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Title:
METHOD FOR BIOLEACHING SULFUR-CONTAINING COPPER MINERALS USING A CONSORTIUM OF MICROORGANISMS COMPRISING IRON-OXIDISING BACTERIA AND THE FUNGUS ACIDOMYCES ACIDOPHILUS HE17 IN AN INORGANIC MEDIUM AT A PH OF LESS THAN 2, PROMOTING BACTERIAL GROWTH AND INCREASING EXTRACTION OF THE METAL FROM THE MINERAL
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/119166
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the field of mining. Specifically, to a method for bioleaching minerals. Even more specifically, to a method for bioleaching sulfur-containing minerals using a consortium of microorganisms comprising iron-oxidising bacteria (Regional Microbial Genetic Resources Research Bank Quilamapu, Chillán, Chile, accession number RGM 2527) and the fungus Acidomyces acidophilus HE17 (Regional Microbial Genetic Resources Research Bank Quilamapu, Chillán, Chile, accession number RGM 2527) in a ferrous sulfate-free inorganic medium at pH < 2, promoting bacterial growth and improving extraction of the metal from the mineral.

Inventors:
ESPARZA MANTILLA MARIO (CL)
HUARACHI OLIVERA RONALD ELEAZAR (CL)
Application Number:
CL2018/050134
Publication Date:
June 27, 2019
Filing Date:
December 19, 2018
Export Citation:
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Assignee:
UNIV DE ANTOFAGASTA (CL)
International Classes:
C22B3/18; C22B15/00
Foreign References:
US20110136125A12011-06-09
US20130089378A12013-04-11
US20010002312A12001-05-31
Other References:
RAWLINGS, D. E. ET AL.: "The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia", MICROBIOLOGY, vol. 153, 2007, pages 315 - 324, XP055620883
LOPEZ-ARCHILLA, A. I. ET AL.: "Ecological study of the fungal populations of the acidic Tinto River in southwestern Spain", CAN. J. MICROBIOL., vol. 50, 2004, pages 923 - 934
BOONEN, F. ET AL.: "Identification and characterization of a novel multicopper oxidase from Acidomyces acidophilus with ferroxidase activity", BIOCHIMIE, vol. 102, 2014, pages 37 - 46, XP055620891, DOI: 10.1016/j.biochi.2014.02.009
HUARACHI-OLIVERA, R. ET AL.: "Revision Bibliografica: Estudio sobre los procesos de Biolixiviacion con hongos para la industria minera", RESEARCHGATE, 2016, XP055620895, Retrieved from the Internet [retrieved on 20190312]
SAGUMA, A.: "Influencia de microorganismos productores de sustancias polimericas extracelulares en la extraction de cobre por biolixiviación a partir del mineral calcopirita", TESIS PARA OPTAR AL TITULO DE BIÓLOGA- MICROBIOLOGA, 2018, Retrieved from the Internet [retrieved on 20190312]
Attorney, Agent or Firm:
ESTUDIO FEDERICO VILLASECA Y CIA (CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1 . Método para biolixiviar minerales sulfurados de cobre aumentando el crecimiento del consorcio bacteriano biolixiviante caracterizado porque comprende conducir la biolixiviación con un consorcio de microorganismos que comprende bacterias ferroxldantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2527 y el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , en un medio Inorgánico libre de sulfato ferroso y pH < 2.

2. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque las bacterias ferroxldans que se encuentran en el mineral sulfurado. 3. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque el pH tiene valor 1 ,8.

4. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dichas bacterias se seleccionan preferentemente de bacterias del género Acidithiobacillus, Acidiphilium o una combinación de las mismas.

5. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dichas bacterias se seleccionan del grupo consistente de Acidithiobacillus ferridurans cepa YNTR1 -41 , Acidiphilium sp. cepa MPLK-613, Acidithiobacillus ferrooxidans cepa HBDY3-5 o una combinación de las mismas.

6. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho medio Inorgánico libre de sulfato ferroso es un medio 9K.

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91)

7. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho mineral sulfurado de cobre es calcopirita.

8. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha biolixiviación se realiza en bioreactor estático.

9. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha biolixiviación se realiza en un bioreactor de flujo ascendente o bioreactor airlift.

Description:
MÉTODO PARA BIOLIXIVIAR MINERALES SULFURADOS DE COBRE USANDO UN CONSORCIO DE MICROORGANISMOS QUE COMPRENDE BACTERIAS FERROOXIDANTES Y EL HONGO ACIDOMYCES ACIDOPHILUS HE17 EN UN MEDIO INORGÁNICO LIBRE DE SULFATO FERROSO Y PH MENOR QUE 2. FAVORECIENDO EL CRECIMIENTO BACTERIANO Y AUMENTANDO LA EXTRACCIÓN DEL METAL DESDE EL MINERAL.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al área de la minería. En particular, a un método para la biolixiviación de minerales. Aún más particularmente, a un método para biolixiviar minerales sulfurados a partir de un consorcio de microorganismos que comprende bacterias ferrooxldantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2527 y el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , en un medio Inorgánico libre de sulfato ferroso y pH < 2, favoreciendo el crecimiento bacteriano y aumentando la extracción del metal desde el mineral.

ANTECEDENTES

Uno de los problemas que enfrenta la minería de sulfuras, en la actualidad, es que los procesos de biolixiviación microbiana en los minerales sulfurados tardan mucho tiempo Incluso años debido a que las bacterias crecen lentamente y su actividad metabóllca es muy débil. En ausencia de aditivos que aceleren el proceso de crecimiento bacteriano, y en particular, cuando ocurre la oxidación de Fe o S, y se favorece la lixiviación del mineral sulfurado.

La biolixiviación es el proceso por el cual microorganismos oxidantes de hierro y azufre catalizan la extracción de metales a partir de minerales y residuos Industriales (Krebs

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) W., Brombacher C., Bosshard P.P., Bachofen R., Brandl H. 1997. Microbial recovery of metáis from solids. FEMS Microbiol Rev. 20, 605-17). Es un proceso que resulta particularmente útil en la extracción de metales presentes en muy baja cantidad, que no son rentables de extraer mediante procesos químicos. En la biolixiviación se utilizan tanto cepas únicas como cultivos mixtos de microorganismos, siendo algunos de los más utilizados las bacterias acidófilas Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans; y la arquea Sulfolobus acidocaldarius (Harrison, A. P., Norris, P. R. 1985. Leptospirillum ferrooxidans and similar bacteria: some characteristics and genomic diversity. FEMS Microbiol. Lett. 30, 99-102; Temple, K. L, Colmer, A. R. 1951 . The autotrophic oxidation of ¡ron by a new bacterium: Thiobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 62, 605- 1 1 ).

