ICHIKAWA MASAKO (JP)
USAMI SATORU (JP)
YAMAMOTO TAKESHI (JP)
TSUKAMOTO HIROSHI (JP)
KAJIWARA HITOMI (JP)
OKA NAOMI (JP)
TAKAKURA YOSHIMITSU (JP)
ICHIKAWA MASAKO (JP)
USAMI SATORU (JP)
YAMAMOTO TAKESHI (JP)
TSUKAMOTO HIROSHI (JP)
KAJIWARA HITOMI (JP)
OKA NAOMI (JP)
| WO2002072817A1 | 2002-09-19 | |||
| WO2002072817A1 | 2002-09-19 |
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See also references of EP 2184356A4
| タンパク質を担体に結合する方法であって、 ビオチンを結合させた担体を準備し; タマビジンに上記タンパク質を結合させた融合タンパク質を準備し;そして タマビジン-ビオチン結合を介して、上記担体に上記タンパク質を結合させる ことを含む、前記方法。 |
| タマビジンが、 (a)配列番号2又は配列番号4において1又はそれより多くのアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ビオチン結合活性を有するタンパク質;又は (b)配列番号2又は配列番号4と同一性が60%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ビオチン結合活性を有するタンパク質;又は (c)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質;又は (d)配列番号1又は3の塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ビオチン結合活性を有するタンパク質 から選択される、請求項1に記載の方法。 |
| タンパク質が、抗体若しくはその断片、抗原タンパク質、酵素、レクチン、ペプチド、プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択される、請求項1ないし2のいずれか1項に記載の方法。 |
| 担体が、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ及びセンサーチップからなる群から選択される、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。 |
| タマビジンとタンパク質がリンカーを介して結合して融合タンパク質を構成している、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。 |
| タマビジンとタンパク質が6個以上のアミノ酸からなるリンカーを介して結合して融合タンパク質を構成している、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。 |
| 前記融合タンパク質に、さらにリーダー配列が結合している請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。 |
| ビオチンと担体が、長さが13.5Åより長いリンカーを介して結合している、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。 |
| ビオチンを結合させた担体に、タマビジンにタンパク質を結合させた融合タンパク質をタマビジン-ビオチン結合を介して結合させた、タマビジン融合タンパク質結合担体。 |
| タマビジンとタンパク質がリンカーを介して結合している融合タンパク質をコードする核酸を含む、タマビジン融合タンパク質を発現するための、発現ベクター。 |
本出願は、2007年8月28日に出願された日本 国特許出願2007-220921に基づく優先権を主張す 。
本発明は、タマビジンを利用した、タン ク質を担体に結合する方法に関する。
従来、タンパク質をマイクロプレートや 小ビーズ、あるいはセンサーチップなどの 体に結合させる汎用的な方法として、疎水 合、共有結合などが知られている。疎水結 は、担体の疎水性表面とタンパク質の疎水 部分の相互作用で、特別な試薬を必要とし い点で簡便であるが、概して結合力は弱く ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等に用いる 場合、結合後の洗浄操作等で、タンパク質が 担体から離れてしまうことが多い。また、疎 水結合によりタンパク質と担体を結合させた 場合、タンパク質の多くが、その機能を完全 に、あるいは部分的に失うことが知られてい る。一方、共有結合は、タンパク質中の官能 基(例えばアミノ基)と担体表面に配置された 能基(例えばカルボキシル基)の相互作用の め、結合力は強い。しかし、共有結合によ タンパク質と担体と結合させた場合、疎水 合の場合と同様に、多くのタンパク質にお て、その機能は完全に、あるいは部分的に われてしまう。
疎水結合や共有結合の他にも、複数のヒ チジンをタンパク質の末端に融合させ、こ ヒスチジンタグをもつ融合タンパク質を、 面にニッケルが配置された、例えばプロテ ンチップ等の基板などに結合させる方法が られている。しかしながら、ヒスチジンタ とニッケルイオンの相互作用はあまり強く く、さらにニッケルイオンには、様々な生 分子との非特異的な結合が知られており、 ずしも万能ではない。
アビジンは、卵白由来の糖タンパク質で オチン(ビタミンH)に極めて強く結合する。 ビジンとビオチンの相互作用は最も強い非 有結合の一つである(Green (1975) Adv Protein C hem 29: 85-133)。ストレプトアビジンは放線菌 来のアビジン様タンパク質で、やはりビオ ンと強く結合する。これまでに(ストレプト )アビジン-ビオチンの相互作用は、その作用 の強さから、例えば、抗原や抗体の検出な 分子生物学や生化学の分野で、広範に用い れている(Green (1990) Methods Enzymol 184: 51-67) 。
このアビジンやストレプトアビジンのビ チン結合性を利用して、タンパク質を担体 結合する方法が考案されている。例えば(ス トレプト)アビジンを共有結合や疎水結合に りマイクロプレートなどのような基板に固 化し、ビオチン化したタンパク質と結合さ ることにより固定化させる方法である。し し、この方法では、アビジンそのものの活 が部分的に失われるばかりでなく、ビオチ を介して結合させたタンパク質の比活性が 下し、十分な作用効率が得られているとは えなかった。
一方、ビオチンを結合させた基板に、ま アビジンタンパク質を、アビジン-ビオチン 結合によって結合させ、ここへビオチン化し た所望のタンパク質を結合させ、アビジンの 別のビオチンポケットに結合させることで、 基板-ビオチン-アビジン-ビオチン-所望のタ パク質という順序で固定させる技術が報告 れている(特開平4-236353)。しかし、この方法 は、所望のタンパク質をビオチン化するス ップが入り、余分な労力が必要な上に、ビ チン標識の効率も考慮に入れなければなら いという問題があった。
これまで、タンパク質の標識、診断マーカ
や細胞特異的標的化因子としての使用を目
に、アビジンまたはストレプトアビジンを
いた融合タンパク質が作成されてきた(Airenn
e et al. (1999) Biomol Eng 16: 87-92)。これらの
ち特にアビジンまたはストレプトアビジン
、scFvやFab断片、IgGのような抗体との融合タ
ンパク質は、ガン細胞等への薬剤の特異的標
的への応用研究が進んでいる。また、ストレ
プトアビジンとscFvとの融合タンパク質を用
て、scFvをアビジン-ビオチン結合を介して固
定化したカラムの発想が記載されている(Kipri
vanov et al. (1995) Hum Antib Hybrid 6: 93-101、Dub
el et al. (1995) J Immunol Methods 178: 201-209)。
かし、アビジン、ストレプトアビジンは大
菌において、可溶性に大量に発現させるこ
が難しいばかりでなく、アビジン融合タン
ク質やストレプトアビジン融合タンパク質
ビオチン化担体と結合させることにより固
化し、従来の結合法と比較してタンパク質
活性を向上させるといった報告はない。そ
どころか、ストレプトアビジンとβ-ガラク
シダーゼとの融合タンパク質をビオチン化
ーズに結合させた場合において、β-ガラク
シダーゼの比活性がおよそ50%に低下したと
報告がなされている(Huang et al(1996) Enzyme a
nd Microbial technology)。
本発明は、タンパク質を担体に結合する あたり、当該タンパク質を直接結合する場 よりも、当該タンパク質が効率良く作用す 、担体との結合方法を提供することを目的 する。タンパク質を担体に直接結合させる 来の方法では、結合させたタンパク質の活 が低下することが問題になっていた。本発 は、従来のタンパク質固定化法における上 問題を解決することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、 マビジンと所望のタンパク質を融合させた ンパク質を作製し、この融合タンパク質を その表面にビオチンを固定化させた担体に 合することにより、所望のタンパク質を従 の方法で担体に固定した場合と比べ、当該 ンパク質の機能を損なうことなく、遥かに 率良く作用させることができることを見出 た。
すなわち、本発明者らは、酵素とタマビ ンとの融合タンパク質を用いて、例えば、 オチン化磁性ビーズにタマビジン-ビオチン 結合を用いて結合させると、酵素タンパク質 を共有結合によって磁性ビーズに結合させる 場合と比べて、酵素活性が10倍以上と大幅に 昇することを見出した。また、抗体断片と マビジンとの融合タンパク質をビオチン化 イクロプレートに結合させると、当該抗体 片を疎水結合によってマイクロプレートに 合させた場合に比べて、抗原結合活性が高 ことを見出した。さらに、プロテインAとタ マビジンとの融合タンパク質をビオチン化マ イクロプレートに結合させ、これに抗体を結 合させると、抗体を疎水結合によって直接マ イクロプレートに結合させた場合に比べて、 約2倍~4倍検出感度が向上することを見出した 。
本発明は、以上の知見に基づきタンパク を、そのタンパク質の活性を損なわず、担 に結合させる新規な結合方法を提供するも である。
[本発明を実施するための形態]
本発明は、好ましくは以下の態様を含む。
態様(1)
タンパク質を担体に結合する方法であって
ビオチンを結合させた担体を準備し;
タマビジンに上記タンパク質を結合させ
融合タンパク質を準備し;そして
タマビジン-ビオチン結合を介して、上記
体に上記タンパク質を結合させる
ことを含む、前記方法。
態様(2)
タマビジンが、
(a)配列番号2又は配列番号4において1又はそ
より多くのアミノ酸が欠失、置換若しくは
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ビ
チン結合活性を有するタンパク質;又は
(b)配列番号2又は配列番号4と同一性が60%以
のアミノ酸配列からなり、かつ、ビオチン
合活性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列
らなるタンパク質;又は
(d)配列番号1又は3の塩基配列の相補鎖に、
トリンジェントな条件下でハイブリダイズ
る核酸によってコードされるアミノ酸配列
らなり、かつ、ビオチン結合活性を有する
ンパク質
から選択される、態様1に記載の方法。
態様(3)
タンパク質が、抗体若しくはその断片、抗
タンパク質、酵素、レクチン、ペプチド、
ロテインA、プロテインG及びプロテインLか
なる群から選択される、態様1ないし2のい
れか1項に記載の方法。
態様(4)
担体が、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細
、フィルター、プレート、マイクロプレー
、カーボンナノチューブ及びセンサーチッ
からなる群から選択される、態様1ないし3
いずれか1項に記載の方法。
態様(5)
タマビジンとタンパク質がリンカーを介し
結合して融合タンパク質を構成している、
様1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
態様(6)
タマビジンとタンパク質が6個以上のアミノ
酸からなるリンカーを介して結合して融合タ
ンパク質を構成している、態様1ないし4のい
れか1項に記載の方法。
態様(7)
前記融合タンパク質に、さらにリーダー配
が結合している態様1ないし6のいずれか1項
記載の方法。
態様(8)
ビオチンと担体が、長さが13.5Åより長いリ
ンカーを介して結合している、態様1ないし7
いずれか1項に記載の方法。
態様(9)
ビオチンを結合させた担体に、タマビジン
タンパク質を結合させた融合タンパク質を
マビジン-ビオチン結合を介して結合させた
、タマビジン融合タンパク質結合担体。
態様(10)
タマビジンとタンパク質がリンカーを介し
結合している融合タンパク質をコードする
酸を含む、タマビジン融合タンパク質を発
するための、発現ベクター。
以下、本発明を実施するための好ましい 態について説明する。
タマビジン
タマビジンは、食用キノコである担子菌タ
ギタケ(Pleurotus conucopiae)から発見された新
ビオチン結合タンパク質である(WO02/072817)。
該文献には、
-タマビジン1とタマビジン2の相互のアミノ
相同性は65.5%で、ビオチンと強く結合する;
-タマビジン2は、大腸菌で可溶性画分に高
現する;そして
-タマビジン2を大腸菌で発現させた場合、4.
5時間の培養で、50mlの培養当たり約1mgの純度
高い精製組換えタンパク質が得られた。こ
はビオチン結合性タンパク質として知られ
いるアビジンやストレプトアビジンと比較
ても、非常に高い値である;
ことが記載されている。
さらに本発明者らは、タマビジンについて
究を進め、以下のことを見出した:
-タマビジン1も、大腸菌で可溶性画分に高
現する;そして、
-タマビジン1についても大腸菌で発現させ
場合、4.5時間の培養で、50mlの培養当たり約1
mgの純度の高い精製組換えタンパク質が得ら
た。
本発明のタマビジンの融合タンパク質を いた結合方法により、酵素や抗体のタンパ 質を結合させた担体について、従来の疎水 合あるいは共有結合で結合させた担体に比 、その活性を大幅に上昇させることに成功 た。即ち、所望のタンパク質をタマビジン の融合タンパク質として発現させ、ビオチ 結合担体に結合させることで、他の方法で 合させた場合と比べ、所望のタンパク質の 性を大幅に向上させることができた。理論 縛られるわけではないが、この理由は、タ パク質の配向化による効果ではないかと推 される。またこの方法で結合させる場合、 ンパク質の精製と担体への結合を同時に行 ことができるため、製造工程の簡略化によ 労力とコストの大幅な削減が実現できた。 た、所望のタンパク質としてレクチンを選 した場合において、従来レクチンは担体の 定化が難しいとされていたが、本方法によ レクチン活性を阻害することなく固定化す ことができる。このように、担体の固定化 難しいタンパク質についても、本方法によ 問題なく固定化することができる。さらに ビオチン結合タンパク質としてタマビジン 使用した結合担体は、従来のアビジンに比 して非特異結合が少なく、また、ストレプ アビジンと比較して、耐熱性が上昇すると えられる。さらにまた、タマビジンを用い 場合、タマビジン自体が、アビジンやスト プトアビジンと異なり、大腸菌で可溶性高 現することから、融合させる相手である所 のタンパク質が大腸菌で可溶性発現する場 には、この融合タンパク質も大腸菌で可溶 発現すると考えられるため、このようなタ ビジン融合タンパク質とその結合担体は、 の作製にかかる労力やコストを大幅に削減 ることが可能となる。
タマビジンとビオチンとの結合力は、例 ば上述のヒスチジンタグとニッケルとの結 よりも強いため、融合タンパク質を所望の オチン化担体に結合させた後に、例えば、 面活性剤や高濃度の塩などを用いた強い洗 を行うことが可能となり、融合タンパク質 外の生体物質が、担体に結合する非特異結 を、極力減らすことができる。さらに、ビ チンは、ニッケルに比べ生体分子との非特 結合がほとんど生じない。これらのことは 最終的に作成するELISAプレートや磁性ビー 、あるいはセンサーチップにおけるノイズ 減少と、検出感度の上昇に繋がる。
本発明における「タマビジン」は、タマ ジン1、タマビジン2、またはそれらの変異 を意味する。具体的には、本発明のタマビ ンは典型的には、配列番号2もしくは配列番 4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、 または、配列番号1もしくは配列番号3の塩基 列を含んでなる核酸によってコードされる ンパク質、であってよい。あるいは、本発 のタマビジンは、配列番号2もしくは配列番 号4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質 または、配列番号1もしくは配列番号3の塩基 配列を含んでなる核酸によってコードされる タンパク質、の変異体であって、タマビジン 1または2と同様のビオチン結合活性を有する ンパク質であってよい。本明細書において タマビジン1、タマビジン2、およびそれら 変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶ とがある。
タマビジン1または2の変異体は、配列番 2または4のアミノ酸配列において、1または 数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および/ま は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタ パク質であって、タマビジン1または2と同 のビオチン結合活性を有するタンパク質で ってもよい。置換は、保存的置換であって よく、これは、特定のアミノ酸残基を類似 物理化学的特徴を有する残基で置き換える とである。保存的置換の非限定的な例には Ile、Val、LeuまたはAla相互の置換のような脂 族基含有アミノ酸残基の間の置換、Lysおよ Arg、GluおよびAsp、GlnおよびAsn相互の置換の うな極性残基の間での置換などが含まれる
アミノ酸の欠失、置換、挿入および/また は付加による変異体は、野生型タンパク質を コードするDNAに、例えば周知技術である部位 特異的変異誘発(例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によ その全体を本明細書に援用する)を施すこと より作成することができる。本明細書にお て、「1または複数のアミノ酸」とは、部位 特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入お よび/または付加できる程度のアミノ酸を意 する。また、本明細書において「1または複 のアミノ酸」とは、場合により、1または数 個のアミノ酸を意味してもよい。
