In Abhängigkeit von dem abzutastenden Probenvolumen kann

die Position des Lichtblattes in Relation zum Objektiv in x, y und z-Richtung, und / oder der Winkel δ, und / oder

die Ausrichtung des Lichtblattes innerhalb des besagten Probenvolumens durch zentrische oder exzentrische Drehung um die optische Achse variiert werden. Das Probenvolumen wird vorteilhaft im Auflichtverfahren abgetastet. Die erfindungsgemäß vorgesehene axial nicht diskriminierende Detektion erlaubt in Kombination mit der Lichtblattbeleuchiung bekannter Neigung vorteilhaft, Probenbereiche zu beleuchten und abzubilden, die nicht nur in der Fokusebene des Detektionsobjektivs, sondern in axialer Richtung gesehen auch in unterschiedlichen Tiefen vor oder hinter der Fokusebene in der Probe liegen.

In alternativen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden, abhängig von der Wahl der optischen Mittel zur Abbildung des Detektionslichtes auf die Empfangsebene des Flächensensors und dem Algorithmus zur Signalverarbeitung, zwei oder dreidimensionale Abbildungen des abgetasteten Probenvolumens generiert. Vorteilhaft sind Ausgestaltungen, bei denen zwei- oder dreidimensionale Abbildungen des abgetasteten Probenvolumens nach der Exiended-Depth-of-Field-Verfahrensweise oder Light-Field-Technologie generiert werden, beispielweise unter Einbeziehung Diffraktiver Optischer Elemente (DOE) in den Detektionsstrah- lengang.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt es, die Probe durch das Objektiv hindurch, im Durchlicht oder auch seitlich entsprechend dem Selective-Plane-Iliumination- Microscopy-Verfahren (SPIM) zu beleuchten.

Denkbar ist auch die Implementierung des stimu!ated emission depletion-Prinzips (STED) in das erfindungsgemäße Verfahren. Dabei wird die zur Bildgebung beitragende Dicke des Lichtblattes reduziert, indem ein Doppellichtblatt dem Anregungslichtblatt so überlagert wird, dass die Nullstelle des Doppellichtblattes im Wesentlichen an der Position des Anregungsiicht- blattes liegt. Die an der Wellenlänge des Doppellichtblattes stimulierte Emission wird bei der Signalauswertung nicht berücksichtigt, wodurch die longitudinale Auflösung erhöht wird. Weiterhin sind alle an sich bekannten Verfahren, bei denen die Auflösung mit linearen oder nichtlinearen Mitteln erhöht wird, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kombinierbar. Diesbezüglich besonders geeignet sind Verfahrensweisen der Lokalisierungsmikroskopie, wie Photo- activated Localization Microscopy PALM, stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) oder super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI) zur Bildgewinnung in 2D und 3D. Zudem können Mehrphotonen-Verfahren zur Generierung des Signallichts herangezogen werden, wie zum Beispie! 2- oder 3-Photonenmikroskopie, SHG, THG-Mikroskopie oder CARS- Anregung.

Die Aufgabe, die der Erfindung zugrunde liegt, wird weiterhin mit einer Anordnung zur Ausführung des vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst. Diese Anordnung umfasst: Mittel zur Abtastung eines abzubildenden Probenvolumens mit einem Lichtblatt (9), das mit der optischen Achse eines Objektivs einen Winkel δ Φ 90° einschließt, wobei

- das Lichtblau in Propagationsrichtung das gesamte abzubildende Probenvolumen durchdringt, und wobei

- die Schärfentiefe S _obj des Objektivs kleiner ist als die Tiefe T dieses Probenvolumens in Richtung der optischen Achse,

eine dem Objektiv nachgeordnete optische Einrichtung, ausgebildet zur Erhöhung der Schärfentiefe S _obj auf eine Schärfentiefe S _eff , die gleich oder größer ist als die Tiefe T dieses Probenvolumens,

Mittel zur Positionierung des Probenvolumens innerhalb des Bereiches der Schärfentiefe

S _e ff,

einen der optischen Einrichtung nachgeordneten ortsauflösenden optoelektronischen Flächensensor, und

Hard- und Software, ausgebildet zum Generieren von Abbildungen des Probenvolumens aus den vom Flächensensor abgegebenen elektronischen Bildsignalen.