En comparación a los procesos de extracción química, la biolixiviación tiene la ventaja de ser amigable con el medio ambiente; además de tener un bajo costo de implementación. Sin embargo, no está exenta de problemas, ya que durante el proceso puede ocurrir una inhibición del crecimiento microbiano debido a la presencia de cloro, metales pesados, metaloides y materia orgánica disuelta (MOD). Esto repercute en una baja recuperación del metal de interés (Hansford, G.S. 1997. Recent developments in modeling the kinetics of bioleaching. In: Rawlings, D.E. (Ed.), Biomining: Theory, Microbes and Industrial Processes. Springer Verlag, Berlín, pp. 153-175; Schrenk, M.O., Edwards, K.J., Goodman, R.M., Hamers, R.J., Banfield, J.F. 1998. Distribution of Thiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans : implications for generation of acid mine drainage. Science. 279, 1519-1522; Rawlings, D.E. 1999. The molecular genetics of mesophilic, acidophilic, chemolithotrophic, iron- or sulfur-oxidizing microorganisms. Process Metallurgy. 9, 3-20; Rawlings DE. 2005. Characteristics and adaptability of ¡ron- and sulfure-oxidizing microorganisms used for the recovery of metáis from minerals and their concentrates. Microb. Cell Fact. 4, 13.). La eficiencia de la biolixiviación se puede mejorar con la incorporación de hongos heterotróficos, tales como Aspergillus spp. y Penicillium spp. Esto se debe a que los hongos excretan ácidos orgánicos (como ácido cítrico y ácido oxálico) durante el proceso de acidólisis, lo cual en ciertos minerales permite la solubilización de los metales por medio de la formación de complejos con estos ácidos (Bosecker, K. (1997). Bioleaching: metal solubilization by microorganisms. FEMS Microbiology reviews, 20(3-4), 591 -604; Bosshard, P., Bachofen, R., Brandl, H. 1996. Metal leaching of fly ash from municipal waste incineration by Aspergillus niger. Environ. Sci. Technol. 30, 3066-3070; Torre, M. A., Gomez-Alarcon, G., Vizcaíno, C., García, M. T. 1992. Biochemical mechanisms of stone alteration carried out by filamentous fungí living in monuments. Biogeochemistry. 19, 129-147). Además, Aspergillus spp. y Penicillium spp., que han sido aplicados mayoritariamente en la biolixiviación de materia orgánica, son muy eficientes en la degradación de MOD. Por lo tanto, la incorporación de estos hongos a los procesos de biolixiviación favorece el crecimiento bacteriano, reduciendo el tiempo requerido para la solubilización del metal de interés (Gu, X., Wong, J.W.C. 2004. Identification of inhibitory substances affecting bioleaching of heavy metáis from anaerobically digested sewage sludge. Environ. Sci. Technol. 38, 2934-2939; Gu, X.Y., Wong, J.W.C. 2007. Degradation of inhibitory substances by heterotrophic microorganisms during bioleaching of heavy metáis from anaerobically digested sewage sludge. Chemosphere. 69, 31 1 -318; Wang, S., Zheng, G., & Zhou, L. 2010. Heterotrophic microorganism fíhodotorula mucilaginosa R30 improves tannery sludge bioleaching through elevating dissolved C0 2 and extracellular polymeric substances levels in bioleach solution as well as scavenging toxic DOM to Acidithiobacillus species. Water fíes. 44, 5423-5431 ; Zheng, G., Zhou, L., Wang, S. 2009. An acid- tolerant heterotrophic microorganism role in improving tannery sludge bioleaching conducted in successive multibatch reaction systems. Environ. Sci. Technol. 43, 4151 - 4156; Zheng, G., Wang, Z., Wang, D., Zhou, L. 2016. Enhancement of sludge dewaterability by sequential inoculation of filamentous fungus Mucor circinelloides ZG- 3 and Acidithiobacillus ferrooxidans LX5. Chem. Eng. J. 284, 216-223; Ngom, B., Liang, Y., Liu, Y., Yin, H., Liu, X. 2015. Use of an acidophilic yeast strain to enable the growth of leaching bacteria on solid media. Arch. Microbiol. 197, 339-346; Zhou, J., Zheng, G., Wong, J. W., & Zhou, L. 2013. Degradation of inhibitory substances in sludge by Gaiactomyces sp. Z3 and the role of its extracellular polymeric substances in improving bioleaching. Bioresour. Technol. 132, 217-223).

En cuanto a documentos de patente es posible mencionar a CN106190871 (A) que describe un método para biolixiviación en suelo contaminado con metales pesados a través de hongos filamentosos compuestos tomando paja como fuente de carbono. El hongo filamentoso se clasifica y nombra como Penicillium simplicissiumum y se conserva en el Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China el 25 de junio de 2015 con el número de acceso CGMCC No.10990. La invención describe adicionalmente un inoculante de hongos filamentosos compuesto formado por la mezcla de esporas isométricas de Penicillium simplicissiumum NAU-12 (1 x 10 8 esporas/mL a 2 x 10 8 esporas/mL) y Aspergillus niger A80 (1 x 10 7 esporas/mL a 2 x 10 7 esporas/ mL). La invención describe adicionalmente un método para llevar a cabo el tratamiento de biolixiviación en suelos contaminados con metales pesados a través de hongos filamentosos compuestos que crecen rápidamente en el suelo, altos en resistencia a metales pesados y capaces de utilizar paja sometida a pretratamiento alcalino con calor alcalino como fuente de carbono para el crecimiento y tener una alta producción de múltiples ácidos orgánicos moleculares pequeños. El método se adopta para tratar el suelo contaminado con metales pesados, la eficiencia de eliminación de metales pesados es alta y el costo es bajo.

TW201429883 (A) describe un método de biolixiviación de metales y su sistema utilizando hongos para lodos. El sistema de biolixiviación de metales incluye una unidad de biolixiviación, una unidad de suministro de lodo y una unidad de suministro de hongos. La unidad de biolixiviación se proporciona para procesar un tratamiento de biolixiviación de metales. La unidad de suministro de lodo se proporciona para suministrar lodos que contienen metales. La unidad de suministro de hongos se proporciona para suministrar hongos a la unidad de biolixiviación y luego los hongos generan un material metabólico. El material metabólico se aplica para lixiviar los metales contenidos en el lodo para eliminar los metales de los lodos.

AU2010288177 (B2) describe un aditivo para la biolixiviación que hace posible aumentar la recuperación de cobre a partir de minerales de sulfuro. En el que este aditivo está constituido sustancialmente por la lipoproteína Llcanantasa y una solución de ácido sulfúrico con un pH de 0,8 a 3. La lipoproteína de Llcanantasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de homología con respecto a la secuencia definida en la secuencia SEQ ID N°1 o es el producto de traducción de una secuencia de nucleótidos con al menos 50% de homología con respecto a la secuencia definida en la secuencia SEQ I D N^. Tamb ién protege el proceso mejorado de biolixiviación que incluye añadir el aditivo durante el proceso de biolixiviación de mineral y continuando con el proceso habitual, obteniendo recuperaciones de cobre aumentó de 5 a 20%. Llcanantasa es la proteína predominante en el secretoma de Acidithiobacillus thiooxidans cuando es cultivada con azufre elemental y es capaz de Incrementar la recuperación de cobre desde calcopirita cuando se utiliza como aditivo para la biolixiviación.

Aunque ciertos hongos heterotróficos puedan ser buenos candidatos para mejorar la eficiencia de la biolixiviación de minerales. No hay reportes del uso de hongos en procesos de biolixiviación en un medio inorgánico. La presente Invención describe el aislar y caracterizar el hongo Acidomyces acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 , obtenido a partir de drenaje ácido de mina, y evaluar su

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) adición a un consorcio bacteriano para mejorar el proceso de biolixiviación. Al analizar la recuperación de cobre a partir de calcopirita en biolixiviación estática y en un blorreactor de flujo ascendente o airlift, en presencia de un consorcio bacteriano que además puedo o no Incluir el hongo A. acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 , se demuestra la importancia de agregar este hongo en el crecimiento de las bacterias lixiviantes y en el resultado de la recuperación de cobre desde minerales de sulfuros de cobre. La presente Invención permite salvar las dificultades al comienzo mencionadas, al incluir el proceso de lixiviación de minerales sulfurados, el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 como un aditivo de origen natural. Este aditivo permite reducir los tiempos de biolixiviación de los minerales sulfurados a meses incluso semanas, e Incrementa el crecimiento celular microbiano en más de un 20%, permitiendo un Incremento mayor al 10%, en la recuperación de cobre desde minerales sulfurados, en particular, desde soluciones ya sea provengan de pilas, reactores, concentrados u otros equipos u operaciones necesarias para la extracción del mineral. El valor antes mencionado es un valor estimado para la recuperación con el aditivo.