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望 変異である特定の不一致の他は、変異を受 るべき一本鎖ファージDNAに相補的な合成オ ゴヌクレオチドプライマーを用いて次のよ に行うことができる。即ち、プライマーと て上記合成オリゴヌクレオチドを用いてフ ージに相補的な鎖を合成させ、得られた二 鎖DNAで宿主細胞を形質転換する。形質転換 れた細菌の培養物を寒天にプレーティング 、ファージを含有する単一細胞からプラー を形成させる。そうすると、理論的には50% 新コロニーが一本鎖として変異を有するフ ージを含有し、残りの50%が元の配列を有す 。上記所望の変異を有するDNAと完全に一致 るものとはハイブリダイズするが、元の鎖 有するものとはハイブリダイズしない温度 おいて、得られたプラークをキナーゼ処理 より標識した合成プローブとハイブリダイ させる。次に該プローブとハイブリダイズ るプラークを拾い、培養してDNAを回収する
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列 その活性を保持しつつ1または複数のアミノ 酸の欠失、置換、挿入および/または付加を す方法としては、上記の部位特異的変異誘 の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法 および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択 れたヌクレオチドを除去、置換、挿入また 付加し、次いで連結する方法もある。より ましくは、本発明におけるタマビジンは、 列番号2又は配列番号4において1ないしは10個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された アミノ酸配列からなり、ビオチン活性を有す るタンパク質である。
タマビジン1または2の変異体はさらに、 列番号2または4のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、好ましくは65%以上、70%以上、75%以上 、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上 、97%以上、98%以上または99%以上、より好まし くは99.3%以上のアミノ酸同一性を有するアミ 酸配列を含んでなるタンパク質であって、 マビジン1または2と同様のビオチン結合活 を有するタンパク質であってもよい。
2つのアミノ酸配列の同一性%は、視覚的 査および数学的計算によって決定してもよ 。あるいは、2つのタンパク質配列の同一性 ーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D . (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)のアルゴリズ ムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝 学コンピューターグループ(UWGCG)より入手可 なGAPコンピュータープログラムを用い配列 報を比較することにより、決定してもよい GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメ ターには:(1)Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. (Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992)に 載されるような、スコアリング・マトリッ ス、blosum62;(2)12のギャップ加重;(3)4のギャッ 長加重;及び(4)末端ギャップに対するペナル ティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプ グラムもまた、用いてもよい。同一性のパ セントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されているBLASTプロ ラムを用いて配列情報と比較し決定するこ が可能である。当該プログラムは、インタ ネット上でNational Center for Biotechnology Infor mation(NCBI)、あるいはDNA Data Bank of Japan(DDBJ) ウェブサイトから利用することが可能であ 。BLASTプログラムによる同一性検索の各種 件(パラメーター)は同サイトに詳しく記載さ れており、一部の設定を適宜変更することが 可能であるが、検索は通常デフォルト値を用 いて行う。または、2つのアミノ酸配列の同 性%は、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver. 7(ゼネティックス製)などのプログラム、また は、FASTAアルゴリズムなどを用いて決定して よい。その際、検索はデフォルト値を用い よい。
2つの核酸配列の同一性%は、視覚的検査 数学的計算により決定可能であるか、また より好ましくは、この比較はコンピュータ プログラムを使用して配列情報を比較する とによってなされる。代表的な、好ましい ンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピ ータ・グループ(GCG;ウィスコンシン州マディ ソン)のウィスコンシン・パッケージ、バー ョン10.0プログラム「GAP」である(Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387)。この「GAP プログラムの使用により、2つの核酸配列の 較の他に、2つのアミノ酸配列の比較、核酸 配列とアミノ酸配列との比較を行うことがで きる。ここで、「GAP」プログラムの好ましい デフォルトパラメーターには:(1)ヌクレオチ についての(同一物について1、および非同一 物について0の値を含む)一元(unary)比較マトリ ックスのGCG実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「 ポリペプチドの配列および構造のアトラス(At las of Polypeptide Sequence and Structure)」国立バ オ医学研究財団、353-358頁、1979により記載 れるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリ クス;または他の比較可能な比較マトリック ス;(2)アミノ酸の各ギャップについて30のペナ ルティと各ギャップ中の各記号について追加 の1のペナルティ;またはヌクレオチド配列の ギャップについて50のペナルティと各ギャ プ中の各記号について追加の3のペナルティ; (3)エンドギャップへのノーペナルティ:およ (4)長いギャップへは最大ペナルティなし、 含まれる。当業者により使用される他の配 比較プログラムでは、例えば、米国国立医 ライブラリーのウェブサイト:http://www.ncbi.nlm .nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能 なBLASTNプログラム、バージョン2.2.7、またはU W-BLAST2.0アルゴリズムが使用可能である。UW-BL AST2.0についての標準的なデフォルトパラメー ターの設定は、以下のインターネットサイト :http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア 付けマトリックスを使用し、使用可能である 選択パラメーターは以下の通りである:(A)低 組成複雑性を有するクエリー配列のセグメ ト(WoottonおよびFederhenのSEGプログラム(Computers and Chemistry, 1993)により決定される;Woottonお びFederhen, 1996「配列データベースにおける 成編重領域の解析(Analysis of compositionally bi ased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい)、または、短周期 性の内部リピートからなるセグメント(Claverie およびStates(Computers and Chemistry, 1993)のXNUプ グラムにより決定される)をマスクするため フィルターを含むこと、および(B)データベ ス配列に対する適合を報告するための統計 的有意性の閾値、またはE-スコア(Karlinおよ Altschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって 、単に偶然により見出される適合の期待確率 ;ある適合に起因する統計学的有意差がE-スコ ア閾値より大きい場合、この適合は報告され ない);好ましいE-スコア閾値の数値は0.5であ か、または好ましさが増える順に、0.25、0.1 0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-2 0、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、または1e-100 ある。
タマビジンの変異体については、ビオチ 結合能に影響を及ぼさないことが求められ 。ところで、ビオチン結合タンパク質の一 であるストレプトアビジンのビオチンポケ トについては既に解明が進んでいる。この トレプトアビジンとタマビジン2のアミノ酸 配列のホモロジーは50%程度に過ぎないが、発 明者らは、タマビジン2のビオチンポケット ついての知見を得るべく、タマビジン2とス レプトアビジンのアミノ酸配列を並列させ 比較した。すると、ストレプトアビジンの オチンポケットを形成するアミノ酸の中で ビオチンと直接相互作用する残基N23、S27、Y 43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128( Weber et al. (1989)Science 243: 85-88、Livnah et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5076-5080) は、TM2では各々、N14、S18、Y34、S36、D40、W69、 S76、T78、W80、W96、W108、D116に該当し、非常に く保存されていることが見出された。
特に4つのトリプトファン残基(W69、W80、W9 6、W108)はビオチンポケットの構造に重要な役 割を果たしていると考えられるため、改変さ れないことが望ましい。一方、ビオチンとの 結合に関与すると考えられるその他のアミノ 酸すなわち、TM2においては、ビオチンと直接 相互作用すると考えられるアミノ酸残基(N14 S18、Y34、S36、S76、T78、D116)についても改変さ れないことが望ましい。あるいは、これらを 改変する場合にはビオチンとの結合を維持で きるよう、性質あるいは構造が類似したアミ ノ酸に改変することが望ましく、例えばアス パラギン(N14)の場合は、グルタミン(Q)やアス ラギン酸(D)へ、好ましくはアスパラギン酸 、アスパラギン酸(D40)の場合は、アスパラ ン(N)へ、セリン(S18、S36、S76)の場合は、スレ オニン(T)あるいはチロシン(Y)へ、好ましくは スレオニンへ、チロシン(Y34)の場合は、セリ (S)やスレオニン(T)あるいはフェニルアラニ (F)へ、好ましくはフェニルアラニンへ、ス オニン(T78)の場合は、セリン(S)やチロシン(Y )へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸(D 116)の場合は、グルタミン酸(E)やアスパラギ (N)へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞ 改変した変異体が望ましい。
タマビジン1または2の変異体はまた、配 番号1または3の塩基配列の相補鎖にストリン ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配 列を含んでなる核酸によってコードされるタ ンパク質であって、タマビジン1または2と同 のビオチン結合活性を有するタンパク質で ってもよい。
ここで、「ストリンジェントな条件下」 は、中程度または高程度にストリンジェン な条件においてハイブリダイズすることを 味する。具体的には、中程度にストリンジ ントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき 一般の技術を有する当業者によって、容易 決定することが可能である。基本的な条件 、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版,第6章,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20 01に示され、例えば5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(p H8.0)の前洗浄溶液、約42℃での、約50%ホルム ミド、2×SSC-6×SSC、好ましくは5-6×SSC、0.5% SD S(または約42℃での約50%ホルムアミド中の、 ターク溶液(Stark’s solution)などの他の同様 ハイブリダイゼーション溶液)のハイブリダ ゼーション条件、及び例えば、約50℃-68℃ 0.1-6×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の使用が含まれ 。好ましくは中程度にストリンジェントな 件は、約50℃、6×SSC、0.5% SDSのハイブリダ ゼーション条件(及び洗浄条件)を含む。高ス トリンジェントな条件もまた、例えばDNAの長 さに基づき、当業者によって、容易に決定す ることが可能である。
一般に、こうした条件は、中程度にストリ ジェントな条件よりも高い温度及び/又は低 い塩濃度でのハイブリダイゼーション(例え 、0.5%程度のSDSを含み、約65℃、6×SSCないし0. 2×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC 、より好ましくは0.2×SSC、あるいは0.1×SSCの イブリダイゼーション)及び/又は洗浄を含み 、例えば上記のようなハイブリダイゼーショ ン条件、及びおよそ65℃-68℃、0.2ないし0.1×SS C、0.1% SDSの洗浄を伴うと定義される。ハイ リダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では SSC(1×SSCは、0.15M NaClおよび15mM クエン酸ナ リウムである)にSSPE(1×SSPEは、0.15M NaCl、10mM NaH 2 PO 4 、および1.25mM EDTA、pH7.4である)を代用するこ とが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーシ ョンが完了した後で15分間ないし1時間程度行 う。
また、プローブに放射性物質を使用しな 市販のハイブリダイゼーションキットを使 することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system(Amersham社製)を使用 たハイブリダイゼーション等が挙げられる ストリンジェントなハイブリダイゼーショ としては、例えば、キット中のhybridization b ufferにBlocking試薬を5%(w/v)、NaClを0.5Mになるよ に加え、42℃で4時間行い、洗浄は、0.4% SDS 0.5xSSC中で、55℃で20分を2回、2xSSC中で室温、 5分を一回行う、という条件が挙げられる。
タマビジン1または2の変異体のビオチン 合活性は、公知の手法のいずれかにより測 することが可能である。例えば、Kadaら(Biochi m. Biophys. Acta., 1427: 33-43 (1999))に記載され ように蛍光ビオチンを用いる方法により測 してもよい。この方法は、ビオチン結合タ パク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチ が結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が 失する性質を利用したアッセイ系である。 るいは、表面プラズモン共鳴を原理とした イオセンサーなど、タンパク質とビオチン 結合を測定することが可能なセンサーを用 て、変異体タンパク質のビオチン結合活性 評価することもできる。
本発明の好ましい態様において、タマビジ
は、
(a)配列番号2又は配列番号4において1又はそ
より多くのアミノ酸が欠失、置換若しくは
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ビ
チン結合活性を有するタンパク質;又は
(b)配列番号2又は配列番号4と同一性が60%以
のアミノ酸配列からなり、かつ、ビオチン
合活性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列
らなるタンパク質;又は
(d)配列番号1又は3の塩基配列の相補鎖に、
トリンジェントな条件下でハイブリダイズ
る核酸によってコードされるアミノ酸配列
らなり、かつ、ビオチン結合活性を有する
ンパク質
から選択される。
タンパク質
タマビジンの相手として融合させるタンパ
質は、特に限定されないが、例えば、抗体
抗原タンパク質、各種酵素、レクチン、ペ
チド、あるいはプロテインA、プロテインG
プロテインLなどが挙げられる。抗体として
、IgGの他、scFvやFab等の抗原結合部位を含む
抗体断片が、抗原タンパク質としては、B型
C型肝炎ウイルス、HIV、インフルエンザ等の
イルス由来のタンパク質や、ヘリコバクタ
・ピロリ等の細菌由来のタンパク質、ある
はCEA、PSA等の腫瘍マーカー、性ホルモンな
が挙げられる。また、酵素としては、ペル
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピ
ノースオキシダーゼ、シトクロムP-450、カ
ラーゼ等の酸化還元酵素、アルカリフォス
ァターゼ等の脱リン酸化酵素、PPDK等のリン
化酵素、シアル酸転移酵素などの糖転移酵
、CMP-シアル酸合成酵素などの糖ヌクレオチ
ド合成酵素、アシル基転移酵素、アミノ基転
移酵素、パパインやトロンビンなどのタンパ
ク質分解酵素、制限酵素などのヌクレアーゼ
、PLD等の脂質分解酵素、アミラーゼ,リゾチ
ム,β‐ガラクトシダーゼ等の糖質分解酵素
ホスホグリセリン酸ホスホムターゼ、グル
ース6-リン酸イソメラーゼ等の異性化酵素、
ルシフェラーゼ、DNA/RNAポリメラーゼ、ATP合
・加水分解酵素などが挙げられる。レクチ
は、糖結合性タンパク質であり、マンノー
特異的レクチン、GalNAc特異的レクチン、GlcNA
c特異的レクチン、フコース特異的レクチン
シアル酸特異的レクチンなどの単糖特異的
クチン、オリゴ糖特異的レクチンなどが挙
られる。更にペプチドとしては、2~100アミノ
酸からなるもの、好ましくは2~50アミノ酸か
なるもの、より好ましくは2~30アミノ酸から
るものが、例として挙げられるが、これら
限定されるものではない。
タマビジン融合タンパク質
タマビジン融合タンパク質は、タマビジン
上記のタンパク質との融合タンパク質を意
する。タマビジン融合タンパク質の準備の
法は特に限定されず、例えば公知の遺伝子
学的手法を用いて発現させてもよい。例え
、タマビジンと所望のタンパク質との融合
ンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌等
発現システムを用いて発現することによっ
取得することができる。