Das Objektiv hat beispielsweise eine nominale Schärfentiefe S _{o j} im Bereich von 0,5 μηπ bis 170 μπι, und die dem Objektiv nachgeordnete optische Einrichtung ist zur Erhöhung der Schärfentiefe S _obj um einen Faktor a £ 5 auf die effektive Schärfentiefe S _e f _f ausgebildet, wobei stets gilt S _eff £ T.

Die erfindungsgemäße Anordnung ist vorzugsweise ausgestattet mit optischen Mitteln

zur Erzeugung eines in das Probenvolumen eingescannten Lichtblattes, sowie zur Variation der Position des Lichtblattes in Relation zum Objektiv in x, y und z-Richtung, und / oder

zur Variation des Winkels δ, und / oder

zur Variation der Ausrichtung des Lichtblattes innerhalb des Probenvolumens durch zentrische oder exzentrische Drehung um die optische Achse.

Für die Beleuchtung und die Detektion ist vorzugsweise ein gemeinsames Objektiv vorhanden, und die Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Elntrittspupilie des Objektivs ist an einem parallel zu dessen optischer Achse versetzten Ort vorgesehen. In diesem Fall ist eine Einrichtung vorhanden, die ausgebildet ist zur

Änderung des Abstandes des Eintrittsortes des Beleuchtungslichtes von der optischen

Achse des Objektivs,

Verschiebung des Eintrittsortes in der Pupillenebene auf einem Teilkreis, dessen Radius dem Abstand des Eintrittsortes des Beleuchtungslichtes von der optischen Achse entspricht, und zur Änderung der Richtung der Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille des Objektivs.

Beim Betreiben dieser Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung wird mit der dezentralen Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille des Beieuchtungs- und Detektionsobjektivs der Winke! ö bzw. die Schrägstellung des Lichtblattes vorgegeben. Die Verschiebung des Eintrittsortes des Beleuchtungslichtes auf dem Umfang des Teilkreises in der Pupillenebene bewirkt eine Drehung des Lichtblattes um die optische Achse des Objektivs. Die Änderung der Richtung der Einstrahlung bzw. des Einstrahlungswinkels des Beleuchtungslichtes relativ zur Normalen der Pupille, die im Sinne der Erfindung parallel zur optischen Achse verläuft, führt bei einem elliptisch gaußschen Lichtblatt zu einer Verschiebung des Lichtblattes und beeinflusst die laterale Ausdehnung eines Lichtblattes, welches durch das Scannen einer elongierten Punktbildfunktion in der Beleuchtung entsteht.

Die optische Einrichtung zur Erhöhung der Schärfentiefe S _0bj umfasst beispielsweise ein Axicon, eine Phasenmaske oder ein Mikroiinsenarray. Dabei werden das Axicon oder die Phasenmaske im Zusammenhang mit der Erzeugung zwei- oder dreidimensionaler Abbildungen nach der Ex- tended-Depth-of-Field-Verfahrensweise, das Mikroiinsenarray im Zusammenhang mit der Erzeugung zwei- oder dreidimensionaler Abbildungen nach der Light-Field-Technologie genutzt.

Ais Phasenmasken im Sinne der Erfindung kommen beispielsweise kubische, logarithmische, exponentielle, fractional-power Phasenmasken und rationale Phasenmasken rnfrage, sowie alle weiteren Phasenmasken, welche für eine Verlängerung der Detektions-PSF nutzbar sind. Desweiteren können auch Pupillenmasken zum Einsatz kommen, die die Amplitude des zu delektierenden Lichtes beeinflussen. So kommen auch Pupillenmasken in Betracht, die in bestimmten Bereichen eine erhöhte Absorption aufweisen und somit eine Apodisierung bewirken bzw. zu einer Abbiendung der Objektiv-NA führen. Hierbei kann auch eine Mischung aus absorbierenden und phasenbeeinfiussenden Bereichen einer Maske vorteilhaft eingesetzt werden.