Breve Descripción de la Invención

La presente Invención proporciona un método para biolixiviar minerales sulfurados de cobre usando un consorcio de microorganismos que comprende bacterias ferroxidantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2527 y el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 en un

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) medio inorgánico libre de sulfato ferroso y pH <2, de preferencia, pH = 1 ,8, favoreciendo el crecimiento de los microorganismos lixiviantes y aumentando la extracción del metal desde el mineral. Se realizaron cultivos de la cepa fúnglca Acidomyces acidophylus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 , en forma aislada con bacterias ferrooxidantes en medio sólido inorgánico agarosa 9K-Fe, pH=1 ,8, lo que favoreció el crecimiento tanto del hongo como de las bacterias. En el estado del arte, se han reportado hongos en consorcios bacterianos para recuperar metales pero en medios orgánicos a pH neutros. En particular Ngom, B., Llang, Y., Liu, Y., Yin, H., Liu, X. 2015. Use of an acidophlllc yeast strain to enable the growth of leachlng bacteria on solid media. Arch. Mlcrobiol. 197, 339-346 reporta el crecimiento de bacterias lixiviantes en medios sólidos 9K suplementado con glucosa a pH=5, se inoculó Candida digboiensis NB en la capa Inferior del gel, demostrando ser eficaz en la activación y mejoramiento del crecimiento de las bacterias autótrofas lixiviantes oxidantes de hierro y azufre. Asi mismo, se ha reportado la actividad del hongo Rhodotorula mucilaginosa R30 que permitió el Incremento de la biomasa bacterial de Acidithiobacillus ferrooxidans en lodos con alta concentración de materia orgánica (Wang, S., Zheng, G., & Zhou, L. 2010. Heterotrophlc mlcroorganlsm Rhodotorula mucilaginosa R30 ¡mproves tannery sludge bioleachlng through elevating dissolved C02 and extracellular polymerlc substances levels in bioleach solution as well as scavenglng toxic DOM to Acidithiobacillus species. Water Res. 44, 5423-5431 ). No se ha reportado entonces un consorcio bacteriano que adicione A. acidophilus con fines de biolixiviación.

Se demostró que A. acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 , puede crecer en medio sólido 9K-Fe-Cu pH 1 ,8 con 400 mM de CuS0 4 (Fig. 7),

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) condiciones que no se han utilizado con anterioridad a la presente invención. Para aislados de los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium, se ha descrito una concentración inhibitoria mínima de cobre de 15-20 mM; 7,5-20 mM, y 12,5 mM, respectivamente (Ezzouhri, L., Castro, E., Moya, M., Espinóla, F., Lairini , K. 2009. Heavy metal tolerance of fllamentous fungí isolated from polluted sites ¡n Tangier, Morocco. Afr. J. Microbiol. Res. 3, 35-48). El hongo Antrodia vaillantii fue capaz de tolerar hasta 40 mM de cobre (Collett, O. 1992. Comparative tolerance of the brown-rot fungus Anthrodia vaillantii (DC.Fr.) Ryv. isolates to copper. Holzforschung. 46, 293- 298). Por lo tanto, en comparación a otros hongos descritos en la literatura, A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , posee una gran tolerancia al cobre, lo que permite pueda ser usado en procesos de biolixiviación que involucran este metal. En procesos de biolixiviación en biorreactor airlift usando hongos, sólo se ha reportado la publicación de trabajos de Sabra, N., Dubourguier, H. C., Hamieh, T. 2012. Fungal leaching of heavy metáis from sediments dredged from the Deúle Canal, France. Advances ¡n Chemical Engineering and Science. 2, 1 -8, donde se utilizan los hongos filamentosos Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum para lixiviar metales pesados de sedimentos dragados en biorreactores airlift a escala semi-piloto usando medios orgánicos con sacarosa obteniendo una recuperación de 12% de cobre en 40 días. Comparado a los resultados de la presente invención, se obtuvo una mayor recuperación de cobre en biorreactores airlift (BA) con el hongo A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , usando medio inorgánico 9K, a partir del mineral calcopirita durante 68 días, conduciéndose la biolixiviación en BA con hongos lixiviando minerales en medios inorgánicos.

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) En cuanto a operaciones de biolixiviación estática (BE) y biorreactor airlift (BA) de calcopirita en medio inorgánico 9K libre de sulfato ferroso a pH=1 ,8 sólo con bacterias ferrooxldantes, se observó una menor recuperación de cobre; comparado a la biolixiviación con bacterias ferrooxldantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2527 y la cepa fúngica A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , se mostró una mayor recuperación de cobre con una mayor eficiencia en biorreactores airlift, demostrando que la inoculación del hongo A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 mejora los procesos de biolixiviación.

El método de la presente Invención se conduce en medios inorgánicos a pH bajo (< 2), y no se refiere a biolixiviación en lodos con metales pesados con una alta concentración de materia orgánica disuelta usando hongos y bacterias. Se ha estudiado que la inoculación del hongo Gaiactomyces sp. Z3 mejora los procesos de biolixiviación en lodos con metales pesados cuando se usan dos cepas Acidithiobacillus ferrooxidans LX5 y Acidithiobacillus thiooxidans TS6 disminuyendo el período requerido para el proceso, con mayores eficiencias en la solubilización del cobre (Zhou, J., Zheng, G., Wong, J. W., & Zhou, L. 2013. Degradation of ¡nhlbitory substances in sludge by Gaiactomyces sp. Z3 and the role of its extracellular polymerlc substances in ¡mprovlng bioleachlng. Bloresour. Technol. 132, 217-223). La inoculación de Pichia spartinae mejoró la biolixiviación de lodos de curtiduría usando dos cepas bacterianas A. ferrooxidans LX5 y A. thiooxidans TS6 con la mayor solubilización de otro metal como el cromo (Zheng, G., Zhou, L., Wang, S. 2009. An acid-tolerant heterotrophlc mlcroorganlsm role in ¡mprovlng tannery sludge bioleachlng

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) conducted in successive multibatch reaction systems. Environ. Sci. Technol. 43, 4151 - 4156). La inoculación del hongo filamentoso Mucor circinelloides ZG-3 mejoró de biolixiviación de lodos con A. ferrooxidans reduciendo el periodo de oxidación del hierro ferroso (Zheng, G., Wang, Z., Wang, D., Zhou, L. 2016. Enhancement of sludge dewaterability by sequential inoculation of filamentous fungus Mucor circinelloides ZG- 3 and Acidithiobacillus ferrooxidans LX5. Chem. Eng. J. 284, 216-223).

En cuanto al tipo de sistema de biolixiviación, no se reportan trabajos sobre procesos de biolixiviación con hongos filamentosos en sistema estático en medio inorgánico 9K sin sulfato ferroso, la mayor parte de los trabajos en biolixiviación con hongos se hicieron en medios orgánicos a pH neutro en sistemas de agitación (e eΐ bή como la investigación realizada por Mehta, K.D., Das, C., Pandey, B.D. 2010. Leaching of copper, nickel and cobalt from Indian Ocean manganese nodules by Aspergillus niger. Hydrometallurgy. 105, 89-95, donde la biolixiviación usa medios orgánicos en sistema de agitación a 120 rpm en 30 días, a partir de nodulos de manganeso polimetálicos del Océano índico usando un hongo Aspergillus niger se obtuvo una recuperación de 97% de cobre. En la investigación de Ren, W. X., Li, P. J., Geng, Y., Li, X. J. 2009. Biological leaching of heavy metáis from a contaminated soil by Aspergillus niger. J. Hazard. Mat. 167, 164-169, para la biolixiviación de metales pesados de un suelo contaminado en un área industrial usa metabolitos, principalmente ácidos orgánicos débiles, producidos por el hongo Aspergillus niger obteniendo una recuperación del 56% de cobre en sistema de agitación a 120 rpm a 30 e C a intervalos de tiempo regulares de 15 días. Por otra parte Deng, X., Chai, L, Yang, Z., Tang, C., Tong, H., Yuan, P. 2012. Bioleaching of heavy metáis from a contaminated soil using indigenous Penicillium chrysogenum strain F1 . J. Hazard. Mater. 233, 25-32 para la biolixiviación también usa medio orgánico para remediar el suelo contaminado por metales pesados usando el hongo Penicillium Chrysogenum obteniendo una recuperación del 34,89% de Cu en agitador orbital a 120 rpm durante 15 días. Por tanto, la biolixiviación estática de calcopirita a diferentes tratamientos con el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillón, Chile, RGM 2451 , en medio inorgánico 9K sin sulfato ferroso de la presente Invención, es más eficiente.