タマビジン融合タンパク質において、タ ビジンとタンパク質は直接結合していても く、あるいはリンカーを介して結合してい もよいが、アミノ酸のリンカーを介した結 が好ましい。このリンカーの長さは、少な とも1アミノ酸以上であればよいが、好まし くは5アミノ酸以上、さらに好ましくは6アミ 酸以上である。また、担体と結合している オチンとタマビジンとの結合力を一層向上 せるためには、好ましくは10アミノ酸以上 より好ましくは12アミノ酸以上、15アミノ酸 上、18アミノ酸以上、更に好ましくは25アミ ノ酸以上である。また、このようなリンカー はタマビジン融合タンパク質の活性をも向上 させると推測される。このリンカーを構成す るアミノ酸は特に限定されないが、好ましく は、グリシン、セリン、あるいはアラニンの ような中性アミノ酸の繰り返しからなる。例 えば、これらに限定されないが、GGGGS、GGSGG GASAG、GSGAA、GSGSA、GGGGSG、GGGSGGS、GGSGGGGS、AAAAG SGAA、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番 号52-62)などが挙げられる。
またタマビジンは、所望のタンパク質のN 末端側、もしくはC末端側のどちらに結合さ ても良い。また所望のタンパク質を発現さ るにあたり、例えば大腸菌の細胞質よりも リプラズム空間の方が適する場合には、ペ プラズムに標的するためのリーダー配列を いても良い。このようなリーダー配列とし 、PelB(Lei et al. (1987) J Bacteriol 169: 4379-4383 )やOmpA(Gentry-Weeks et al. (1992) J Bacteriol 174: 7729-7742)等があるが、これらに限定されるも ではない。
また、融合タンパク質の例えばC末端に、 後の精製や検出用のタグを付加しても良い。 このようなタグとして例えば、c-mycエピトー タグ(Munro and Pelham (1986) Cell 46: 291-300)や スチジンタグ(Hochuli et al (1988) Bio/Technol 6 : 1321-1325、Smith et al. (1988) J Biol Chem 263: 7211-7215)等があるが、これらに限定されるも ではない。
タマビジン融合タンパク質が可溶性画分 ら得られる場合は、粗タンパク抽出液を後 のビオチン化担体と接触させ、融合タンパ 質をビオチン化担体に結合させてもよい。 れをその後十分に洗浄することで、融合タ パク質の精製と担体への固定化が一度でで る。あるいはイミノビオチン等(Hofmann et al . (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668)のビ オチン類縁体の結合したカラムを用いて精製 してから、ビオチン化担体に結合させること もできる。
融合タンパク質が不溶性画分から得られ 場合は、例えば尿素や塩酸グアニジンのよ なカオトロピック塩を用いて、一度タンパ 質を可溶化し、その後透析等を用いて、カ トロピック塩を徐々に抜きながら、タンパ 質のリフォルディング(refolding)を促す、公 の方法が取られる(Sano and Cantor (1991) Bio/Tec hnology 9: 1378-1381、Sano et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1534-1538)。
あるいはまた、所望のタンパク質が大腸 内で不溶性画分に発現する場合、例えば、 ルトース結合タンパク質(Bach et al. (2001) J Mol Biol 312: 79-93)や、チオレドキシン(Jurado et al. (2006) J Mol Biol 357: 49-61)、グルタチ ンSトランスフェラーゼ(Tudyka and Skerra (1997 ) Protein Sci 6: 2180-2187)、あるいはIdeno et al (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64: 99-105に記載 れているようなシャペロン類を共発現させ か、もしくは融合タンパク質にさらにシャ ロンを融合させた3連融合タンパク質を作製 てもよい。
なお、融合タンパク質の発現システムと て、昆虫細胞や植物細胞、哺乳類細胞、酵 細胞、無細胞発現系など、他の公知の発現 で発現させてもよい。特に融合相手のタン ク質が植物細胞で発現する場合は、当該融 タンパク質も植物細胞の発現系で発現させ ことが好ましい。当業者は、融合相手のタ パク質の性質を考慮し適切な発現系を選択 ることが可能である。
ビオチンを結合させた担体
「ビオチン」とは、D-[(+)-cis-ヘキサヒドロ-2
-オキソ-1H-チエノ-(3,4)-イミダゾール-4-吉草酸
]の一般名称である。ビタミンB群に分類され
水溶性ビタミンの一種で、Vitamin B 7
(ビタミンB 7
)とも呼ばれる、あるいは、ビタミンH、補酵
Rとも言われることもある。ビオチンは卵白
中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジン
と非常に強く結合し、その吸収が阻害される
。そのため、生卵白の大量摂取によってビオ
チン欠乏症を生じることがある。
本明細書中において「ビオチン」とは、 記ビオチンの他、イミノビオチン(iminobiotin) (Hofmann et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:46 66-4668)や、デスチオビオチン(desthiobiotin)(Hirsch et al. (2002) Anal Biochem 308: 343-357)、あるい はビオシチン(biocytin)やBiotin sulfoxide等のビオ チン類縁体も含む。
ビオチン-アビジン複合体を用いたシステ ムは、組織免疫学やDNA分析、臨床検査などの 分野で広く利用されている。本発明のタンパ ク質を担体に結合する方法は、タマビジンに 所期のタンパク質を結合させた融合タンパク 質を、ビオチン-タマビジン結合を利用して 担体に結合させるものである。本発明の方 では、従来のビオチン-アビジン結合を利用 た結合と比較して、タンパク質の機能を損 うことなく、遥かに効率良く作用させるこ が可能になる。
固体担体を構成する材料は、セルロース テフロン、ニトロセルロース、アガロース デキストラン、キトサン、ポリスチレン、 リアクリルアミド、ポリエステル、ポリカ ボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、 イロン、ポリジビニリデンジフルオライド ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維 金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチー 、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチ ン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂 多糖類、タンパク(アルブミン等)、炭素ま はそれらの組合せ、などを含むがこれらに 定されない。また、一定の強度を有し、組 が安定し、かつ非特異結合が少ないものが ましい。
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ 薄膜、微細管、フィルター、プレート、マ クロプレート、カーボンナノチューブ、セ サーチップなどを含むがこれらに限定され い。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体 、当該技術分野で知られているように、ピ ト、溝、フィルター底部などを設けてもよ 。
発明の一態様において、ビーズは、約25nm ~約1mmの範囲の球体直径を有しうる。好まし 態様では、ビーズは約50nm~約10μmの範囲の直 を有する。ビーズのサイズは特定の適用に じて選択されうる。いくらかの細菌スポア 約1μmのオーダーのサイズを有するので、か かるスポアを捕捉するための好ましいビーズ は1μmよりも大きい直径を有する。
ビオチン化されたマイクロプレートとして 、例えば、Reacti-Bind TM Biotin Coated Polystyrene Plates(PIERCE社製)を利用 できるが、これに限定されるものではない。 ビオチン化された微小ビーズとしては、例え ば、磁性ビーズとして、BioMag Biotin(Polysciences 社製)が、ナノ磁性ビーズとして、コアフロ ト社製のnanomag(登録商標)-D biotin、nanomag(登 商標)-silica biotinが、ポリスチレン製マイク ビーズとして、Beadlyte(登録商標) Biotin Beads (Upstate社製)が、アガロースとしてSigma社製の Biotin Agarose、2-iminobiotin-Agaroseが、高架橋ア ロースとして、Biotin-Sepharose(バイオリサー テクノロジー社製)を利用できるが、これら 限定されるものではない。
ビオチン化試薬として例えば、PIERCE社製の( カッコ内は順にリンカー長、反応基) EZ-Link( 録商標) Sulfo-NHS-Biotin(13.5Å、1級アミン)、EZ -Link(登録商標) Sulfo-NHS-LC-Biotin(22.4Å、1級ア ン)、EZ-Link(登録商標) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin(30.5Å 、1級アミン)、EZ-Link(登録商標) PFP-Biotin(9.6Å 、アミン)、EZ-Link(登録商標) Maleimide-PEO 2 -Biotin(29.1Å、チオール基)、EZ-Link(登録商標) Biotin-PEO 2 Amine(20.4Å、カルボキシル基)、EZ-Link(登録商 標) Biotin-PEO 3 -LC Amine(22.9Å、カルボキシル基)、EZ-Link(登録 商標) Biotin-Hydrazide(15.7Å、アルデヒド基)、EZ -Link(登録商標) Biotin-LC-Hydrazide(24.7Å、アルデ ヒド基)、EZ-Link(登録商標) NHS-Iminobiotin(13.5Å 1級アミン)などを利用できるが、これらに 定されるものではない。
上記ビオチン化試薬を用いて、マイクロ レート、微小ビーズ、あるいはセンサーチ プなど所望の担体に、公知の方法を使用し ビオチンを結合させることができる。例え 、アミノ基、カルボキシル基、チオール基 トシル基、エポキシ基、マレイミド基、活 化エステルなど種々の官能基を持つ担体(例 えば磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガ ロースビーズ、ラテックスビーズ、マイクロ タイタープレートなど)を用いる方法がある この場合例えば、NHSエステルを含むビオチ 化試薬を用いる場合は、DMSO(demethylsulfoxide)の ような有機溶媒か、pH7-9のリン酸緩衝液で溶 し、アミノ基を持つ固定化担体に添加する とによってビオチンを結合させることがで る。また、例えばアミノ基を含むビオチン 試薬を用いる場合は、EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylami nopropyl) carbodiimide hydrochloride)のようなカルボ ジイミドを用いて固定化担体のカルボキシル 基を活性化エステルに変換させた後、pH5付近 の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加し て、ビオチンを結合させてもよい。なお、ビ オチン化した固定化担体は、好ましくは未反 応の官能基を不活性化した後、BSAなどでブロ ッキングする。
後述の実施例3では、リンカー長が13.5Å 磁性ビーズにはHEL scFv-TM2は全く結合しなか たが、22.4Åの磁性ビーズには72%のHEL scFv-TM 2が結合し、30.5Åの磁性ビーズには77%のHEL sc Fv-TM2が結合した。また、実施例4ではタマビ ン2とシアル酸転移酵素の融合タンパク質に いて、リンカーの長さが30.5Åの場合は、融 合タンパク質は、ビオチンとの特異的な結合 を示した。よって、担体とビオチンと繋ぐリ ンカーの長さは、少なくとも13.5Åより長い とが好ましく、より好ましくは15Å以上、15. 7Å以上、17Å以上、20Å以上、20.4Å以上、22. 4Å以上、22.5Å以上、さらにより好ましくは3 0.5Å以上である。
タンパク質を担体に結合させる方
法
本発明の方法は、ビオチンを結合させた担
とタマビジン融合タンパク質を準備し、両
を接触させ、タマビジン-ビオチン結合を介
して担体にタンパク質を結合させることを含
むものである。
結合担体
本発明はさらに、上述した本発明の「タン
ク質を担体に結合させる方法」によって得
れるタマビジン融合タンパク質結合担体も
供する。即ち、本発明によって提供される
体は、ビオチンを結合させた担体に、タマ
ジンにタンパク質を結合させた融合タンパ
質をタマビジン-ビオチン結合を介して結合
させた、タマビジン融合タンパク質結合担体
である。
発現ベクター
タマビジン融合タンパク質を発現させるた
の発現ベクターは、本発明のタマビジンを
ードする核酸を含む。本発明のタマビジン
コードする核酸は、「タマビジン」の項目
上述したタマビジンタンパク質をコードす
核酸であれば、特に限定されない。例えば
配列番号1または3の塩基配列からなる核酸
またはそれらの相補鎖にストリンジェント
条件下でハイブリダイズし、かつビオチン
合活性を有するタンパク質をコードする核
(以下すべてを合わせて「タマビジン遺伝子
という。)を含む。さらに、その片側もしく
は両端に、タマビジンと融合させる所望のタ
ンパク質をコードする遺伝子を挿入するため
の配列、例えば制限酵素認識部位や、あるい
はaatB1、 aatB2,、aatB3などのGatewayシステム(Invi
trogen社)で用いられる配列などを有し、さら
タマビジン遺伝子と、所望のタンパク質を
ードする遺伝子を挿入するための配列から
るユニット(例えば、制限酵素認識部位配列-
タマビジン遺伝子配列、という並びのユニッ
ト)の上流には所望の宿主で機能するプロモ
ターが、またそのユニットの下流にはター
ネーターが配置されることを特徴とする。
お、制限酵素認識部位の種類は特に限定さ
ないが、発現ベクターにおいては、それが
一の認識部位であることが好ましい。認識
位の数も特に限定されないが、1または2個以
上であり、好ましくは10個以下である。
なお、制限酵素部位やaatB配列とタマビジ ン遺伝子配列の間には、1アミノ酸以上、好 しくは5アミノ酸以上、更に好ましくは10ア ノ酸以上、更に好ましくは25アミノ酸以上で あり、50アミノ酸以下のリンカーアミノ酸配 (特に限定されないが、グリシンやセリンを 多く含む配列など、当業者が通常使用する配 列でよい)をコードする核酸配列を配置して よく、また特に限定されないが、例えばFacto r Xa等のようなプロテアーゼの認識部位をコ ドする配列を配置してもよい。また、例え scFvやFab等の抗体遺伝子を本発現ベクターに 挿入する場合において、融合タンパク質の発 現に細胞質内部のような還元条件が適さない ときには、プロモーターと、タマビジン遺伝 子及び所望タンパク質遺伝子を挿入するため の配列からなるユニットとの間に、シグナル ペプチドや分泌シグナルなどのような、リー ダーペプチドをコードする核酸配列を含んで もよい。
本発現ベクターは、このような発現ユニ トの他に、所望の宿主で複製できるための ニット、例えば複製開始点を有し、また所 の宿主細胞を選抜するための、薬剤抵抗性 ーカー遺伝子を有してもよい。宿主は特に 定されないが、好ましくは大腸菌である。 た、本発現ベクターに、例えば、大腸菌に けるラクトースリプレッサー系のような適 な発現制御系を組み込んでもよい。
タンパク質の精製方法
上記の発現ベクターを用いて、タンパク質
簡便に精製することができる。まず、所望
タンパク質をコードする遺伝子を、上記ベ
ターに常法のクローニング技術によって組
込み、所望の宿主に発現させる。宿主は、
望のタンパク質が発現する宿主が好ましい
発現は例えば、宿主が大腸菌、昆虫細胞、
乳類細胞、植物細胞、酵母細胞の場合は、
養によって行ってもよく、また例えば宿主
植物の場合には、植物体中に融合タンパク
を発現、蓄積させてもよい。
次に、融合タンパク質が発現した細胞や 体組織を適当な緩衝液中で破砕し、タンパ 質を抽出する。得られたタンパク質抽出液 ビオチン化した担体を接触させ、融合タン ク質中のタマビジンとビオチンとの強い結 を利用して、担体-ビオチン-タマビジン-所 のタンパク質、という複合体を形成させる その後、担体の性質を利用して、例えば磁 ビーズであれば磁石、そうでなければ例え 遠心によって、上記複合体を回収し、上清 存在するビオチン化担体と結合しなかった 分を廃棄する。さらに、上記複合体を適当 緩衝液(例えば0.5M~2M程度の濃度のNaClなどを んでもよい)で数回洗浄する。最後に、ビオ チン溶液、低pH(pH1.5~4程度)の緩衝液、あるい 熱処理(85℃~95℃程度が好ましい)によって、 ビオチン-タマビジン結合を解離させ、所望 タンパク質を精製する。
以上のようにして、タマビジンの例えば 腸菌における高い発現性を利用して、宿主 胞の中で効率的に融合タンパク質を合成す ことができ、かつタマビジンとビオチンの い結合を利用することで、比較的厳しい条 での洗浄操作が可能となり、タマビジン融 タンパク質をワンステップで精製すること 可能となる。なお、タマビジンと所望のタ パク質の間にプロテアーゼ認識配列を配置 た場合には、融合タンパク質をそのプロテ ーゼで処理することにより、タマビジンを り離し、所望のタンパク質だけを得ること できる。この場合、上記複合体を洗浄した に、プロテアーゼ処理を行って、担体を回 することで、タンパク質精製をより効率的 行うことができる。また、イミノビオチン のビオチン類縁体が結合した担体を使用し も、上記と同様にタマビジン融合によるタ パク質精製に使用することが可能である。
以上のようにして、タマビジン融合遺伝 を構築し、適当な発現系を用いて同融合タ パク質を発現させ、発現タンパク質を、表 にビオチンを結合させた担体を用いて精製 固定化を同時におこなうことにより、タマ ジンを含む融合タンパク質を結合させた担 を製造することができる。あるいは発現タ パク質を、ビオチン類縁体を用いて精製し 後に、表面にビオチンを結合させた担体に 定化し、タマビジンを含む融合タンパク質 結合させた担体を製造することができる。 れらの担体は、タンパク質を従来の方法で 定化した場合と比べ、強固な力で固定でき かつ当該タンパク質の機能を損なうことな 、効率的に作用させることができる。
AはHELscFv-TM2、BはHELscFv-mycの結果を示す。Sは
可溶性画分、ISは不溶性画分を示す。1次抗体
として、HELscFv-TM2には抗TM2抗体を、HELscFv-myc
は抗c-mycエピトープ抗体を用い、2次抗体と
てアルカリフォスファターゼ標識抗体を用
た。発現ベクターpTrc99Aのみを持つ大腸菌か
、同様に調製した画分を対照とした。
以下、実施例によって本発明を具体的に 明するが、これらは本発明の技術的範囲を 定するためのものではない。当業者は本明 書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・ 更を加えることができ、それらは本発明の 術的範囲に含まれる。
実施例1.タマビジンと抗体との融
タンパク質
本実施例では、タマビジン2と抗体(HEL抗体sc
