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Title:
METHOD FOR BIOLEACHING COPPER SULFIDE MINERALS, PREFERABLY CHALCOPYRITE, WITH A CONSORTIUM OF BACTERIA THAT OXIDISE IRON AND SULFUR AND ARE RESISTANT TO SEAWATER AND CHLORIDE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/126891
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to copper mining, and particularly to a method for bioleaching copper sulfide minerals, preferably chalcopyrite, with a consortium of bacteria that oxidise iron and sulfur and are resistant to seawater.

Inventors:
ESPARZA MANTILLA MARIO (CL)
RIVERA GALLEGUILLOS KATHERINE MAGDALENA (CL)
Application Number:
CL2018/050138
Publication Date:
July 04, 2019
Filing Date:
December 20, 2018
Export Citation:
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Assignee:
UNIV DE ANTOFAGASTA (CL)
International Classes:
C22B3/18
Domestic Patent References:
WO2014057443A22014-04-17
Foreign References:
Other References:
REA, S. M. ET AL.: "Salt-tolerant microorganisms potentially useful for bioleaching operations where fresh water is scarce", MINERALS ENGINEERING, vol. 75, 2015, pages 126 - 132, XP055622815
CARDENAS, C. P.: "Adaptation y monitoreo de bacterias hierro-oxidantes a niveles crecientes de cloruro de sodio", TESIS DOCTORAL, 9 July 2017 (2017-07-09), pages 1 - 66, XP055622817, Retrieved from the Internet [retrieved on 20190321]
DAVIS-BELMAR, C. S. ET AL.: "Biologically assisted copper secondary sulfide ore leaching in the presence of chloride", ADVANCED MATERIALS RESEARCH, vol. 825, 2013, pages 292 - 295, XP055444966, doi:10.4028/www.scientific.net/AMR.825.292
JAFARI, M. ET AL.: "Acidophilic bioleaching: a review on the process and effect of organic-inorganic reagents and materials on its efficiency", MINERAL PROCESSING AND EXTRACTIVE METALLURGY REVIEW, vol. 40, 2019, pages 87 - 107, XP055622819
MA, L. ET AL.: "Co-culture microorganisms with different initial proportions reveal the mechanism of chalcopyrite bioleaching coupling with microbial community succession", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 223, 2017, pages 121 - 130
WATLING, H. R. ET AL.: "Saline-water bioleaching of chalcopyrite with thermophilic, iron (II)-and sulfur-oxidizing microorganisms", RESEARCH IN MICROBIOLOGY, vol. 167, no. 7, 2016, pages 546 - 554, XP029699161, doi:10.1016/j.resmic.2016.05.003
Attorney, Agent or Firm:
ESTUDIO FEDERICO VILLASECA Y CIA (CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Método para lixiviar minerales sulfurados que contienen cobre caracterizado porque comprende biolixiviar dicho mineral con una solución salina con alto contenido de ión cloruro, a pH ácido de aproximadamente 2.0, que comprende un consorcio bacteriano halotolerante acidofilo y/o acido tolerante, cuyo número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillón, Chile, es RGM 2493, comprendiendo bacterias acidófilas seleccionadas de A. ferrooxidans y Acidiphilium spp.

2. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho consorcio bacteriano fue cultivado previamente en un medio de cultivo 9K-Fe.

3. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho consorcio bacteriano fue cultivado previamente en una solución con altas concentraciones de NaCI.

4. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho mineral de sulfuro que contiene cobre es calcopirita.

5. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha solución salina comprende una solución de NaCI con concentraciones de hasta 30gL 1.

6. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha solución salina comprende una solución salina de 50 a 100% (v/v).

7. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque en dicho consorcio la bacteria halotolerante acidofila predominante es una bacteria cuyo filotipo homólogo a A. ferrooxidans, la que tiene alta tolerancia a NaCI.

8. El método de la reivindicación 6 caracterizado porque dicha bacteria tiene una tolerancia a NaCI de aprox. 30gL 1.

9. El método de la reivindicación 6 caracterizado porque dicha bacteria tiene la secuencia SEQ ID No.:4.

Description:
MÉTODO DE BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO DE COBRE. PREFERENTEMENTE CALCOPIRITA. CON UN CONSORCIO DE BACTERIAS OXIDANTES DE HIERRO Y AZUFRE RESISTENTES A AGUA DE MAR Y CLORURO.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con la minería del cobre, y especialmente con un método para biolixiviar minerales de sulfuro de cobre, preferentemente calcopirita, con un consorcio de bacterias oxidantes de hierro y azufre resistentes a agua de mar.

ANTECEDENTES

Las bacterias oxidantes del hierro y azufre, extremoacldófllas con capacidad de biolixiviar minerales de cobre son sensibles al agua de mar (agua clorurada, ver Tabla 1 1 , Libes, S. (201 1 ). Introductlon to marine blogeochemistry. Academic Press, pp 42) y cloruro ya que tanto el agua clorurada como el cloruros alteran negativamente el desarrollo celular (efecto bactericida y bacteriostátlco) y la capacidad de oxidar hierro y azufre de minerales de cobre. En particular, las bacterias Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidiphilium son sensibles al agua de mar. Por ello, el agua de mar que Incluye cloruro, es un agente bactericida y bacteriostátlco sobre A. ferrooxidans y Acidiphilium. En base a lo antes mencionado, no existen medios de cultivo en investigación o comerciales que usen el agua de mar como aditivo para el crecimiento de las bacterias lixiviantes A. ferrooxidans y Acidiphilium. Tampoco existen operaciones comerciales o Industriales de biolixiviación de minerales sulfuras que usen el agua de mar como aditivo para extraer metales con las bacterias lixiviantes A. ferrooxidans y Acidiphilium.

Es reconocido el problema actual de escasez de agua continental para la Industria Minera de zonas áridas la cual se ve negativamente afectada por la carencia de este insumo. Por tanto surge la opción del uso de agua de mar para procesos hidrometalúrgicos (flotación) pero no existe un proceso de biolixiviación de cobre usando agua de mar por el impacto negativo de las sales, que inhiben el desarrollo microbiano. La calcopirita (CuSFe) es el mineral de cobre más abundante en el planeta, pero es refractarlo y el cobre está en baja ley. Las operaciones Industriales para extraer el cobre desde este mineral son muy costosas (fundición, flotación), alta Inversión de energía y contaminación ambiental colateral. En virtud de ello, la biolixiviación es una de las alternativas conocidas para extraer el cobre, sin embargo las empresas que la aplican usan agua continental.

La presente Invención propone un proceso de biolixiviación de mineral sulfuro (calcopirita) usando agua de mar y un consorcio de bacterias acldófllas halotolerantes que permite recuperar cobre de 23 a 31 %.

La biolixiviación usando agua de mar, exponiendo microorganismos a diferentes concentraciones de NaCI, se traducen a la posibilidad de utilizar agua de mar como estrategia ante el agotamiento de las reservas hídrlcas continentales, obteniendo ventaja del alto contenido de cloruro para mejorar la disolución del mineral y el uso de un consorcio capaz de mantener su actividad en condiciones de salinidad. Adlclonalmente se abre la posibilidad de tratar minerales que en solución liberan Iones cloruro como la atacamlta (Cu 2 CI (OH) 3 ). De esta manera, el consorcio bacteriano de la presente Invención - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2493, es útil como aditivo para la Industria minera.

El problema que aún no ha sido resuelto ya que los microorganismos extremoacldófllos biolixiviantes son sensibles al cloruro presente tanto en agua de mar como en aguas continentales, y en base a este problema, no pueden funcionar eficientemente para solubilizar el cobre desde mineral sulfuro por efecto Inhibidor del cloruro, sin embargo existen algunas patentes que aplican lixiviación clorurada sin usar microorganismos o con microorganismos pero a pH alcalinos, Incluyendo aumento de costos en el proceso.

Por ejemplo, US5278069 enseña un método de biolixiviación para la extracción de metales de cenizas volantes de carbón (CFA), el que se suspende en un medio de cultivo ácido basado en agua de mar y la suspensión se Incuba con un cultivo de microorganismos que comprende al menos una cepa de Thiobacillus thiooxidans capaz de cultivar y producir ácido sulfúrico en el medio de cultivo ácido basado en agua de mar y facilitar así la extracción de metales del CFA. Los metales extraídos se separan de las células de refinado de CFA y de microorganismos y se fraccionan para proporcionar fracciones enriquecidas en metal. Se describe una cepa de Thiobacillus thiooxidans seleccionada que ha sido designada Thiobacillus thiooxidans ZYR1 , una muestra de la cual se ha depositado bajo el número 40453 en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas Ltd. (NCIMB) en Aberdeen, Escocia. Esta cepa seleccionada es particularmente adecuada para la biolixiviación de metales a partir de cenizas volantes de carbón.

W02002/081761 enseña un método de biolixivacion de un concentrado de sulfuro en solución salina. El método comprende el tratamiento de un mineral sulfurado que incluye biolixiviar el mineral en una solución salina usando al menos una bacteria tolerante a la sal. El contenido en sal de la solución puede estar en el Intervalo de 10000 a 35000 ppm de CI . Las bacterias adecuadas incluyen una cepa tolerante a la sal como Thiobacillus prosperus, Acidhalobacter ferrooxidans y Acidhalobacter aeolicus.

US2009/0173188 A1 enseña un método de lixiviación en pilas para recuperar el cobre de un mineral de sulfuro de cobre primario en el que el mineral es lixiviado en una solución áclda con cloruro/sulfato en presencia de oxígeno con el potencial superficial del mineral a 600 mV para causar la disolución del sulfuro de cobre con los parámetros siguientes: pH 0.5 (H 2 S0 4 ), cloro 10 g/L (NaCI), Fe 3+ 10 g/L, aire a 2013 , recuperación de cobre de 70% en 900 h. Este documento Indica que la concentración de cloruro puede ser controlada a nivel de 5-100g/L adicionado HCI u otra fuente de cloruro que Incluyen sales NaCI, MgCI 2 , agua salada ("salares"), agua de mar o cloruro contenido en agua de proceso.

WO2012/001501 A1 se refiere a un método de lixiviación química y bacteriana Integrada de un metal base a partir de un mineral. El método comprende lixiviar un metal base a partir de un mineral con una solución de lixiviación química de tlosulfato amoniacal que tiene un pH de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10,5 formando de este modo un primer lixiviado que tiene una primera concentración del metal base. Ajustar posteriormente el primer lixiviado a un pH neutro en un Intervalo de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Inocular el primer lixiviado neutralizado con una o más bacterias neutrofílicas; y la biolixiviación del metal base del mineral con primer lixiviado Inoculado que contiene una o más bacterias neutrofílicas, formando de este modo un segundo lixiviado que tiene una segunda concentración del metal base. En una realización adicional, el método comprende además Inocular el segundo lixiviado con una o más bacterias acldófllas tolerantes al cloruro, cuando el segundo lixiviado alcanza un pH ácido de 4,5 o menos después de la biolixiviación con una o más bacterias neutrofílicas, y además biolixiviar el metal base del mineral con el segundo lixiviado Inoculado que contiene una o más bacterias acldófllas tolerantes al cloruro al pH ácido. CN104404252 (UNIV CENTRAL SOUTH) divulga un método para la lixiviación bacteriana de minerales de sulfuro mediante agua de mar. Según el método, el pH del agua de mar o una solución diluida de agua de mar se ajusta a 1 ,6-1 ,8 con ácido sulfúrico, luego, se agrega sulfato ferroso para que la concentración de Fe 2+ alcance 3- 5 g/L, un pozo de la solución preparada se agrega a un recipiente de lixiviación de mineral de sulfuro, y una cierta cantidad de soluciones bacterianas se Introducen en el sistema para la lixiviación bacteriana. La eficacia de lixiviación (oxidante) de los minerales de sulfuro se puede mejorar en más de 1 ,7 veces, y el tiempo de oxidación se acorta sustanclalmente. Cuando el agua de mar se toma como medio de cultivo para la lixiviación bacteriana de los minerales de sulfuro, se puede mejorar la actividad bacteriana, el consumo de hierro ferroso en una solución de lixiviación mineral en pequeño, se produce poca lixiviación bacteriana bloqueadora de jarosita y la lixiviación bacteriana del sulfuro los minerales pueden ser fortalecidos eficientemente. El método tiene procedimientos simples y cortos y es conveniente para operar, respetuoso con el medio ambiente, de bajo costo y adecuado para aplicaciones a gran escala. El agua de mar se puede diluir con agua fresca en una proporción máslca de 1 : 1 . La Inoculación de la mena de sulfuro se realiza con acidophilic ferrioxithiobacillus. Hlndawl Publlshlng Corporation, BloMed Research International, Volumen 2014, Articulo ID 909312, http://dx.dol.org/10.1155/2014/909312 Revlew Artlcle

Blotechnologlcal Applications derlved from Mlcroorganlsms of the Atacama desert, Armando Azua-Bustos y Carlos González Silva señala que el desierto de Atacama en su condición de ser el desierto más seco y antiguo del planeta contiene adaptaciones mlcroblológlcas a bajas disponibilidad de agua, alta radiación UV, alta salinidad y otros situaciones de estrés ambiental, siendo la mayoría de sus aplicaciones desconocidas aún, excepto aquellas relacionadas con la biolixiviación de cobre.

Advanced Materials Research ISSN: 1662-8985 Vol 825 pp. 292-295 dol:10.4078/www.sclentlflc.net AMR 835.292 onllne 2013-10-07 Blologlcally asslted copper secondary sulflde ore leachlng ¡n the presence of chloride Carlos Davls Belmar, Dina Cautivo, George Rautenbach y Cecilia Demergasso explican que las operaciones mineras enfrentan el reto de la disponibilidad de agua que es mayor aun cuando los depósitos de minerales se ubican en áreas áridas donde el agua fresca escasea. Además, la calidad del agua afecta el resultado de la biolixiviación. Propone entonces un cultivo mixto resistente a cobre y a cloruro para la lixiviación de sulfuro de cobre secundarlo a diferentes concentraciones de cloruro, obteniéndose buenas tasas de recuperación de cobre - comparables a aquellas que se obtienen usando agua fresca. El método se protege en las patentes

EP2313534/AU2009270677/CN102165079/US8597933/ ZA201009191 , que se refieren a un proceso de biolixiviar cobre con un consorcio que contiene Leptospirillum ferríphilum (número de depósito DSM22399) y microorganismos que oxidan azufre que son halofílicos o halotolerantes

Bloprocess and Blosystems Englneerlng, Julio 2016, Volumen 39, No.7, pp 1081-1104 Optimlzation of staged bioleachlng of low-grade chalcopyrlte ore in the presence and absence of chloride in the irrigating lixiviant: ANFIS simulation All Behrad Vakylabadln et al señala que una mena de bajo grado fue biolixiviada para obtener cobre usando agente lixiviante que contenía cloruro. Se diseñó un medio de cultivo para bacterias con un costo controlado para su aplicación comercial. Se usó el cultivo de bacterias que se aclimató en presencia de cloruro en el lixiviante. La recuperación de cobre fue mejor que en ausencia de cloruro. La composición lixiviante usada fue un medio 9K modificado para optimizar la lixiviación.