La presente Invención demuestra que el hongo A. acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillón, Chile, RGM 2451 , presenta actividad mlxotrofa y acidotolerante con bacterias del género Acidithiobacillus y Acidiphilium. El hongo es capaz de favorecer el crecimiento bacteriano y de aumentar la recuperación de cobre a partir de calcopirita, tanto en BE como en BA. Por lo tanto, A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillón, Chile, RGM 2451 , potencia la solubilización de minerales sulfurados, probablemente - sin consentir con ninguna teoría, mediante la excreción de ácidos orgánicos ayudando a aumentar la biomasa de bacterias lixiviantes debido a una posible degradación de materia orgánica disuelta (MOD).

Por lo que en la presente Invención, el método biolixivlación se realiza con un consorcio de microorganismos que comprende además del hongo A. acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de

Investigación Quilamapu, Chillón, Chile, RGM 2451 , una bacteria seleccionada de bacterias del género Acidithiobacillus, Acidiphilium o una combinación de las mismas.

Se han reportado pocos estudios que revelen el uso de hongos en medios extremadamente ácidos (pH < 2). Tampoco se conoce su función en relación a procesos de biolixivlación de minerales. Por tanto, la presente Invención proporciona una forma de aislar y caracterizar hongos extremoacidófilos para su aplicación en biolixivlación de los minerales de sulfuras de cobre. Primero se aíslan hongos y

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) bacterias desde cultivos lixiviantes extremadamente ácidos (pH 1 ,8), luego se analizan por: métodos mlcrobiológicos, a saber, microscopía óptica, confocal y electrónica; métodos de biología molecular, a saber PCR, DGGE y secuenclaclón de ADN; y métodos blolnformátlcos para análisis f ilogenéticos. Tanto los hongos como las bacterias Identificadas son sometidas a procesos de biolixiviación con mineral calcopirita 4% en sistema estático y en blorreactores airlift de 2L a 22 +.213 durante 68 días, usando 4 tratamientos: Tratamiento 1 (T1 ) = Control negativo; Tratamiento 2 (T2) = Bacterias; Tratamiento 3 (T3) = Bacterias + Hongo y Tratamiento 4 (T4)= Hongo. El hongo fue Identificado como Acidomyces acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , mostrando tener un metabolismo mixótrofo siendo capaz de crecer en quimilitoautotrofia en ambientes extremadamente ácidos en presencia de hierro 33,3 g/L o cobre 200-400 mM (9K-Fe-Cu, pH 1 ,8) y en organografía (agar sabouraud y PDA a pH=6,49 . A. acidophilus- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación

Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 tiene la función de potenciar el crecimiento de las bacterias ferrooxldantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2527 siendo mayor la tasa de crecimiento en T3 en biolixiviación estática (T2 = 0,045/día; T3=0, 048/día) y en blorreactor airlft, (T2 = 0,034/día; T3 = 0,037/día). En el consorcio bacteriano - en procesos de biolixiviación, se identificaron especies del género Acidithiobacillus y Acidiphilium.

Durante el proceso de biolixiviación estática (tratamientos T2 y T3) se recuperó la siguiente cantidad de cobre, en mg/L: 476,09 (T2 = 56,68%); 554 (T3 = 65,97%). En biolixiviación con blorreactor airlift, la cantidad en mg/L, fue: 9623,16 (T2 = 63,65 %) y 1 1 120,28 (T3 = 73,55%) respectivamente. De esta forma, el hongo filamentoso A.

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , potencia el proceso de biolixiviación de calcopirita, en comparación a la biolixiviación bacteriana, siendo la primera Investigación que describe la utilidad de un hongo filamentoso acldotolerante en la biolixiviación de minerales sulfurados en medio Inorgánico. Se realizaron estudios con A. acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , para confirmar viabilidad, desarrollo y mejoras en procesos de extracción de metales. Para las dificultades mencionadas al comienzo de esta solicitud, no se han reportado soluciones de ningún tipo, menos aún el uso de la adición de hongos para mejorar la recuperación de cobre desde minerales sulfurados. Cabe destacar que los procesos de biolixiviación industrial son ecosistemas extremoacidófilos en un ambiente estrictamente inorgánico (aguas cloruradas, minerales inorgánicos y H 2 SO 4 ). Sin embargo en otros sectores como medio ambiente - un sector diferente al sector minero, se aplican hongos en aplicaciones de biorremediación usando ecosistemas orgánicos, donde se ha usado hongos como Aspergillus niger y Penicillium Chrysogenum para extraer cobre presente en pasivos ambientales con una alta cantidad de materia orgánica disuelta.

La presente invención propone entonces el uso de Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , como aditivo de biolixiviación ya que es capaz de crecer en un ecosistema minero industrial que dispone de un ambiente inorgánico, lo que le confiere una ventaja muy relevante sumado al hecho que permite el crecimiento más rápido de bacterias lixiviantes - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2527, las que oxidan rápidamente Hierro o azufre, y en

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) consecuencia, permiten recuperar más cobre en menos tiempo y en mayor cantidad con respecto a sistemas bacterianos que no usan este hongo.

Breve Descripción de las Figuras

Figuras 1A y 1 B. Crecimiento de la cepa fúngica en medio de cultivo inorgánico y orgánico. Figura 1 A Crecimiento de la cepa fúngica en medio sólido orgánico Sabouraud y PDA a pH 6,49. Figura 1 B Crecimiento de la cepa fúngica en medio sólido inorgánico 9K-Fe pH 1 ,8; en presencia y ausencia de bacterias oxidantes de hierro.

Figuras 2A-2M. Morfología de la cepa fúngica. Figura 2A Colonia fúngica en medio sólido 9K-Fe, pH 1 ,8 después de 28 días de incubación a temperatura ambiente. Se observa un halo de degradación que rodea a la colonia. Figura 2E Fíalo de degradación observado en microscopía confocal. Se aprecia la presencia de bacterias oxidantes de hierro. Figura 2B Colonia fúngica en medio sólido 9K-Fe pH 1 ,8 después de 30 días de incubación a temperatura ambiente. Figura 2C y Figura 2D. Colonia fúngica en medio agar Sabouraud y PDA pH 6,49 después de 17 días. Figura 2F, Figura 2G, Figura 2H. Crecimiento de A. acidophilus en medio sólido agarosa 9K-Fe-Cu, pH= 1 ,8 a

0 mM, 200 mM y 400 mM Cu después de 40 días. Figura 2I Vista microscópicas (100X) de filamentos septados de A. acidophilus, con tinción de azul de metileno. Se observan células hinchadas intercalares y terminales (flechas rojas). Figura 2J Vista microscópica (100X) de las hifas septadas de A. acidophilus, con tinción de lugol. Figura 2K Filamentos de A. acidophilus HE17 de cultivos en medio líquido 9K-Fe, pH=1 ,8 en observado microscopía confocal. Figura 2L Imágenes en 3D de los filamentos de A. acidophilus observado en microscopía confocal de fluorescencia. Figura 2M Micrografía electrónica del filamento de A. acidophilus.