Fv断片)との融合タンパク質を大腸菌で発現さ
せ、担体としてのプレートに、タマビジン-
オチン結合により固定化させた。また、抗
の抗原との結合活性を調べた。対照として
抗体を疎水結合により直接プレートに固定
させた。以下、具体的に説明する。
1-1.HEL抗体scFv断片
タマビジン2(TM2)とマウス抗ニワトリ卵白リ
チーム(HEL)抗体(D1.3)のscFv断片を用いてタマ
ジンと抗体との融合タンパク質を作製した
HEL(D1.3)scFv抗体断片の遺伝子(Iba et al. (1997)
Gene 194: 35-46、Ideno et al. (2004) Appl Microbio
l Biotechnol 64: 99-105)は積水化学工業(株)井手
晃氏から譲り受けた。
発現は大腸菌で行い、発現ベクターはタ なしのベクターpTrc99A(Pharmacia社製)を用いた HELscFvの単独発現には、HELscFvのC末にc-mycエ トープタグ(アミノ酸配列:EQKLISEEDL、Munro and Pelham (1986) Cell 46: 291-300)を導入した。融合 タンパク質はHELscFvのC末側にTM2が来るように 計した。この時、TM2とHELscFvの間のリンカー (アミノ酸配列:GGGGSG)を挿入した。また、HELscF v-myc融合タンパク質及びHELscFv-TM2融合タンパ 質を、ペリプラズム空間へ標的するために PelBリーダーペプチド(Lei et al. (1987) J Bacte riol 169: 4379-4383)をそれらのN末端に組み込ん 。
1-1-1.タマビジン2とHELscFvの融合タンパク質
発現用ベクター及びHELscFv発現用ベクターの
築
HEL抗体(D1.3)scFv断片の遺伝子の構造は、5’
にV H
遺伝子断片、3’側にV L
遺伝子断片が配置され、それらはGly-Gly-Gly-Gly
-Serの3反復からなるリンカーをコードするDNA
よって連結されている。PCRを用いて、TM2の
列をscFv抗体のC末に接続させた融合タンパ
質(PelB-HELscFv-TM2)(配列番号10)と、c-mycエピト
プタグをscFv抗体のC末に接続させたタンパク
質(PelB-HELscFv-myc)(配列番号9)をコードする遺伝
子を構築した。
プライマーの設計
PelB-HELscFv-TM2融合遺伝子の構築のために、ま
ず、HELscFv、TM2両遺伝子をリンカー(GGGGSG)を介
し結合させるためのプライマーを設計した。
即ち5’側にHELscFv部分、中央にリンカー、3’
側にTM2部分からなるプライマーHELscFvlinkTM2 RV
、 5’側にリンカー、3’側にHELscFv部分を逆
きにコードするDNA配列からなるプライマーH
ELscFvlinkFWを設計した。
次にHELscFv遺伝子の5’部分と、その上流 BspH I制限酵素切断部位(TCATGA)とPelBリーダー プチド部分をコードする配列とからなるプ イマーPelB-HELscFv-VH-F 、また、TM2遺伝子の3 部分と、その下流にBamH I制限酵素切断部位( GGATCC)をコードする配列とからなるプライマ TM2-3’Bamを設計した。また、PelB-HELscFv-myc遺 子の構築用には、上記PelB-HELscFv-VH-Fと、HELscF v遺伝子の3’部分と、その下流にc-mycエピト プタグとBamH I制限酵素切断部位(GGATCC)をコ ドする配列とからなるプライマーHELscFv-VL-myc -Rを設計し、使用した。タマビジンとHELscFv抗 体との融合タンパク質構築用プライマーを表 1にまとめた。
PCR
PelB-HELscFv-TM2遺伝子の遺伝子を構築するため
に、2段階のPCRを行った。1段階目のPCRは、HEL(
D1.3)scFv抗体断片の遺伝子がベクターpT7に組み
込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマ
ー PelB-HELscFv-VH-FとHELscFvlinkFWを用いてHELscFv部
の増幅を、また、TM2遺伝子がベクターpTrc99A
組み込まれたプラスミド(WO02/072817)を鋳型に
てプライマーHELscFvlinkTM2 RVとTM2 3’Bamを用
て、TM2部の増幅を、それぞれ行った。PCR反
条件は、50 μLの反応液中に鋳型DNAを500 ng
2×GC bufferII(Takara社)を25 μL、2.5 mM dNTPを4
L、プライマーを各25 pmoles、5 U/μL Pyrobest
DNA polymerase(Takara社製)を 0.5 μL添加し、プ
グラムテンプコントロールシステムPC-700(ASTE
K)を用いて、96℃ 3分を1回、96℃ 1分、55℃ 1
分、72℃ 2分を30回、72℃ 6分を1回とした。
の結果、HELscFv部分においては860 bp、TM2部分
においては450 bpのPCR産物が得られた。これ
のPCR産物を、低融点アガロース(SeaPlaqueGTG)を
用いてTAE緩衝液中でアガロース電気泳動を行
った。各DNA断片をゲルごと切り出し、ゲルと
等量の200 mM NaClを加え、70℃で10分間処理し
ゲルを融解した。得られたサンプルについ
、フェノール抽出、フェノール・クロロホ
ム抽出、クロロホルム抽出を各1回行い、エ
タノール沈殿によってHELscFv部分とTM2部分のDN
A断片を回収した。
これら2つの断片を鋳型にして、プライマ ーPelB-HELscFv-VH-FとTM2 3’Bamを用いて、2段階目 のPCRを行った。反応条件は1段階目と同様と た。その結果、約1300 bpのPCR産物(PelB-HELscFv-T M2遺伝子断片)(配列番号7)が得られた。次に、 PelB-HELscFv-myc遺伝子を構築するために、HEL(D1.3 )scFv抗体断片の遺伝子がベクターpT7に組み込 れたプラスミドを鋳型にして、プライマー PelB-HELscFv-VH-FとHELscFv-VL-myc-Rを用いて、上記 同じ条件でPCRを行った。その結果、約880 bp PCR産物(PelB-HELscFv-myc遺伝子断片)(配列番号6) 得られた。
クローニング
PCRによって得られたPelB-HELscFv-TM2遺伝子断片
及びPelB-HELscFv-myc遺伝子断片をベクターpCR4 Bl
unt TOPO(Invitrogen社製)にクローニングした。ラ
イゲーション反応はベクターキット添付の説
明書きに従った。大腸菌TB1にエレクトロポレ
ーション法を用いてDNAを導入し、常法(Sambrook
et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual
, 2 nd
edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。
ンサートが確認されたクローンに関して、M1
3プライマー(Takara社)を用いて、ABI PRISM蛍光
ークエンサー(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin
Elmer社)でPCR産物の塩基配列をその両端から決
定し、もとの遺伝子と比較して変異がないこ
とを確認した。これらの遺伝子が組み込まれ
たプラスミドをBspH IとBamH Iで二重消化し、
述の方法でゲル精製を行い、DNA断片を回収
た。この断片を、あらかじめNcoIとBamH Iで
化しておいた大腸菌発現用ベクターpTrc99Aに
Ligation kit(Takara社製)を用いてライゲーショ
した。ライゲーション産物を大腸菌TB1に形
転換し、常法に従いプラスミドDNAを抽出、
限酵素分析を行い、挿入遺伝子の有無を確
して、タマビジン2とHELscFvの融合タンパク
発現用のベクターPelB-HELscFv-TM2/pTrc99AとHELscFv
現用のベクターPelB-HELscFv-myc/pTrc99Aを完成さ
た。
1-1-2.タマビジン2とHELscFvの融合タンパク質
、及びHELscFvの発現と粗精製
タマビジン2との融合によるscFv抗体の基板
の固定化の効果を調べるため、まずタマビ
ン2とHELscFvの融合タンパク質およびHELscFvを
腸菌で発現させ、粗精製した。
大腸菌発現
PelB-HELscFv-TM2/pTrc99AとPelB-HELscFv-myc/pTrc99Aにつ
て、それぞれを形質転換した大腸菌 TB1を
抗生物質アンピシリン(最終濃度 100 μg/mL)
含むLB培地6 mLに接種し、OD 600
における吸光度が0.5に達するまで37℃で振と
培養した。その後、1mM IPTGを添加し、さら
37℃で一晩振とう培養した。培養液1mLから
心にて大腸菌を集菌し、20 mM リン酸緩衝液
(pH7)400 μL中に懸濁後、菌体を超音波により
砕した。破砕液を遠心(15000rpm)し、その上清
可溶性画分とした。さらに、沈殿物を8 M
素を含む20 mM リン酸緩衝液(pH7) 400 μLで
濁後、再び超音波破砕し、これを不溶性画
とした。
HELscFv-TM2およびHELscFv-mycの可溶性画分と不 溶性画分についてウエスタンブロッティング 解析を行った。1次抗体としてHELscFv-TM2にはウ サギ抗TM2抗体(後述の「ウサギ抗TM2抗体の精 」を参照)を、HELscFv-mycにはウサギ抗c-mycエピ トープ抗体(BETHYL社製)を用いた。さらに、2次 抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗 ウサギ IgG抗体(BIO-RAD社製)を用いた。結果を 1に示す。HELscFv-TM2発現大腸菌からは、40 kDa 付近にバンドが検出され、HELscFv-myc 発現大 菌からは27 kDa付近にバンドが検出された。 れらのサイズは、HELscFv-TM2、HELscFv-mycのアミ ノ酸配列から予測される分子量(それぞれ、43 kDa、29kDa)とほぼ一致した。また、大腸菌で発 現しているHELscFv-TM2およびHELscFv-mycのうち、 溶化しているタンパク質の割合はおよそ40% あり、培養液1L当たりの可溶性タンパク質の 発現量は、HELscFv-TM2が120μg、HELscFv-mycが128μg あった。HELscFv-TM2、HELscFv-mycのアミノ酸配列 それぞれ配列番号10、9で示す。
ウサギ抗TM2抗体の精製
大腸菌で発現させたタマビジン2(TM2)タンパ
質をイミノビオチンカラムで精製したもの(
タマビジン2は四量体)、及び、これをさらにS
DS-PAGE電気泳動後、ゲルから切り出し精製し
もの(タマビジン2は単量体)を抗原に用い、
サギに免疫することで二種類の抗体を作成
た。アルカリフォスファターゼ標識抗IgG抗
を用いたウェスタン法による検出限界は、
抗体ともに、精製組換えタマビジン2標品に
して、およそ0.5ngであった。この結果から
異性及びタイターともに高い抗体が完成し
と結論した。なお抗タマビジン2抗体-タマビ
ジン1の交差反応は、低いものの検出された(
来の抗原に対して1/20程度)。
抗TM2抗体(イミノビオチンカラム精製のみ を行った抗原から作成した抗体)は、さらに 下のようにして精製した。TM2 40μgを15%アク ルアミドゲル 2枚を用いてSDS-PAGEによって 離し、タンパク質をニトロセルロース膜(BIO- RAD)2枚に転写した。膜を3% BSAを含むTBS緩衝液 にて室温で1時間振とうさせることによりブ ッキングを行った。続いて、室温で一晩、 TM2抗体(イミノビオチンカラム精製のみを行 た抗原から作成した抗体、1000倍希釈)と反 させた後、TM2が転写されている部位を切り り、溶出緩衝液(0.2M グリシン、 1mM EDTA pH2 .8)中で室温20分間振とうさせ、抗体を膜から 出した。精製抗体は、溶出緩衝液の1/10容量 の1M Tris溶液で中和後、同量の10×TBS緩衝液を 加え4℃で保存した。
発現タンパク質の抗原結合活性
大腸菌で発現させたHELscFv-TM2とHELscFv-mycにつ
いて、ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)に対する
体価を以下のように確認した。50μg/mLのニ
トリ卵白リゾチーム(生化学工業社製)を、100
μlずつマイクロプレートに加え、4℃で一晩
置することにより固相化した。ウエルを0.1%
Tween 20を含むTBS緩衝液(10mM Tris(pH 7.4)、150mM
NaCl)(TTBS) 250μlで3回洗浄後、0.5% BSA含有TTBS
250μl加え、室温で1時間静置することにより
ロッキングし、再度、TTBS 250μlで3回洗浄し
た。一方、HELscFv-TM2またはHELscFv-mycが発現し
大腸菌の菌体から、浸透圧ショックプロト
ール(Ausubel et al, 1989)に従って、ペリプラ
ム画分を調製した。この10倍希釈液を、HELが
固定化された上記プレートに添加し、室温で
3時間反応させた。なお対照試験として、ベ
ターpTrc99Aのみを組み込んだ大腸菌から調製
たペリプラズム画分も準備した。
各ペリプラズム画分を加えた後、TTBS 250μl 3回洗浄し、それぞれ、HELscFv-TM2にはウサギ TM2抗体を、HELscFv-mycにはウサギ抗c-mycエピト ープ抗体(BETHYL社製)を、0.5% BSA含有TTBSで1000 希釈した抗体溶液を、100μl添加し、室温で1 間静置し反応させた。さらに、TTBS 250μlで3 回洗浄後、0.5% BSA含有TTBSで1000倍希釈したア カリフォスファターゼ標識抗ウサギ IgG抗 (BIO-RAD社製)を100μl添加し、1時間、室温で反 させた。TTBS 250μlで3回洗浄後、1-Step TM PNPP(PIERCE社製)を100 μL添加し、室温で30分間 色させた。2 N NaOHを100 μL加えて反応を停 させ、405 nmにおける吸光度をプレートリー ーInfinite M200(TECAN社製)によって測定した。
その結果、ベクターpTrc99Aのみを組み込んだ 大腸菌抽出液と比較して、10 0 から10 3 倍希釈したHELscFv-TM2を含む画分及びHELscFv-myc 含む画分に、顕著な抗体価の上昇が認めら た。
粗精製
次に、300mLの培養液から得られた可溶性画
より、HEL scFv-TM2とHEL scFv-mycを、カラムクロ
マトグラフィーにより粗精製した。300 mLの
養液から得られた菌体を、50mM NaClを含む5 0
mM Tris緩衝液(pH 8)18 mL中に懸濁後、超音波に
よって破砕した。破砕液を遠心(9000rpm)し、そ
の上清に75%飽和硫酸アンモニウムを添加し、
生じた沈殿を5 0mM NaClを含む5 0mM Tris緩衝液
(pH 9)中で一晩透析し、粗タンパク質サンプ
とした。このサンプルを、イオン交換カラ
MonoQ HR10/10(アマシャムファルマシア社製)に
した。50 mM NaClを含む50 mM Tris緩衝液(pH9)
カラムを平衡化した後、サンプルを打ち、
出は500 mM NaCl を含む50 mM Tris緩衝液(pH 9)
用いた。流速は3 mL/minとし、1 mLずつタン
ク質を回収した。精製タンパク質は、上記
同様にウエスタンブロッティング解析によ
確認した。HELscFv-TM2またはHELscFv-mycのバンド
検出された6画分それぞれを回収し、75%飽和
硫酸アンモニウムを添加してタンパク質の沈
殿を得た。この沈殿を20mM リン酸緩衝液(pH7)
500 μLに再懸濁して、同緩衝液で一晩透析を
行った。この一連の操作により、1.5 μgのHELs
cFv-TM2、6.3 μgのHELscFv-mycが回収された。回収
はHELscFv-TM2は4%、HELscFv-mycは16%であり、HELscFv
-TM2およびHELscFv-mycの精製度は共に10%程度であ
った。
なお、後のELISA分析のための対照として ベクターpTrc99Aのみを組み込んだ大腸菌を、 記と同様にして発現誘導をかけて調製した 溶性画分に対し、MonoQによる精製を行い、HE LscFv-TM2、並びにHELscFv-mycが溶出されてくる時 と同じ画分(それぞれの6画分)を回収し、上 と同様に、硫安沈殿、透析したサンプルも 製した。
1-1-3.タマビジン2とHELscFvの融合タンパク質
及びHELscFvの固定化と、ELISAによるそれらの活
性比較解析
タマビジン2との融合によるscFv抗体の基板
の固定化の効果を調べるため、1-1-2で調製し
たタマビジン2とHELscFvとの融合タンパク質(HEL
scFv-TM2)及び対照のHELscFv-mycをマイクロプレー
に固定化し、卵白リゾチームの検出感度を
標としたELISA分析を行った。
抗体の精製
ELISA分析に先立ち、まず、分析に用いる抗
ゾチーム抗体の精製をおこなった。卵白リ
チーム 40 μgを15% ポリアクリルアミドゲル
2枚を用いてSDS-PAGEによって分離し、タンパ
質をニトロセルロース膜(BIO-RAD社製) 2枚に
写した。この膜を3% BSA含有TBS緩衝液(10 mM
Tris (pH 7.4)、150 mM NaCl)中で、室温で1時間ブ
ロッキングを行った。続いて、室温で一晩、
3% BSA含有TBS緩衝液で1000倍希釈したウサギ抗
ワトリ卵白リゾチーム抗体(Rockland社製)と反
応させた後、卵白リゾチームが転写されてい
る部位を切り取り、溶出緩衝液(0.2 M グリシ
ン、 1 mM EDTA pH2.8)中で、室温で20分間振と
し溶出させた。溶出緩衝液の1/10容量の1 M
Tris溶液で中和後、同量の10×TBS緩衝液を加え
4℃で保存した。
ELISA分析
続いて、ELISA分析を行った。粗精製したHELsc
Fv-TM2とHELscFv-mycを3 μg/mLになるように20mM リ
酸緩衝液(pH 7)でそれぞれ調製し、これを96
マイクロプレートに50 μLずつ添加した。HEL
scFv-TM2にはビオチン化プレート(型番15151、PIER
CE社製)、HELscFv-mycには 疎水性プレート(型番2
592、Corning社製)を用い、一晩室温で静置して
前者はタマビジン-ビオチン結合により、後
者は疎水結合により、それぞれタンパク質を
固定化した。その後、プレートの各ウェルを
0.1% Tween 20を含むTBS緩衝液(TTBS)で3回洗浄後
0.5% BSA含有TTBSを300μL加え、室温で1時間静置
し、ブロッキングを行った。再度、TTBSで3回
浄後、TTBSで50 ng/μLから5 pg/ μLまで段階的
に希釈したリゾチーム溶液を50 μLずつ添加
た。室温で1時間静置し、プレートに固定化
れたHELscFv-TM2あるいはHELscFv-mycと反応させた
後、TTBSで3回洗浄した。
次に、リゾチームを検出するために、前述 通りに精製したウサギ抗ニワトリ卵白リゾ ーム抗体 960 μLに0.5% BSA含有TTBS 5040 μLを 添加した溶液を50μL加えて、室温で1時間反応 させた後、TTBSで3回洗浄し、続いて0.5% BSA含 TTBSで1000倍希釈したアルカリフォスファタ ゼ標識抗ウサギ抗体(BIO-RAD社製)を室温で1時 反応させた。TTBSで3回洗浄後、1-Step TM PNPP(PIERCE社製)を50 μL添加し、発色が認めら たところで2 N NaOHを50 μL加えて反応を停止 させ、405 nmにおける吸光度をプレートリー ーInfinite M200(TECAN社製)によって測定した。 おデータ値としては、HELscFv-TM2とHELscFv-mycの 濃度区それぞれにおいて、HELscFv-TM2、HELscFv- mycそれぞれの対照サンプル(空の発現ベクタ を持つ大腸菌から調製したMonoQ画分、上述) 各濃度の測定も併せて行い、HELscFv-TM2、HELscF v-mycの各濃度区の吸光度から、その対照の吸 度の値を差し引いたものを用いた。