Bloresource Technology Volumen 121 , Octubre 2012, Páginas 348-354 Yuguang Wang et al https://doi.Org/10.1016/j.biortech.2012.06.1 14 Enseña el uso de consorcio moderadamente termofílico de Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus caldus y Ferroplasma thermophilum y una bacteria acidofilica halotolerante marina Sulfobacillus sp. TPY para lixiviar calcopirita agregando cloruro de sodio (NaCI), Sulfobacillus sp. TPY fue capaz de tolerar 2% (p/v) NaCI mientras que los otros 3 microorganismos fueron suprimidos con una concentración de NaCI mayor que 0.35%. Entonces bajo cierta concentración de NaCI, la extracción de cobre podría mejorar usando cultivos puros o el consorcio. La biolixiviación a 0.1 % NaCI mostró que Sulfobacillus sp. TPY fue la especie predominante. Journal of Blotechnology Volumen 262, 20 Noviembre 2017, Paginas 56-59 Short genome Communications Complete genome sequence of Acidihalobacter prosperus strain F5, an extremely acidophlllc, ¡ron- and sulfur-oxidizlng halophlle wlth potential industrial applicability in saline water bioleachlng of chalcopyrlte Hlmel N. et al https://doi.Org/10.1016/j.jbiotec.2017.10.001 plantea los retos de biolixiviar minerales de sulfuro de cobre donde el agua escasea o tienen altas concentraciones de ion cloro. Con un aislado puro de Acidihalobacter prosperus strain F5 se caracterizó la capacidad de lixiviar metales desde menas de sulfuro (pirita, calcopirita y pentlandita), Incrementando las concentraciones de ion cloruro. Para entender los mecanismos genéticos de la tolerancia al estrés por alta acidez, salinidad y metales pesados el genoma de la bacteria se secuenció y analizó. La cepa se aisló desde Australia y fue el primer genoma completamente secuenciado. El genoma mostró genes involucrados en la biosíntesis de solutos compatibles y que codifican antiporters monovalentes cation/proton y transporters de metales pesados que explicarían la capacidad para tolerar la alta salinidad, acidez y metales pesados, lo que demuestra su potencial para biolixiviación de minerales con agua salobre.

Journal of Hazardous Materials Volumen 329, 5 Mayo 2017, Paginas 120-130 Bioleachlng of electronlc waste using bacteria isolated from the marine sponge Hymeniacidon heliophila (Porifera) Enrique E. Rozas et al https://doi.Org/10.1016/j.jhazmat.2017.01 .037 describe que la bacteria aislada de las células de la esponja Hymeniacidon heliophila muestran actividad biolixivlante. La cepa más activa, Hyhel-1 , identificada como Bacillus sp., fue seleccionada para pruebas de biolixiviación a temperaturas de 30Ό y 40Ό, mostrando células en forma de barra y crecimiento filamentoso, respectivamente. Lo que demuestra que podría ser usada para recuperar cobre desde descartes electrónicos.

Minerals Engineering Volume 58, Abril 2014, Páginas 39-51 Effect of water quallty on the leaching of a low-grade copper sulflde ore H. R. Watllng et al https://dol.Org/10.1016/j.mineng.2014.01.005 Indica que las extracciones de cobre desde menas de sulfuro de cobre de bajo grado lixiviadas en 3 medios de agua fresca y agua de mar permitió recuperar 84% a pH 1 ,5 con agua de mar en 28 días a 2313. Calcopirita y bornlta fueron ambas oxidas más fácilmente con agua de mar. Las concentraciones de hierro, sodio, potasio y azufre (sulfato) en las soluciones de lixiviación disminuyeron y las cantidades de productos de reacción de Fe (III) ¡nsoluble disminuyeron con el aumento de la salinidad y el pH. La disolución de silicato fue pequeña, las cantidades de fases pobremente cristalinas (ambas hierro (III) y enriquecida en silica) Incrementó con el aumento de salinidad, y fue mayor en un medio con pH 1.5. Lo que sugiere que en una pila de lixiviación, las cantidades Incrementadas de precipitados secundarlos formados si se usa agua salina podrían disminuir la eficiencia de la extracción y los sólidos disueltos totales, densidad y viscosidad aumentarían, Incrementando los costos en energía. Luego, persiste la necesidad de un método para tratar un mineral de que contiene cobre que incluya la etapa de biolixiviar con una solución salina y usando al menos una bacteria tolerante a la sal.

Por ello, la presente Invención usa diferentes organismos extremoacidófilos biolixiviantes ( Acidithiobacillus sp y Acidiphilium sp.) en un consorcio RGM 2493, bien adaptados a condiciones de alta salinidad y cloruros. En cambio, las otras patentes en general, usan microorganismos neutrófilos halotolerantes, con poca adaptación a ambientes industrial minero extremoacidófilos y acondiciones ambientales de lixiviación de sulfuras. En particular, la presente invención ha sido probada 100% con agua de mar y mineral sulfuro primario (calcopirita).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La minería cuprífera es una actividad que genera muchos ingresos económicos, siendo la calcopirita (CuFeS 2 ) el mineral de cobre más abundante en el mundo, cuya disolución es realizada por biolixiviación. Sin embargo, la industria minera enfrenta como problema actual la gran escasez de agua continental especialmente en las zonas áridas donde se desarrolla y como alternativa se ha incorporado el uso de agua de mar, pero su aplicación en los procesos de biolixiviación no se realiza ya que se conoce que el NaCI afecta negativamente el desarrollo de los microorganismos lixiviantes (acidófilos hierro y/o sulfo-oxidantes). La presente Invención resuelve el problema antes mencionado mediante un consorcio microbiano halotolerante para lixiviar CuFeS 2 en solución acida-salina empleando agua de mar. Se aisló el consorcio microbiano y se cultivó en medio para qulmiolltoautótrofos (9K-Fe) y luego se analizó por microscopía confocal y electrónica (STEM). Se determinó la diversidad fllogenétlca mediante PCR-DGGE y secuenclaclón, para finalmente evaluar su tolerancia a NaCI y efectividad en la extracción de cobre (Cu 2+ ) desde calcopirita al 5% (p/v) en medio 9K a base de diferentes concentraciones de agua de mar (25, 50, 75 y 100% v/v), pH 2.0 y a 23 ± 3 S C, durante 50 días. Los resultados indicaron que el consorcio estaba conformado por filotlpos relacionados a especies del genero Acidithiobacillus y Acidiphilium, siendo capaces de crecer en todo el rango de salinidad evaluado, tolerando hasta ~ 30 gL 1 de NaCI presente en el agua de mar y alcanzando una población de 10 7 - 10 8 cel/mL. Finalmente, el consorcio fue capaz de solubilizar CuFeS 2 , recuperando Cu 2+ entre; 23%, 24%, 26% y 31 % conforme disminuyó el agua de mar en la solución; 100%, 75%, 50%, 25% (v/v), respectivamente. El consorcio fue capaz de mantener su actividad lixiviante de CuFeS 2 en condiciones altamente salinas por el uso agua de mar. Así, la presente Invención se refiere a un método para biolixiviar minerales que contienen cobre con una solución salina y usando un consorcio de bacterias tolerantes a la sal - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2493, que comprende A. ferrooxidans y Acidiphilium.

El consorcio - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2493, de A. ferrooxidans y Acidiphilium, tienen la capacidad de: crecer en presencia hierro/azufre y con agua de mar como Insumo hídrlco único para su desarrollo celular; crecer en presencia mineral sulfuro y con agua de mar como Insumo hídrlco único para su desarrollo celular; oxidar Fe 2+ a Fe 3+ y/o Azufre con agua de mar como Insumo hídrlco único para su desarrollo celular; crecer y tolerar el cloruro presente en el agua de mar y crecer, eficientemente; biolixiviar mineral calcopirita en agua de mar y extraer cobre en solución con capacidades de recuperación Cu 2+ de 23-31 %.

BREVE DESCRIPCION DE FIGURAS

Figura 1. Pilas de biolixiviación (Monardes, 2010).

Figura 2. Mecanismos directo e Indirecto de la biolixiviación (Figura modificada, Tao y Dongwel, 2014).

Figura 3. Esquema de mecanismos Indirectos; tlosulfato y poli-sulfuro en la biolixiviación de sulfuras metálicos (Sand, 2001 ). Figura 4. Biolixiviación cooperativa mediada por ambos mecanismos (Ballester, A. (2005). Mecanismo de la biolixiviación. Fundamentos y perspectivas de las tecnologías biomineras. Ediciones universitarias de Valparaíso, 9-24). Figura 5. Esquema del mecanismo de obtención de energía por Acidithiobacillus ferrooxidans (Casas, J. M., Vargas, T., Martínez, J., and Moreno, L. (1998). Bioleaching model of a copper-sulfide ore bed in heap and dump configurations. Metallurgical and materials transactions B, 29(4), 899-909). Figura 6. Localización del área de estudio en el norte de Chile.

Figura 7. Fotografías de los puntos de muéstreos en el campo geotermal El Tatio- Chile. Figura 8. Difractograma de rayos-x de la muestra de mineral utilizado en este estudio. Sulfuro de cobre de alta ley conformado por un 80,18% de calcopirita.

Figura 9. Esquema de la estructura secundaria del ARN ribosomal 16S de bacteria (Pablo Y. y cois., 2001 ).

Figura 10. Esquema de adaptación de consorcio a medio 9K-Fe y pH= 2.0.

Figura 11. Cultivo de consorcio microbiano CGT en medio 9K-Fe. Figura 12. Curva de crecimiento de consorcio CGT, cultivado en medio 9K-Fe, evaluada durante 240 horas. Figura 13. Imagen de microscopia confocal de consorcio microbiano CGT, cultivado en medio 9k-Fe.

Figura 14. Imagen de microscopia electrónica de consorcio CGT, cultivado en medio 9K-Fe.

Figura 15. Cultivos de consorcio CGT en medio 9K-Fe con diferentes concentraciones de agua de mar; E1 , E2, E3 y E4. Figura 16. Crecimiento de CGT en medio de cultivo 9K-Fe con diferentes concentraciones de agua de mar; E1 , E2, E3 y E4.

Figura 17. Productos de amplificación por PCR del gen ARNr 16S para dominio Bacteria.

Figura 18. Patrones de bandas obtenidos por DGGE para el consorcio CGT en diferentes condiciones de salinidad. Las flechas en rojo indican las bandas secuenciadas (1 D, 2C, 3B y 5A). Figura 19. Bandas de los productos re-amplificados por PCR con los oligonucleótidos 344F (sin cola GC) y 907R, a partir de productos purificados desde gel de poliacrilamida (DGGE).

Figura 20. Árbol filogenético basado en las secuencias de ADNr 16S obtenidas a partir del consorcio CGT, utilizando el método de análisis Máximum Likelihood. Figura 21. Densidad poblacional de células libres pertenecientes a consorcio CGT en medio 9K con diferentes concentraciones de agua de mar; B1 , B2, B3 y B4, y un 5% (p/v) de calcopirita. Figura 22. Cambios en el potencial redox durante la biolixiviación de calcopirita por consorcio CGT por un periodo de 50 días.

Figura 23. Evaluación del porcentaje de disolución de cobre en ensayos de biolixiviación y lixiviación con agua de mar.

Figura 24. Procesamiento previo de la calcopirita. Figura 24 A: Mineral Inicial Figura 24B: Mineral pulverizado. El mineral es molido con batan de acero y tamizado (a), para ser adicionado a vaso de molienda (b). Finalmente se realiza el ensamblaje de anillo y disco para pulverizar el mineral (d y e).

Figura 25. Soluciones de PLS obtenidas desde procesos de biolixiviación de calcopirita con agua de mar mediado por consorcio CGT (A, B, C, D y E) y lixiviación de calcopirita con agua de mar correspondientes a controles abióticos (F, G, H, I y J). DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La industria minera desarrolla diferentes tecnologías y procesos para la recuperación de cobre principalmente desde minerales oxidados y sulfurados, los que requieren distintos tratamientos para la obtención del metal. Los minerales oxidados presentan alta solubilidad y son tratados por un proceso hldrometalúrglco conocido como lixiviación, utilizando ácido para la disolución del mineral (Habbache, N., Alane, N., Djerad, S., and Tlfouti, L. (2009). Leachlng of copper oxide wlth different acid Solutions. Chemical Englneerlng Journal, 152(2), 503-508). Mientras que los minerales sulfurados, principalmente calcopirita (CuFeS 2 ), calcosina (Cu 2 S) y covellna (CuS), son explotados mediante técnicas plrometalúrgicas debido a su elevada estabilidad frente a métodos convencionales (Verney, L. R. (1977). Pyrometallurgy. JOM, 29(3), 16-18), presentándose como un proceso poco rentable para el tratamiento de minerales de baja ley (concentración menor a 0,5% de cobre) por los altos costos de producción al ser demandante de energía y agua, además de ser un proceso altamente contaminante al producir S0 2 (COCHILCO, Comisión chilena del cobre. (2009). Biolixiviación : desarrollo actual y sus expectativas. Dirección de estudios y políticas públicas. 8 - 24).

Desde la década de los 40 ' se ha demostrado que entre los procesos comprometidos en la oxidación de minerales sulfurados además de reacciones químicas existen reacciones biológicas que involucran la actividad de microorganismos, abriendo paso a un revolucionario proceso blotecnológlco denominado biolixiviación.

Este proceso blohidro-metalúrgico nace como mejor opción para el tratamiento de sulfuras de baja ley y minerales altamente refractarios como la calcopirita (Watllng, H. R. (2006). The bloleaching of sulphide minerals with emphasls on copper sulphides— a review. Hydrometallurgy, 84(1 ), 81 -108), basándose en la recuperación del metal de interés por solubilización del mineral bajo la acción directa o Indirecta de microorganismos desde, por ejemplo, pilas o botaderos (Figura 1).

Por otra parte, la biolixiviación es el proceso bioquímico correspondiente a la disolución de minerales generalmente sulfuras metálicos para la recuperación de metales en solución acuosa, mediado por el agua, oxígeno atmosférico y bajo la acción directa o Indirecta de microorganismos quimiolitótrofos acldófllos (Colmer, A. R., and Hinkle, M. E. (1947). The role of microorganisms ¡n acld mine dralnage: a prellminary report. Science, 106(2751 ), 253-256). En el último tiempo, los procesos biolixiviantes han ganado importancia para la obtención de metales a partir de minerales de baja ley con los que resulta poco rentable su tratamiento mediante métodos convencionales. A pesar de que la lixiviación microbiana es más lenta que métodos como la pirometalúrgla o lixiviación química, ofrece una serle de ventajas como bajos costos de operación y rendimientos razonables, dado que la biolixiviación en botaderos y pilas no generan una gran Inversión al ser generalmente un producto de desecho del procesamiento de minerales de alta ley. Adicionalmente, se presenta como una tecnología más limpia y amigable con el medio ambiente al no emitir S0 2 en su periodo de operación (Zhang, Y. S., Qin, W. Q., Jun, W. A. N. G., Zhen, S. J., Yang, C. R., Zhang, J. W., and Qiu, G. Z. (2008). Bloleachlng of chalcopyrlte by puré and mlxed culture. Transactions of nonferrous metáis society of China, 18(6), 1491 -1496).

La función de los microorganismos es catalizar la reacción de disolución de minerales sulfurados, la cual se puede esquematizar mediante la siguiente reacción (Rodríguez, Y., (2000). Tesis Doctoral:“Contribución al estudio del mecanismo de biolixiviación de distintos sulfuras metálicos con bacterias mesófilas y termófllas”. Universidad Complutense, Madrid, España), donde MS corresponde al sulfuro metálico:

MS + 20 2

Los microorganismos implicados en este proceso son principalmente bacterias y arqueas, acidófilos, autotróficos capaces de obtener el carbono necesario para su desarrollo del C0 2 atmosférico y energía mediante la oxidación de compuestos inorgánicos de hierro o azufre a partir de compuestos reducidos de minerales (Ehrllch, H. L. (2001 ). Past, present and futura of biohydrometallurgy. Hydrometallurgy, 59(2), 127-134)Específ¡camente tienen un rol catalítico en la oxidación del ion Fe 2+ y azufre elemental, producidos durante la lixiviación química a ion Fe 3+ e ion S0 4 2 , respectivamente (Ecuaciones 2 y 3).