Die Empfangsfläche des Flächensensors ist rechtwinklig, zumindest im Wesentlichen rechtwinklig zum Detekiionsstrahlengang ausgerichtet und in dieser Position fest im Detektions- strahlengang angeordnet, und zwar unabhängig von einer Positions- oder Neigungsänderung oder einer Drehung des Lichtblattes. Eine der Bewegung des Lichtblattes folgende Nachführung des Flächensensors bzw. der Empfangsfläche ist im Gegensatz zum Stand der Technik nicht notwendig. Damit entfallen mechanisch bewegte Baugruppen, und die Anordnung ist weniger störanfällig. Als Flächensensor kann beispielsweise ein CCD-Sensor vorgesehen sein.

Weiterhin ist kein mikroskopisches Relaysystem zur Erzeugung eines Zwischenbildes notwendig und demzufolge auch kein zweiter Lichtmikroskopaufbau zur Betrachtung eines solchen Zwischenbildes erforderlich, so dass die erfindungsgemäße Lösung im Vergleich zum Stand der Technik einen deutlich geringeren technischen Aufwand erfordert und dadurch weniger kostenintensiv ist. Außerdem ist die Detektionseffizienz höher, denn die NA ist nicht durch Schrägstellung mehrerer Optiken, insbesondere von hochaperturigen Objektiven, begrenzt. Die Transmission des Gesamtsystems ist aufgrund der geringeren Anzahl der erforderlichen Optiken höher als im vergleichbaren Stand der Technik.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht weiterhin darin, dass mit Objektiven, die eine verhältnismäßig geringe nominale Schärfentiefe S _obj aufweisen, räumliche Bilder von Proben gewonnen werden. Dadurch ist es möglich, kostengünstig Standardobjektive bzw. standardgemäße Abbildungsverhältnisse zu nutzen. Die Standardobjektive können hinsichtlich verschiedener praktischer Anwendungsfälle gegeneinander ausgewechselt werden, da die Objektiveigenschaften unabhängig vom Gesamtaufbau sind. So kann die erfindungsgemäße Anordnung wesentlich flexibler genutzt werden.

Als Hardware dienen ein PC sowie Mittel zur elektronischen Speicherung und visuell wahrnehmbaren Wiedergabe zwei- oder dreidimensionaler Abbildungen. Die Software entspricht einem vorgegebenen Algorithmus zur Signalauswertung und zum Generieren der zwei- oder dreidimensionalen Abbildungen im Ergebnis der Signalauswertung.

In einer ergänzenden Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Anordnung optional eine Einrichtung zur Veränderung des Ortes der Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille des Beleuchtungs- und Detektionsobjektivs auf, so dass die Einstrahlung wahlweise dezentral oder zentrisch zu dessen optischer Achse vorgenommen werden kann. Damit ist es möglich, nach Bedarf von einer Abtastung des ausgewählten Probenvolumens nach dem Lichtblatt-Mikroskopie-Verfahren auf die Abtastung nach der hergebrachten Laser- Scanning-Methode umzuschalten. So erfolgt bei der zentralen Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille des Objektivs die Gewinnung der optischen Bildsignale gemäß konfokaler Laserscanmikroskopie.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Ftg.1 ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung, bei dem die Empfangseinrichtung einen Flächensensor aufweist, dem im Detekfionsstrahlengang ein Axicon vorgeordnet ist,

Fig.2 ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung, hier jedoch mit einer dem Flächensensor im Detekfionsstrahlengang vorgeordneten kubischen Phasenmaske, Fig.3 ein drittes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung, hier mit einem dem Fiächensensor im Detektionsstrahlengang vorgeordneten Mikrolinsenarray,

Fig.4 das Zustandekommen einer ersten beispielhaften Position und Ausrichtung eines Lichtblattes in einer Probe in Relation zur optischen Achse eines Objektivs,

Fig.5 das Zustandekommen einer zweiten beispielhaften Position und Ausrichtung eines Lichtblattes in einer Probe in Relation zur optischen Achse eines Objektivs,

Fig.6 eine erfindungsgemäß erzielte Schärfentiefe S _eff im Vergleich zur nominalen Schärfentiefe S _obj eines Objektivs und zur Tiefe T eines Probenvolumens sowie die Erstreckung des Lichtblattes innerhalb des Probenvolumens im Vergleich zur Tiefe T eines Probenvoiumens.