その結果、リゾチームの検出感度は、疎 結合によりHELscFv-mycを固相化したプレート りも、タマビジン-ビオチン結合を介してHELs cFv-TM2を固定化したプレートの方が高かった 即ち、抗体scFvを基板に固定化する際、疎水 合によって固定化するよりも、scFvとタマビ ジンの融合タンパク質を作成し、ビオチン化 された基板に結合させた方が、検出感度が高 くなることが分かった。
タマビジン2とHELscFvとの融合タン
ク質のビオチン結合活性の定量分析
Biacore 3000(BIACORE社製)を用いて、HELscFv-TM2融
タンパク質のビオチン結合能を分析した。
養液の培地中に分泌されているHELscFv-TM2を
ラムクロマトグラフィーにより粗精製した
分を、解析サンプルとした。即ちPelB-HELscFv-T
M2/pTrc99Aで大腸菌株TB1を形質転換し、タンパ
質を発現させ、培地中に含まれるタンパク
を75%飽和硫酸アンモニウムにより沈殿させ
。
得られた沈殿物を50mM NaClを含む50mM Tris 衝液(pH 9)中で一晩透析後、イオン交換カラ MonoQ HR5/5(アマシャムファルマシア社製)に した。平衡化緩衝液には50 mM NaClを含む50 m M Tris緩衝液(pH9)、溶出緩衝液には500 mM NaCl を含む50 mM Tris緩衝液(pH 9)を用い、1 mL/min 流速で0.5mLずつタンパク質を回収した。溶出 画分をSDS-PAGE後、抗TM2抗体を用いたウエスタ ブロッティングに供し、融合タンパク質が まれる画分を検出し、さらに融合タンパク 由来のシグナル量から、HELscFv-TM2量を算出 、Biacore解析に用いた。精製度はおよそ20%で った。センサーチップCM5(Biacore社製)上に、E Z-Link (登録商標)NHS-LCLC-Biotin(30.5Å)(PIERCE社製 括弧内はビオチンとNHSとの間のリンカーの さを表す)でビオチン化したウシ血清アルブ ミン(BSA)をアミンカップリング法により固定 た。ランニング緩衝液にはHBS-EP(Biacore社製) 使用し、HELscFv-TM2を温度25℃、流速20μl/minで 40μl(2分間)ずつインジェクションした。得ら たセンサーグラムから解析ソフトウェア Bi aevaluation version 4.1を用いて結合速度定数(ka) 解離速度定数(kd)、解離定数(KD)を算出した
この結果を表2に示す。HELscFv-TM2 はビオチ と特異的に相互作用し、KDは10 -8 オーダーと低く、ビオチンと強く結合するこ とが分かった。
実施例2.タマビジンと酵素との融
タンパク質
本実施例では、タマビジン2と酵素(α2,6シア
ル酸転移酵素)との融合タンパク質を大腸菌
発現させ、担体としての磁性ビーズに、タ
ビジン-ビオチン結合により固定化させた。
た、融合タンパク質の酵素活性を調べた。
照として、酵素を共有結合によりビーズに
定化させた。以下、具体的に説明する。
2-1.糖転移酵素との融合タンパク質
タマビジンと酵素との融合タンパク質の例
して、タマビジン2(TM2)と糖転移酵素の一種
あるシアル酸転移酵素を採用した。シアル
転移酵素としては、Photobacterium属細菌に由
するβ-ガラクトシド-α2,6-シアル酸転移酵素(
PCT/JP2006/304993)を使用した。なおシアル酸転移
酵素遺伝子としては、シグナルペプチド部分
のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質を
コードする遺伝子(ISH224-2,6ST N1C0、PCT/JP2006/304
993)を用いた。
2-1-1.タマビジン2とシアル酸転移酵素の融
タンパク質発現用ベクターの構築
プライマーの設計
タマビジン2とISH224-2,6ST N1C0とをリンカー(GG
GGSG)を介して融合させたタンパク質をコード
る核酸(ISH224-2,6ST-linkTM2)、GGGGSの3反復からな
る15アミノ酸のリンカーで結合させたタンパ
質をコードする核酸(ISH224-2,6ST3XlinkTM2)、及
GGGGSの5反復からなる25アミノ酸のリンカーで
融合させたタンパク質をコードする核酸(ISH22
4-2,6ST-5XlinkTM2)をPCRを用いて構築するために、
ISH224-2,6ST、TM2の両遺伝子を、GGGGSGを介し結合
させるためのプライマー、GGGGSの3反復からな
る15アミノ酸を介し結合させるためのプライ
ー、及びGGGGSの5反復からなる25アミノ酸を
し結合させるためのプライマーを設計した
即ち5’側にISH224-2,6ST部分、中央にリンカー
3’側にTM2部分からなるプライマー224-26ST-lin
kTM2RV、224-26ST-3XlinkTM2RV 、224-26ST-5XlinkTM2RV、な
らびに5’側にリンカー、3’側にISH224-2,6ST部
を逆向きにコードするDNA配列からなるプラ
マー224-26ST-linkFWを設計した。なお、ISH224-2,6
ST 部分のクローニングのために、同遺伝子
シグナルペプチドを除いたN末部分をコード
る部分と、その上流に制限酵素PciI認識部位
をコードする配列を有するプライマー224-26ST-
N1-PciI(PCT/JP2006/304993)を使用した。タマビジン
シアル酸転移酵素との融合タンパク質構築
プライマーを表3にまとめた。
PCR
ISH224-2,6ST-TM2融合タンパク質をコードする核
酸(以下「ISH224-2,6ST-TM2融合遺伝子」。)を構築
するために、2段階のPCRを行った。1段階目のP
CRは、ISH224-2,6ST N1C0の遺伝子がベクターpTrc99A
に組み込まれたプラスミド(PCT/JP2006/304993)を
型にして、プライマー224-26ST-N1-PciIと224-26ST-l
inkFWを用いてISH224-2,6ST部の増幅を、また、TM2
伝子がベクターpTrc99Aに組み込まれたプラス
ミド(WO 02/072817)を鋳型にしてプライマー224-26
ST-linkTM2RVとTM2 3’Bam(上述)、224-26ST-3XlinkTM2RV
TM2 3’ Bam、さらに224-26ST-5XlinkTM2RVとTM2 3’
Bamを用いてTM2部の増幅を、それぞれ行った
PCR反応条件は、50 μLの反応液中に鋳型DNA を500 ng、10X Pyrobest buffer II (Takara)を5μL、2. 5 mM dNTPを4 μL、プライマーを各50 pmoles、5 U/μL Pyrobest DNA polymerase(Takara社製)を 0.5 μL 加し、プログラムテンプコントロールシス ムPC-700(ASTEK)を用いて、96℃ 3分を1回、96℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 2分を10回、72℃ 6分を1 とした。その結果、ISH224-2,6ST部分において 1530 bp、TM2部分においては420 bpのPCR産物が られた。これらのPCR産物について、低融点 ガロース(SeaPlaqueGTG)を用いてTAE緩衝液中で ガロース電気泳動を行った。
各DNA断片をゲルごと切り出し、ゲルと等 の200mM NaClを加え、70℃で10分間処理し、ゲ を融解した。このサンプルをフェノール抽 、フェノール・クロロホルム抽出、クロロ ルム抽出を各1回行い、エタノール沈殿によ ってscFv部分とTM2部分のDNA断片を回収した。 れら2つの断片を鋳型にして、プライマー224- 26ST-N1-PciIとTM2 3’Bamを用いて、2段階目のPCR 行った。反応条件は1段階目と同様とした。 の結果、約1950 bpのPCR産物(ISH224-2,6ST-linkTM2)( 配列番号5)、約1970bpのPCR産物(ISH224-2,6ST-3XlinkTM 2)(配列番号24)、さらに約1990bpのPCR産物(ISH224-2 ,6ST-5XlinkTM2)(配列番号19)が得られた。配列番 5の第1番目-第1494番目の塩基がISH224-2,6STに、 1513番目-第1935番目の塩基がTM2に相当する。 た、配列番号24の第1番目-第1494番目の塩基 ISH224-2,6STに、第1540番目-第1962番目の塩基がTM 2に相当する。さらに、配列番号19の第1番目- 1494番目の塩基がISH224-2,6STに、第1570番目-第1 992番目の塩基がTM2に相当する。
クローニング
PCRによって得られたISH224-2,6ST-TM2融合遺伝子
をベクターpCR4 Blunt TOPO(Invitrogen社製)にクロ
ニングした。ライゲーション反応はベクタ
キット添付の説明書きに従った。大腸菌TB1
エレクトロポレーション法を用いてDNAを導
し、常法(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning,
A laboratory manual, 2 nd
edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。
ンサートが確認されたクローンに関して、M1
3プライマー(Takara社)、シークエンス用プライ
マー(5’-TTT TTT GGA TCC CTA GAC TGC AAT ACA AAC
ACC -3’)、シークエンス用プライマー2(5’-
GCC CAT ACA GTC GTA CCT GTA A -3’)を用いて、
ABI PRISM蛍光シークエンサー(Model 310 Genetic A
nalyzer, Perkin Elmer社)で、PCR産物の塩基配列を
その両端から決定し、もとの遺伝子と比較し
て変異がないことを確認した。これらの遺伝
子が組み込まれたプラスミドをPciIとBamH Iで
重消化し、前述の方法でゲル精製を行い、D
NA断片を回収した。この断片を、あらかじめN
coIとBamH Iで消化しておいた大腸菌発現用ベ
ターpTrc99Aに、Ligation kit(Takara社製)を用いて
イゲーションした。ライゲーション産物を
腸菌TB1に形質転換し、常法に従いプラスミ
DNAを抽出、制限酵素分析を行い、挿入遺伝
の有無を確認し、タマビジン2とシアル酸転
移酵素の融合タンパク発現用のベクターISH224
-2,6ST-linkTM2/pTrc99A、ISH224-2,6ST-3XlinkTM2/pTrc99A、
びISH224-2,6ST-5XlinkTM2/pTrc99Aを完成させた。
2-1-2.タマビジン2と糖転移酵素との融合タ
パク質の大腸菌発現
タマビジン2との融合による糖転移酵素の基
板への固定化及び配向化による感度上昇を調
べるため、まずタマビジン2と糖転移酵素の
合タンパク質を大腸菌で発現させた。
大腸菌発現
ISH224-2,6ST -linkTM2/pTrc99A、ISH224-2,6ST-3XlinkTM2/pT
rc99A、及びISH224-2,6ST-5XlinkTM2/pTrc99Aのそれぞれ
形質転換した大腸菌株TB1を、抗生物質アン
シリン(最終濃度 100 μg/ml)を含むLuria broth(
LB)培地に接種し、A 600
=0.5に達するまで30℃で振とう培養した。さら
にその後、1 mM isoproryl-1-thio-b-D-galactopyranoside
(IPTG)を添加し、30℃で一晩振とう培養した。
養液1 mlから遠心にて大腸菌を集菌し、20 m
M BisTris緩衝液(pH 6.0) 400 μl中に懸濁後、超
波破砕した。破砕液を遠心(15000 rpm)し、そ
上清を粗抽出液とした。
これらの粗抽出液についてSDS-ポリアクリ ルアミド電気泳動(SDS-PAGE)を行い、クマジー リリアントブルー(CBB)染色を行った。その結 果、両方の粗抽出液において約70 kDaの位置 、pTrc99Aだけを形質転換した大腸菌には見出 れないバンドが検出された。ISH224-2,6ST-linkTM 2の結果を図2Aに示す。ISH224-2,6ST-TM2融合タン ク質の分子量は、ISH224-2,6ST N1C0の分子量が 55 kDa、タマビジン2は約15 kDaであることか 、約70 kDaと考えられるので、ほぼ理論値通 のサイズであるが、ウェスタンブロッティ グ解析により確認を行ったところ、このバ ドは抗TM2抗体(上述)で特異的に検出された ISH224-2,6ST-linkTM2の結果を図2Bに示す。融合タ パク質の発現量は、約80mg/ L培養と見積も れた。このことから、ISH224-2,6ST-TM2融合タン ク質が大腸菌内で高発現していることが確 された。このタンパク質のアミノ酸配列を 列番号8に示す。
上記タンパク質粗抽出液のシアル酸転移 性を、Yamamoto et al. (1996) J. Biochem 120: 104 -110に記載されている方法に準じて測定した ころ、ISH224-2,6ST-linkTM2融合タンパク質のシア ル酸転移の比活性は9.8U/mgタンパク質と算出 れた。
一方、対照として用いるISH224-2,6ST N1C0タ パク質は、特許(PCT/JP2006/304993)に記載の方法 で発現、精製を行った。ただし、精製した酵 素は、最終的に50 mM MES緩衝液(pH 5.0)に4℃で 一晩透析した。シアル酸転移酵素活性を測定 したところ、9.3 U/mgタンパク質であった。
さらに、ISH224-2,6ST-TM2、ISH224-2,6ST-3XlinkTM2 及びISH224-2,6ST-5XlinkTM2のタンパク粗抽出液の 光ビオチン結合活性を、以下のような方法 より測定し、本融合タンパク質のビオチン 合活性を確認した。
具体的には、ビオチン結合活性の測定を、K adaら(Biochim. Biophys. Acta., 1427: 33-43, (1999))の 方法に従って行った。200μLアッセイバッファ ー(50mM NaH 2 PO 4 、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.5))中に、ISH224-2,6ST-TM2 ISH224-2,6ST-3XlinkTM2、またはISH224-2,6ST-5XlinkTM2 タンパク粗抽出液が段階的に含まれるよう 調整をした。この溶液に20pmol/μL蛍光ビオチ 溶液(biotin-4-fluorescein: Molecular Probe)50μL(1nmol )を混和し、室温で10分間放置後、プレートリ ーダーInfinite M200(TECAN社製)を用いて蛍光強度 を測定した。その結果、ISH224-2,6ST-TM2、ISH224-2 ,6ST-3Xlink TM2、及びISH224-2,6ST-5XlinkTM2のタンパ 粗抽出液中には高い蛍光ビオチン結合活性 あることが分かった。
一方、対照として用いた、pTrc99Aのみを有 する大腸菌から調製したタンパク質粗抽出液 には、ビオチン結合活性は検出されなかった 。以上のことから、ISH224-2,6ST -TM2融合タンパ ク質は、ビオチン結合活性と、シアル酸転移 酵素活性の両方を有することが明らかとなっ た。
2-1-3.タマビジン2と糖転移酵素との融合タ
パク質のビオチン固相化担体による簡易精
と担体への固定化
次に、タマビジン2との融合を利用したタン
パク質の基板への固定化の効果を調べるため
、タマビジン2と糖転移酵素との融合タンパ
質の、ビオチン固相化担体による簡易精製
固定化を行った。
ISH224-2,6ST-TM2融合タンパク質の磁
ビーズへの結合
ビオチン化磁性ビーズ(BioMag Biotin, Polyscicen
ces, Inc.社製、ビオチンと磁性ビーズとの間
リンカーの長さは22.4Å) 400 μlを20 mM BisTri
s緩衝液(pH 6.0) 400 μlで2回洗浄した。ビオチ
ン化磁性ビーズにISH224-2,6ST-linkTM2融合遺伝子
形質転換した大腸菌抽出液(上述)を添加し
4℃で2時間振とうさせながらインキュベート
することによりISH224-2,6ST-linkTM2をタマビジン-
ビオチン結合によって磁性ビーズと結合させ
た。磁石(Adem-Mag SV、Ademtech SA社製)で磁性ビ
ズを回収し、上清(非結合画分)を除去後、1
M塩化ナトリウムを含む20 mMTris緩衝液(pH 6.0)
400 μlで磁性ビーズを2回洗浄した。その後
20 mM Tris緩衝液(pH6.0) 400 μlで磁性ビーズ
懸濁し、タマビジン-ビオチン結合を介して
合タンパク質を磁性ビーズに結合させたISH2
24 2,6ST-TM2磁性ビーズを完成した。
ISH224 2,6ST N1C0の磁性ビーズへの
合
カルボキシル基で表面をコートされた磁性
ーズ(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal社製)
200 μlを、0.01 N 水酸化ナトリウム 200 μlで
10分間洗浄後、さらにMilliQ水(Millipore社製)200
μlで10分間3回洗浄した。洗浄済みの磁性ビー
ズに、MilliQ水で溶解した1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminop
ropyl)carbodiimide Hydrochloride(EDC)(PIERCE社製)を、
終濃度0.2 Mになるように添加し、30分間、室
温で振とうさせながらインキュベートした。
その後、冷MilliQ水 400 μl、さらに50 mM MES緩
衝液(pH 5.0) 400 μlで磁性ビーズを洗浄した
精製ISH224- 2,6ST N1C0タンパク質(PCT/JP2006/304993
)を 50mM MES緩衝液(pH 5.0)中に0.6 mg/mlの濃度
なるように調製した。このタンパク質液 400
μl(精製酵素で240μg)に、上記磁性ビーズを添
した。これを4℃で2時間振とうし、共有結
によってISH224 2,6ST N1C0と磁性ビーズを結合
せた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清(非
結合画分)を除去した。次に、50 mM Tris緩衝
(pH 7.0) 200μlをビーズに加え、未反応のカル
ボキシル基を不活化した後、0.5% BSA、0.1% Twe
en 20を含むPBS緩衝液(10mM リン酸ナトリウム
150mM NaCl) 200μlで、磁性ビーズをブロッキン
グした。PBS緩衝液 200 μlで再度磁性ビーズ
懸濁し、酵素上のアミノ基と磁性ビーズの
ルボキシル基との共有結合を介して酵素を
合させたISH224-2,6ST磁性ビーズを完成した。
磁性ビーズに結合したISH224-2,6ST-li
nkTM2およびISH224-2,6STの結合量と精製度の測定
磁性ビーズに結合したISH224-2,6ST-linkTM2の量
同ISH224 2,6ST量は、磁性ビーズに結合させる
のタンパク量から、非結合分のタンパク量
差として計算した。ビーズ結合前画分およ
非結合画分のタンパク質をSDS-PAGEにより分
し、CBB染色によって検出した。ISH224-2,6ST-link