2. 2S + 30 2 + 2H 2 0 ® 2H 2 S0 4 (EC. 3) Los fundamentos de la lixiviación por microorganismos, se explican mediante los siguientes dos tipos de mecanismos (Rodríguez, Y., (2000). Tesis Doctoral: “Contribución al estudio del mecanismo de biolixiviación de distintos sulfuras metálicos con bacterias mesófllas y termófllas”. Universidad Complutense, Madrid, España; Tñbustsch, 2001 ):

Mecanismo de acción directa: lixiviación por contacto mediada por la acción directa de microorganismos. Las reacciones químicas son catalizadas enzlmátlcamente suponiendo que la mayoría de las células se encuentran adheridas a la superficie del mineral mediante sustancias pollméñcas extracelulares (EPS), generando la disolución producto de los procesos bioquímicos que tienen lugar en el espacio de contacto entre la pared del microorganismo y la superficie del mineral (Figura 2).

Mecanismo de acción Indirecta: lixiviación Indirecta que generaría la disolución del mineral mediante reacciones químicas enzlmátlcas o no enzlmátlcas, no habiendo contacto físico entre los microorganismos y la superficie del mineral, formándose reactivos químicos durante el proceso que jugarían un rol catalítico en la disolución del mineral (Figura 2). La biolixiviación de sulfuras metálicos mediante este mecanismo tendría lugar producto de la acción del ¡ón Fe 3+ y/o protones en solución, donde el rol principal de los microorganismos es regenerar constantemente los agentes oxidantes y concentrarlos en la ¡nterface mlneral/soluclón/bacterla acelerando así la tasa de disolución del mineral. Sand W. (2001 ), propone dos vías de mecanismo Indirecto dependiendo del tipo de mineral, basándose en los productos intermediarios formados durante el proceso (Figura 3). Di-sulfuros como la pirita (FeS 2 ), son degradados por acción del Ion Fe 3+ que actúa como agente oxidante generando la producción de tlosulfato. Seguida-mente el tiosulfato es degradado hasta la formación de sulfato, con producción de azufre elemental como producto secundarlo. Los sulfuros como la calcopirita (CuFeS 2 ) son degradados por ataque de iones Fe 3+ y protones, como Intermediarlos de reacción se forman poli-sulfuros y azufre elemental. Siendo la cinética del proceso altamente dependiente de la concentración de iones Fe 3+ . Un tercer supuesto es la presencia simultánea de ambos mecanismos; indirecto y directo (Figura 4), lo que podría convertirse en un suministro óptimo de energía química a partir de una superficie limitada de sulfuros, favoreciendo la supervivencia de los microorganismos (Ballester, A. (2005). Mecanismo de la biolixivlación. Fundamentos y perspectivas de las tecnologías biomlneras. Ediciones universitarias de Valparaíso, 9-24). Los microorganismos adheridos serían los responsables de liberar especies químicas oxidables, siendo el recurso energético de los microorganismos en solución (Trlbutsch, H. (2001 ). Dlrect versus indirect bioleachlng. Hydrometallurgy, 59(2), 177-185). Por otra parte, la calcopirita es uno de los minerales sulfurados de cobre más abundantes alcanzando un 70% de las reservas de cobre en el mundo. A diferencia de otros sulfuros de cobre, la calcopirita es conocida por ser uno de los minerales más refractarlos a los procesos hldrometalúrglcos. Se han propuesto diferentes causas para este fenómeno, principalmente debido a; mayor estabilidad dada por su configuración estructural, alta energía de activación y la formación de capas de pasivación evitando la libre difusión de iones hacia y desde la superficie del mineral (Mateos, F. B., Pérez, I. P., and Mora, F. C. (1987). The passivation of chalcopyrlte subjected to ferric sulfate leachlng and its reactivation wlth metal sulfides. Hydrometallurgy, 19(2), 159-167; Wang, 2005; Watling, H. R. (2006). The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides— a review. Hydrometallurgy, 84(1 ), 81 -108; Zeng, W. et al. (2010). Community structure and dynamics of the free and attached microorganisms during moderately thermophilic bioleaching of chalcopyrite concéntrate. Bioresource technology, 101 (18), 7068-7075).

Continuos esfuerzos para acelerar la disolución de calcopirita ha llevado a utilizar bacterias para catalizar el proceso, obteniéndose bajas cinéticas y una pobre tasa de disolución del mineral cuando se utilizan cultivos puros o microorganismos mesófilos, por lo que la elección de los microorganismos es crucial para mejorar el rendimiento del proceso dependiendo de las condiciones en las que este se desarrolla, observándose mejores cinéticas y tasa de disolución del mineral cuando se utilizan cultivos mixtos, debido a que la actividad oxidante de hierro y azufre de un consorcio es crucial para la degradación eficaz de la calcopirita (Akcil, A., Ciftci, H., and Deveci, H. (2007). Role and contrlbution of puré and mlxed cultures of mesophlles in bioleaching of a pyrltic chalcopyrite concéntrate. Mlnerals Englneerlng, 20(3), 310- 318). Adicionalmente, se suele requerir un agente oxidante, tal como el ión Fe 3+ para romper el enlace metal-sulfuro en la estructura del mineral (Ec. 3) y obtener mejores resultados (Hlroyoshl, N., Mlkl, H., Hlrajima, T., and Tsunekawa, M. (2000). A model for ferrous-promoted chalcopyrite leachlng. Hydrometallurgy, 57(1 ), 31 -38).

CuFeS 2 + 4Fe 3+ 5Fe 2+ + Cu 2+ + 2S° (Ec. 4)

La lixiviación de calcopirita por microorganismos mesófilos resulta ser poco eficiente debido a las características fisicoquímicas del mineral (Zhou, H. B., Zeng, W. M., Yang, Z. F., Xle, Y. J., and Qiu, G. Z. (2009). Bioleaching of chalcopyrite concéntrate by a moderately thermophlllc culture in a stirred tank reactor. Bioresource Technology, 100(2), 515-520), siendo los microorganismos termoacidófilos la mejor opción para incrementar la velocidad de disolución de cobre y mejorar así el rendimiento del proceso (Norris, P.R., Burton, N.P., Clark, D.A., (2013). Mineral sulflde concéntrate leaching in high temperature bloreactors. Miner. Eng. 48, 10-19). Sin embargo, el uso de microorganismos termófllos conlleva a un mayor gasto de producción al elevar la temperatura del sistema. Por lo tanto, la optimización y el mejoramiento de cinéticas en la lixiviación de calcopirita mediada por microorganismos mesófllos se ha convertido en objetivo de estudio para la blominería.

Entre los factores que influyen en el proceso de biolixiviación es posible Indicar que la mayoría de los microorganismos qulmiolltoautótrofos oxidantes de hierro y azufre responsables del proceso de biolixiviación son acldófllos, que crecen u oxidan las fuentes de energía en un rango de pH de 1.5 a 3.0, donde la mayoría de los Iones metálicos permanecen en solución (Bosecker, K., (1997). Bioleaching: metal solubilization by microorganisms. FEMS Microblology Reviews 20, 591 - 604; Dorado y cois., 2012). La actividad microblológlca se ve Influenciada por las condiciones ambientales a la que estén expuestos, por lo que es de suma Importancia mantener bajo control los factores biológicos y flslcoquímicos que puedan afectar su actividad con el fin de asegurar los requisitos óptimos de funcionamiento. Entre los factores e ¡nsumos más destacados se encuentran; potencial redox (Eh), pH, C0 2 , 0 2 , concentración de nutrientes, temperatura, concentración de Iones metálicos, granulometría del mineral y la calidad del agua suministrada (Das y cois., 1999;

Acevedo, F. (2000). The use of reactors ¡n blomining processes. Electronic Journal of Biotechnology, 3(3): 10-11 ; Rossl, G. (2001 ). The deslgn of bloreactors. Hydrometallurgy, 59(2): 217-231 ; Gómez, J., and Cantero, D. (2005). Biooxldaclón del ión ferroso. Fundamentos y Perspectivas de las Tecnologías Biomineras. p, 2543; Pradhan, N., Nathsarma, K. C., Rao, K. S., Sukla, L. B., and Mishra, B. K. (2008). Heap bioleaching of chalcopyrite: a review. Minerals Engineering, 21 (5): 355-365; Valencia y Acevedo, F., Gentlna, J.C. (2005). Biolixiviación de minerales de cobre. Fundamentos y perspectivas de las tecnologías biomlneras. Ediciones universitarias de Valparaíso, 45-61 ).

El proceso de biolixiviación es dependiente de la velocidad con que se lixivia el metal de Interés desde el mineral, siendo la velocidad de lixiviación del mineral el resultado de la cinética de fenómenos fisicoquímlcos y mlcrobiológicos que interaccionan íntimamente. De modo que, los factores fisicoquímlcos controlables más importantes son el pH y potencial redox, los cuales entregan Información de las etapas que se están desarrollando durante el proceso de biolixiviación, convirtiéndose además en Indicadores de la actividad micro- biológica.

Diversos estudios han demostrado que la biolixiviación de minerales sulfurados ocurre favorablemente a pH menor a 2.5, donde se encuentra una alta concentración de protones (H + ), la cual genera la disolución de la fracción del mineral que es soluble en ácido. En este sentido, el tipo de mineral y su composición tiene un rol primordial en la determinación del pH en operaciones de biolixiviación, donde la variación de pH del sistema se definirá por los componentes que consumen y producen ácido (Plumb, J. J., Muddle, R., and Franzmann, P. D. (2008). Effect of pH on rates of ¡ron and sulfur oxidation by bioleachlng organlsms. Mlnerals Englneerlng, 21 (1 ), 76-82). De esta manera, se registrará un aumento de pH cuando se consume ácido debido al ataque protónico del mineral y por el contrario, la disminución del pH en la solución se verá influenciado por los acidófilos capaces de oxidar compuestos Intermediarlos de azufre en H 2 S0 4 (Rodríguez y cois., 2003; Zhou, Q. G., Bo, F., Bo, Z. H , XI, L, Jlan, G., Fei, L. F., and Hua, C. X. (2007). Isolation of a strain of Acidithiobacillus caldus and ¡ts role in bioleachlng of chalcopyrlte. World Journal of Mlcrobiology and Blotechnology, 23(9), 1217-1225; Vera, M., Schlppers, A., and Sand, W. (2013). Progress in bioleachlng: fundamentáis and mechanlsms of bacterial metal sulfide oxidation— part A. Applied mlcrobiology and biotechnology, 97(17), 7529-7541 ). Es crucial mantener el pH en un óptimo para la eficiencia del proceso, ya que a valores de pH por debajo de 1.75, el metabolismo de los microorganismos es lento o retardado y a valores de pH por sobre 2.0 se produce la precipitación de hierro como jarosita (Pogliani, C., and Donati, E. (2000). Immobilisation of Thiobacillus ferrooxidans : importance of jarosite precipitation. Process Blochemlstry, 35(9), 997-1004). La precipitación de jarosita genera un recubrimiento de la superficie de los minerales formando una barrera física para la difusión de iones, retardando o Inhibiendo en gran medida la disolución de los metales, viéndose afectada la actividad mlcrobiológica por el bajo intercambio iónico, ya que se dificulta la obtención de iones como fuente de energía.

La difusión de iones férricos está estrechamente relacionado al potencial redox, el cual condiciona tanto la cinética de disolución del mineral como la actividad microbiana. Se ha observado que la disolución de los sulfuros de cobre alcanza mayores velocidades una vez que el Eh de la solución supera los 450 mV, donde cuya disolución está controlada por la velocidad de oxidación del ion Fe 2+ como rol principal de los microorganismos, permitiendo la regeneración constante de los iones Fe 3+ , que son los oxidantes más importante en la lixiviación de sulfuros metálicos. Así, estos microorganismos controlan el potencial redox del proceso ya que se determina principalmente por la relación Fe 3+ / Fe 2+ en soluciones de lixiviación. Sin embargo, a pesar de la acción positiva de los microorganismos en la regeneración de Fe 3+ , un aumento en la concentración de ese ion favorecerá su precipitación como jarosita (Córdoba, E. M., Muñoz, J. A., Blázquez, M. L., González, F., and Ballester, A. (2008). Leachlng of chalcopyrlte wlth ferric ion. Part IV: The role of redox potential in the presence of mesophlllc and thermophlllc bacteria. Hydrometallurgy, 93(3), 106-1 15). Por lo tanto, el potencial redox al igual que el pH, deben ser controlados en un óptimo para obtener una alta eficiencia en la cinética de lixiviación química y biológica de sulfuras de cobre como la calcopirita (Donatl, E. R., and Sand, W. (Eds.). (2007). Microbial Processing of metal sulfldes. Sprlnger Science & Business Media. Pág. 39 - 40; Zhao, H., Wang, J., Yang, C., Hu, M., Gan, X., Tao, L, and Qlu, G. (2015). Effect of redox potential on bloleachlng of chalcopyrlte by moderately thermophlllc bacteria: an emphasls on solutlon composltlons. Hydrometallurgy, 151 , 141 -150).

En cuanto a los microorganismos presentes en los procesos de biolixiviación es posible Indicar que la población microbiana con capacidad lixiviante (ver tabla 1 , Antón, 2012) es diversa, encontrándose un gran número de microorganismos que coexisten en ambientes ácidos (pilas de lixiviación, drenajes ácidos de minas, campos geotermales, entre otros.). Estos son habitados generalmente por microorganismos mesófllos y termófllos, Incluyendo; bacterias, arqueas y heterótrofos capaces de obtener materia orgánica para su crecimiento a partir de la liberada por bacterias qulmlolltoautótrofas (Norris, P. (2007). Acldophlle dlverslty ¡n mineral sulflde oxldatlon. In: RAWLINGS, D. and JOHNSON, B. eds. Blomlnlng. Berlín, Sprlnger.199-216). Uno de los primeros microorganismos conocidos fue Thiobacillus thiooxidans , acldófllo aislado en 1922 por Waksman y Joffe, que es capaz de obtener energía por la rápida oxidación de azufre elemental y compuestos de azufre parcialmente reducidos, lo que a su vez genera H 2 S0 4 , acidificando aún más el pH del medio y conduciendo a la disolución más rápida del mineral. Sin embargo, uno de los microorganismos más estudiados e Importantes en blomlnería es Acidithiobacillus ferrooxidans del género Acidithiobacilli; bacteria gram negativa, quimilitoautótrofa, mesóflla, aislada por primera vez desde las aguas de una mina de carbón en 1947 (Colmer y Hinkle., 1947). A. ferrooxidans es capaz de oxidar sulfuras metálicos a sulfatos solubles en soluciones ácldas y obtener energía mediante la oxidación de Iones Fe 2+ (Figura 5), siendo el primer microorganismo hierro y sulfo-oxldante estudiado a profundidad, conocido anteriormente como Thiobacillus ferrooxidans (Kelly y Wood, 2000). Son bastantes los microorganismos acidófilos reportados a la fecha capaces de oxidar sulfuros y acelerar la disolución de minerales, siendo Acidithibacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans las bacterias más estudiadas y encontradas en los procesos de biolixiviación (Qlu, M. Q., Xlong, S. Y., Zhang, W. M., and Wang, G. X. (2005). A comparlson of bloleachlng of chalcopyrlte uslng puré culture or a mlxed culture. Mlnerals Englneerlng, 18(9), 987-990; Akcll, A., Clftcl, H., and Devecl, H. (2007). Role and contrlbutlon of puré and mlxed cultures of mesophlles ¡n bloleachlng of a pyrltlc chalcopyrlte concéntrate. Mlnerals Englneerlng, 20(3), 310-318).