Das in Fig.1 gezeigte Ausführungsbeispiel weist ein nach unendlich abbildendes Objektiv 1 fester Brennweite auf, das zur Nutzung sowohl als Beleuchtungs- als auch als Detektionsobjektiv vorgesehen ist. Es kann nominal für eine Schärfentiefe S _0bj im Bereich von 0,5 μηη bis 170 μηι ausgelegt sein.

Eine Laserlichiquelle 2, eine Strahlaufweitungsoptik 3 und eine Scanneinrichtung 4 erzeugen einen Beleuchtungsstrahlengang 5, der mittels der Teilerfläche 6 eines Strahlteilers 7 zum Objektiv 1 hin umgelenkt und seitlich versetzt zur optischen Achse 8 des Objektivs 1 in die Eintrittspupilie 24 des Objektivs 1 eingestrahlt wird (vgl. Fig.4 und Fig.5). Der aufgeweitete, kollimierte und beispielsweise mittels einer Zylinderlinse {zeichnerisch nicht dargestellt) in nur einer Richtung fokussierte und so zu einem Lichtblatt 9 geformte Laserstrahl wird über das Objektiv 1 in das Probenvolumen 10 hineinprojiziert. In alternativen Ausführungsformen kann das Lichtblatt 9 mit einem scannend bewegten punktförmigen Laserfokus oder mittels sonstiger lichtformender Verfahrensweisen generiert werden.

Die zur optischen Achse 8 dezentrale Einstrahlung des Beleuchtungslichtes bewirkt, dass die Propagationsrichtung des Lichtblattes 9 mit der optischen Achse 8 einen Winkel 5 einschließt, der von 90° verschieden ist. Die Größe des Winkels δ ist dabei abhängig vom Abstand zwischen dem Eintrittsort 23 des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille 24 und der optischen Achse 8.

Die Schrägstellung des Lichtblattes 9 relativ zur optischen Achse 8 hat zur Folge, dass mit dem Lichtblatt 9 auch Bereiche des Probenvolumens 10 beleuchtet werden, die in axialer Richtung, d.h. in z-Richtung in unterschiedlichen Tiefen vor und hinter der Fokusebene 11 liegen.

Die Scanneinrichtung 4 gibt mit der Scannbewegung in x- und / oder y-Richtung die aktuelle Position und Ausrichtung des Lichtblattes 9 innerhalb des Probenvolumens 10 vor. Besagte Scanneinrichtung 4 ist auch zur Drehung des Lichtblattes 9 um einen Winkel φ um die optische Achse 8 oder um eine zur optischen Achse 8 parallele Achse ausgebildet (vgl. Fig.4 und Fig.5). Zudem ermöglicht die Scaneinheit 4 das Verschieben des Eintrittsort.es 23 des Beleuchtungslichtes in der Pupillenebene entlang des Umfangs eines Teilkreises 25, dessen Radius dem Abstand des Einirittsortes 23 von der optischen Achse 8 entspricht.

Die Scanneinrichtung 4 ist hier beispielhaft ausgebildet zur

Änderung des Abstandes des Eintrittsortes 23 des Beleuchtungslichtes von der optischen Achse 8,

Verschiebung des Eintrittsortes 23 in der Pupillenebene auf einem Teilkreis 25, dessen Radius dem Abstand des Eintrittsortes 23 von der optischen Achse 8 entspricht, und zur Änderung der Richtung der Einstrahlung des Beleuchtungslichtes in die Eintrittspupille 24 des Objektivs 1.

Im Rahmen der Erfindung liegt jedoch ausdrücklich auch die Ausübung jeder einzelnen dieser Funktionen durch gesondert dafür ausgebildete Einrichtungen.

Von den beleuchteten Probenbereichen kommendes reflektiertes, gestreutes oder angeregtes Licht tritt als Detektionslicht in das Objektiv 1 ein. Das Objektiv 1 bildet einen Detektionsstrahlengang 12 aus, für den, wie in Fig.1 dargestellt, die Teilerfläche 6 transparent ist. Mit einer auf das Objektiv 1 abgestimmten Tubusoptik 13 wird ein Zwischenbild 14 erzeugt, das nachfolgend mittels zweier weiterer Linsengruppen 15 und 16a und einem Axicon 19 auf die Empfangsebene 18 eines Flächensensors 17 abgebildet wird. Die Empfangsebene 18 ist fest in einer Bildebene des Objektivs 1 positioniert, die zur Fokusebene 11 konjugiert ist.