Figura 3. Análisis filogenético de Acidomyces acidophilus HE17 basado en las secuencias de la región ITS del rDNA 5.8S y de los dominios D1/D2 del rDNA 28S. La filogenia se reconstruyó utilizando la parsimonia Bootstrap, y el árbol se construyó usando máxima verosimilitud. La barra de escala indica 0,5 sustituciones por sitio. Se utilizó Teratosphaeria micromaculata como grupo raíz externo.

Figura 4. Crecimiento de Acidomyces acidophilus HE17 en presencia de cobre. Figura

4A Diámetro de la colonia fúngica durante 40 días de incubación en medio sólido 9K-Fe pH 1 ,8 suplementado con 0 mM (control negativo), 200 mM y 400 mM de CuS0 4 x5Fl 2 0. Figura 4B Peso seco de A. acidophilus HE17 medido en las tres condiciones evaluadas (0 mM, 200 mM y 400 mM de

CUS0 4 X5H 2 0) en medio líquido 9K-Fe-Cu, pH 1 ,8.

Figuras 5A-5G. Arquitectura de las biopelículas de Acidomyces acidophilus HE17 en presencia de cobre. El hongo se creció en medio líquido 9K-Fe pH 1 ,8 suplementado con 0 mM (control negativo), 200 mM y 400 mM de

CUS0 4 X5H 2 0. A los 40 días de cultivo, las biopelículas se tiñeron con naranja de acridina para la visualización de las hifas mediante microscopía confocal. Figuras 5A, 5B y 5C Fotografías que muestran las biopelículas de A. acidophilus en medio líquido 9K-Fe pH 1 ,8; a las distintas concentraciones de CuS0 4 x5H 2 0. Figuras 5D, 5E y 5F imagen bidimensional de biopelículas de filamentos de A. acidophilus. Figuras 5G, 5H y 5I imagen tridimensional de biopelículas de filamentos de A. acidophilus. Figuras 5J, 5K y 5L Imagen en 3D de biopelículas de filamentos de A. acidophilus mostrando su espesor Barra: 40pm.

Figuras 6A-6H. Experimentos de biolixiviación estática (BE) y biolixiviación en biorreactor airlift (BA). Se utilizó una comunidad bacteriana oxidante de hierro con o sin la incorporación del hongo Addomyces acidophilus HE17, y se evaluó la recuperación de cobre a partir de calcopirita. Figura 6A Curva de crecimiento de bacterias oxidantes de hierro en BA. Figura 6B Curva de crecimiento de bacterias oxidantes de hierro en BE. Figura 6C Potencial redox (ORP) en BE. Figura 6D ORP en BA. Figura 6E Producción de hierro en BE. Figura 6F Producción de hierro en BA. Figura 6G Recuperación de cobre en BE. Figura 6H Recuperación de cobre en BA. Tratamientos (T): T1 (control negativo), medio 9K + calcopirita; T2, medio 9K + calcopirita + bacterias; T3, medio 9K + calcopirita + bacterias + A. acidophilus HE17; T4, medio 9K + calcopirita + A. acidophilus HE17.

Figuras 7A y 7B. Caracterización del consorcio bacteriano presente en los experimentos de biolixiviación estática y biolixiviación en biorreactor airlift, mediante análisis del rDNA 16S. Figura 7A Gel de DGGE al 30-60% urea- formamida, en el cual se separaron los fragmentos del rDNA 16S amplificados por PCR. El gel se tiñó con GeIRed. Las bandas se denominaron C1 , C2 y C3. Figura 7B Árbol filogenético basado en las tres secuencias del rDNA 16S obtenidas del análisis por DGGE. El árbol se construyó mediante análisis Máximum Likelihood. Se muestran los valores de Bootstrap > 50% (100 réplicas utilizadas). La barra de escala indica 0,01 substituciones por sitio. Se utilizó Acidiphilium cryptum JF-5 como grupo raíz externo. Descripción Detallada de la Invención

La biolixiviación de cobre y otros metales suele utilizar bacterias oxidantes de hierro y azufre, cuyo crecimiento se puede ver Inhibido por la presencia de metales pesados, materia orgánica disuelta, y otros. Esto afecta la eficiencia de recuperación del metal de Interés. Se ha visto que en blorremedlaclon en medio orgánico ciertas especies de hongos contribuyen a mejorar la eficiencia de recuperación de metales y a contrarrestar la Inhibición del crecimiento bacteriano. Sin embargo, no se reportan estudios sobre el proceso de biolixiviación con hongos en medios Inorgánicos. La presente Invención proporciona como aditivo a la biolixiviación, un hongo filamentoso proveniente de un drenaje ácido de mina. Mediante secuenclaclón del rDNA 5.8S y de la reglón ITS, se determinó que el hongo correspondía a Acidomyces acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 . Se demostró la capacidad de este hongo para promover la recuperación de cobre a partir de calcopirita, en biolixiviación estática (BE) y biolixiviación en blorreactor airlift ( BA). Para estos experimentos se utilizó un consorcio bacteriano- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2527, que mediante secuenclaclón del rDNA 16S, se determinó que estaba formado por las especies Acidithiobacillus ferridurans straln YNTR1 -41 , Acidithiobacillus ferrooxidans straln HBDY3-51 y Acidiphilium sp. straln MPLK-613, entre otras especies que la técnica usada no permitió detectar. Tanto en los experimentos de BE como de BA, la presencia A. acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chlllán, Chile, RGM 2451 , provocó un aumento en la recuperación de cobre, en el potencial redox oxldatlvo, y en la cantidad de hierro disuelto.

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) Así, la presente invención demuestra la utilidad de un hongo filamentoso acidotolerante antes mencionado en la biolixiviación de minerales sulfurados en medio inorgánico. La presente Invención proporciona un método para biolixiviar minerales sulfurados a partir de un consorcio de microorganismos que comprende bacterias ferroxldantes, preferentemente, bacterias ferroxldans que se encuentran en el mineral sulfurado; y además el hongo Acidomyces acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , en un medio Inorgánico libre de sulfato ferroso y pH < 2, de preferencia, pH = 8, favoreciendo el crecimiento de los microorganismos lixiviantes y aumentando la extracción del metal desde el mineral. donde las bacterias se seleccionan preferentemente de bacterias del género Acidithiobacillus, Acidiphilium o una combinación de las mismas. Preferentemente, dichas bacterias se seleccionan del grupo consistente de Acidithiobacillus ferridurans cepa YNTR1 -41 , Acidiphilium sp. cepa MPLK-613, Acidithiobacillus ferrooxidans cepa HBDY3-5, o una combinación de las mismas. Ejemplos

Ejemplo 1 : Metodología para aislar la cepa fúngica y del consorcio bacteriano

La cepa fúngica se aisló a partir de un cultivo microbiano proveniente de un drenaje ácido de mina. Para aislar la cepa fúngica y caracterizar su crecimiento, se cultivó en cuatro medios de cultivo distintos, a temperatura ambiente: Primer Medio de Cultivo, cultivo (I): medio 9K líquido suplementado con FeS0 4 (9K-Fe; 0,4 g MgS0 4 x7H 2 0; 0,04 g K 2 HP0 4 ; 0,1 g NH 4 S0 4 ; 33,33 g FeS0 4 x 7H 2 0 por litro, pH 1 ,8). Segundo Medio de Cultivo, cultivo (¡I): 9K-Fe sólido (10 g NH 4 S0 4 ; 1 ,5 g MgS0 4 x 7H 2 0; 0,5 g

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) K 2 HP0 4 ; 10 g agarosa y 33,3 g FeSC h^O por litro, pH 1 ,8). Tercer Medio de Cultivo, cultivo (iii): agar Sabouraud (10 g peptona de caseína; 40 g glucosa; 12 g agar por litro, pH 6,4), y Cuarto Medio de Cultivo, cultivo (iv): agar papa dextrosa (PDA, 250 g de trozos de papa; 20 g glucosa; 20 g agar agar por litro, pH=6,49).