Luego, el agua es un Insumo crítico en la Industria minera. La disposición de los yacimientos mineros en Chile se localiza principalmente en el sector norte del país, donde la disponibilidad del recurso hídrlco (aguas continentales; superficiales y subterráneas) es escasa, por ser una de las zonas más desérticas del mundo. Su uso es Indispensable para llevar a cabo los procesos hldrometalúrglcos así como la biolixiviación, ya que las reacciones químicas y biológicas se llevan a cabo en solución acuosa, convirtiéndose en un Insumo estratégico para la Industria minera del cobre tanto por su consumo en los procesos productivos como por la situación de escasez hídrica que enfrenta el país.

Para el año 2014 un estudio sobre el uso de agua en la Industria minera Indicó un consumo de 12,7 m 3 /s, aumentando un 1 ,9% en relación al año 2013, demostrando la alta demanda del recurso por la Industria. La mayor parte del consumo fue destinado en un 70% del total de agua consumida solo a tratamientos de sulfuros metálicos para la producción de cobre (COCHILCO, Comisión chilena del cobre. (2015). Proyección del consumo de agua en la minería del cobre al 2026. Dirección de estudios y políticas públicas). Por lo tanto, su uso y manejo se ha poslclonado como prioridad para continuar con la actividad minera, conduciendo a la búsqueda y optimización de nuevas fuentes de agua para llevar a cabo los procesos, así como la Introducción de mejores tecnologías como lo es la biolixiviación.

En particular el agua de mar en la Industria minera H 2 0 (M) a diferencia de aguas continentales es una solución líquida más compleja, en la que se encuentran disueltos una gran variedad de compuestos sólidos de fuente orgánica e Inorgánica y gases atmosféricos (Hernandéz, 2013). En los compuestos sólidos, la sal es uno de sus principales componentes (Tabla 1 ), siendo la más representativa NaCI (~30gl_ 1 ), proporcionando al mar sus características especiales de salinidad desempeñando un papel muy Importante en los equilibrios flslcoquímlcos y en los fenómenos bioquímicos del medio marino (Broecker, W. S. (1971 ). A kinetic model for the Chemical composltlon of sea water. Quaternary Research, 1 (2), 188-207).

Tabla 1. Principales componentes del H 2 0 (M) en g/kg de solución (Mlllero, F. J. (2013). Chemical oceanography. CRC press. 66 - 67 pp; Mlllero, F. J. et al. (2006).

Dlssoclatlon constants of carbonlc acld ¡n seawater as a functlon of sallnlty and temperature. Marine Chemlstry, 100 (1 -2), 80 - 94; Mlllero, F.J. (2006). Chemical Oceanography, 3rd ed., CRC Press, Boca Ratón, FL, 496 pp).

Iones - Compuestos Químicos g/kg de solución

CI 19.35271

Na + 10.78145

Mg 2+ 1 .28372

Ca 2+ 0.41208

K + 0.3991

Sr 2+ 0.00795 só? v 2.71235

HCO 3 " 0.10481

BG 0.06728

co 3 2 - 0.02434

B(OH) 4 · 0.01944

r 0.0013

OH 0.00014

B(OH) 3 0.01944

C0 2 0.00042

La dificultad hídrica de los últimos tiempos producto de la escasez y alta demanda de agua en la industria minera, ha llevado a varias empresas a utilizar H 2 0 (M) en sus procesos productivos para asegurar el acceso al recurso hídrlco. En la II región de Chile empresas mineras como; Mlchllla, Centinela, Las cenizas Taltal, Mantos de luna y Sierra Gorda, utilizan H 2 0 (M) en sus procesos productivos mediante sistemas de impulsión, siendo utilizada directamente (salada) o previamente desalineada (COCHILCO, Comisión chilena del cobre. (2014). Consumo de agua en la minería del cobre al año 2014. Dirección de estudios y políticas públicas. 5 - 8). Por lo que, su uso ha presentado un aumento en el último tiempo, registrándose para el año 2015 un alza del 33% en comparación al año anterior (COCHILCO, Comisión chilena del cobre. (2015). Proyección del consumo de agua en la minería del cobre al 2026. Dirección de estudios y políticas públicas). Por otra parte, el uso de H 2 0 (M) en la lixiviación de sulfuros metálicos ha mostrado tener un efecto positivo en la extracción de cobre, debido a la presencia de altas concentraciones de NaCI, donde los iones CI jugarían un rol catalítico en el proceso al Incrementar la cinética de disolución del mineral (Hernández, 2013), fenómeno que ha sido estrechamente relacionado a la alta electronegativldad del ión cloruro (Yoo, K., Kim, S. K., Lee, J. C., Ito, M., Tsunekawa, M., and Hiroyoshi , N. (2010). Effect of chloride ¡ons on leaching rate of chalcopyrite. Minerals Engineering, 23: 471 -477). Los efectos de los Iones cloruro en lixiviación se han Investigado durante bastante tiempo, principalmente por los efectos positivos sobre la disolución de minerales altamente refractarlos como la calcopirita (Watllng, H. R. (2014). Chalcopyrite hydrometallurgy at atmospherlc pressure: 2. Revlew of acldlc chloride process optlons. Hydrometallurgy, 146, 96-1 10). Chalcopyrite hydrometallurgy at atmospherlc pressure: 2. Revlew of acldlc chloride process optlons. Hydrometallurgy, 146, 96-1 10). Se ha observado que los Iones cloruro generan un Incremento de porosidad en la superficie del mineral promoviendo la formación de una capa de azufre más porosa (Lu y cois., 2000;

Klnnunen, P. H. M., and Puhakka, J. A. (2004). Chlorlde-promoted leaching of chalcopyrite concéntrate by blologlcally-produced ferric sulfate. Journal of Chemical Technology and Blotechnology, 79(8), 830-834; Llang y cois., 2012), favoreciendo de esta manera su rápida disolución. Adlclonalmente, Dutrlzac, J. E. (1981 ). The dissolution of chalcopyrite ¡n ferric sulfate and ferric chloride media. Metallurglcal

Transactlons B, 12(2): 371 -378) demostró que la energía de activación para la disolución de calcopirita en presencia de CI ' es mucho más baja que en soluciones que contenían sulfato, de 42 kj/mol y 75 kj/mol, respectivamente. Por otra parte, en sistemas clorurados se produce la formación de complejos de cobre con CI ' (CuCI y CuCI 2 ), donde el cloruro cúprico actuaría como oxidante mejorando la lixiviación de calcopirita, sin embargo, requlrléndose altas concentraciones de CI " en el sistema para evitar la precipitación de los complejos, mejorando así la solubilidad de estos (Wlnand, R. (1991 ). Chloride hydrometallurgy. Hydrometallurgy, 27(3), 285-316; Lundstrom, M., Aromaa, J., Forsen, O. , Hyvarlnen, O., and Barker, M.H. (2005). Leaching of chalcopyrite ¡n cuprlc chloride solutlon. Hydrometallurgy 77 (1-2), 89; Al-Harahsheh, M., Klngman, S., and Al-Harahsheh, A. (2008). Ferric chloride leaching of chalcopyrite: synergetlc effect of CuCI2. Hydrometallurgy, 91 (1 ), 89-97). De manera que, el uso de soluciones lixiviantes con cloruro ha sido potencialmente más atractiva que soluciones lixiviantes alternativas.

El uso de H 2 0 ( M ) en minera no está orientado a todos los procesos, ya que para la biolixiviación se ha limitado su uso por los efectos negativos del NaCI sobre los microorganismos involucrados en el proceso. Ante este antecedente se han realizado bastantes intentos para lograr la adaptación de microorganismos lixiviantes a concentra- ciones de NaCI similares a las del agua de mar, con el fin de desarrollar y optimizar procesos de biolixiviación de sulfuros metálicos con la posible utilización de H 2 0 ( M ) a nivel industrial (Veloso, T. C., Peixoto, J. J., Pereira, M. S., and Leao, V. A.

(2016). Kinetics of chalcopyrite leaching in either ferric sulphate or cupric sulphate media in the presence of NaCI. International Journal of Mineral Processing, 148, 147- 154). Actualmente existen patentes desarrolladas por empresas mineras proponiendo diversos métodos de biolixiviación en presencia de cloruro y el uso de microorganismos halotolerantes (Dew Du Plessis, 2002, Nicol, M. J., Rautenbach, G. F., and Van Buuren, C. (2012). A chloride method for bioleaching. Patent). El método de USNo.5.278.069 se enfocaría en el uso de soluciones a base de H 2 0 (M) , sin embargo, dirigido a la biolixiviación de cenizas de carbón. Por lo que a la fecha no se ha registrado un sistema de biolixiviación en el cual se utilice H 2 0 (M) para el procesamiento de sulfuros metálicos utilizando un consorcio de microorganismos acidófilos halotolerantes y/o con capacidad halófila. Respecto a los efectos de NaCI en microorganismos lixiviantes, es posible indicar que la presencia de NaCI en el agua empleada para los procesos mineros puede deberse al uso de aguas salobres, a una baja calidad del agua conteniendo ciertas concentraciones de iones cloruro que pueden provenir de la disolución de ganga o recirculación de agua, y/o introducir intencionalmente NaCI para favorecer la tasa de disolución del mineral (Dopson M, et al. (2008). Silicate mineral dissolution during heap bloleaching. Biotechnol Bioeng 99:811-820). A diferencia de los efectos positivos de los Iones cloruro en la lixiviación química, en biolixiviación disminuye la eficacia del proceso debido a que la actividad mlcrobiológica se ve afectada, dando lugar a la inactivación y/o muerte de los microorganismos implicados en el proceso (Akcil, A., Gahan, C., Erust., and Tuncuk. (2013). Influence of chloride on the chemolithotrophlc acidophlles in biohydrometallurgy: a revlew. Industrial and Envlronmental Blotechnology, Studium Press, New Delhl, 45-69).

Los efectos de altas concentraciones de NaCI sobre microorganismos no adaptados a salinidad, genera estrés osmótico ya que las membranas de los microorganismos son permeables al agua, por lo tanto, pierden agua hacia el medio que las rodea por una mayor concentración de solutos extracelulares (Brown, A. D. (1990). Microbial water stress physiology. Principies and perspectives. Jhon Wlley and Sons, Ltd., Chlchester, Unlten Klngdom). Por otra parte, la presencia de iones Cl en la solución Inhibe el crecimiento microbiano afectando drásticamente la actividad metabólica. En este sentido, los iones Cl generan la destrucción de las capas más externas de las células, ingresando a través de la membrana citoplasmática provocando que el potencial de membrana (DY) se disipe. Seguidamente, se produce la entrada de protones al citoplasma que conduce a la alteración de la homeostasis y el pH ¡ntracelular (Slonczewskl JL, Fujisawa M, Dopson M and Krulwlch TA, (2009). . Adv Mlcrob

Physiol. 55:1-317). Finalmente, la acumulación de aniones en el citoplasma en respuesta a DY positivos, conlleva a la acidificación desnaturalizante del citoplasma y posterior muerte celular (Alexander y cois., 1987; Simmons, S., and Norris, P. (2002). Acidophlles of saline water at thermal vents of Vulcano, Italy. Extremophlles, 6(3), 201 - 207). Ante estos antecedentes, la mayoría de los microorganismos halófilos y halotolerantes han desarrollado estrategias para sobrellevar el estrés osmótico y mantener su actividad metabóllca. Se conocen dos tipos de estrategias; estrategia“salt-ln”, donde las células mantienen altas concentraciones ¡ntracelulares de sal equivalente a la concentración externa y estrategia “soluto-compatible” que les permite a los microorganismos sintetizar o tomar del medio extracelular moléculas como; aminoácidos, péptldos, pollalcoholes, entre otros., que no afectan la función metabóllca y son acumuladas en el Interior celular para evitar la desecación producto de la salida de agua desde su Interior, manteniendo su citoplasma ¡so-osmótlco con respecto al exterior celular (Santos, H., and Da Costa, M. S. 2002. Compatible solutes of organlsms that Uve ¡n hot sallne envlronments. Envlronmental Mlcroblology, 4(9), 501 -509).

Actualmente, se han reportado varios microorganismos hierro y sulfo - oxidantes capaces de mantener su actividad en presencia de NaCI. Sin embargo, resultando en una decreciente tasa de oxidación de Fe 2+ y disminución de la población microbiana, debido al estrés osmótico y a la toxicidad de los Iones CI ' , afectando de esta manera la actividad metabóllca principalmente de microorganismos hierro-oxidantes mesófllos (Harahuc, L, Llzama, H. M., and Suzuki, I. (2000). Selectlve inhibition of the oxldatlon of ferrous ¡ron or sulfur ¡n Thiobacillus ferrooxidans. Applied and envlronmental mlcroblology, 66(3): 1031 -1037; Shlers, D.W., Blight, K.R. and Ralph D.E. (2005). Sodlum sulphate and sodlum chloride effects on batch culture of ¡ron oxidising bacteria. Hydrometallurgy, 75 - 82; Devecl, H., Jordán, M.A., Powell, N., Alp, I. (2008). Effect of sallnlty and acldlty on bloleachlng actlvlty of mesophlllc and extremely thermophlllc bacteria. 2007, Transactlons of Nonferrous Metals Soclety of China 18, 714-721 ; Gahan, J. Sundkvlst, and A. Sandstrom. (2009). A study on the toxlc effects of chloride on the blooxldatlon efflclency of pyrlte. Journal of Hazardous Materials. Vol. 172: 1273- 1281 ; Zamrnlt, 2009). Por ejemplo, Acidithiobacillus ferrooxidans una de las bacterias más representativas en biominería, al estar expuesta a NaCI es capaz de sintetizar prolina y betaína como solutos osmo-protectores, tolerando así el estrés osmótico (Kleft, T.L. and Spence, S.D., (1988). Osmoregulation ¡n Thlobacillus ferrooxidans: stimulation of iron oxidation by proline and betaine under salt stress. Curr. Mlcrobiol. 17, 255-258). Esta bacteria es capaz de adaptarse a 3.5 gL '1 de NaCI, oxidando todo el Fe 2+ y mostrando una máxima de densidad celular (10 7 cel/mL) pero al estar expuesta a concentraciones igual o mayor a 7 gL '1 se Inhibe completamente su actividad y crecimiento (Zammlt, C.M., Mangold, S., Jonna, Vr., Mutch, L.A., Watling, H.R., Dopson, M. and Watkln, E.L. (2012). Bloleachlng ¡n bracklsh waters-effect of chloride ions on the acidophlle population and proteomes of model species. Appl. Mlcrobiol. Blotechnol, 93(1 ): 319-329). Lo que podría significar no ser una cepa apta para biolixiviación de minerales en soluciones con elevadas concentraciones de NaCI por su limitada tolerancia. La búsqueda de microorganismos lixiviantes con mayor tolerancia a NaCI ha llevado a encontrar especies con la capacidad de mantener su actividad metabólica en concentraciones de NaCI por sobre las del agua de mar; Thiobacillus prosperus, Thiobacillus halophilus y Acidianus brierleyi (Tabla 2). En 1989 Huber y Stetter, señalaron a la bacteria halotolerante Thiobacillus prosperus como uno de los acidófilos que presenta mayor tolerancia a las altas concentraciones de NaCI, presentando genes involucrados en la síntesis de los solutos compatibles; ectoína, sucralosa y betaína, permitiendo de esta manera reducir el estrés osmótico (Ossandon et. al. (2014). Draft genome sequence of the iron-oxidizing , acidophlllc, and halotolerant “Thiobacillus prosperus” type strain DSM 5130. Genome Announc :2(5)). Además, posee una actividad metabólica similar a A. ferrooxidans, altamente eficiente en la oxidación de Fe 2+ , presentándose como candidato potencial para la biolixiviación de minerales en presencia de NaCI por sobre las de agua de mar. Tabla 2. Concentración límite de tolerancia de microorganismos lixiviantes a NaCI.