Das Axicon 19 ist im Detektionsstrahlengang zwischen den beiden Linsengruppen 15, 16a positioniert. Das Axicon 19 transformiert das Detektionslicht in einen besselförmigen Lichtstrahl mit einem sehr langen Fokus und bewirkt somit erfindungsgemäß eine Erhöhung der nominalen Schärfentiefe S _obJ des Objektivs 1 um ein Vielfaches auf eine Schärfentiefe S _eff , wodurch das gesamte mit dem Lichtblatt 9 abgetastete Probenvolumen 10 scharf auf die Empfangsebene 18 abgebildet wird.

Aus der vom Flächensensor 17 registrierten Intensitätsverteilung im Detektionsstrahlengang 12 wird eine tiefenaufgelöste Abbildung jedes beleuchteten dünnen Schnittes des Probenvolumens 10 rechnerisch ermittelt und für einen Beobachter visuell wahrnehmbar dargestellt. Derartige Restaurationsverfahren sind an sich bekannt. Im Fall des sogenannten wave-front coding mittels Phasenmasken wird der Datensatz zunächst numerisch decodiert. Dies geschieht durch eine Entfaltung mit einer bekannten, durch die Maske, das Objektiv und das Mikroskopsystem bestimmten Punktbildfunktion (PSF). Nach diesem ersten Schritt erhält man eine Projektion des Probenvolumens entlang der optischen Achse. In einem weiteren Schritt wird die a-priort- Information über die jeweils aktuelle Beleuchtungsgeometrie in die Probenrestauration so einbezogen, dass eine eindeutige örtliche Zuordnung jedes detektierten Ereignisses zu dem abgetasteten Probenvolumen erfolgt.

Diesbezüglich ist, wie aus Fig.1 ersichtlich, eine Recheneinheit 26 vorgesehen, beispielsweise in Form eines PC mit entsprechender Verarbeitungs-Software. Die Recheneinheit 26 empfängt über die in Fig.1 dargestellten Signalwege vom Flächensensor 17 die Bildsignale, von der Scanneinrichtung 4 Informationen über die räumliche Lage und Ausrichtung des Lichtblattes 9 relativ zu dem beleuchteten Probenvolumen 10 und vom Probentisch 22 Informationen über die Position des Probenvolumens 10 in z-Richtung relativ zum Objektiv 1 und verknüpft diese Informationen mittels der Verarbeitungs-Software mit den Bildsignalen zwecks Gewinnung zwei- oder dreidimensionaler Abbildungen des abgetasteten Probenvolumens 10. Die visuell wahrnehmbare Darstellung und/oder Speicherung der Ergebnisse erfolgt mittels einer mit der Recheneinheit 26 verbundenen Speicher- und Wiedergabeeinheit 27.

In einer konkreten Ausgestaltung beträgt der Abstand von der Tubusoptik 13 zur Position des Zwischenbildes 14 f ₁₃ = 200 mm. Die Linsengruppe 15 ist beispielsweise f ₁₅ = 200 mm von der Position des Zwischenbildes 14 entfernt und erzeugt einen Unendlichstrahlengang. Das Axicon 19 ist 41 mm von der Linsengruppe 15 entfernt. Der Kegelwinkel des Axicon 19 ist £ 2 , er beträgt hier beispielsweise 0.5 . Der Abstand zwischen dem Axicon 19 und der Empfangsebene 18 variiert je nach Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung, er kann bis zu 50 cm betragen und wird durch die Länge des Besselstrahls bestimmt, der durch das Axicon 19 erzeugt wird. Die Empfangsebene 18 ist im Bereich des Besselstrahls positioniert.

Die Linsengruppen 15, 16a können sowohl aus mehreren Linsen bestehen als auch als Einzellinsen ausgeführt sein. Eine Linsengruppe 16a ist prinzipiell nicht erforderlich, im Rahmen der Erfindung liegt eine Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung ohne Linse oder Linsengruppe 16a. Jedoch können mit einer Linsengruppe 16a vorteilhaft optische Parameter wie Auflösung und laterale Vergrößerung eingestellt werden.