TM2のバンドは70kDa付近に、またISH224 2,6STのバ
ンドは55kDa付近に検出された。イメージアナ
イザーLas3000(Fuji Film社製)を用いて、予めタ
ンパク質量が分かっている分子量マーカー(LM
W マーカーキット:Pharmacia社製)のバンドの濃
から検量線を作成し、結合前画分と非結合
分のバンドを定量化した。
次にISH224 2,6ST-linkTM2の精製度を確認した まず、磁性ビーズに結合しているタンパク の熱による解離を行った。即ち、ISH224 2,6ST -linkTM2を結合させた磁性ビーズを、PBSで洗浄 、等量の2×SDS sample buffer(100 mM Tris-HCl pH 6.8, 12% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 20% glycerol)に 濁し、95℃で40分間加熱処理を行った。磁石 磁性ビーズを回収し、その上清についてSDS- PAGEを行い、CBB染色、並びにウェスタンブロ ティング分析を行った。1次抗体には抗TM2抗 、2次抗体にはアルカリフォスファターゼ標 識抗ウサギIgG抗体を用いた。
次に、ISH224-26ST-linkTM2を、ビオチンを用い て磁性ビーズから解離させる試験を行った。 ISH224-26ST-linkTM2を結合させた磁性ビーズ 200μL に、16 nmoles D-biotin(Sigma社製)を添加し、室 で2時間転倒混和した。このビオチン量は、 融合タンパク質の発現量から換算されるビオ チンポケット数の500倍過剰量である。磁石で 磁性ビーズを回収し、その上清についてSDS-PA GEを行い、CBB染色を行った。上清のうち一部 トリクロロ酢酸沈殿法によって5倍に濃縮し た。即ちビーズから解離したタンパクを含む 上清 100μLに100% w/v トリクロロ酢酸 10μL添 し、氷上で20分間静置後、15000rpmで20分間4℃ にて遠心した。上清を除去し、アセトン 500 Lで沈殿物を洗浄後、再び15000rpmで20分間4℃ て遠心した。沈殿物を乾燥し、1×SDS sample b ufferで溶解した。
ISH224-2,6ST-linkTM2をビオチン化磁性ビーズ 結合させる前の画分、非結合画分、洗浄画 、並びに熱またはビオチン処理によって生 た解離画分についてのSDS-PAGE-CBB解析、並び ウェスタンブロッティング解析の結果を図3 示す。CBB染色では、ISH224-2,6ST-linkTM2発現大 菌粗抽出タンパク質サンプルには、pTrc99A発 大腸菌には存在しない約70 kDaの太いバンド が見られ、このバンドは抗TM2抗体で特異的に 検出されたことから、このバンドが、ISH224-2, 6ST-linkTM2タンパク質に由来することが示され 。この融合タンパク質のおよそ40%が、ビオ ン化磁性ビーズに結合した。また、融合タ パク質はビオチン化磁性ビーズに一旦結合 ると、その結合力は強く、1 M塩化ナトリウ ムでは全く解離せず、1% SDS存在下で95℃で40 処理しても、あるいは過剰量のビオチンを えても10分の1程度しか解離しなかった。な 、熱処理を行うと、約70kDa以外に、CBB染色 おいて、60kDa、40kDa、25kDa付近のバンドが見 れるが、このうち60kDa、40kDaのバンドは、抗T M2抗体で認識された。従って、これらのバン は、融合タンパク質から生じた分子である とが示唆された。25 kDa付近のバンドの由来 は不明だが、これが融合タンパク質に由来す るものではないと仮定すると、ビオチン化磁 性ビーズに結合したISH224-2,6ST-linkTM2タンパク 精製度は、50%程度である。一方、過剰量の オチンを添加すると、熱処理に比較して余 な分子種は生じず、70kDaのバンドのみが検 された。
以上のことから、ビオチン化磁性ビーズ 用いて、タマビジン融合タンパク質の精製 、ビーズへの固定化を同時に行うことに成 したことが示された。
2-1-4.ビオチン固相化担体に固定化された
マビジン2と糖転移酵素との融合タンパク質
及び共有結合で担体に固定化された糖転移
素の活性比較解析
タマビジン2との融合を利用した糖転移酵素
の固定化の効果を調べるため、ビオチン固定
化担体に固定化されたタマビジン2と糖転移
素との融合タンパク質の活性を分析した。
ISH224-2,6ST-linkTM2磁性ビーズ並びにI
SH224-2,6ST磁性ビーズの活性比較解析
ISH224-2,6ST-linkTM2をタマビジン2-ビオチンを介
して結合させた磁性ビーズと、ISH224-2,6STをISH
224-2,6ST自体のアミノ酸残基を介して共有結合
させた磁性ビーズの酵素活性とを比較するた
め、結合前画分(磁性ビーズと反応させる前
ISH224-2,6ST-linkTM2、またはISH224-2,6ST溶液)と、
性ビーズ画分(ISH224-2,6ST-linkTM2、またはISH224-
2,6STが結合した磁性ビーズ)のシアル酸転移
素を測定した。
シアル酸転移活性は、Yamamoto et al. (1996) J Biochem 120: 104-110に記載されている方法で測 定した。糖供与体基質として70 nmol CMP-NeuAc( 14 CでNeuAcをラベルしたCMP-NeuAc約20000 cpmを含む NeuAcはN-アセチルノイラミン酸を表す)、糖受 容体基質として1.25μmol ラクトース、0.5M NaCl に上記の画分を含む反応液 30μlを用いて酵 反応を行った。酵素反応は30 ℃で5分間行っ た。反応終了後、反応溶液に1.9mLの 5mM リン 酸緩衝液(pH 6.8)を加え、この溶液をDowex1×8(PO 43-フォーム、0.2× 2cm、BIO-RAD社)カラムに供し た。このカラムの溶出液に含まれる反応生成 物、すなわちシアリルラクトースに含まれる 放射活性を測定することで酵素活性を算出し た。酵素1単位(1 U)は、1分間に1μmolのシアル を転移する酵素量である。磁性ビーズに結 したISH224-2,6ST-linkTM2、およびISH224-2,6STタン ク1mg当りの酵素活性を算出し、結合様式の いによる酵素活性の強弱を比較した。結果 表4に示す。
シアル酸転移酵素を磁性ビーズに結合さ る際、ビーズの官能基と酵素内部の官能基 用いて共有結合によって結合させると、酵 の非活性がおよそ10分の1に落ちる。一方、 アル酸転移酵素をタマビジンと融合させ、 マビジン-ビオチン結合を介して磁性ビーズ に結合させた場合、ビーズに結合する前の酵 素活性がそのまま維持された。なお、ISH224-2, 6ST-linkTM2で用いた磁性ビーズ(平均粒径1μm)と ISH224-2,6STで用いた磁性ビーズ(平均粒径2.8μm )は異なるので、これらの平均粒径から表面 を求め、さらにビーズに結合しているタン ク量を得られた表面積で割り、ビーズ単位 面積当り酵素活性も求めた。この結果から 、タマビジン-ビオチンを介した基板への固 化は、共有結合による固定化の10倍以上の 性を示した。なお、ISH224-2,6STタンパク質の 子量が約55kDa、ISH224-2,6ST-TM2融合タンパク質( 量体)の分子量が約70kDaであることを考慮す と、実際のタンパク質1分子当たりの活性差 はさらに大きいと予想される。
ISH224-2,6ST-TM2融合タンパク質が固定化され た磁性ビーズを4 ℃で3週間、保存した後の 素活性を測定したところ、活性の低下は殆 無かった。従って、融合タンパク質のビオ ンへの結合は非常に強く、また、固定化さ た酵素の活性も安定であった。
実施例3 HELscFv-TM2融合タンパク質
磁性ビーズへの結合
本実施例では、実施例1で作成したHEL scFv-TM
2をビオチン化磁性ビーズに結合させ、磁性
ーズとビオチン間のリンカー長が、結合に
響を与えるか否かを調べた。
具体的には、Ez-Link (登録商標)NHS-Biotin(13. 5Å)、Ez-Link (登録商標) NHS-LC-Biotin(22.4Å)、Ez -Link (登録商標) NHS-LCLC-Biotin(30.5Å)(いずれも PIERCE社製)をDMSO(dimethyl sulfoxide)で10mMに調整し た。これらをDynabeads M-270 Amine(PIERCE社製) 200 μLに200μL(2μm)添加し、室温で30分間反応させ ことによって、各ビオチン化試薬と磁性ビ ズを結合させた。
続いて、0.1% BSA、0.01% Tween20を含むPBS緩 液(10mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4) 400μLで2回ビーズを洗浄すると同時にブロッ ングを行った。最後に200μL PBS緩衝液でビー ズを懸濁し、ビオチンと磁性ビーズ間のリン カー長が、13.5Å、22.4Å、30.5Åの各ビオチン 化磁性ビーズを作製した。作製したビオチン 化磁性ビーズはHABA:Avidin法によってビオチン 効率を測定し、ビオチン 200pmolで修飾され 磁性ビーズをHEL scFv-TM2との結合に用いた。
大腸菌培養液中に分泌されているHEL scFv- TM2 100μgと、200pmol ビオチン化磁性ビーズを 温で1時間反応させた後、磁石で磁性ビーズ を集め、その上清、つまりビオチンに結合し ていないHEL scFv-TM2画分(非結合画分)を回収し た。ビーズと反応させる前の画分と非結合画 分をウェスタンブロッティング解析し、各画 分におけるHEL scFv-TM2量を測定することによ て、ビオチン化磁性ビーズに結合したHEL scF v-TM2量を算出した。1次抗体としてマウス抗TM2 抗体を、2次抗体としてアルカリホスファタ ゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体を使用した。
その結果、リンカー長が22.4Åの磁性ビー ズには72%のHEL scFv-TM2が結合し、30.5Åのビオ ン磁性ビーズには77%のHEL scFv-TM2が結合した 。これに対し、リンカー長が13.5Åのビオチ 磁性ビーズには、HEL scFv-TM2は全く結合しな った。これらの事から、HEL scFv-TM2融合タン パク質とビオチンとの結合には、担体とビオ チン間のリンカー長が影響することがあり、 その長さは少なくとも13.5Åより長くなけれ ならないことが明らかになった。
実施例4 タマビジン2とシアル酸
移酵素との融合タンパク質のビオチン結合
性の定量分析
本実施例では、Biacore 3000(BIACORE社製)を用い
て、実施例2のISH224-2,6ST-TM2融合タンパク質の
オチン結合試験を実施し、タマビジンとタ
パク質(この場合酵素)間のアミノ酸リンカ
長が、結合に影響を与えるか否かを調べた
ISH224-2,6ST融合TM2タンパク質として、ISH224- 2,6ST-linkTM2、ISH224-2,6ST-3XlinkTM2及びISH224-2,6ST-5Xl inkTM2を用いた。発現ベクターISH224-2,6ST-linkTM2/ pTrc99A、ISH224-2,6ST-3XlinkTM2/pTrc99A、ISH224-2,6ST-5Xli nkTM2/pTrc99Aをそれぞれ大腸菌株TB1に形質転換 、タンパク質発現を行った。菌体を50mM NaCl 含む50mM Tris緩衝液(pH8)で懸濁後、超音波破 によってタンパク質を抽出した。破砕液を 心(15000rpm)し、その上清をイオン交換カラム Q-SepharoseもしくはMonoQ HR5/5(アマシャムファル マシア社製)に供した。平衡化緩衝液には50 m M NaClを含む50mM Tris緩衝液(pH8)、溶出緩衝液 は500 mM NaCl を含む50 mM Tris緩衝液(pH 8)を い、1 mL/minの流速で0.5mLずつタンパク質を 収した。溶出画分をSDS-PAGEし、ISH224-2,6ST-TM2 合タンパク量を検出・定量後、Biacore解析に いた。いずれのタンパク質も精製度はおよ 50%であった。
センサーチップCM5(Biacore社製)上に、EZ-Link (登録商標) NHS-Biotin(13.5Å)、またはEZ-Link(登 商標) NHS-LCLC-Biotin(30.5Å)(いずれもPIERCE社製 括弧内はビオチンとNHSとの間のリンカーの さを表す)でビオチン化したウシ血清アルブ ミン(BSA)を、アミンカップリング法を用いて 定した。ランニング緩衝液にはHBS-EP(Biacore 製)を使用し、ISH224-2,6ST-linkTM2、ISH224-2,6ST-3Xli nkTM2、及びISH224-2,6ST-5XlinkTM2を25℃、流速20μl/m inで40μl(2分間)ずつインジェクションした。 られたセンサーグラムから解析ソフトウェ BIAevaluation version 4.1を用いて結合速度定数 (ka)、解離速度定数(kd)、解離定数(KD)を算出し た。この結果を表5-7に示す。また、()内の値 Biacore 3000の測定範囲外であることを示す。
ビオチンとBSAの間のリンカーの長さが、13.5 Åの場合、融合タンパク質とビオチンとの結 合は検出されなかったが、リンカーの長さが 、22.4 Åの場合、3種類いずれの融合タンパ 質も、ビオチンとの特異的な結合を示した( 6)。KDは10 -8 ~10 -9 と低く、ISH224-2,6ST-5XlinkTM2が最も低かった。 ンカーの長さが30.5Åの場合も、いずれの融 タンパク質も、ビオチンとの特異的な結合 示した(表7)。ISH224-2,6ST-linkTM2においてもKDは 10 -8 オーダーと低く、融合タンパク質とビオチン は強く結合していることが分かった。また、 ISH224-2,6STとTM2とを、より長いリンカーで融合 させたISH224-2,6ST-3XlinkTM2及びISH224-2,6ST-5XlinkTM2 おいては、結合はさらに強くなり、特に解 速度定数kdは、Biacore3000の検出限界(>5X10 -6 )以下にまで低くなり、10 -6 、10 -7 オーダーとなった。つまり、事実上ISH224-2,6ST -3XlinkTM2とISH224-2,6ST-5XlinkTM2は、ビオチンと一 結合するとほとんど解離しないことが示さ た。また解離定数KDはそれぞれ10 -10 、10 -11 オーダーとなり、極めて低い値となった。
実施例5 タマビジンとレクチンと
の融合タンパク質
本実施例ではタマビジン2とレクチンとの融
合タンパク質をタバコ培養細胞BY2で発現させ
、融合タンパク質のレクチン活性やビオチン
結合活性を調べた。また固定化実験を行った
。
レクチン遺伝子
タマビジンとレクチンとの融合タンパク質
例として、タマビジン2(以下、「TM2」と記
する場合がある)とレクチンの一種であるダ
ズレクチン(SBA)、小麦胚芽レクチン(WGA)を使
用した。SBAはsoybean agglutininをコードする遺
子(NCBI:K00821)を、WGAはwheat germ agglutinin isolec
tin A(WGA-A)(NCBI:M25536)とwheat germ agglutinin isolec
tin D(WGA-D)(NCBI:M25537)をコードする遺伝子を使
した。
融合タンパク質はレクチンのC末端にTM2が 来るように設計した。このとき、レクチンと TM2の間にリンカー(アミノ酸配列1xlink: GGGGSG または5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を挿入した 。またレクチン-TM2融合タンパク質を培地中 と分泌させるためのレクチンのシグナルペ チドは、元来レクチンが有するものをその ま用いた。発現はタバコ培養細胞BY2で行い 発現ベクターはpSB24 (Komari et al. 1996)を用 た。
5-1.タマビジン2とレクチンの融合タンパク
発現用ベクターの構築
タマビジン2とSBAとをリンカー(GGGGSG)を介し
融合させたタンパク質をコードする核酸(SBA
-1xlink-TM2)、及びタマビジン2とWGAとを5×リン
ー(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を介して融合させた
ンパク質をコードする核酸(WGA-A-5xlink-TM2, WGA
-D-5xlink-TM2)の3種類を構築した(各々の塩基配
:配列番号63、65及び67;各々の塩基配列によっ
てコードされるアミノ酸配列:配列番号64、66
び68)。
プライマーの設計
レクチン-TM2融合遺伝子の構築のために、ま
ず、レクチン, TM2両遺伝子をリンカー(1xlink:
GGGGSG, 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を介し結合
させるためのプライマーを設計した。即ち、
5’側にレクチンC末端部位、中央にリンカー
3’側にTM2部分からなるプライマー(SBA-link-TM
2-FW, WGA-A-5xlink-TM2-F, WGA-D-5xlink-TM2-F)、5’側に
TM2N末端部位、リンカー、3’側にレクチンC末
端部位を逆向きにコードするDNA配列からなる
プライマー(SBA-link-TM2-RV, WGA-A-5xlink-TM2-R, WGA-D
-5xlink-TM2-R))を設計した。
次に、レクチンのシグナル配列部位を含 る5’部分と、その上流にXba I制限酵素切断 部位(TCTAGA)をコードする配列からなるプライ ー(SBA5’XbaI, WGA-A5’XbaI, WGA-D5’XbaI)、また TM2遺伝子の3’部分とその下流にSac I制限酵 素切断部位(GAGCTC)をコードする配列からなる ライマー(TM2CtermSacI)を設計した。タマビジ とレクチンとの融合タンパク質構築用プラ マーを表8にまとめた。
PCR
レクチン-TM2遺伝子を構築するために、二段
階のPCRを行った。一段階目のPCRは、ダイズも
しくは小麦のゲノムDNAを鋳型にしてプライマ
ーSBA5’XbaIとSBA-link-TM2-RV、WGA-A5’XbaIとWGA-A-5xl
ink-TM2-R、WGA-D5’XbaIとWGA-D-5xlink-TM2-Rを用いて
クチン部位の増幅を、また、TM2遺伝子がベ
ターpTrc99Aに組み込まれたプラスミド(WO02/0728
17)を鋳型にしてプライマーSBA-link-TM2-FWとTM2Cte
rmSac、WGA-A-5xlink-TM2-FとTM2CtermSac、WGA-D-5xlink-TM2-
FとTM2CtermSacを用いてTM2部位の増幅をそれぞれ
行った。
PCR反応条件は20ulの反応液中に鋳型DNAを500 ng、1xlinkの場合10XExTaq buffer(TaKaRa社)を2ul、5xli nkの場合2X GC buffer(TaKaRa社)を10ul、2.5mM dNTPを 1.6ul、プライマーを10pmoles、5U/ul Ex Taqを0.1ul( XX U)添加し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER) 用いて96℃ 3分を1回、95℃ 1分, 60℃ 1分, 72℃ 2分を25回、72℃ 6分を1回とした。その 果、レクチン部分においては、SBA-1xlink-TM2の 場合900 bp、WGA-A-5xlink-TM2の場合663 bp、WGA-D-5xl ink-TM2の場合666 bpのPCR産物が得られた。TM2部 においてはSBA-1xlink-TM2の場合468 bp、WGA-A-5xli nk-TM2とWGA-D-5xlink-TM2の場合525 bpのPCR産物が得 れた。