La presente invención propone un consorcio de microorganismos hierro-oxidante halotolerante aislado número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2493 que lixivia calcopirita en condiciones de salinidad al utilizar agua de mar. Dicho consorcio microbiano halotolerante es capaz de crecer en medio de cultivo para quimiolitotróficos con Fe +2 como fuente de energía y ser eficaz en la biolixiviación de mineral calcopirita con H 2 0 ( M ) como Insumo hídrico.

La presente Invención propone un método para cultivar dichos microorganismos hierro-oxidantes y adaptar consorcio a medios de cultivo 9k-Fe con diferentes concentraciones % (v/v) de H 2 0 (M) , caracterizando e identificando los microorganismos pertenecientes al consorcio mediante técnicas microbiológicas y moleculares. También, la presente invención propone un proceso de biolixiviación de calcopirita en solución áclda-sallna con diferentes concentraciones de H 2 0 (M) ; 25, 50, 75, 100% (v/v), monitoreando el crecimiento del consorcio durante el proceso de biolixiviación, determinar los parámetros fisicoquímlcos; pH y potencial redox y determinar el porcentaje de disolución de cobre final en los ensayos de biolixiviación.

Ejemplo 1 : Obtención de consorcio microbiano hierro-oxidante

El Tatio se ubica en el complejo volcánico de los Andes central del Desierto de Atacama, en el borde noroeste de la Región de Antofagasta, aproximadamente 100 km al Este de la ciudad de Calama, a una altitud de 4.300 msnm. Es un campo geotermal complejo, que permite el desarrollo de comunidades microbianas tales como bacterias y arqueas, las que habitan bajo condiciones ambientales únicas y extremas, Incluyendo un variado rango de temperatura, intensa radiación ultravioleta, presencia de metales, metaloides y altas concentraciones de sales, siendo la principal NaCI (130 Mm de Na + y 160 Mm Cl ; Phoenlx y cois., 2006; Alsina, 2013).

Las muestras fueron recolectadas desde diferentes puntos del complejo (Figura 7A, 7B, 7C y 7D), donde se midió pH (rango; 6.0 - 7.9) y la temperatura (rango; 12 -

60 S C), mediante un pHmetro portátil Hl 9126 Hanna. En cada punto de muestreo se obtuvo sedimento empleando espátulas esterilizadas y las muestras fueron depositadas en tubos eppendorf de 50 mL estériles. El cultivo de microorganismos hierro-oxidantes y ensayos de oxidación de FeS0 4 en medio de cultivo a base de agua de mar comprendió que las muestras obtenidas del campo geotermal fueran mezcladas para generar una única muestra, la que fue cultivada utilizando un medio de enriquecimiento para quimiolitótrofos, con la adición de sales básales y el uso del Ion Fe 2+ como fuente de energía en un ambiente aeróblco, sin agitación y a temperatura ambiente (20 - 26 C C). Los microorganismos fueron cultivados en medio 9K-Fe, formulado por; 0.04 g- L 1 K 2 HP0 4 , 0.4 g- L 1 MgS0 4 y 0.1 g- L 1 NH 4 S0 4 , 33.3 gL 1 de FeS0 4 - 7H 2 0, con la disminución gradual del pH hasta la adaptación de los microorganismos a pH 2.0 (acidificado con H 2 S0 4 al 98%). Las curvas de crecimiento se realizaron por recuento celular en cámaras

Neubauer, utilizando microscopio óptico de luz LEICA CME.

El H 2 0 ( M ) utilizada en la preparación de los medios de cultivo para los ensayos de oxidación de Ion Fe 2+ y cinética microbiana, fue obtenida desde diferentes puntos del sector costero Sur de Antofagasta y se filtró a 0.2 pm (milipore) mediante un sistema de filtración al vacío BUCHI v-700, con el fin de eliminar contaminantes, Impurezas, compuestos orgánicos y microorganismos (> 0.2 pm). Finalmente, fue autoclavada a 120 S C a 1 atm durante 30 minutos. Se determinó el comportamiento del consorcio en medio 9k - Fe a pH 2.0, preparado con diferentes % (v/v) de H 2 0 (M) obteniendo cultivos con distinta salinidad (Tabla 3). Las pruebas se realizaron en matraces de 100 mL, con un volumen de trabajo de 40 mL y la adición de un 10% (v/v) de Inoculo.

Como control positivo se utilizó la cepa Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 y los controles negativos se realizaron para cada ensayo sin la adición del Inoculo microbiano (controles ablótlcos). Los ensayos fueron realizados a temperatura ambiente, sin agitación y se monltorearon durante 15 días. Para evaluar el crecimiento del consorcio en cada ensayo, se realizó vlsuallzaclón microscópica (Microscopio óptico binocular de campo claro LEICA CME) y recuento celular en cámara de Neubauer (BOECO) cada 24 horas. Cada ensayo fue realizado por triplicado.

Tabla 3. Condiciones experimentales para el cultivo de microorganismos en medio de cultivo 9K-Fe a base de agua de mar.

Condición experimental Designación

CGT en medio 9K - Fe. pH 2.0 É (C)

CGT en medio 9K - Fe con 25 %(v/v) H 2 0 (M) , pH 2.0 E1

CGT en medio 9K - Fe con 50%(v/v) H 2 0 (M) , pH 2.0 E2

CGT en medio 9K - Fe con 75 %(v/v) H 2 0 (M) , pH 2.0 E3

CGT en medio 9K - Fe con 100%(v/v) H 2 0 (M) , pH 2.0 E4

CGT: Consorcio Campo Geotermal Tatio, RGM 2493.

Para el cultivo de los microorganismos, el primer paso fue la de adaptación de la muestra que se realizó en medios de cultivo para quimiolitoautótrofos acidófilos con adición de FeS0 4 como fuente de energía a pH 4.0, por un periodo de 30 días. Se finalizó una vez que los microorganismos Fe - S oxidantes lograron adaptarse a las condiciones de cultivo y se observó la oxidación de hierro por viraje de color del medio (Figura 11 -A). El segundo paso de adaptación consistió en disminuir el pH del medio de cultivo a 2.0 y se terminó transcurridos 15 días cuando se alcanzó una población de 10 7 cel/mL y la oxidación de hierro (Figura 11 -B). Finalmente, se realizó un último cultivo con un inoculo del 10% (v/v) a pH 2.0 y como criterio de término se consideró la oxidación del FeS0 4 y el crecimiento poblacional de los microorganismos (Figura 1 1- C y 12). Se designó al consorcio obtenido como CGT y se utilizó la cepa Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 como control positivo (Figura 11 -D). Así, las muestras obtenidas desde el campo geotermal Geiser del Tatlo ubicado en el Desierto de Atacama, zona rica en NaCI (Galada, N. (2012). Metagenomlc analysls and characterlzatlon of mlcroblal dlverslty from hydrothermal samples of El Tatlo geyser field, Chile (Doctoral dlssertatlon, Unlverslty of the Western Cape)), con un contenido de cloruro > 5000 ppm en sus suelos y manantiales (Lahsen, A., and Trujlllo, P. (1975). El Tatlo geothermal field. In Proc. of the Second United Natlons Symposlum on the Development and Use of Geothermal Resources, pp. 157-178; Glggenbach, W. F. (1978). The ¡sotoplc composltlon of waters from the El Tatlo geothermal field, Northern Chile. Geochlmlca et Cosmochlmlca Acta, 42(7), 979-988), se logró obtener un consorcio bacteriano capaz de crecer y lixiviar calcopirita en solución áclda con concentraciones crecientes de H 2 0 (M) (%v/v), condiciones de salinidad en las que se relacionó cualquier efecto sobre los experimentos realizados a la presencia de NaCI por ser una de las sales más representativas que componen al H 2 0 (M) (30 gL '1 ). A partir de las muestras provenientes del campo geotermal Tatlo se logró obtener un consorcio de microorganismos oxidantes de hierro y posiblemente de azufre, que al pasar por diferentes pasos de adaptación según se describió antes, fueron capaces de adaptarse a las condiciones finales de cultivo; medio 9k-Fe, pH 2 a temperatura ambiente en un rango registrado de 20 o - 2613. La o xldaclón de Iones Fe 2+ a Fe 3+ fue observada por el cambio físico del medio de cultivo, que presentó virajes de color a tonalidades café - rojizo, representativo de la presencia de Iones Fe 3+ (Mannlng, H. L. (1975). New médium for ¡solatlng iron-oxidizing and heterotrophlc acldophlllc bacteria from acld mine dralnage. Applied mlcroblology, 30(6), 1010-1016). La oxidación de los Iones Fe 2+ (Figura 11 ) fue atribuido a la acción microbiana, ya que este fenómeno no fue registrado en los controles ablótlcos correspondientes. Los resultados de la cinética microbiana (Figura 12), muestra una fase exponencial alcanzando una población de 10 8 cel/mL. Ejemplo 2: Caracterización microscópica de microorganismos cultivados

Para la vlsuallzaclón microscópica de los microorganismos (microscopía óptica y confocal) las células fueron recolectadas del cultivo (ver ejemplo 1 ) y lavadas con agua estéril dos veces, se adicionó en el porta objeto 5mI de muestra y se dejó secar a temperatura ambiente para luego ser fijadas en metanol durante 20 minutos (Flnegold, S. M., Martin, W. J., and Lorenzo, I. (1983). Balley-Scott diagnóstico mlcroblológlco. Editorial Médica Panamericana). Para observar las muestras mediante un microscopio óptico (Lelca CME), se realizaron preparados en fresco y en seco coloreados con tinción diferencial gram (previa fijación con metanol) siguiendo protocolo de tinción.

A las muestras previamente fijadas en metanol, en condiciones de oscuridad se les adiciono colorante naranja de acrldlna (0,5 pg/mL) en suficiente cantidad para cubrir toda la muestra (5 - 10 pL). Luego de 20 minutos se lavó con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Seguidamente, se adicionó sobre la muestra de 3 - 4 gotas de medio de montaje Dako, sellando con el cubre objeto. Finalmente, la muestra fue observada en un microscopio confocal CS SP8 Invertido (Lelca), con una unidad de alimentación compacta de láser de Argón y una longitud de onda alrededor de 488 nm. Todas las muestras se observaron usando el objetivo 63X humectado en aceite de Inmersión.

Las células fueron recolectadas del cultivo y lavadas con agua estéril dos veces, se fijaron con glutaraldehído al 4% (v/v) y tampón de cacodllato de sodio 0,1 M a pH 7,2 por 24 horas a 4 S C. Posteriormente las células fueron transferidas a solución de azlda de sodio al 5% (v/v) en tampón cacodllato 0,1 M a pH 7,2. Luego las muestras se lavaron 3 veces con agua deslonlzada por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos para posteriormente ser filtradas con malla de nylon de 100 pM y colocadas sobre rejillas de cobre cubiertas con una membrana de formar y una capa delgada de carbono, se eliminó el exceso de solución por transferencia con papel de filtro y se tiñeron con acetato de uranilo al 5% (v/v) en metanol al 70% (v/v) por 30 segundos a temperatura ambiente. Finalmente, la morfología de las células bacterianas fue examinada por STEM (Scannlng Transmlssion Electron Mlcroscope, SU 3500 Hitachi, Tokio, Japón).

Mediante microscopía confocal y electrónica (STEM) se estimó el tamaño y se visualizó el tipo de morfología de los microorganismos representantes del consorcio (Figura 13 y 14). En la Tabla 6 se resumen los resultados obtenidos para la morfología y coloración Gram de los microorganismos pertenecientes al consorcio CGT.

Tabla 6. Caracterización microscópica de consorcio CGT.

Cultivo Morfología Coloración Gram Endoesporas

Consorcio CGT

Cocobacilos

cultivado en medio Gram-negativos No se observan

Bacilos

9K-Fe pH 2.0

En la caracterización microscópica se obtuvo una visión general del consorcio CGT mediante microscopía confocal, permitiendo dilucidar la morfología y estimar el tamaño de los microorganismos (Figura 13). La observación por microscopía electrónica (STEM), reveló la presencia de morfologías tipo cocobacilo y bacilos, encontradas de forma aislada o en diplobacilos, con tamaños variables y no se observó formación de endosporas (Figura 14). Por coloración Gram se determinó que el consorcio CGT está compuesto por microorganismos gram-negativos (Tabla 4), lo que concuerda con reportes donde se describen a los microorganismos gram-negativos como los más frecuentes en campos geotermales (Garrlty, G. M., Bell, J.A. and Lllburn, T.G. (2004). Taxonomlc outline of the prokaryotes Bergey’s Manual of Systematic Bacteñology. Segunda edición. Ed. Srlnger. New York. U.S.A). Ejemplo 3: Extracción de ADN genómico total

Para la colección y pre-tratam lento de células para extracción de ADN, se obtuvieron 200 mi de cada cultivo (ver ejemplo 2) para ser centrifugado a 1000 rpm durante 5 mln., con el objetivo de precipitar sales. Se recuperó el sobrenadante y las células fueron colectadas por centrifugación a 10.000 rpm durante 15 mln. El pellet celular fue lavado una vez con agua áclda (agua bldestllada con H 2 S0 4 98% a pH 2, filtrada y autoclavada.) y dos veces con un 1 mi de solución amortiguadora fosfato pH 8 (Fernández, 2005). El pellet celular obtenido desde cultivos fue Incubado a 55 S C con Protelnasa K (USBIologlcal) durante 20 minutos según Zamrnlt y cois. (2009), con el objetivo de hacer más eficiente la extracción de ADN. La extracción de ADN fue realizada mediante el kit comercial Power Solí DNA Isolatlon Kit (Moblo), según las Instrucciones del fabricante. El ADN obtenido fue resuspendldo en 60 pl de agua estéril libre de nucleasas. Para verificar la extracción del ADN genómico y el estado de este, se cargaron 7 pl en gel de agarosa al 1 %, se realizó corrida electroforétlca y finalmente fue visualizado en trans-llumlnador de luz UV (Vllber Lourmat ECX - F20.M). Se realizó la cuantlflcaclón del ADN obtenido mediante Nanodrop (Thermo). Ejemplo 4: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen ARNr 16S y electroforesis en gel de agarosa.

El ADN extraído según el ejemplo 3, fue utilizado como templado para amplificar mediante PCR las reglones V3, V4 y V5 del gen ARNr 16S del dominio Bacteria y Arquea (Figura 9). Los ollgonucleótldos utilizados fueron; 341 -GC F/907R y Ar344- GCF/Ar915R, para dominio Bacteria y Arquea respectivamente (Tabla 5), originando un ampllcón de aproximadamente 560 nucleótldos (Yong Wang., Pel-Yuan Qlan. (2009). Conservatlve Fragments ¡n Bacterial 16S rRNA Genes and Primer Deslgn for 16S Rlbosomal DNA Ampllcons ¡n Metagenomlc Studles. PLoS ONE 4, 10). Los oligonucleótidos 341 y Ar344 contenían aproximadamente 40 nucleótidos adicionales, secuencias ricas en GC (GC clamp) unidas al extremo 5’, permitiendo una mayor estabilidad al evitar la completa desnaturalización del ADN durante la migración de los fragmentos a través del gel de pollacrilamida con gradiente denaturante (Muyzer G., Waal E. and Ultlerlinden A. (1993). Profiling of Complex Microbial Populatlons by Denaturing Gradlent Gel Electrophoresls Analysls of Polymerase Chain Reaction- Ampllfled Genes Coding for 16S rRNA. Applied and envlronmental mlcrobiology. Vol. 59, 695-700). El programa de PCR para el dominio Bacteria incluyó una desnaturalización Inicial a 9413 por 5 mln., seguid o de 20 ciclos de touchdown (disminución gradual de la temperatura de hibridación) de desnaturalización a 9413 por 1 mln., alineamiento a 6513 (con la temperatura disminuyendo 0.513 cada ciclo) por 0:45 mln. y extensión a 7213 por 3 mln. Luego 1 5 ciclos de desnaturalización a 9413 por 1 mln., alineamiento a 5513 por 1 mln., un a extensión a 7213 por 3 mln., y una extensión final a 7213 por 7 mln. Para el domln ¡o Arquea el programa incluyó una desnaturalización Inicial a 9513 por 5 mln., seguid o por 35 ciclos de desnaturalización a 9513 por 1 mln., hibridación a 6513 por 0:30 mln. , y extensión a 7213 por 1 mln., luego una extensión a 7213 por 5 mln. Finalmente, I os productos de amplificación y un marcador de peso molecular de 1500pb (CS Cleaver) fueron cargados en un gel de agarosa 1 ,7% (CS Cleaver) y visualizados en el transilumlnador de luz UV.