La comunidad bacteriana a utilizar en los experimentos de biolixiviación se obtuvo a partir de una muestra de calcopirita proveniente de una mina, la cual fue inoculada (10 %, 10 6 cel/ml) en medio 9K líquido sin la adición de FeS0 4* 7H 2 0, pH 1 ,8, Temperatura 20 ^2 e C. El crecimiento bacteriano se evaluó cada 7 días mediante recuento celular en una cámara de Petroff-Hausser.

Ejemplo 2: Composición del mineral utilizado

El mineral se pulverizó hasta un tamaño de partícula de 38 a 150 pm, utilizando un pulverizador (Rocklabs, Auckland, New Zealand) con tamiz N e 100 y 400, esterilizándolo antes de la experimentación. El análisis mineralógico se realizó con un difractómetro de rayos X Siemens D5000 (Siemens, Munich, Germany), mediante el cual se comprobó que el mineral correspondía a sulfuro de cobre, determinándose el siguiente contenido: 80,18% calcopirita (CuFeS); 4,52% trolita (FeS); 6,61 % covelita (CuS); 1 ,15% magnetita (Fe 2 0 3 ); y 7,54% cuarzo (Si0 2 ).

Ejemplo 3: Extracción de DNA genómico y amplificación de DNA ribosomal bacteriano y fúngico

El DNA genómico bacteriano se extrajo de cuatro muestras líquidas de procesos de biolixiviación a partir de 1 mL en medio 9K mas calcopirita después de 68 días y el DNA genómico de hongos se extrajo directamente de cultivo de microorganismos lixiviantes a partir de 1 mL de medio 9K-Fe, pH=1 ,8 después de 60 días, realizando la purificación con el PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El DNA purificado se cuantificó en un espectrofotómetro Epoch (Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT, USA), y su pureza se comprobó mediante la relación de absorbancia a 260 nm y a 280 nm

(A260/280) · Para la identificación de especies bacterianas, se amplificó el DNA ribosomal (rDNA) 16S utilizando los oligonucleótidos universales 1492R/27F y el kit de PCR GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, Wl, USA). El programa de amplificación fue el siguiente: una desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, seguida de 35 ciclos a 94°C por 45 s, 57°C por 45 s, y 72°C por 1 min 30 s; con una extensión final a 72 e C por 5 min.

Para la identificación de la cepa fúngica se amplificó la región del espaciador transcrito interno (ITS) del rDNA 5.8S, utilizando los oligonucleótidos ITS1 e ITS4 (White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In: M. A. lnnis,D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, & T. J. White (ed.), PCR Protocols: A Guide to the Methods and Applications. New York: Academic Press. 315-322); y los dominios variables D1 -D2 del rDNA 28S, utilizando los oligonucleótidos NL1 y NL4 (O’ Donnell K. 1993. Fusarium and its near relatives. In: D. R. Reynolds J. W. Taylor (eds), The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics. Wallingford: CAB International: 225- 233). La reacción de amplificación contuvo 13,2 pL de agua miliQ; 5 pL de Buffer PCR; 2 pL de MgCI 2 ; 0,5 pL de dNTPs (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA), 1 pL de cada oligonucleótido; 0,25 pL GoTaq DNA Polymerase kit reagent (Promega/USA) y 2 pL de templado. El programa de amplificación fue el siguiente: una desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, seguida de 35 ciclos a 95 e C por 30 s, 55°C por 1 min, y 72°C por 1 min. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1 %, y se purificaron con el lllustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (General Electric Healthcare, Buckinghamshire, UK). Se almacenaron a -20°C. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE).

Los fragmentos amplificados del rDNA 16S se utilizaron como templados en una nueva amplificación con los oligonucleótidos específicos para bacterias 341 F-GC y 907R (Muyzer G., Teske A., Wirsen CO., Jannasch HW. 1995. Phylogenetic relationships of Thiomicrospira species and their identification in deep-sea hydrothermal vent samples by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments. Arch. Microbiol. 164, 165-171 ). Se utilizó el siguiente programa: una desnaturalización inicial de 94°C por 5 min, seguida por 35 ciclos a 94°C por 30 s, 50°C por 45 s, y 72°C por 1 min, con una extensión final de 72°C por 3 min. Los productos resultantes de PCR se sometieron a DGGE, basándose en el protocolo descrito por Demergasso, C., Galleguillos, P., Escudero, L., Zepeda, A., Castillo, D., Casamayor, E. 2005. Molecular characterization of microbial populations in a low- grade copper ore bioleaching test heap. Hydrometallurgy. 80, 241 -253. Brevemente, se cargaron los productos en un gel de poliacrilamida al 6% conteniendo un gradiente desnaturalizante de 30-60% urea-formamida (el 100% del gradiente se definió como 7 M urea y 40% formamida). El gel se corrió en una cámara de electroforesis BioRad D Gene (BioRad, Hercules, CA, USA) a 60 °C y 100 V durante 7 h. Posteriormente, el gel se tiñó en una solución de 0,5% GeIRed (Biotium, Fremont, CA, USA) durante 1 h en oscuridad, y las bandas se visualizaron bajo luz UV en transiluminador. Las bandas se cortaron y purificaron usando E.Z.N.A™ Gel Extraction Kit (OMEGA), para luego re- amplificar los productos de PCR con los partidores 341 F-GC/907R, bajo las mismas condiciones del PCR mencionado anteriormente, visualizándose en gel de agarosa al

1 %. Secuenciación de los productos de PCR

Los productos de PCR bacterianos fueron secuenciados por Macrogen, Korea. Las secuencias se editaron manualmente utilizando el programa ChromasPro 2.1 (Technelysium Pty Ltd, Brisbane, Australia), y se compararon con la base de datos GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), usando el algoritmo BLASTn (- Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410). Posteriormente se realizó el alineamiento de las secuencias mediante la herramienta MUSCLE (- Edgar, R. C. 2004. MUSCLE: múltiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, 1792-1797). El árbol filogenético se construyó usando el modelo estadístico Máximum Likelihood y el test de robustez Bootstrap, utilizando el programa MEGA7 (Tamura K.; Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. 201 1 . MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using máximum likelihood, evolutionary distance, and máximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731 -2739).

Los productos de PCR fúngicos se secuenciaron utilizando el BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit's robust, y el ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Se usaron los mismos oligonucleótidos utilizados en la amplificación inicial de los rDNAs 5.8S y 18S. Las secuencias consenso se obtuvieron utilizando los programas AutoAssembler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y Lasergene Seqman (Dnastar, Madison, Wl, USA).

Ejemplo 4: Tolerancia de Acidomyces acidophilus HE17 al cobre

Los ensayos de tolerancia al cobre se realizaron en medio 9K-Fe sólido y líquido pH 1 ,8, suplementado con 0, 200 y 400 mM de CuS0 4* 5H 2 0 (9K-Fe-Cu) (Remonsellez,

F., Orell, A., Jerez, C.A. 2006. Copper tolerance of the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus metallicus: possible role of polyphosphate metabolism. Microbiology. 152, 59-66; Novo, M.T.M., Da Silva A.C., Moreto, R., Cabral, P.C. P., Costacurta, A., García, O.J., Ottoboni, L.M.M. 2000. Thiobacillus ferrooxidans response to copper and other heavy metáis: growth, protein synthesis and protein phosphorylation, Antonie van Leeuwenhoek, 77, 187-95). El efecto inhibitorio del cobre sobre el crecimiento del hongo se determinó midiendo el diámetro de la colonia (en medio sólido), y cuantificando la diferencia de masa seca al principio y al final del experimento (en medio líquido).