これらのPCR産物をTAE緩衝液中でアガロー ゲル電気泳動で分画した。各DNA断片をゲル と切り出し、QIAEX IIゲル抽出キット(QIAGEN) 用いてDNA断片を回収した。抽出方法はキッ 添付の説明書に従った。
上記断片を鋳型にして、SBA-1xlink-TM2の場 プライマーSBA5’XbaI とTM2CtermSac(鋳型は上記S BA-1xlink-TM2のSBA部分とTM2部分) 、WGA-A-5xlink-TM2 場合プライマーWGA-A5’XbaI とTM2CtermSac (鋳 は上記WGA-A-5xlink-TM2のWGA-A部分とTM2部分)、WGA- D-5xlink-TM2の場合プライマーWGA-D5’XbaI とTM2Cte rmSac(鋳型は上記WGA-D-5xlink-TM2のWGA-D部分とTM2部 分)を用いて二段階目のPCRを行った。反応条 は一段階目と同様とした。その結果、SBA-1xli nk-TM2の場合1314 bp、WGA-A-5xlink-TM2の場合1152 bp WGA-D-5xlink-TM2の場合1155 bpのPCR産物が得られ 。
クローニング
PCRによって得られたレクチン-TM2遺伝子断片
をベクターpCR4 TOPO(Invitrogen社製)にクローニ
グした。ライゲーション反応はベクターキ
ト添付の説明書に従った。大腸菌TB1にエレ
トロポレーション法を用いてDNAを導入し、
法(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A labor
atory manual, 2 nd
edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。
インサートが確認されたクローンに関し M13プライマー(TaKaRa社)を用いてABI PRISM蛍光 ークエンサー(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社)でPCR産物の塩基配列をその両端から 定し、もとの遺伝子と比較して変異がない とを確認した。これらの遺伝子が組み込ま たプラスミドをXba IとSac Iで二重消化し、 述の方法でゲル精製を行い、DNA断片を回収 た。
この断片を予めXba IとSac Iで消化してGUS 伝子を除去した植物用ベクターpSB24(Komari et al. 1996 Plant J)に、Ligation Kit(TaKaRa社製)を いてライゲーションした。ライゲーション 物を大腸菌TB1に形質転換し、得られた大腸 コロニーを鋳型にSBA-1xlink-TM2の場合プライマ ーSBA5’XbaI とTM2CtermSac 、WGA-A-5xlink-TM2の場合 プライマーWGA-A5’XbaI とTM2CtermSac 、WGA-D-5xlin k-TM2の場合プライマーWGA-D5’XbaI とTM2CtermSac 用いて前述の条件でPCRによる挿入遺伝子部 の増幅分析を行い、挿入遺伝子の有無を確 して、タマビジン2とレクチンの融合タンパ 質発現用のベクターSBA-link-TM2/pSB24, WGA-A-5xli nk-TM2/pSB24, WGA-D-5xlink-TM2/pSB24を完成させた。 築したベクターを用いてレクチン-TM2融合タ パク質遺伝子を、Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231の方法を用いてタバコ培養細胞BY2 と導入した。
5-2.タマビジン2とレクチンの融合タンパク
の発現と機能解析
タマビジン2との融合によるレクチンの活性
を調べるため、まずタマビジン2とレクチン
融合タンパク質をタバコ培養細胞BY2で発現
せ、粗精製した。
タバコ培養細胞BY2発現
SBA-1xlink-TM2を形質転換したタバコ培養細胞BY
2の7日間培養した後、吸引濾過にて細胞画分
培地画分に分離した。回収した細胞3gに対
て4mlの50mM HEPES/KOH(pH7.4)を添加し、乳鉢です
潰した後、細胞を超音波により破砕した。
砕液を遠心(15,000rpm)し、その上清を可溶性
分とした。また、培地画分は70%飽和となる
う硫酸アンモニウムを添加し、4℃で一晩イ
キュベート後遠心(14,500rpm)することで培地
に含まれるタンパク質を沈殿させた。この
殿物を50mM HEPES/KOH (pH7.4) 1mLで再懸濁し、100
mLの0.1M HEPES/KOH (pH7.4)で透析後得られた画分
濃縮培地画分とした。
SBA-1xlink-TM2の可溶性画分と濃縮培地画分 ついてウェスタンブロッティング解析を行 た。検出には一次抗体としてウサギ抗TM2抗 、二次抗体としてアルカリフォスファター 標識抗ウサギIgG抗体(BIO RAD社製)を用いた。 の結果、SBA-1xlink-TM2導入BY2細胞からは可溶 画分にのみ45kDa付近にバンドが検出された。 このサイズはSBA-1xlink-TM2からシグナルペプチ の切断後に得られる分子量(43kDa)とほぼ一致 した。
融合タンパク質のレクチン活性の
測定(赤血球凝集反応)
タマビジン2-SBA融合タンパク質のレクチン
活性を調べるため、粗精製したSBA-1xlink-TM2を
用いて赤血球凝集活性を検討した。
ウサギ保存血液(コスモバイオ)2mlに10mlのP BSを添加し、遠心後に上清を除去することで 赤血球画分を得た。得られた赤血球画分を1 0mlのPBS で3回洗浄後、赤血球画分と等量の5% リプシン溶液を加えて37℃で一時間静かに とうしながらインキュベートした。トリプ ン処理した赤血球画分を再度10mlのPBS で3回 浄後、PBSで希釈し、2%(v/v)赤血球浮遊液を調 製した。
SBA-1xlink-TM2を発現するタバコ培養細胞から ンパク質を抽出し、イミノビオチンカラム 粗精製した。カラムへの結合バッファーは50 mM CAPS pH11, 50 mM NaCl、洗浄バッファーは50 mM CAPS pH11, 500 mM NaCl、溶出バッファーは5 0 mM NH 4 OAc pH4を用いた。また対照としてpSB24を有す タバコ培養細胞からタンパク質を抽出し、 様にイミノビオチンカラムで粗精製した。
次に活性を測定するために、96穴プレー に1ug/ul, 10ng/ul, 0.1ng/ulに希釈したSBA(Jオイル ミルズ)溶液、TM2溶液、粗精製したSBA-1xlink-TM2 溶液と、対照としてpSB24ベクター(GUS遺伝子を 発現)を導入したBY2細胞の粗精製溶液を添加 、PBSで2倍ずつ段階希釈した。各希釈溶液に2 %(v/v)赤血球浮遊液を同量添加し、室温で一時 間インキュベート後に赤血球凝集の有無を判 定した。
その結果、粗精製したSBA-1xlink-TM2でも赤 球凝集反応が見られたことから、タマビジ 2融合SBAはレクチン(SBA)活性を保持している とが示された(図4)。
粗精製と発現タンパク質の糖結合
活性
次に、SBA-1xlink-TM2を形質転換したタバコ培
細胞BY2の7日間培養細胞より、SBA-1xlink-TM2を
ラムクロマトグラフィーにより粗精製した
15gの7日間培養細胞を用いて前述と同じ方法
調整した可溶性画分をそのまま粗タンパク
サンプルとした。これらのサンプルと50mM H
EPES/KOH(pH7.4)で平衡化したD-GalNAc agarose (SIGMA
製)を混合し、室温で1時間インキュベートし
た後、オープンカラムを作製した。溶出には
溶出バッファー(50mM HEPES/KOH(pH7.4), 0.1% Nonidet
P40, 20mM GalNAc)を用いた。
精製タンパク質の検出は、SDS-PAGE後のCBB 色(図5A)、また上記と同様に一次抗体として サギ抗TM2抗体、二次抗体としてアルカリフ スファターゼ標識抗ウサギIgG抗体(BIO RAD社 )を用いたウェスタンブロッティング解析( 5B)により行った。その結果、溶出画分にSBA-1 xlink-TM2が検出された(図5A、Bの矢印)。この様 SBA-1xlink-TM2は、D-GalNAc agaroseに結合すること から、タマビジン2融合SBAは糖鎖結合活性を 持していることが示された。次にSBA-1xlink-TM2 のバンドが検出された精製タンパク質溶液を 50mM HEPES/KOH(pH7.4)中で透析した。この操作に り7.5ugのSBA-1xlink-TM2が回収された。精製度は2 6%であった。
タマビジン2とレクチンの融合タ
パク質のビオチン結合活性の定量分析
Biacore 3000(BIACORE社製)を用いて、SBA-1xlink-TM2
合タンパク質のビオチン結合能を分析した
SBA-1xlink-TM2を形質転換したタバコ培養細胞BY
2の7日間培養細胞を用いて上述の方法で粗精
した画分を、解析サンプルとした。
センサーチップCM5(BIACORE社製)上に、EZ-Link TM NHS-LCLC-Biotin(30.5Å)(PIERCE社製、括弧内はビオ ンとNHSとの間のリンカーの長さを表記した) ビオチン化したウシ血清アルブミン(BSA)を ミンカップリング法により固定した。ラン ング緩衝液にはHBS-EP(BIACORE社製)を使用し、SB A-1xlink-TM2を温度25℃、流速20ul/minで40ul(2分間) つインジェクションした。得られたセンサ グラムから解析ソフトウェアBiaevaluation vers ion 4.1を用いて結合速度定数(ka)、解離速度定 数(kd)、解離定数(KD)を算出した。この結果を 9に示す。SBA-1xlink-TM2はビオチンと特異的に 互作用し、KDは10 -9 オーダーと低く、ビオチンと強く結合するこ とが分かった。
以上のことから、レクチンとタマビジン2 の融合タンパク質を、植物細胞において、レ クチンの糖結合活性ならびにタマビジン2の オチン結合活性の両方の活性を持ったまま 発現させることに成功した。
実施例6 タマビジンとプロテイン
Aとの融合タンパク質
本実施例ではタマビジン2とプロテインAと
融合タンパク質を大腸菌で発現させ、精製
の融合タンパクを、ビオチン化プレートに
マビジン-ビオチン結合により固定化させた
こうして得られたプロテインAプレートにポ
リクローナル抗体を反応させ、プロテインA
のアフィニティを利用して固定化し、抗原
の結合活性を調べた。対照として、ポリク
ーナル抗体を疎水結合により直接プレート
固定化させたものを用いた。以下、詳細に
明する。
プロテインA遺伝子と融合タンパ
質の構造
プロテインAは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus
aureus)由来のプロテインAを用いた。Staphylococ
cus aureus proteinA (spa)遺伝子は、独立行政法
製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門
(NBRC)から譲り受けた。NBRCは黄色ブドウ球菌N3
15株とMW2株の二菌株由来のゲノムDNAクローン
分譲しており、これら二菌株のspa遺伝子NBRC
G04-000-249 (ORF ID: SA0107), NBRC G05-000-311 (ORF
ID: MW0084)を用いた。
融合タンパク質はspaのC末側にタマビジン 2(以下「TM2」と記載する場合がある)が来るよ うに設計した。この時、spaとTM2の間にリンカ ー(アミノ酸配列 1xlink: GGGGSG、または5xlink: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を挿入した。またspa-TM2融 合タンパク質を培地中へと分泌させるために spaのシグナルペプチドはそのまま用いた。さ らに、spaのC末に存在する細胞壁結合ドメイ (Uhlen et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1695-1702) はこれを除去した。発現は大腸菌で行い、発 現ベクターはタグなしのベクターpTrc99A (Pharm acia社製)を用いた。
6-1.タマビジン2とプロテインAの融合タンパ
質発現用ベクターの構築
spaの遺伝子の構造は、N末側からシグナルペ
プチド、5つのIgG結合ドメイン、細胞壁結合
メインから成る。PCRを用いてTM2の配列をspa
IgG結合ドメインのC末端側に接続させた融合
ンパク質をコードする遺伝子を4種類構築し
た。
1. spa(SA)δC-1xlink-TM2 (塩基配列69、アミノ
配列70)
2. spa(MW)δC-1xlink-TM2 (塩基配列71、アミノ
配列72)
3. spa(SA)δC-5xlink-TM2 (塩基配列73、アミノ
配列74)
4. spa(MW)δC-5xlink-TM2 (塩基配列75,アミノ酸
列76)
プライマーの設計
spa-TM2融合遺伝子の構築のために、まず、spa
, TM2両遺伝子をリンカー(1xlink: GGGGSG, 5xlink:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を介し結合させるための
プライマーを設計した。即ち、5’側にspa IgG
結合部位、中央にリンカー、3’側にTM2部分
らなるプライマー(spaδC-1xlink-TM2-F, spaδC-5xlin
k-TM2-F)、5’側にTM2N末端部位、リンカー、3’
にspa IgG結合部位を逆向きにコードするDNA
列からなるプライマー(spaδC-1xlink-TM2-R, spaδC
-5xlink-TM2-R)を設計した。
次に、spaのシグナル配列部位を含める5’ 部分と、その上流にNco I制限酵素切断部位(CC ATGG)をコードする配列からなるプライマー(sp- spa 5’ NcoI-F)、また、TM2遺伝子の3’部分と の下流にBamH I制限酵素切断部位(GGATCC)をコ ドする配列からなるプライマー(TM2CtermBam)を 計した。タマビジンとspaとの融合タンパク 構築用プライマーを表10にまとめた。
PCR
spa-TM2遺伝子を構築するために、二段階のPCR
を行った。一段階目のPCRは、spaをコードする
ゲノム遺伝子がベクターpUC18に組み込まれた
ラスミドを鋳型にしてプライマーsp-spa 5’
NcoI-FとspaδC-1xlink-TM2-RもしくはspaδC-5xlink-TM2-R
を用いてspa IgG結合部位の増幅を、また、TM2
伝子がベクターpTrc99Aに組み込まれたプラス
ミド(WO02/072817)を鋳型にしてプライマーspaδC-1
xlink-TM2-FもしくはspaδC-5xlink-TM2-FとTM2CtermBamを
いてTM2部位の増幅をそれぞれ行った。
PCR反応条件は20ulの反応液中に鋳型DNAを500 ng、1xlinkの場合10XExTaq buffer(TaKaRa社)を2ul、5xli nkの場合2X GC buffer(TaKaRa社)を10ul、2.5mM dNTPを 1.6ul、プライマーを10pmoles、5U/ul Ex Taqを0.1ul 加し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用 て96℃ 3分を1回、95℃ 1分, 60℃ 1分, 72℃ 2分を25回、72℃ 6分を1回とした。その結果、 spa部分においては、1xlinkの場合854 bp、5xlink 場合912 bpのPCR産物が得られ、TM2部分におい は1xlinkの場合468 bp、5xlinkの場合525 bpのPCR 物が得られた。
これらのPCR産物をTAE緩衝液中でアガロー ゲル電気泳動により分画した。各DNA断片を ルごと切り出し、QIAEX IIゲル抽出キット(QIA GEN)を用いてDNA断片を回収した。抽出方法は ット添付の説明書に従った。
上記断片を鋳型にして、1xlinkの場合、5xli nkの場合それぞれに関して、プライマーsp-spa 5’ NcoI-FとTM2CtermBamを用いて二段階目のPCRを 行った。反応条件は一段階目と同様とした。 その結果、1xlinkの場合1268 bp、5xlinkの場合1325 bpのPCR産物が得られた。
クローニング
PCRによって得られたspa-TM2遺伝子断片をベク
ターpCR4 TOPO(Invitrogen社製)にクローニングし
。ライゲーション反応はベクターキット添
の説明書に従った。大腸菌TB1にエレクトロ
レーション法を用いてDNAを導入し、常法(Samb
rook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory ma
nual, 2 nd
edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。
ンサートが確認されたクローンに関してM13
ライマー(TaKaRa社)を用いてABI PRISM蛍光シー
エンサー(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer
)でPCR産物の塩基配列をその両端から決定し
、もとの遺伝子と比較して変異がないことを
確認した。これらの遺伝子が組み込まれたプ
ラスミドをNco IとBamH Iで二重消化し、前述
方法でゲル精製を行い、DNA断片を回収した
この断片を予めNco IとBamH Iで消化しておい
大腸菌発現用ベクターpTrc99Aに、Ligation Kit(T
aKaRa社製)を用いてライゲーションした。
ライゲーション産物を大腸菌BL21に形質転 換し、得られた大腸菌コロニーを鋳型にsp-spa 5’ NcoI-FとTM2CtermBamを用いて前述の条件でPC Rによる挿入遺伝子部位の増幅分析を行い、 入遺伝子の有無を確認して、タマビジン2とs paの融合タンパク質発現用のベクターspa(SA)δC -1xlink-TM2/pTrc99A、spa(MW)δC-1xlink-TM2/pTrc99A、spa(SA )δC-5xlink-TM2/pTrc99A、spa(MW)δC-5xlink-TM2/pTrc99Aを 成させた。
6-2.タマビジン2とspaの融合タンパク質の発
と粗精製
タマビジン2との融合によるプロテインAの
板への固定化の効果を調べるため、まずタ
ビジン2とspaの融合タンパク質を大腸菌で発
させ、粗精製した。
大腸菌発現と発現タンパク質のIgG
結合活性
spa(SA)δC-1xlink-TM2/pTrc99Aとspa(MW)δC-1xlink-TM2/pTrc
99Aについて、それぞれを形質転換した大腸菌
BL21を、抗生物質アンピシリン(最終濃度100ug/m
L)を含むLB培地50mLに接種し、OD600における吸
度が0.5に達するまで30℃で振とう培養した。
その後、1mM IPTGを添加し、さらに30℃で5時間
振とう培養した。培養液50mLから遠心にて大
菌画分と培地画分に分離した。大腸菌画分
0.1M HEPES/KOH(pH7.4)3mL中に懸濁後、菌体を超音
により破砕した。破砕液を遠心(15,000rpm)し
その上清を可溶性画分とした。さらに、沈
物は8M尿素を含む0.1M HEPES/KOH (pH7.4)3mLに懸濁
後、再び超音波破砕し、これを不溶性画分と
した。また、培地画分は70%飽和となるよう硫
酸アンモニウムを添加し、4℃で一晩インキ
ベート後遠心(14,500rpm)することで培地中に含
まれるタンパク質を沈殿させた。この沈殿物
を0.1M HEPES/KOH (pH7.4) 1mLで再懸濁し、100mLの0.