Tabla 5. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las regiones V3, V4 y V5 del gen ARNr 16S, para los dominios Arquea y Bacteria.

Reactivos y soluciones para preparación de PCR

El volumen para cada reacción fue de 50 mI_ en presencia de 1X del tampón GoTaq Green Master Mlx, 10mM de cada ollgonucleótldo reverso y directo (Tabla 5) y 2 mI_ templado

(< 250 ng).

GoTaq Green Master Mlx Promega

Ollgonucleótldos Bacteria (341 -GC, 907, 341 ) Macrogen

Ollgonucleótldos Arquea (344-GC, 915) Macrogen

Ejemplo 5: Evaluación de la comunidad microbiana en estudio mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE).

El análisis de DGGE se realizó de acuerdo a Muyzer y cois., 1995, con productos de PCR del gen ARNr 16S de bacteria originado con los ollgonucleótldos 341 -GC F y 907R, ver ejemplo 4. Los productos de PCR fueron colocados en geles de pollacrllamlda al 6%, conteniendo un gradiente desnaturalizante de 30-60% para dominio bacteria, donde la solución 100% desnaturalizante fue definida como 7M urea y 40% de formamlda (Gene - x press). La corrida del DGGE se realizó en el sistema CS Cleaver VS20WAVE DGGE a 6013, 100V, durante 7 ho ras. Los geles fueron teñidos con GeIRed (Blotlum) durante 45 minutos y visualizados bajo luz UV en el trans-llumlnador. Las bandas de Interés se cortaron cuidadosamente y los fragmentos de gel fueron dispuestos en tubos eppendorf 1 ,5 mL, con 20 mI de agua libre de nucleasas para purificar los fragmentos de ADN mediante el kit comercial Poly-Gel DNA Extraction Kit (OMEGA). Se re-amplificaron las secuencias utilizando el mismo set de oligonucleótidos 341/907 pero sin cola GC. Los productos de PCR fueron purificados con kit de purificación QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) siguiendo instrucciones del manual. Finalmente, los productos generados fueron visualizados en un gel de agarosa al 1 ,7% en el trans-iluminador de luz UV y enviados a secuenciar.

Es importante indicar que para lograr la adaptación de microorganismos a calcopirita, los microorganismos fueron adaptados a concentraciones crecientes de calcopirita, en medio 9K-Fe con adición de diferentes concentraciones de H 2 0 (M) (25%, 50% 75% y 100% (v/v)) a pH 2.0 (Silverman, M. and Lundgren, D. (1959). Studies on the chemolithotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans. An improved médium and a harvesting procedure for securing high cell yields. J. Bacteriol.77: 642-647; Nieto P., 2009), con reemplazo sucesivo de FeS0 4 por concentrado de mineral, hasta la adaptación a una pulpa del 5% (p/v), sin adición externa de sulfato ferroso. La primera etapa consistió en la adaptación inicial del consorcio a un concentrado de 1% (p/v) de mineral y 10% (v/v) de FeS0 4 , el segundo subcultivo se realizó con 2 % (p/v) de mineral y un 7,5 % (v/v) de FeS0 4 , el tercer subcultivo con un 3% (p/v) de mineral y 5%(v/v) de FeS0 4 , el cuarto subcultivo con 4% (p/v) de mineral y 2,5% (v/v) de FeS0 4 , el quinto subcultivo fue constituido con 5% (p/v) de mineral y 2,5% (v/v) de FeS0 4 . El sexto y último ensayo de biolixiviación se realizó con 5% (p/v) de mineral y se inoculo sin adición externa de FeS0 4 . El medio 9K fue acidificado a pH 2.0 con H 2 S0 4 al 98%; esta solución fue esterilizada en autoclave a 12013 y 1 atm durante 30 minutos. La solución de FeS0 4 se acidificó a pH 2.0 con ácido sulfúrico y fue filtrado a 0,2 pm (membrana milipore). Los medios con adición de pulpa fueron inoculados con 10% (v/v) y una población de 10 8 células/mL, la cual se determinó por recuento en cámara de Newbauer. Una vez que los cultivos presentaban una dinámica determinada, caracterizada por potenciales redox ~ 500 mV, pH ~ 2.0, y era constante, se tomaba una muestra que correspondería al inoculo del siguiente medio con adición de una concentración mayor de mineral y disminución del sulfato ferroso (Osplna, J.D. et al. (2012). Biooxldaclón de concentrados de arsenoplrita por Acidithiobacullus ferrooxldans en erlenmeyer agitados. Revista Colombiana de Biotecnología, 14: 135-145). Las condiciones experimentales fueron las mismas para los controles ablótlcos correspondientes.

Para la biolixivación de calcopirita y con el fin de evaluar la eficiencia del consorcio microbiano en estudio para lixiviar mineral en presencia de NaCI por la adición de H 2 0 ( M), se realizaron ensayos con un 5% (p/v) de pulpa de calcopirita de alta ley, sin adicionar FeS0 4 , obligando a los microorganismos a obtener el sustrato a partir del mineral. Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 500 mL, con un volumen de trabajo de 200 mL y se adicionó un Inoculo de células correspondiente a un 10% (v/v), con una población celular de 1 x10 7 cel./mL. Todas las condiciones experimentales se muestran en la Tabla 4, donde los controles negativos se realizaron para cada ensayo en las mismas condiciones, pero sin la adición de inoculo microbiano (controles de lixiviación). Durante el periodo de evaluación del bioproceso, se monltorearon cada 96 horas los parámetros fisicoquímlcos; potencial redox (Hl 9126 Hanna) y pH (Hl 9126 Hanna). Por vlsualización microscópica se realizó el recuento de los microorganismos libres (células planctónicas) mediante cámara de Neubauer. El proceso de biolixiviación fue monltoreado por un periodo de 50 días.

Tabla 4. Condiciones experimentales para ensayos de biolixiviación y lixiviación (controles abióticos) de calcopirita en H 2 0 (M) .

Condición experimental Designación

CGT en medio 9K y 5% (p/p) de calcopirita. B (C)

CGT en medio 9K con 25% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita. B1 CGT en medio 9K con 50% (v/v) H 2 Ó (M) y 5% (r/r) de calcopirita. B2

CGT en medio 9K con 75% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita. B3

CGT en medio 9K con 100%(v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita. B4

Medio 9K y 5% (p/p) de calcopirita L (C)

Medio 9K con 25% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita L1

Medio 9K con 50% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita L2

Medio 9K con 75% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita L3

Medio 9K con 100% (v/v) H 2 0 (M) y 5% (p/p) de calcopirita L4

CGT = Consorcio en estudio (Campo Geotermal Tatloj, RGM 2493

B (C) = control biolixiviación L (C) = Control lixiviación.

Para la determinación de cobre en ensayos de biolixiviación por espectroscopia de absorción atómica en llama (F-AAS), se procedió a determinar el grado de recuperación de cobre al finalizar el proceso se utilizó un F-AAS GBC 933 plus, como gas de combustión se empleó una mezcla de aire-acetileno y una lámpara de cátodo hueco de Cu. La absorbancla de las muestras se leyó directamente a una longitud de onda de 324,7. A partir de un patrón certificado de 1000 mgL 1 de cobre (CuCI 2 en H 2 0) Titrisol®, se realizaron curvas de calibración de 1 .0, 2.0, 3.0, y 4.0 mgL 1 por adición de estándar múltiple. Para cada curva analítica, un blanco fue preparado conteniendo todos los componentes de las soluciones estándar excepto el analito de interés. Para la determinación de cobre en solución en los ensayos, se tomaron 5 mL de solución y se filtraron a 0,2 pm (milipore) para evitar el paso de partículas de mineral. Las mediciones se realizaron de acuerdo al manual del equipo.

Es importante mencionar que para la evaluación de la tolerancia a salinidad en medios de cultivo con adición de agua de mar, el consorcio obtenido designado arbitrariamente como CGT (número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2493) fue inoculado en medios de cultivos 9K -Fe con adición de diferentes % (v/v) de H 2 0 (M) , con el fin de visualizar la actividad oxidativa (viraje de color) y el crecimiento poblacional del consorcio en condiciones de salinidad por el alto contenido de NaCI en el H 2 0 ( M ) . El viraje de color de los medios de cultivo a rojo ladrillo indicativo de la oxidación de Fe 2+ comenzó a observarse en los ensayos; E(C), E1 y E2, luego de 2 - 3 días de cultivo. Para los ensayos; E3 y E4, se observó el viraje de color del medio a naranjo luego de 5 - 6 días de cultivo (Figura 15). El viraje de color en los controles abióticos correspondientes a cada ensayo, no se observó en todo el periodo de monltoreo.

Los resultados del crecimiento poblacional de los microorganismos que conforman el consorcio CGT, en medio 9K con FeS0 4 y la adición de H 2 0 (M) , se presentan en la Figura 16. La máxima densidad poblacional se observó a los 6 días de cultivo para los ensayos E (C) y E1 , luego de 8 días para el ensayo E2, para los ensayos; E3 y E4, luego de 10 - 11 días de cultivo. En los controles abióticos correspondientes para cada ensayo no se observó oxidación del medio en todo el periodo de monltoreo.

También es importante mencionar que para la identificación molecular de consorcio CGT, se realizó:

La amplificación del gen ARNr 16S de los microorganismos del consorcio CGT, esta comprendió la amplificación de las regiones V3, V4 y V5 del gen ARNr 16S mediante PCR utilizando los oligonucleótidos 341 -GC/907 para el dominio Bacteria y Ar344GC/Ar915 para el dominio Arquea, dio como resultado un producto de 560 pares de bases soló para el dominio Bacteria en todos los ADN aislados a partir de los microorganismos pertenecientes al consorcio CGT (Figura 17). No se observó amplificación de la región para el dominio Arquea (datos no mostrados). Mientras en la evaluación de la comunidad microbiana mediante electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE), con la finalidad de identificar los microorganismos del consorcio y ver el posible cambio en la comunidad a mayor salinidad por el uso de H 2 0 ( M ) . Se realizó un gel de poliacrllamlda con gradiente denaturante 30 - 60% para el dominio Bacteria. La Figura 18 muestra el patrón de bandas detectadas en cada condición de cultivo. El patrón obtenido tiende a ser similar en cada una de las condiciones estudiadas, Identificándose 4 bandas con diferente migración en los carriles 1 , 2 y 3. Sin embargo, en las condiciones E3 y E4 se detectaron un menor número de bandas; 3 y 2 bandas respectivamente.

Las bandas señaladas en la Figura 18 fueron purificadas y re-amplificadas con los ollgonucleótldos 341 (sin cola GC) y 907R (Figura 19), a partir de productos purificados desde el gel de pollacrilamida (DGGE). Los productos de ADN re amplificados posteriormente fueron secuenclados.

Reactivos y soluciones para preparación de DGGE

Preparación de gradiente denaturante 30% - 60% para dominio Bacteria en un Gel dal 6%:

Solución denaturante 30% para 100mL: 15mL de 40% ABA, 2mL TAE, 12 mL de formamida, 12,6 g de urea, adicionar agua destilada filtrada (0.2 milipore) hasta un volumen de 100 mL.

Solución denaturante 60% para 100mL: 15 mL de 40% ABA, 2 mL TAE, 24 mL de formamida, 25,2 g de urea, adicionar agua destilada filtrada (0.2 milipore) hasta un volumen de 100 mL.

Acrilamida/Bis-acrilamida (ABA) Winkler

Buffer; Tris, ácido acético, EDTA (TAE) Winkler

Formamida Amresco Urea Amresco

Agua destilada Winkler

Persulfato de amonio (APS) Blo - Rad

TEMED Bio - Rad

Ejemplo 6: Análisis bioinformático y filogenético.

Los productos purificados desde el gel DGGE (ver ejemplo 5) fueron procesados y secuenclados en un secuenclador ABI PRISM 3500 xl Applied Biosystems en la Pontificia Universidad Católica de Chile. Las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas fueron editadas con el programa Chromas Pro versión 2 1 .2, para posteriormente ser comparadas con las secuencias disponibles en la base de datos genbank utilizando la herramienta de alineación básica de búsqueda local BLAST (Altschul, S.F., Gish, W., Mlller, W., Myers, E.W. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Blology 215(3), 403-410). Las secuencias fueron alineadas utilizando la herramienta ClustalW del software MEGA 7, para posteriormente Inferir la afiliación fllogenética mediante el método estadístico Máximum Llkelihood basado en el modelo de tiempo general reversible (GTR) y test de robustez Bootstrap para 500 réplicas (Kumar S. y cois., 2016), el análisis incluyó a 30 secuencias de nucleótidos. El análisis de las secuencias de ARNr 16S y la comparación con la base de datos del National Center of Blotechnology Information (NCBI) a través de la herramienta BLAST (Tabla 5), permitieron la identificación de las secuencias obtenidas a partir del análisis de DGGE. La comparación en la base de datos de las secuencias reveló un alto grado de similitud con géneros pertenecientes al grupo filogenético Proteobacterla; Acidiphilium y Acidithiobacillus. Los filotipos; 1 D, 2C y 3B presentaron un 99%, 95% y 98% de similitud con diferentes cepas para el género Acidiphilium. El fllotipo 5A tuvo un 99% de similitud con Acidithiobacillus ferrooxidans DX-m (Tabla 7). Se construyó un árbol fllogenétlco con las secuencias de las bacterias pertenecientes al consorcio CGT y secuencias similares obtenidas desde la base de datos. Se utilizó la secuencia de la arquea Sulfolobus metallicus como raíz de grupo y todas las secuencias fueron afiliadas al filo Proteobacteria (Figura 20).

Tabla 7. Similitud de secuencias de ARNr 16S con entradas Genbank para bacterias (búsqueda en BLASTN).

Microorganismo N°de

Muestra Identidad Cobertura E-Value homólogo Acceso

1 D

(SEQ Acidiphilium sp. cepa

99% 90% KX689776.1 0.0

ID MPLK-613

No.:1)

2C

Acidiphilium sp. cepa

(SEQ ID 95% 86% KX689782.1 0.0

MPLK-613

No.:2)

3B

Acidiphilium sp. cepa

(SEQ ID 98% 88% KX689775.1 0.0

CCD-20-3

No.3)

5A Acidithiobacillus

(SEQ ID ferrooxidans cepa DX- 99% 92% KX694508.1 0.0

No.4) m

Se determinó la tolerancia a salinidad del consorcio CGT al ser expuesto a medios de cultivo 9K-Fe elaborados con concentraciones crecientes de H 2 0 (M) ; E1 , E2, E3 y E4 (Tabla 3). El consorcio CGT fue capaz de crecer en todo el rango de salinidad evaluado, alcanzando una población de 10 7 - 10 8 cel/mL y la oxidación de Fe 2+ visualizado por el viraje de color del medio a rojo ladrillo (Figura 15 y 16). Para la cinética de crecimiento microbiana evaluada a mayor salinidad; E2, E3 y E4, se observó un aumento en la fase lag representando un periodo de transición para los microorganismos al ser transferidos a una nueva condición (aumento de salinidad), además se registró una disminución gradual en el crecimiento y un retraso en la visuallzaclón de oxidación del medio en comparación a los demás ensayos. Las mejores condiciones de crecimiento para el consorcio CGT fueron registradas en los ensayos E(C) y E1. Sin embargo, el consorcio CGT fue capaz de adaptarse a todas las concentraciones de H 2 0 (M) expuestas, ya que no se observó una completa inhibición en el crecimiento celular producto de la presencia de NaCI, lo que permite designarlo como un consorcio halotolerante (Antón, J. (2011 ). Halotolerance. In Encyclopedla of Astroblology (pp. 727-727). Springer Berlín Heldelberg).