Ejemplo 5: Metodología Experimentos de Biolixiviación Estática (BE) y Biolixiviación en Biorreactor Airlift (BA).

La biolixiviación estática (BE) se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 100 mL de medio salino 9K sin FeS0 4 x7H 2 0 y concentrado de calcopirita a una densidad de pulpa del 4%. La biolixiviación en biorreactor airlift (BA) se realizó en un tubo concéntrico de 15 cm de altura, con un diámetro inferior de 9,5 cm y un diámetro superior de 15 cm, el cual posee un compresor de aire electromagnético (modelo ACQ-001 , Boyu, China) con un caudal de aire de 5 L/min (Fig. 1 ). Para BA se usaron 1 ,8 L de medio salino 9K sin FeS0 4 x7H 2 0 y a la misma densidad de pulpa que en BE.

En cada uno de los procesos de biolixiviación se analizaron los siguientes tratamientos (T): T1 (control negativo), medio 9K + calcopirita; T2, medio 9K + calcopirita + consorcio bacteriano; T3, medio 9K + calcopirita + consorcio bacteriano + A. acidophilus·, T4, medio 9K + calcopirita + A. acidophilus. En T2 y T3 se puso un inoculo inicial de 10 6 bacterias/mL. En T3 y T4 se puso un inoculo inicial medido en equivalencia a biomasa seca de 0,025 mg/pL de A. acidophilus.

Cada tratamiento se evaluó por triplicado y se monitoreó durante 68 días. El potencial redox (ORP) de cada tratamiento se midió cada dos días, utilizando un medidor ORP Meter modelo Hl 9126 (Hanna Instruments, Woonsocket, Rl, USA). La concentración de cobre y hierro se analizó con un espectrofotómetro de absorción atómica con llama modelo Avanta P (GBC Scientific Equipment, Melbourne, Australia).

Ejemplo 6: Metodología para la medición de biopelículas de A. acidophilus y visualización de su estructura celular.

La formación de biopelículas de A. acidophilus se analizó en cultivos en medio 9K-Fe- Cu líquido con 0, 200 y 400 mM de CuS0 4 x5H 2 0 y en los experimentos de BA (T3 y T4). En estos últimos, una vez finalizado el experimento, se midió el espesor de la biopelícula del hongo y se obtuvo una muestra de filamentos. Estos se montaron en una placa de Petri, se colectaron con portaobjetos, se tiñeron con naranja de acridina, y se observaron en microscopio confocal. Los filamentos también se analizaron en un microscopio electrónico de barrido (7582, serie A3038-5350-TV3-1841 , England), para lo cual se montaron con fijador marca Dako. La estructura celular del hongo se estudió a partir de muestras de medio de cultivo 9K-Fe, PDA y Sabouraud, las cuales se visualizaron en un microscopio confocal CS SP8 invertido, con una unidad de alimentación compacta de láser de Argón a 488 nm y objetivos de 63X con aceite de inmersión (Leica, Wetzlar, Germany).

Las diferencias en la recuperación de cobre, concentración de hierro y ORP en los experimentos de biolixiviación se analizaron mediante ANOVA de dos vías, utilizando los softwares SPSS v. 20 y Sigma plot v. 1 1 .

Ejemplo 7: Crecimiento de la cepa fúngica

Para evaluar los requerimientos nutricionales de la cepa fúngica, se comparó su crecimiento en medio inorgánico sólido 9K-Fe pH 1 ,8 con medio orgánico Sabouraud y PDA pH 6,49 (Tabla 1 ; Fig. 1 A). El mayor crecimiento se obtuvo en medio Sabouraud, en el cual la colonia fúngica obtuvo un diámetro máximo de 34 mm, mientras que en medio sólido 9K-Fe y PDA el diámetro alcanzó 37 mm y 21 ,67 mm, respectivamente. Estos resultados muestran que, si bien la cepa fúngica crece mejor en presencia de sustratos orgánicos, es capaz de crecer en un medio inorgánico y a pH ácido, lo cual indica que se trata de un hongo acidotolerante y mixótrofo.

Tabla 1

A continuación se evaluó si la presencia de bacterias oxidantes de hierro favorece el crecimiento de la cepa fúngica en el medio sólido 9K-Fe pH 1 ,8. La cepa se sembró en presencia y ausencia de bacterias, y se realizó un seguimiento de su crecimiento por 45 días. La colonia fúngica se hizo visible al séptimo día de cultivo, y su crecimiento fue mayor en presencia de bacterias, alcanzando un diámetro máximo de 57,5 mm; 1 ,55 veces más que en ausencia de bacterias (Tabla 2 y Fig. 1 B).

Tabla 2.

Ejemplo 8: Caracterización morfológica de la cepa fúngica

El análisis de la colonia fúngica por microscopía óptica mostró una morfología similar en medio sólido 9K-Fe, agar Sabouraud y PDA (Fig. 2A-D). En medio sólido 9K-Fe, la colonia fúngica creció de color blanco, con un crecimiento rápido del micelio, y presentó un halo de degradación de materia orgánica (Fig. 2A). Mediante microscopía confocal se pudo apreciar que este halo favoreció el crecimiento de bacterias productoras de ácido sulfúrico (Fig. 2E). En otros cultivos en medio sólido 9K-Fe no se observó halo de degradación, sólo colonias de color blanco (Fig. 2B). En medio Sabouraud y PDA las colonias crecieron de color negro (Fig. 2C, D).

Un análisis microscópico más detallado mostró células hinchadas intercaladamente.

La presencia de filamentos de A. acidophilus se estudió por microscopía óptica con tinción de azul de metileno (Fig. 21) y lugol (Fig. 2J); y por microscopía confocal con tinción de naranja de acridina se observaron los filamentos de A. acidophilus de cultivos en medio liquido 9K.Fe, pH=1 ,8 (Fig. 2K), en imagen en 3D se observa la medida de los filamentos de A. acidophilus con longitud de 76-192 pm y un diámetro de 2-6 pm (Fig. 2L).

La figura 2M muestra la estructura de un filamento de A. acidophilus en medio liquido 9K-Fe, pH=1 ,8 visualizado en microscopía electrónica de barrido.

Ejemplo 9: Análisis filogenético de la cepa fúngica

Para identificar a qué especie pertenece la cepa fúngica aislada, se extrajo DNA genómico y se amplificaron los rDNAs 5.8S y 28S, utilizando los oligonucleótidos ITS1/ITS4 y NL1/NL4, respectivamente. La secuenciación de los productos de PCR reveló que el hongo corresponde a Addomyces acidophilus HE17— número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , perteneciente a la división Ascomycota. El árbol filogenético con soporte de bootstrap bajos mostró esta cepa como una especie distinta, agrupada con Mycospharaella sp. CPW22515 (DQ632682.1 ), Acidomyces acidophilus strain MH934 (JQ172742.1 ), Acidomyces acidothermus strain MH1 101 (JQ172743.1 ) y

Penidiella tenuiramis strain CBS124993 (KF442523.1 ) (Figura 3).

Ejemplo 10: Crecimiento y formación de biopelículas de A. acidophilus HE17 en presencia de cobre.

Para determinar si la presencia de cobre en el medio afecta el crecimiento de A. acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , se analizó el diámetro de la colonia fúngica durante 40 días de cultivo en medio sólido 9K-Fe (control negativo) y 9K-Fe-Cu, con 200 o 400 mM de CuS0 4* 5H 2 0. El mayor crecimiento del hongo se dio en el control negativo, con un diámetro de 60,8 mm ; mientras que a 200 mM de Cu el diámetro se redujo a 33,8 mm; y a 400 nM de Cu se redujo a 20,5 mm (Fig. 4A). Adlclonalmente, a los 40 días, en medio liquido 9K-Fe-Cu, pH=1 ,8 se cuantificó el peso seco del hongo en las tres condiciones evaluadas, el cual fue 18,9 mg/100 mL en el control negativo, de 1 1 ,9 mg/100 mL a 200 mM Cu, y de 6,4 mg/100 mL a 400 mM Cu (Figura 4B).