1M HEPES/KOH (pH7.4)で透析後得られた画分を濃
培地画分とした。
spa(SA)δC-1xlink-TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2の 溶性画分と濃縮培地画分についてウェスタ ブロッティング解析を行った。検出にはア カリフォスファターゼ標識ウサギIgG抗体(BIO RAD社製)を用いた。その結果、spa(SA)δC-1xlink- TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2発現大腸菌からは可 溶性画分と濃縮培地画分の両方で40kDa付近に ンドが検出された。このサイズはspa(SA)δC-1x link-TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2からシグナルペ チドの切断後に得られる分子量(42kDa)とほぼ 一致した。さらに通常二次抗体として用いる アルカリフォスファターゼ標識ウサギIgG抗体 のみで検出できたことから、タマビジン2融 spaはIgG結合活性を保持していることが示さ た。
粗精製
次に、spa(SA)δC-1xlink-TM2/pTrc99Aおよびspa(MW)δC-
1xlink-TM2/pTrc99Aを形質転換した大腸菌の培養液
50mLより、spa(SA)δC-1xlink-TM2とspa(MW)δC-1xlink-TM2
をカラムクロマトグラフィーにより粗精製し
た。前述と同じ方法で発現誘導させた大腸菌
の培地画分をそのまま粗タンパク質サンプル
とした。これらのサンプルとTST溶液(50mM Tris
衝液, 150mM NaCl, 0.05% Tween20, pH7.6)で平衡化
したIgG sepharose TM
6 Fast Flow (GE Healthcare社製)を混合し、室温
で1時間インキュベートした後、オープンカ
ムを作製し、溶出には0.5M酢酸溶液(pH3.4)を用
いた。
精製タンパク質は上記と同様に、SDS-PAGE-C BB染色(図6A)、またアルカリフォスファターゼ 標識ウサギIgG抗体を用いたウェスタンブロッ ティング解析により確認した(図6B)。なお後 においてはタンパク質の会合状態を見るた に、タンパク質サンプルを還元剤の入って ないSDSサンプルバッファーに添加後、加熱 しでSDS-PAGEに供試した。その結果、両融合タ ンパク質ともにIgG sepharoseにより精製された とから、タマビジン2融合spaはIgG結合活性を 保持していることが示された。即ち、SDS-PAGE- CBB染色実験では、可溶性画分において40kDa付 に二本のバンドが検出された(図6A矢印)。こ れらのバンドはその分子量から、融合タンパ ク質であると考えられた。また、ウェスタン 分析では、可溶性画分において融合タンパク 質が単量体(モノマー)のもの(二本のバンド) 四量体(テトラマー)のもの(数本のバンド)の 方が検出された(図6B)。単量体のバンドは、 先のSDS-PAGEで検出されたサイズと同じであっ 。また培地濃縮画分からは、単量体と四量 のサイズに、一本づつバンドが検出された( 図6B)。なお、このウェスタン分析では上記と 同様に、アルカリフォスファターゼ標識ウサ ギIgG抗体のみで検出できたことから、タマビ ジン2融合spaはIgG結合活性を保持しているこ が示された。
spa(SA)δC-1xlink-TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2の ンドが検出された精製タンパク質溶液(図6B SA-7、MW-9のmedium画分)は凍結乾燥させた。こ 一連の操作により10.8ugのspa(SA)δC-1xlink-TM2と1 2.6ugのspa(MW)δC-1xlink-TM2が回収された。
6-3.タマビジン2とspaの融合タンパク質及びsp
aの固定化と、ELISAによるそれらの活性比較解
析
タマビジン2との融合によるspaプロテインA
基板への固定化の効果を調べるため、粗精
したspa(SA)δC-1xlink-TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2
マイクロプレートに固定化し、さらにダイ
レクチン抗体を固定化し、ダイズレクチン
検出感度を指標としたELISA分析を行った。
ELISA分析
粗精製したspa(SA)δC-1xlink-TM2とspa(MW)δC-1xlink-T
M2を20ng/uLとなるようにPBS(137mM NaCl, 2.68mM KCl,
8.1mM Na 2
HPO 4
, 1.47mM KH 2
PO 4
)でそれぞれ調製し、これをビオチン化96穴マ
イクロプレート(型番15151, PIERCE社製)に100ulず
つ添加した。室温で30分間静置することでタ
ビジン-ビオチン結合により融合タンパク質
を固定化した。その後、プレートの各ウェル
を0.1% Tween20を含むTBS緩衝液(TTBS)で3回洗浄し
。次に抗体を固定化するために、ウサギ抗S
BA抗体(EY LABORATORIES社製)をPBSで50ng/ulとなるよ
うに調製し、先ほど融合タンパク質を固定化
したプレート、並びに対照として疎水性プレ
ート(型番15031, PIERCE社製)及びプロテインAコ
ティングプレート(プロテインA(ナカライテ
ク)を5ng/ulとなるようにPBSで希釈し、これを
疎水性プレート(型番15031, PIERCE社製)に50ulず
添加し、一晩室温で静置した。その後、プ
ートの各ウェルを0.1% Tween20を含むTBS緩衝液
(TTBS)で3回洗浄して作成した)に100ulずつ添加
、一晩室温で静置した。ビオチン化プレー
とプロテインAコーティングプレートはプロ
インA-IgG結合により、疎水性プレートは疎
結合により、それぞれプレートにウサギ抗SB
A抗体を固定化した。
その後これらのプレートを、TTBSで3回洗浄 、0.5% BSA含有TTBSを300ul加え、室温で1時間静 し、ブロッキングを行った。再度、TTBSで3 洗浄後、TTBSで100ng/ulから0.1pg/ulまで段階的に 希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識SBA (J-オイルミルズ社製)溶液を100ulずつ添加した 。なお対照として、ウサギ抗SBA抗体を固定化 していないビオチン化プレートと疎水性プレ ートにも添加した。西洋ワサビペルオキシダ ーゼ標識SBAを添加後、室温で1時間静置し、 レートに固定化されたウサギ抗SBA抗体と反 させた。さらにTTBSで3回洗浄した後、各ウェ ルに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ標 識SBAを検出するために、1-Step TM Ultra TMB-ELISAを100ul添加し、発色が認められた ところで2M硫酸を100ul加えて反応を停止させ 450nmにおける吸光度をプレートリーダーInfini te M200(TECAN社製)によって測定した。
なお、データ値としては、西洋ワサビペ オキシダーゼ標識SBAの各濃度区それぞれに いて、各プレートの対照サンプル(固定化す ることなく、西洋ワサビペルオキシダーゼ標 識SBAのみを添加したもの)の各吸光度の測定 併せて行い、ウサギ抗SBA抗体を固定化した 濃度区の吸光度から、その対照の吸光度の を差し引いたものを用いた。さらに、spa-TM2 合タンパク質を介して固定化した抗体量、 水結合により直接固定化した抗体量、およ 疎水結合により固定化したプロテインAを介 して固定化した抗体量は、アルカリフォスフ ァターゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて定 量し、抗体の単位固定化量当たりの西洋ワサ ビペルオキシダーゼ標識SBA検出量を算出した 。
次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識S BA(SBA-HRP)を用いたウサギ抗SBA抗体の検出感度 測定した。ウサギ抗SBA抗体1ngに結合するSBA- HRP量を計算したところ、抗体を疎水結合によ りプレートに結合させた場合と比較して、ビ オチン化プレートにタマビジンとプロテイン A(spa)融合タンパク質を結合させた後に、抗体 を結合させたほうが、抗原であるSBA-HRPは2.3 から4.5倍多く結合した(表11)。このことから ポリクローナル抗体(IgG抗体)を基板に固定 する際、疎水結合によって固定化するより 、プロテインAとタマビジンの融合タンパク を介して基板に固定化させた方が、検出感 がおよそ2-4倍高くなることが示された。さ に、プロテインAをそのまま疎水結合させた プレートに抗体を固定化するよりも、2倍か 3倍程度、感度が高くなることが分かった(表 11の添加SBA-HRP濃度10pg/μlと1pg/μlのデータ参照 )。
6-4.タマビジン2とspaとの融合タンパク質の
オチン結合活性の定量分析
Biacore 3000(BIACORE社製)を用いて、spa-TM2融合
ンパク質のビオチン結合能を分析した。培
液の培地中に分泌されているspa-TM2を上述の
法で粗精製した画分を、解析サンプルとし
。
センサーチップCM5(BIACORE社製)上に、EZ-Link TM NHS-LCLC-Biotin(30.5Å)(PIERCE社製、括弧内はビオ ンとNHSとの間のリンカーの長さを表記した) ビオチン化したウシ血清アルブミン(BSA)を ミンカップリング法により固定した。ラン ング緩衝液にはHBS-EP(BIACORE社製)を使用し、sp a(SA)δC-1xlink-TM2およびspa(MW)δC-1xlink-TM2を温度25 ℃、流速20ul/minで40ul(2分間)ずつインジェクシ ョンした。得られたセンサーグラムから解析 ソフトウェアBiaevaluation version 4.1を用いて結 合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、解離定数( KD)を算出した。この結果を表12に示す。spa(SA) δC-1xlink-TM2とspa(MW)δC-1xlink-TM2はビオチンと特 的に相互作用し、KDは10 -8 オーダーと低く、ビオチンと強く結合するこ とが分かった。
実施例7 タマビジン融合タンパク
質発現ベクター
本実施例ではタマビジン2との融合タンパク
質を大腸菌で発現させるための発現ベクター
を構築した。発現ベクターは目的タンパク質
のN末側にタマビジン2を融合させるベクター
、C末側にタマビジン2を融合させるベクタ
の両方を構築した。以下、具体的に説明す
。
7-1.タマビジン2融合タンパク質発
用ベクターの構築
タマビジン2(以下、「TM2」と記載する場合
ある)融合タンパク質発現用ベクターの構造
、pTrc99A(Pharmacia社製)を骨格とし、制限酵素N
co I認識部位とHind III認識部位の間にTM2、TM2
目的タンパク質を結合するリンカー部位、
的タンパク質をコードする遺伝子を組み込
ためのマルチクローニングサイト(以下、「
MCS」)部位、目的のタンパク質を発現させた
にTM2配列を除去するエンテロキナーゼ(以下
「EK」)認識部位の配列、His標識配列を以下
順に組み込んだ。
目的タンパク質のN末端側にタマビジン2 融合させるベクターの場合、pTrc99Aの制限酵 NcoI認識部位の下流にTM2遺伝子、リンカー(1x link: GGGGSG, 3xlink: GGGGSGGGGSGGGGS, 5xlink: GGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGS)、EK認識部位の配列、制限酵素 識サイトがEcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xho I, Not Iの順に並ぶMCS、6個のHisからな His標識配列を挿入した。詳細なベクター地 は図7-9に示した。目的タンパク質のC末端側 にタマビジン2を融合させるベクターの場合 pTrc99AのNcoI認識部位の下流に6個のHisからな His標識配列、制限酵素認識サイトがEcoR I, S ac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xho I, Not Iの順に 並ぶMCS、EK認識部位の配列、リンカー(1xlink: GGGGSG, 3xlink: GGGGSGGGGSGGGGS, 5xlink: GGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGS)、TM2遺伝子を挿入した。詳細なベク ー地図は図10-12に示した。
プライマーの設計
TM2融合タンパク質発現ベクター構築のため
、まず、TM2遺伝子の上流もしくは下流にリ
カー、EK認識配列、MCSサイト、His標識配列
Nco I制限酵素切断部位(CCATGG)もしくはHind III
制限酵素切断部位(AAGCTT)をコードする配列を
合させるためのプライマーを設計した。即
、5’側にNco I制限酵素切断部位、His標識配
列、MCSサイト、EK認識配列、リンカー、3’側
にTM2 N末端部位からなるプライマー(His-MCS-EK-
1xlink-TM2-F, His-MCS-EK-3xlink-TM2-F)、5’側にHind II
I制限酵素切断部位、His標識配列、MCSサイト
EK認識配列、リンカー、3’側にTM2 C末端部
を逆向きにコードするDNA配列からなるプラ
マー(TM2-1xlink-EK-MCS-His-R, TM2-3xlink-EK-MCS-His-R)
設計した。尚、リンカー配列が5xlinkの場合
プライマー長が180merと長すぎるため、5’側1
10merと3’側110merの二つのプライマー(His-MCS-EK-
5xlink-TM2-F1, His-MCS-EK-5xlink-TM2-F2, TM2-5xlink-EK-MCS
-His-R1, TM2-5xlink-EK-MCS-His-R1)をそれぞれ設計し
。
次に、TM2の5’部分と、その上流にNco I制限
酵素切断部位をコードする配列からなるプラ
イマー(TM2NtermNcoI-F)、また、TM2の3’部分とそ
下流にHind III制限酵素切断部位を逆向きに
ードする配列からなるプライマー(TM2CtermHind
III-R)を設計した。タマビジン融合タンパク質
発現ベクター構築用プライマーを表13にまと
た。
PCR
TM2融合タンパク質発現ベクターを構築する
めに、リンカー長が1xlink, 3xlinkの場合は一
階のPCRを、5xlinkの場合は二段階のPCRを行っ
。リンカー長が1xlink, 3xlinkの場合、TM2遺伝
がベクターpTrc99Aに組み込まれたプラスミド
(WO02/072817)を鋳型にしてプライマーTM2NtermNotI-F
とTM2-1xlink-EK-MCS-His-RもしくはTM2-3xlink-EK-MCS-His-
R、プライマーHis-MCS-EK-1xlink-TM2-FもしくはHis-MC
S-EK-3xlink-TM2-FとTM2CtermHindIII-Rを用いてTM2遺伝
の上流もしくは下流にリンカー、EK認識配列
、MCSサイト、His標識配列を含む配列を増幅さ
せた。リンカー長が5xlinkの場合、TM2遺伝子が
ベクターpTrc99Aに組み込まれたプラスミド(WO02
/072817)を鋳型にしてプライマーTM2NtermNotI-FとTM
2-5xlink-EK-MCS-His-R1、プライマーHis-MCS-EK-5xlink-TM
2-F1とTM2CtermHindIII-Rを用いてTM2遺伝子の上流も
しくは下流にリンカー、EK認識配列、MCSサイ
の一部を含む配列を増幅させた。
PCR反応条件は20ulの反応液中に鋳型DNAを500 ng、2X GC buffer(TaKaRa社)を10ul、2.5mM dNTPを1.6ul プライマーを10pmoles、5U/ul Pyrobestを0.1ul添加 し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用いて9 6℃ 3分を1回、95℃ 1分, 60℃ 1分, 72℃ 2分 25回、72℃ 6分を1回とした。その結果、N末 にTM2を融合させる配列においては、1xlinkの 合546 bp、3xlinkの場合573 bp、5xlinkの場合523 bpのPCR産物が得られ、C末端にTM2を融合させる 配列においては、1xlinkの場合538 bp、3xlinkの 合565 bp、5xlinkの場合525 bpのPCR産物が得られ た。5xlinkの場合に得られたPCR産物をアガロー ス(Agarose Type II : SIGMA)を用いてTAE緩衝液中 アガロース電気泳動を行った。
各DNA断片をゲルごと切り出し、QIAEX IIゲ 抽出キット(QIAGEN)を用いてDNA断片を回収し 。抽出方法はキット添付の説明書に従った 得られた5xlinkの断片を鋳型にして、N末端にT M2を融合させる配列の場合はプライマーTM2Nter mNotI-F とTM2-5xlink-EK-MCS-His-R2、C末端にTM2を融 させる配列の場合はプライマーHis-MCS-EK-5xlink -TM2-F2とTM2CtermHindIII-Rを用いて二段階目のPCRを 行った。反応条件は一段階目と同様とした。 その結果、N末端にTM2を融合させる配列の場 603 bp、C末端にTM2を融合させる配列の場合595 bpのPCR産物が得られた。
クローニング
PCRによって得られたTM2遺伝子の上流もしく
下流にリンカー、EK認識配列、MCSサイト、Hi
s標識配列を含む断片をベクターpCR4blunt TOPO(I
nvitrogen社製)にクローニングした。ライゲー
ョン反応はベクターキット添付の説明書に
った。大腸菌TB1にエレクトロポレーション
を用いてDNAを導入し、常法(Sambrook et al. 198
9, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2 nd
edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。
ンサートが確認されたクローンに関してM13
ライマー(TaKaRa社)を用いてABI PRISM蛍光シー
エンサー(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer
)でPCR産物の塩基配列をその両端から決定し
、もとの遺伝子と比較して変異がないことを
確認した。これらの遺伝子が組み込まれたプ
ラスミドをNco IとHind IIIで二重消化し、前述
の方法でゲル精製を行い、DNA断片を回収した
。この断片を予めNco IとHind IIIで消化してお
いた大腸菌発現用ベクターpTrc99Aに、Ligation K
it(TaKaRa社製)を用いてライゲーションした。
ライゲーション産物を大腸菌TB1に形質転 し、常法に従いプラスミドDNAを抽出、制限 素分析を行い、挿入遺伝子の有無を確認し 、タマビジン2融合タンパク質発現用のベク ターTM2-1xlink-EK-MCS-His/pTrc99A(図7)、TM2-3xlink-EK-MC S-His/pTrc99A(図8)、TM2-5xlink-EK-MCS-His/pTrc99A(図9)、 His-MCS-EK-1xlink-TM2/pTrc99A(図10)、His-MCS-EK-3xlink-TM2 /pTrc99A(図11)、His-MCS-EK-5xlink-TM2/pTrc99A(図12)を完 成させた(配列番号77-82)。
Next Patent: METHOD FOR IMPARTING STRESS TOLERANCE TO PLANT