La capacidad del consorcio CGT de adaptarse a concentraciones crecientes de NaCI aportado por el H 2 0 (M) , podría deberse principalmente a la zona de origen de los microorganismos. En el campo geotermal Tatlo la evaporación de aguas callentes de los geiseres resulta en altas concentraciones de solutos disueltos, en su mayoría NaCI, generando aguas super-saturadas en sal. Las aguas ricas en NaCI al ebulllr y ser expulsadas por los gélseres permiten la formación de; manantiales, fumarolas, pozas de barro y áreas de slnterizaclón, donde es posible encontrar una gran diversidad de microorganismos halotolerantes (Jones, B., Renaut, R. W., and Rosen, M. R. (1997). Biogenicity of silica precipitation around geysers and hot-spring vents, North Island, New Zealand. Journal of Sedlmentary Research, 67(1 ); Ncebakazi, 2012).

Los amplicones obtenidos para el dominio bacteria, pertenecientes al consorcio CGT (Figura 17), se analizaron mediante DGGE con la finalidad de Identificar las bacterias que conforman el consorcio. El perfil obtenido consistió en un patrón de bandas en donde cada banda fue considerada como una unidad taxonómica operativa (OTUs) correspondiente a bacterias representantes y predominantes en el cultivo (Lindstróm, E. S., and Leskinen, E. (2002). Do neighboring lakes share common taxa of bacterioplankton. Comparison of 16S rDNA fingerprints and sequences from three geographic regions. Microbial Ecology, 44(1 ), 1 -9). En la Figura 18, el perfil obtenido Indicó un bajo número de OTUs (4 bandas) para el consorcio CGT cultivado en medio de enriquecimiento 9K-Fe (E(C)), resultado que podría no ser representativo de toda la población presente debido principalmente al límite de detección de la técnica, siendo entre 1 a 2% de las especies totales que conforman la comunidad, es decir, sólo las especies dominantes como se ha indicado por MacNaughton, S. J., Stephen, J. R., Venosa, A. D., Davls, G. A., Chang, Y. J., and Whlte, D. C. (1999). Microbial population changes durlng bioremediation of an experimental oil spill. Applied and envlronmental mlcrobiology, 65(8), 3566-3574. El análisis del cambio en la comunidad del consorcio CGT en condiciones crecientes de salinidad por la adición de H 2 0 (M) al medio, se basó en la comparación de los perfiles obtenidos para cada condición con el patrón de bandas registrado ¡nlcialmente (E(C)). El patrón de bandas fue el mismo para los cultivos; E (C), E1 y E2, para los ensayos E3 y E4, el patrón cambio, detectándose un menor número de OTUs Indicativo de un cambio en la comunidad, que podría deberse a un aumento de la concentración de H 2 0 (M) y por consiguiente de NaCI, como se puede observar en la Figura 18, el consorcio CGT en las condiciones E3 y E4 sólo presenta 3 y 2 OTUs respectivamente. De acuerdo a los resultados obtenidos en la comparación de las secuencias en la base de datos genbank, todas las secuencias analizadas presentaron una similitud igual o mayor al 95% con especies bacterianas pertenecientes al género Acidithiobacillus y Acidiphilium (Tabla 7), las cuales fueron registradas en todos los perfiles obtenidos para el consorcio en condiciones crecientes de salinidad (Figura 18).

Las señales; 1 D, 2C y 3B migraron de manera distintiva en el gel Indicativo de secuencias que difieren en un par de bases (Muyzer, G., and Smalla, K. (1998). Application of denatuñng gradlent gel electrophoresls (DGGE) and temperature gradlent gel electrophoresls (TGGE) ¡n mlcroblal ecology. Antonle van Leeuwenhoek, 73(1 ), 127-141 ). Sin embargo, fueron homologas a especies del genero Acidiphilium, siendo posible que se tratase de diferentes cepas o bien un mismo microorganismo podría haber generado más de una señal en el perfil como consecuencia de la existencia de múltiples coplas del gen ARNr 16S, las que presentan diferencias en sus secuencias (Gelsomlno y cois., 1999; Nleml y cois., 2001 ).

El fllotlpo CGT 5A ha mostrado tener una similitud del 99% con la bacteria A. ferrooxidans (Tabla 7), siendo una de las más significativas del genero

Acidithiobacillus, la cual ha sido ampliamente estudiada por ser unos de los microorganismos más representativos en los procesos mineros, tratándose de una alpha - proteobacteña, gram negativa, acldóflla, quimiolitotrófica, que utiliza energía derivada de la oxidación de Fe 2+ y que presenta alta sensibilidad a NaCI (Rohwerdert y cois., 2003; Gonzales y cois., 2003; Quatrini, R., Appla-Ayme, C., Denls, Y., Jedllckl, E., Holmes, D. S., and Bonnefoy, V. (2009). Extendlng the models for ¡ron and sulfur oxldatlon ¡n the extreme acldophlle Acidithiobacillus ferrooxidans. BMC genomlcs, 10(1 ), 394). Por otro lado, especies del genero Acidiphilium, corresponden a bacterias gram negativas, autotróflco facultativo, que tienen la capacidad de utilizar una variedad de sustratos orgánicos (desechos metabóllcos celulares, células muertas, aminoácidos, azucares simples, entre otros) y reducir Fe 3+ , cualidades que les permite jugar un rol primordial en procesos de biolixiviación (Rawllngs, D. E., and Silver, S. (1995). Mining wlth mlcrobes. Nature Blotechnology, 13(8), 773-778; Brierley, J.A. (2000). “Wadsworth award lecture: Expanding role of mlcroblology in metallurglcal processes”. Mining Engineering 52: 49-53; Zhu, J. Y., Zhang, J. X., Qian, L. I., Tao, H. A. N., Hu, Y. H., Liu, X. D., and Qiu, G. Z. (2014). Bioleaching of heavy metáis from contaminated alkaline sediment by auto-and heterotrophic bacteria in stirred tank reactor. Transactions of Nonferrous Metals Society of China, 24(9), 2969-2975). En cuanto a la morfología de estas bacterias, corresponden a bacilos y bacilos cortos para A. ferrooxidans (Ehrllch, H. L, Newman, D. K., and Kappler, A. (Eds.). (2015). Ehrllch’s Geomlcroblology. CRC press. pp 355) y especies del genero Acidiphilium (Kusel y cois., 1999; Garrlty, G., Staley, J. T., Boone, D. R., De Vos, P., Goodfellow, M., Ralney, F. A., and Schlelfer, K. H. (2006). Bergey's Manual® of Systematlc Bacterlology: Volume Two: The Proteobacterla. D. J. Brenner, and N. R. Krleg (Eds.). Sprlnger Science and Business Media) respectivamente, lo que concuerda con las morfologías observadas mediante microscopía electrónica (Figura 14). Estos microorganismos son comúnmente encontrados en ambientes ácidos (pH ~ 1.5 - 5) (Kusel y cois., 1999; Baker-Austln, C., and Dutrízac, M. (2007). Life ¡n acld: pH homeostasls ¡n acldophlles. Trends ¡n mlcroblology, 15(4), 165-171 ; Okamura, K., Kawal, A., Wakao, N., Yamada, T., and Hlralshl, A. (2015). Acidiphilium ¡watense sp. nov., ¡solated from an acld mine dralnage treatment plant, and emendatlon of the genus Acidiphilium. International journal of systematlc and evolutlonary mlcroblology, 65(1 ), 42-48), su presencia en la zona de muestreo no ha sido reportada en otras Investigaciones. Sin embargo, estudios realizados por Parro y cols.( Parro, V., et al. (2011 ). A mlcroblal oasis ¡n the hypersallne Atacama subsurface dlscovered by a Ufe detector chip: ¡mpllcatlons for the search for Ufe on Mars. Astroblology, 11 (10), 969- 996) en una zona hlper-sallna del Desierto de Atacama cercano al Salar Grande, han

Indicado la presencia de estas bacterias y otros acldófllos (A. ferrooxidans, A. caldus, Acidiphilium spp, Acidimicrobium ferrooxidans y Acidobacterium capsulatum). El hallazgo de fllotlpos relacionados a bacterias acldófllas oxidantes y reductoras de hierro en la zona de estudio, podría deberse a la naturaleza que presentan los suelos del Desierto de Atacama, en particular el campo geotermal Tatlo, conteniendo ácidos fuertes en partículas debido a la presencia de gélseres (Qulnn, R.C., Zent, A.P., Grunthaner, F.J., Ehrenfreund, P., Taylor, C.L., and Garry, J.R.C. (2005). Detectlon and characterlzatlon of oxidizing aclds ¡n the Atacama Desert uslng the Mars Oxldatlon Instrument. Planet Space Sel 53:1376-1388). Donde se produce la acumulación de agua subterránea y posteriormente una condensación completa, lo que conlleva a que el vapor escape a la superficie conduciendo a la formación de posas calentadas por vapor tipo ácido-sulfato (Glggenbach, 1978), dando lugar a micro-nichos para la supervivencia de microorganismos acldófllos oxidantes y reductores de Fe ó S (Lu y cois., 2010; Demergasso, C., Dorador, C., Meneses, D., Blamey, J. , Cabrol, N., Escudero, L , and Chong, G. (2010). Prokaryotlc dlverslty pattern ¡n hlgh-altltude ecosystems of the Chllean Altiplano. Journal of Geophyslcal Research: Blogeosclences, 1 15(G2)).

La capacidad de microorganismos lixiviantes para tolerar NaCI varía entre géneros, especies y cepas, como se señala en reportes realizados por Zamrnlt (Zammlt, C.M., Mangold, S. , Jonna, Vr., Mutch, L.A., Watllng, H.R., Dopson, M. and Watkln, E.L. (2012). Bloleachlng ¡n bracklsh waters-effect of chloride ¡ons on the acldophlle populatlon and proteomes of model specles. Appl. Mlcroblol. Blotechnol, 93(1 ): 319- 329) y Rea (2015), cuyos trabajos Indican diferentes niveles de tolerancia a NaCI para microorganismos similares. Comparando los resultados que ambos estudios obtuvieron para A. ferroxidans, ninguna de las dos cepas utilizadas fueron capaces de tolerar una salinidad equivalente a la del H 2 0 (M) (Tabla 1 ). SI bien, A. ferrooxidans ha sido reportada como una de las bacterias más sensibles a NaCI (Belmar y cois., 2014), el fllotlpo CGT5A homologa a A. ferrooxidans ha sido Identificada en todos los cultivos con concentraciones crecientes de H 2 0 (M) (Figura 18), presentando mayor tolerancia en comparación a los reportes señalados (Tabla 8). En cambio para especies mesófilas pertenecientes al género Acidiphilium, se ha determinado un amplio rango de tolerancia a NaCI (7 - 20 gL _1 ) como así lo indico Zammit y cois., (2012), lo que concuerda con este estudio al encontrar fllotipos relacionados a especies del género Acidiphilium en todos los cultivos con concentraciones crecientes de NaCI por la adición de H 2 0 (M) (E1 , E2, E3 y E4).

Tabla 8. Tolerancia a NaCI para diferentes cepas de A. ferrooxidans.

* Bacteria homologa a A. ferrooxidans identificada en este estudio Ejemplo 7: Biolixiviación de calcopirita en solución acida- salina.

Para la preparación y análisis del mineral, se usó mineral que fue procesado con el fin de disminuir su tamaño en partículas adecuadas para su análisis y ensayos de biolixiviación. La trituración Inicial del mineral se realizó en un chancador de mandíbula, con el fin de obtener tamaños del mineral menores a una pulgada, seguidamente se realizó la molienda en un batan de acero, hasta obtener tamaños menores a 8 mm. El mineral fue pulverizado en un molino de anillo ESSA de disco vibrante y posteriormente fue tamizado en malla Tyler N s +100 de 150 pm y N s +400 de 38 pm. Finalmente, se obtuvo un mineral pulverizado con tamaño de partícula en un 70% de 38 pm y un 30% de 150 pm. Mediante un difractómetro de rayos X

(Siemens, modelo D5000) se determinó que el mineral correspondía en un 80,18% a calcopirita (figura 8) y por espectrometría de absorción atómica en llama (GBC 933 plus) se reveló una concentración de cobre de 20,7 % y hierro de 22,9 %. Para la biolixiviación de calcopirita mediado por consorcio CGT (RGM 2493), se realizaron ensayos de biolixiviación de calcopirita con agua de mar.

El Inoculo utilizado para Iniciar los ensayos de biolixiviación fue adaptado a concentraciones crecientes del mineral y al presentar una mejor adaptación a las condiciones de cultivo y un mayor crecimiento bacteriano (1x10 8 celmL 1 ), se seleccionó un Inoculo del 10% para realizar el estudio de biolixiviación con un 5% (p/v) de Calcopirita. Los ensayos de biolixiviación fueron evaluados por un periodo de 50 días y cada ensayo fue realizado por triplicado. Cada día se realizó recuento de microorganismos, medición del pH y potencial redox.

Mediante recuento mlcroscópicode los microorganismos, se cuantificó la población bacteriana libre en el medio líquido (células planctónicas) de cada ensayo, la que presentó un Incremento en el número de bacterias a partir del día 5 del proceso para los ensayos; B (C), B1 y B2 , luego de 15 a 20 días para los ensayos B3 y B4 (Figura 21 ). Después de 10 días del proceso, el potencial redox presentó un ligero aumento con diferentes pendientes para cada ensayo de biolixiviación (Figura 22). En cuanto al pH, presentó un aumento en cada medición y fue reajustado en cada ocasión. En la recuperación de cobre en sistema de biolixiviación y controles ablótlcos (lixiviación), los ensayos de biolixiviación de cobre se llevaron a cabo durante 50 días y finalmente se determinó la concentración de cobre total extraído (PLS) en cada tratamiento. La Figura 23 muestra el % de disolución de cobre para cada ensayo de biolixiviación (B (C), B1 , B2, B3 y B4) y controles ablótlcos (L(C), L1 , L2, L3 y L4). La recuperación de cobre por biolixiviación mostró diferencias altamente significativas entre los tratamientos según el análisis de ANOVA con un p < 0,01 (Tablas 9, 10, 12 y 13). Para determinar cuáles medias fueron significativamente diferentes de otras, se realizaron pruebas de rangos múltiples siendo comparados y reagrupados (Tablas 11 , 12, 14 y 15). De la Figura 23 se observa que en caso de usar el consorcio bacteriano en una solución salina correspondiente a 100% agua de mar, la capacidad de extracción de cobre con respecto a la lixiviación química, se duplica. Ver B4 (25% cobre recuperado) versus L4 (11 ,5% cobre recuperado) En los resultados de cinética microbiana para los ensayos de biolixiviación (Figura 21 ), se puede observar un aumento en la fase Lag en comparación al consorcio en medio 9K-Fe (Figura 16), siendo la única diferencia entre los ensayos la adición de mineral y la ausencia de FeS0 4 , lo que permitiría atribuir este fenómeno al efecto del mineral sobre los microorganismos. La disponibilidad de calcopirita como única fuente de energía a una alta densidad de pulpa (5 % p/v), presentó una mayor dificultad para el consorcio en la obtención de energía a partir del mineral, adlclonalmente los efectos tóxicos del mineral (Oklbe, N., and Johnson, D. B. (2002). Toxlclty of flotatlon reagents to moderately thermophlllc bloleachlng mlcroorganlsms. Blotechnology Letters, 24(23), 201 1 -2016) y la generación de una elevada fuerza de clzallamlento que limita la transferencia de 0 2 y C0 2 , se podría haber traducido en un aumentó en la fase Lag registrada (Wang, Y., Zeng, W., Qlu, G., Chen, X., and Zhou, H. (2014). A moderately thermophlllc mlxed mlcroblal culture for bloleachlng of chalcopyrlte concéntrate at hlgh pulp denslty. Applied and envlronmental mlcroblology, 80(2), 741 -750). En la etapa final del proceso (45 - 50 días), se detectó una disminución de la población en todos los ensayos, lo que podría deberse a los efectos tóxicos de la acumulación de los iones de cobre, ya que la mayoría de los microorganismos no tienen una actividad metabólica óptima frente a un aumento en la concentración de cobre (Dopson y cois., 2003; L¡ y Ke., 2001 ).