Fig.2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung. Die hier dargestellten Baugruppen sind, soweit sie mit Baugruppen aus Fig.1 bezüglich ihrer Funktionsweise vergleichbar sind, auch mit den gleichen Bezugszeichen wie in Fig.1 benannt.

Der Unterschied zu dem Ausführungsbeispiel nach Fig.1 besteht im Wesentlichen darin, dass hier kein Axicon 19, sondern eine kubische Phasenmaske 20 zwischen zwei Linsengruppen 15 und 16b vorgesehen und in einer zwischen den Linsengruppen 15, 16b ausgebildeten Pupille positioniert ist. Die Phasenmaske 20 transformiert das Detektionslicht in einen airy-förmigen Lichtstrahl und bewirkt erfindungsgemäß ebenfalls eine Erhöhung der nominalen Schärfentiefe S _obj des Objektivs 1 um ein Vielfaches auf eine Schärfentiefe S _eff , wodurch auch hier das gesamte mit dem Lichtblatt 9 abgetastete Probenvolumen 0 scharf auf die Empfangsebene 18 abgebildet wird.

Aus der vom Flächensensor 17 registrierten intensitätsverteilung im Detektionslichtstrahl wird wiederum unter Anwendung der Extended-Depth-of-Field-Technologie (EDoF) eine tiefenaufgelöste Abbildung jedes beleuchteten dünnen Schnittes des Probenvolumens 10 mit der Recheneinheit 26 rechnerisch ermittelt und mittels der Speicher- und Wiedergabeeinheit 27 für einen Beobachter visuell wahrnehmbar dargestellt.

In Fig.3 ist ein drittes Ausführungsbeispiel dargestellt. Auch hier werden für Baugruppen, soweit sie mit Baugruppen aus Fig.1 und Fig.2 vergleichbar sind, auch dieselben Bezugszeichen verendet.

Das Ausführungsbeispiel nach Fig.3 unterscheidet sich von den vorhergehenden Ausführungsbeispielen nach Fig.1 und Fig.2 dahingehend, dass weder ein Axicon 19 noch eine Phasenmaske 20 vorgesehen, sondern der Empfangsebene 18 ein Mikrolinsenarray 21 vorgeordnet ist.

Das Mikrolinsenarray 21 erhöht die Schärfentiefe S _obj des Objektivs 1 um ein Vielfaches auf eine Schärfentiefe S _e r _f , indem das mit dem Lichtblatt 9 abgetastete Probenvolumen 10 als Ganzes auf die Empfangsebene 18 abgebildet wird. Nachfolgend wird eine dreidimensionale Rekonstruktion dieses Volumens vorgenommen, indem aus der registrierten Intensitätsverteilung im Detektionslichtstrahl mittels der Light-Field-Technoiogie eine tiefenaufgelöste Abbildung des beleuchteten dünnen Schnitts rechnerisch ermittelt und visuell wahrnehmbar angezeigt wird.

Die Gewinnung und Nutzung der a-priori-information über die jeweils aktuelle Beleuchtungsgeometrie, wie weiter oben anhand Fig.1 beschrieben, kann in dem hier genannten Fall zur Verbesserung der Resultate der dreidimensionalen Probendarstellung einbezogen werden.

Die Gewinnung zwei- oder dreidimensionaler Abbildungen des abgetasteten Probenvolumens 10 erfolgt auch hier mittels einer Recheneinheit 26. in Fig.4 und Fig.5 sind beispielhaft zwei der möglichen Positionen und Ausrichtungen perspektivisch dargestellt, die das Lichtblatt 9 während der Abtastung eines Probenvolumens 10 in Relation zur optischen Achse 8 und zu einem Probentisch 22 einnehmen kann. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in Fig.4 und Fig.5 auf die Darstellung eines Objektivs und einer auf dem Probentisch 22 abgelegten Probe, die von dem Lichtblatt 9 abgetastet wird, verzichtet.

Fig.4a zeigt in einer Draufsicht auf die Eintrittspupille 24 eines Objektivs den Eintrittsort 23 des Beleuchtungsstrahlengangs 5 in die Eintrittspupilie 24, der durch den Winkel φ und den Abstand zur optischen Achse 8 bestimmt ist und die in Fig.4b dargestellte Position und Ausrichtung des Lichtblattes 9 in der Probe verursacht.