A continuación, se estudió la formación de biopelículas de A. acidophilus HE17- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , en medio líquido 9K-Fe y 9K-Fe- Cu pH 1 ,8 con 200 mM y 400 mM de CuS0 4 x5H 2 0. Se realizó tinción con naranja de acrldina para visualizar las hlfas bajo microscopía confocal de fluorescencia. Tanto en el control negativo como a 200 mM de Cu, se observó la formación de biopelículas ricas en hlfas, con una arquitectura homogénea (Figura 5A y 5B). A 400 mM de Cu se

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) observó una menor cantidad de hitas (Figura 5C). El espesor de las blopelículas se midió calculando las profundidades. En el control negativo la biopelícula tuvo una profundidad promedio aproximada de 216 pm (Figuras 5D, 5G y 5J), a 200 mM Cu se obtuvo una profundidad de 179 pm (Figuras 5E, 5H y 5K), y a 400 mM Cu una profundidad de 120 pm (Figura 5F, 5I y 5L).

Ejemplo 11 : Experimentos de biolixiviación de calcopirita con Acidomyces adidophilus HE17

Para estudiar si A. acidophilus HE17 - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , aumenta la recuperación de cobre en un proceso de biolixiviación bacteriana, se realizaron experimentos de biolixiviación estática (BE) y de biolixiviación en biorreactor airllft (BA). Se utilizaron muestras de calcopirita a partir de las cuales se obtuvo la comunidad bacteriana naturalmente presente en el mineral. Los siguientes tratamientos se analizaron por triplicado en BE y BA: T1 (control negativo), medio 9K + calcopirita; T2, medio 9K + calcopirita + comunidad bacteriana; T3, medio 9K + calcopirita + comunidad bacteriana + A. acidophilus-, T4, medio 9K + calcopirita + A. acidophilus. Para evaluar la Influencia de A. acidophilus - número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , en el crecimiento bacteriano, se analizaron T2 y T3 a los 68 días de experimentación. En BE, el crecimiento bacteriano en T2 aumentó de 1 ,1 x10 5 a 2,5x10 6 células/mL; mientras que en T3 se observó un Incremento mayor, de 1 ,1 x10 5 a 2,9x10 ® células/mL (Flg. 6A, Fig. 6B). En BA ocurrió una situación similar, el crecimiento bacteriano en T2 aumentó de 3,6x10 s a 3,8x10 ® células/mL, y en T3 aumentó de 3,1 x10 ® a 3,9x10 ® células/mL (Flg. 6C, Flg. 6D). Por lo tanto, en ambos sistemas de biolixiviación, la adición de A. acidophilus HE17 - número de acceso del

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Quilamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 , tuvo un efecto positivo en el crecimiento bacteriano.

Se midió el potencial redox (ORP) y la concentración de hierro disuelto en cada tratamiento. En T3 se encontraron los valores más altos de ORP, con 620,47 mV en BE y 640,9 mV en BA (Fig. 6E, Fig. 6F). En T2 se obtuvo un ORP de 581 ,9 mV en BE y de 616,8 mV en BA (Fig. 6E, Fig. 6F). T3 también presentó la mayor cantidad de hierro disuelto, con 250,19 mg/L en BE y 1435,18 mg/L en BA (Fig. 6G, Fig, 6H). En T2 se encontraron 238,49 mg/L de Fe en BE y 1324,84 mg/L de Fe en BA (Fig. 6G, Fig. 6H). Por lo tanto, se observa que la presencia de A. acidophilus HE17 aumenta el crecimiento del consorcio bacteriano aumentando el ORP, esto significa que existe un aumento en reacciones de oxidación y reducción de Fe con una mayor extracción de cobre a partir del mineral realizado por bacterias lixiviantes. La recuperación de cobre se midió a partir del día 1 1 en adelante. Como es de esperar, la menor recuperación se observó en T1 , con un 9,27% en BE y un 21 ,43% en BA; seguido de T4 con una recuperación del 13,14% en BE y del 23,3% en BA (Fig. 6I, Fig. 6J). En T2 la recuperación de cobre fue de un 35,94% en BE y de un 49,7% en BA; mientras que en T3 fue de un 47,4% en BE y de un 59,6% en BA (Fig . 6I, Fig. 6J). Según el análisis estadístico, las diferencias entre BE y BA son significativas (P<0.01 ). A. acidophilus HE17 creció de forma equivalente en ambos procesos de biolixiviación, alcanzando en BE un peso seco de 0,1735 mg/pL en T3 y de 0,1402 mg/pL en T4; y en BA un peso seco de 0,21 15 mg/pL en T3 y de 0,1688 mg/pL en T4. Ejemplo 12: Identificación de las bacterias presentes en los experimentos de biolixiviación

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) Se caracterizaron aquellas bacterias presentes en los experimentos de biolixiviación, en presencia y ausencia de A. acidophilus- número de acceso del Banco de Recursos Genético Microbianos Regional de Investigación Qullamapu, Chillán, Chile, RGM 2451 . Para esto, se tomaron muestras de los tratamientos T2 y T3 de BE (T2E, T3E) y T2 y T3 de BA (T2R, T3R). Una tinción Gram reveló la presencia de múltiples bacilos Gram- negatlvos. A continuación se detalla el proceso de Identificación de estas bacterias.

Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE).

Se extrajo DNA genómico de las muestras obtenidas de T2E, T3E, T2R, y T3R; y se amplificó el rDNA 16S con los ollgonucleótldos universales 1492R/27F. Los productos de PCR se re-amplificaron con los ollgonucleótldos específicos para bacterias 341 F- GC y 907R (Muyzer G., Teske A., Wirsen CO., Jannasch HW. 1995. Phylogenetlc relatlonships of Thiomicrosplra specles and thelr Identification in deep-sea hydrothermal vent samples by denaturing gradlent gel electrophoresls of 16S rDNA fragments. Arch. Microblol. 164, 165-171 ). Los productos resultantes del PCR se sometieron a DGGE. Se visualizaron tres bandas para T2R y T3R, y cuatro bandas para T2E y T3E (Fig. 7A). Las bandas se purificaron, los productos de PCR se re amplificaron con los ollgonucleótldos 341 F-GC/907R, y se secuenclaron. Se obtuvieron secuencias de calidad aceptable para tres de las bandas (C1 , C2 y C3). A partir de las secuencias se construyó un árbol fllogenétlco con el programa MEGA7, utilizando secuencias similares a las nuestras, obtenidas de la base de datos (Fig. 7B). El análisis de las secuencias del rDNA 16S reveló la presencia de dos géneros bacterianos: Acidithiobacillus y Acidiphilium. La Tabla 1 muestra el familiar más cercano para cada una de las especies Identificadas por secuenclaclón, correspondiendo a fllotlpos homólogos a Acidithiobacillus ferridurans strain YNTR1 -41 (C3), Acidiphilium sp. strain MPLK-613 (C2) y Acidithiobacillus ferrooxidans strain HBDY3-51 (C1 ). Es Interesante destacar que A. ferridurans strain YNTR1 -41 sólo se encontró en los experimentos de BE.

HOJAS RECTIFICADAS (REGLA 91) Tabla 1. Banda de clones de bacterias lixiviantes representativos en DGGE

Banda de DGGE El familiar más cercano (closest relative) Score Máx. identidad E-value

C3 Acidithiobacillus ferrídurans strain YNTR1 -41 94 99

0.0

C2 Acidiphilium sp. strain MPLK-613 93 98

0.0

C1 Acidithiobacillus ferrooxidans strain HBDY3-51 84 99 0.0