Durante el proceso de biolixiviación se observó un aumento de pH hasta el día 20, los siguientes días se registró una disminución del pH manteniéndose en el rango de 1.9 - 2.2 hasta finalizar el proceso (datos no mostrados). En los controles abióticos se registró un aumento de pH hasta el día 35, para posteriormente mantenerse en el rango de pH de 2.1 a 2.2 (datos no mostrados). El aumento Inicial de pH se puede atribuir al consumo de iones de hidrogeno para la oxidación Inicial de calcopirita, explicando el aumento registrado en los ensayos de biolixiviación y controles abióticos (Zhao, X., Wang, R., Lu, X., Lu, J., Li, C., and Li, J. (2013). Bloleachlng of chalcopyrlte by Acidithlobacillus ferrooxidans. Mlnerals Englneerlng, 53, 184-192). La mantención de pH en un rango de 1 .9 a 2.2 en los días posteriores, sería el resultado de la posible oxidación de azufre elemental a ácido sulfúrico ó bien debido a la precipitación de Iones férricos (Jarositas) (Wang, Y., Su, L., Zhang, L., Zeng, W., Wu, J., Wan, L. and Zhou, H. (2012). Bloleachlng of chalcopyrlte by defined mlxed moderately thermophlllc consortium ¡ncluding a marine acidophlllc halotolerant bactehum. Bloresource technology, 121 , 348-354; Chang-L¡, L., Jln-Lan, X., Zhen-Yuan, N., Yi, Y., and Chen- Yan, M. (2012). Effect of sodium chloride on sulfur speciation of chalcopyrlte bioleached by the extreme thermophlle Acidianus manzaensis. Bloresource technology, 110, 462-467). Además del pH, la disolución de calcopirita es altamente dependiente del Eh en solución (Gerlcke, M., Govender, Y., and Pinches, A. (2010). Tank bioleachlng of low-grade chalcopyrlte concentrates using redox control. Hydrometallurgy, 104(3), 414-419; Ahmadi, A., Schaffie, M., Petersen, J., Schlppers, A., and Ranjbar, M. (201 1 ). Conventional and electrochemlcal bioleachlng of chalcopyrite concentrates by moderately thermophilic bacteria at high pulp density. Hydrometallurgy, 106(1 ), 84-92), detectándose a partir de los días 15 - 20 un aumento del Eh con diferentes pendientes para todos los ensayos de biolixivlación, alcanzando valores máximos de 500 a 680 mV a los 50 días del proceso (Figura 22), siendo un rango aceptable de Eh para la disolución de calcopirita según se ha Indicado por Ibáñez y Velásquez (2013). En el periodo Inicial, el bajo potencial registrado seria resultado de la lixiviación de mineral que es soluble en ácido, mientras que los microorganimos comienzan la oxidación de Iones Fe 2+ , permitiendo de esta manera el aumento del Eh indicativo por un incremento de los Iones Fe 3+ y la extracción de cobre (Third, K. A., Cord-Ruwisch, R., and Watllng, H. R. (2000). The role of iron- oxidizing bacteria ¡n stlmulatlon or inhibition of chalcopyrite bloleaching. Hydrometallurgy, 57(3), 225-233; Zhou, H. B., Zeng, W. M., Yang, Z. F., Xie, Y. J., and Qlu, G. Z. (2009). Bioleaching of chalcopyrite concéntrate by a moderately thermophilic culture ¡n a stlrred tank reactor. Bioresource Technology, 100(2), 515-520). El Eh para los ensayos B3 y B4 fue más bajo en comparación a los registrados para los demás ensayos de biolixiviación, lo que se podría atribuir a una menor oxidación de Fe 2+ a causa de una mayor concentración de NaCI, ejerciendo un efecto negativo sobre los microorganismos en la oxidación de hierro (Bevilaqua y cois., 2013). Con respecto a los resultados en la disolución de cobre, en todos los ensayos de biolixiviación la disolución de Cu 2+ obtenido fue mayor en comparación a sus respectivos controles ablótlcos (Figura 22), lo que permite inferir que la actividad del consorcio CGT fue clave para lograr una mayor lixiviación del mineral y su capacidad lixiviante no fue completamente inhibida aun estando en concentraciones aproximadas a 30gL 1 de NaCI (B4). Por otro lado, en los controles ablótlcos la mayor recuperación de cobre fue en el ensayo L4, resultado que podría representar los efectos positivos de los Iones CE en la disolución del mineral, lo que ya ha sido reportado en otros estudios (Dutrizac, 1992; Lu y cois., 2000; Velásquez y cois., 2010; Hernández, P. C., Taboada, M. E., Herreros, O. O., Torres, C. M., and Ghorbani, Y. (2015). Chalcopyrite dissolution using seawater-based acidic media in the presence of oxidants. Hydrometallurgy, 157, 325-332). Al comparar los resultados de todos los ensayos de biolixiviación, la disolución de cobre disminuyó conforme aumentaba la concentración de H 2 0 (M) en los ensayos, registrándose una máxima recuperación de cobre para B1 y una mínima para B4, correspondientes a; 31 % (0.7 gL '1 Cu) y 23% (0.5 gL '1 Cu) respectivamente, resultados relativamente bajos si se comparan con un estudio de Bevllaqua y cois., (2013), donde realizaron la biolixiviación de calcopirita durante 44 días con la adición de 100mM (~ 6 gL '1 ) de NaCI y obtuvieron una recuperación entre 1 .5 - 1 .8 gL 1 de cobre mediante el uso de un sistema de biorreactor y un consorcio conformado por A. ferrooxidans y A. thiooxidan. Si bien son condiciones diferentes, ya que en un sistema de biorreactor se mejora el proceso, los resultados obtenidos en este estudio toman Importancia al generar la biolixiviación de calcopirita mediado por el consorcio CGT bajo la Influencia de mayor salinidad (B2, B3 y B4) y otros componentes presentes en el H 2 0 ( M ) que pueden afectar la actividad mlcrobiológica, como por ejemplo, la presencia de compuestos orgánicos (Libes, 201 1 ). A. ferrooxidans además de ser altamente sensible a NaCI, se ve afectada por la presencia de estos compuestos, los que Inhiben su crecimiento (Rohwerdert y cois., 2003), pero su relación con especies del genero Acidiphilium, microorganismos heterótrofos, generaría una mejora en su actividad, debido a la capacidad de estos últimos para metabolizar materia orgánica eliminando de esta manera la Inhibición y aumentando el crecimiento de los microorganismos autótrofos, (Johnson, D. B., and Hallberg, K. B. (2003). The mlcrobiology of acidic mine waters. Research ¡n mlcrobiology, 154(7), 466-473). Por lo tanto, la sinergia y el rol que cumplen microorganismos del género Acidithiobacillus y Acidiphilium en los procesos lixiviantes podría haber favorecido el desarrollo del proceso de biolixiviación al utilizar H 2 0 (M) y encontrar fllotlpos relacionados a estas bacterias.

Diversos estudios sostienen que microorganismos mesófllos comunes en blomlnería pierden su capacidad lixiviante en condiciones de salinidad por debajo a las halladas en el H 2 0 (M) (Shlers y cois., 2005). SI bien, la mayoría de los reportes relacionados a los efectos de Iones cloruro sobre la biolixiviación de calcopirita se han realizado mediante la adición de NaCI, para este estudio se utilizó H 2 0 (M) en porcentajes significativos exponiendo a los microorganismos a diferentes concentraciones de NaCI (Tabla 4). Bajo estas condiciones de salinidad el consorcio CGT a temperatura ambiente (23 ± 3Ό) mantuvo su actividad lixiviante en todo el rango de salinidad evaluado (B1 , B2, B3 y B4).

Procesamiento Previo del mineral calcopirita

El mineral es molido con batan de acero y tamizado (a), para ser adicionado a vaso de molienda (b). Finalmente se realiza el ensamblaje de anillo y disco para pulverizar el mineral (d y e).

Análisis estadístico para la recuperación de cobre por biolixiviación. En la Tabla 9 se muestran los datos estadísticos para cada una de las 5 columnas de datos.

Tabla 9. Resumen Estadístico

Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación

B(C) 3 31.8307 0Ϊ343592 1.07944%

B1 3 31 ,0691 0,292253 0,940655%

B2 3 26,1824 0,434158 1 ,6582% B3 3 23,6612 0,6734 2,84601 %

B4 3 22,6063 0,491658 2,17487%

Total 15 27,0699 3,92012 14,4815%

El valor-P de la prueba-F es menor que 0,05, Indicando una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 5 variables con un nivel del 95,0% de confianza (Tabla 3 y 4).

Tabla 10. ANOVA

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F

Entre grupos 212,968 4 53,2421 244,87

Intra grupos 2,17431 10 0,217431

Total (Corr.) 215,143 14

Tabla 11.

Fuente Valor-P

Éntre grupos 0.0000

Pruebas de múltiple rangos

En la Tabla 12, se han Identificado 4 grupos homogéneos según la alineación de las X's en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.

Tabla 12. Método: 95,0 porcentaje LSD

Casos Media Grupos Homogéneos

B4 3 22,6063 X

B3 3 23,6612 X

B2 3 26,1824 X

B1 3 31 ,0691 X

B(C) 3 31 ,8307 X

La Tabla 13 aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. El asterisco que se encuentra al lado de los 9 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0% de confianza.

Tabla 13. Comparación múltiple.

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

B(C) - B1 0,761667 0,848317

B(C) - B2 5,64833 0,848317

B(C) - B3 8,16953 0,848317

B(C) - B4 9,22443 0,848317

B1 - B2 4,88667 0,848317

B1 - B3 7,40787 0,848317

B1 - B4 8,46277 0,848317

B2 - B3 2,5212 0,848317

B2 - B4 3,5761 0,848317

B3 - B4 1 ,0549 0,848317

* Indica una diferencia significativa. Análisis estadístico para la recuperación de cobre por lixiviación (controles ablótlcos)

La Tabla 14 muestra los datos estadísticos obtenidos para cada una de las 5 columnas de datos.

Tabla 14. Resumen Estadístico.

Recuento Promedio Desviación Estándar Coeficiente de Variación

7,9316 0,209968 2,64723%

,01783 0,230186 2,87093%

,24597 0,2719 3,29736%

,45053 0,30959 3,2759% 1 ,2738 0,418696 3,71387%

Total 11 8,98395 1 ,33696 14,8816%

El valor-P de la prueba-F es menor que 0,05, Indicando una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 5 variables con un nivel del 95,0% de confianza.

Tabla 15. Análisis ANOVA

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F

Éntre grupos 24,1401 4 6,03503 68,25 Intra grupos 0,884306 10 0,0884306

Total (Corr.) 25,0244 14

Fuente Valor-P

Entre grupos 0,0000 Pruebas de Múltiple Rangos

De acuerdo con la Tabla 16 se han Identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X's en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X's. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Flsher.

Tabla 16. Método: 95,0 porcentaje LSD

Casos Media Grupos Homogéneos

7,9316 X

8,01783 X

8,24597 X

9,45053 X

L4 3 11 ,2738 X

La Tabla 17 aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. El asterisco que se encuentra al lado de los 7 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95,0% de confianza.

Tabla 17. Comparación múltiple.

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

L (C) - L1 . -0.0862333 0.54Í002 .

L (C) - L2 -0,314367 0,541002 L (C) - L3 -1 ,51893 0,541002

L (C) - L4 -3,34223 0,541002

L1 - L2 -0,228133 0,541002

L1 - L3 -1 ,4327 0,541002

L1 - L4 -3,256 0,541002

L2 - L3 -1 ,20457 0,541002

L2 - L4 -3,02787 0,541002

L3 - L4 -1 ,8233 0,541002

* indica una diferencia significativa.

Soluciones de biolixiviación y lixiviación de calcopirita.

Soluciones de PLS obtenidas desde procesos de biolixiviación de calcopirita con agua de mar mediado por consorcio CGT (A, B, C, D y E) y lixiviación de calcopirita con agua de mar correspondientes a controles abióticos (F, G, H, I y J). Ver Figura 25 y Tabla 18.

Tabla 18

Designación %(v/v) de H 2 0 ( M )

. Á y F . 0

B y G 25

C y H 50

D y I 75

E y J 100

De . esta forma la presente invención revela un método para lixiviar minerales de cobre, preferentemente, calcopirita, a partir de aislar y hacer crecer un consorcio de microrganismos (RGM 2493) que conforman parte de la comunidad microbiana de un ambiente salino con medidas de pH cercanos a la neutralidad y alcalinos (pH 6.0 - 7.9, campo geotermal El Tatlo) a condiciones de cultivo con un pH extremadamente acido (pH 2.0). La presente invención logra aislar, caracterizar y evaluar la capacidad oxidativa del consorcio CGT (RGM 2493) durante los cultivos en medio 9K-Fe y ensayos de biolixiviación con diferentes concentraciones de H 2 0 (M) a pH acido. El consorcio tiene capacidad para crecer y lixiviar calcopirita con H 2 0 (M) en concentraciones de hasta 30gL 1 de NaCI, condiciones de salinidad que no presentaron una gran amenaza para el consorcio CGT (RGM 2493), a pesar de que a mayor salinidad entre 50 a 100%, específicamente 50, 75 o 100% (v/v) H 2 0 (M) se observó un efecto negativo reflejado en el crecimiento y biolixiviación del mineral, su actividad no se vio completamente inhibida. Lo que permite un nuevo método para solubilizar sulfuras metálicos mediante microorganismos lixiviantes halotolerantes en soluciones salinas con un alto contenido de Iones cloruro.

Se identificó que fllotlpo homólogo a A. ferrooxidans como una de las bacterias predominantes en el consorcio. Su Identificación toma relevancia por la capacidad que presentó para crecer en medio 9K-Fe y lixiviar calcopirita, ambos en presencia de altas concentraciones de NaCI por el empleo de agua de mar, siendo superior su tolerancia a NaCI en comparación a otros reportes en que se utilizan diferentes cepas para A. ferrooxidans (30 gL '1 v/s 3.5 gL '1 ).

Al utilizar H 2 0 (M) y exponer a los microorganismos a diferentes concentraciones de NaCI, los resultados obtenidos se traducen a la posibilidad de utilizar H 2 0 (M) en su totalidad o en porcentajes significativos para el procesamientos de sulfuras metálicos por biolixiviación, mediado por un consorcio halotolerante como CGT (RGM 2493) a nivel Industrial. Potenciando de esta manera el uso de H 2 0 (M) y obteniendo ventaja del alto contenido de cloruro para mejorar la disolución del mineral y el uso de un consorcio capaz de mantener su actividad en condiciones de salinidad. Adlclonalmente, se abre la posibilidad de tratar minerales que en solución liberan iones cloruro como la atacamlta (Cu 2 CI (OH) 3 ). De esta manera, el consorcio CGT (RGM 2493) es un candidato potencial para la Industria minera.