Fig.5a dagegen zeigt in einer Draufsicht auf dieselbe Eintrittspupille 24 den Eintrittsort 23 des Beleuchtungsstrahlengangs 5 in die Eintrittspupille 24, der wiederum durch den Winkel φ und den Abstand zur optischen Achse 8 bestimmt ist, hier allerdings die in Fig.5b dargestellte Position und Ausrichtung des Lichtblattes 9 in der Probe bewirkt.

In beiden Fällen zeigt diese Pupiilenbeieuchtung beispielhaft die Erzeugung eines inklinierten elliptisch gaußförmigen Lichtblattes.

Wie aus Fig.4 und Fig.5 ersichtlich, ist es mit der Variation des Eintrittsortes 23, hier beispielhaft durch Änderung des Winkels φ, möglich, die Position und Ausrichtung des Lichtblattes 9 einem abzutastenden Probenvolumen 10 anzupassen, wobei aber der Winkel δ zwischen optischer Achse 8 und Lichtblatt 9 erhalten bleibt. Der Durchstofipunkt des Lichtblattes 9 bezüglich einer Probenebene außerhalb der Fokusebene des Objektivs 1 läuft dabei auf einer Kreisbahn ab.

Eine Variation des Abstandes des Eintrittsortes 23 von der optischen Achse 8 bewirkt eine Veränderung des Winkels δ zwischen Lichtblatt 9 und der optischen Achse 8. Eine Anpassung der Position des Lichtblattes 9 an das in x- und y-Richtung ausgedehnte Probenvolumen 10 wird durch Änderung des Eintrittswinkels des Beleuchtungslichtes in die Puptllenebene des Objektivs 1 erreicht. Eine Verlagerung der Fokusebene 11 bzw. des Bereiches der Schärfentiefen S _obj , S _eff in z-Richtung relativ zur Probe kann durch Verschieben des Probentisches 22 in z- Richtung erzielt werden.

In Fig.6 ist die erfindungsgemäß erzielte effektive Schärfentiefe S _e ( _f vergleichsweise der nominalen Schärfentiefe S _obj eines Objektivs 1 und der Tiefe T des beleuchteten Volumens 10 einer auf einem Probentisch 22 abgelegten Probe gegenübergestellt.

Des Weiteren ist aus Fig.6 ersichtlich, dass sich das Lichtblatt 9 über die gesamte Tiefe T des Probenvolumens 10 hinweg erstreckt. In Fig.6 erstreckt sich das Lichtblatt 9 in z-Richtung über einen Bereich Δζ = L hinweg, wobei L die Tiefe T des Probenvolumens 10 einschliefst, so dass das Lichtblatt 9 das Probenvolumen 10 in seiner gesamten Tiefe T beleuchtet. Diese Bedingung erfüllt auch der Fall L = T und liegt daher ebenfalls im Rahmen der Erfindung.

Innerhalb des Bereiches L überschreitet die räumliche Ausdehnung des Lichtblattes 9 in Richtung der optischen Achse 8 nicht den Betrag von beispielsweise 10 μηη und ist daher zur Detek- tion bzw. Messung eines Probenvolumens 10 nach dem Prinzip der Lichtblattmikroskopie geeignet.

Die Schärfentiefe S _eff £ T ermöglicht in Verbindung mit der Änderung des Winkels φ und der Verschiebung des Lichiblaties 9 oder der Probe in x- oder y-Richtung die Erfassung und Abbildung des gesamten Probenvolumens 10.

Bezugszeichenliste

1 Objektiv

2 Laserlichtquelle

3 Strahlaufweitungsoptik

4 Scanneinrichtung

5 Beleuchtungsstrahlengang

6 Teilerfläche

7 Strahlteiler

8 optische Achse

9 Lichtblatt

10 Probenvolumen

11 Fokusebene

12 Detektionsstrahlengang

13 Tubusoptik

14 Zwischenbild

15 Linsengruppe

16 Linsengruppe

17 Flächensensor

18 Empfangsebene

19 Axicon

20 Phasenmaske

21 Mikrolinsenarray

22 Probentisch

23 Eintrittsort

24 Eintrittspupille

25 Teilkreis

26 Recheneinheit

27 Speicher- und Wiedergabeeinheit