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Title:
METHOD FOR BIOLOGICAL PREPARATION OF (3R,5S)-6-CHLORO-3,5-DIHYDROXYHEXANOIC-TERT-BUTYL-ACETATE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/075439
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided is a method for biological preparation of (3R,5S)-6-chloro-3,5- dihydroxyhexanoic-tert-butyl-acetate. The method uses (S)-6-chloro-5-carbonyl-3-hydroxyhexanoic-tert-butyl-acetate as a substrate, and the substrate undergoes a reduction reaction in the presence of a biological catalyst, a cofactor, and a hydrogen donor to produce (3R,5S)-6-chloro-3,5- dihydroxyhexanoic-tert-butyl-acetate. The biological catalyst is a recombinant keto reductase. The cofactor is either NAD/NADH or NADP/NADPH. The hydrogen donor is isopropanol. The reduction reaction is conducted in an aqueous buffer solution of a pH between 6.0 and 9.0.

Inventors:
JU XIN (CN)
FAN BO (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/077099
Publication Date:
May 22, 2014
Filing Date:
June 09, 2013
Export Citation:
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Assignee:
ENZYMEWORKS INC (CN)
International Classes:
C12P7/62; C12N9/02; C12R1/19
Domestic Patent References:
WO2003097569A12003-11-27
Foreign References:
CN101528917A2009-09-09
CN102605011A2012-07-25
CN102965403A2013-03-13
Other References:
WANG, SHENG ET AL.,: "ASYMMETRIC REDUCTION OF TERT-BUTYL(S)-6-CHLORO-5-HYDROXY-3-OXO-HEXANOATE CATALYZED BY YEAST CELLS", CHEMICAL REACTION ENGINEERING AND TECHNOLOGY, vol. 22, no. 6, 25 December 2006 (2006-12-25), pages 554 - 559
AMIDJOJO, M. ET AL.,: "ASYMMETRIC SYNTHESIS OF TERT-BUTYL (3R, 5S), 6-CHLORO-DIHYDROXYHEXANOATE WITH LACTOBACILLUS KEFIR", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 69, no. 1, 20 October 2005 (2005-10-20), pages 9 - 15
WOLBERG, M. ET AL.,: "BIOCATALYTIC REDUCTION OF BéTA, DELTA-DIKETO ESTERS: A HIGHLY STEREOSELECTIVE APPROACH TO ALL FOUR STEREOISOMERS OF A CHLORINATED BéTA, DELTA-DIHYDROXY HEXANOATE", CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL, vol. 7, no. 21, 5 November 2001 (2001-11-05), pages 4562 - 4571
Attorney, Agent or Firm:
SUZHOU CREATOR PATENT & TRADEMARK AGENCY LTD. (CN)
苏州创元专利商标事务所有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求-

1. 一种 (3R,5S)- 6氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 以 (S)- 6氯- 5-羰基- 3羟基己酸 叔丁酯为底物, 该底物在生物催化剂、 辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯, 其特征在子: 所述的生物催化剂为重组酮还原酶, 所述的重组 酮还原酶的制备方法为: 将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡纳霉素抗性 的液体 LB培养基中, 于 35--40Ό下摇床活化 8〜12小时, 将活化后得到的培养物接种到含卡 纳霉素抗性的液体 LB 培养基中, 亍 35〜40 'C— F摇床扩大培养, 培养至 OD600 值达到 0,6~0,8时, 加入诱导剂, 于 25〜33 tTF继续培养 8〜12小时, 离心, 收集沉淀物, 加入磷酸 盐缓冲液得悬浮液, 将悬浮液置于冰水浴中超声破碎 8〜12 分钟, 再离心, 将上清液预冻至 温度降至 -10— 25 Ό , 然后再冻干 24〜48 小时, 即得冻千粉状的重组酮还原酶, 所述的重组 酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮; 所述的辅因子为 NAD/NADH或 NADP/NADPH; 所述的 氢供体为异丙醇; 所述的还原反应在 pH为 6,0〜'9.0的水相缓冲液中进行。

2. 根据权利要求 1 所述的 (3R,5S)-6 -氯 - 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 其特征在 于: 在反应起始时的反应体系中, 重组酮还原酶与 (S)- 6-氯- 5-羰基- 3-羟基己酸叔丁酯的质量 百分比为 2〜.4%, 辅因子与 (S)- 6-氯- 5-羰基 3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为 0,05~0.2%, 异 丙醇相对所述的 (S)- 6-氯- 5-羰基- 3 -轻基己酸叔丁酯的物质的量百分比为 100〜150%。

3. 根据权利要求 1 所述的 (3R,5S)-6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 其特征在 于: 诱导剂为异丙基- B 硫代半乳糖昔或乳糖。

4. 根据权利要求 1 所述的 (3R,5S)-6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 其特征在 于: 辅因子为 NAD/NADH 。

5. 根据权利耍求 1 所述的 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁翻的生物制备方法, 其特征在 于; 水相缓沖液为磷酸盐缓冲液、 Tris- HC1缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。

6. 根据权利要求 1 所述的 (3R,5S)-6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 其特征在 于: 还原反应在 pH为 8.0的水相缓冲液中进行。

7. 根据权利要求 1或 2所述的 (3R,5S)-6-氯 -3,5 -二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法, 其实施 过程如不: 在反应容器中依次加入底物 (S)- 6-氯 -5-羰基 -3-羟基己酸叔丁酯、 异丙醇 水相缓 冲液, 搅拌均匀, 继续加入重组酮还原酶和辅因子, 在 25〜45°C下, 搅拌反应, 利用 HPLC- MS 检测反应进程, 待转化率达 90'、.99%时, 加入乙酸乙酯进行多次萃取, 合并有机相并蒸 发脱去溶剂, 即得 (3R,5S)-6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯产品。

Description:
(3R,5S)~ 6氯- 3,5二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法

[0001] 技术领域:

本发明属于生物制药和绿色化学领域, 具体涉及一种 (3R,5SH ^氯- 3,5-二羟基己酸叙丁酯的 生物制备方法,,

[0002] 背景技术:

利用生物酶催化剂制备手性药物中间偉, 在医药工业中有着重要的应用。 在生产世界上畅销 的降胆固醇他汀类药物, 即羟甲基戊二酰 CoA(HMG- Co A)还原酶抑制剂类化合物的研究 中, 其手性侧链的生产步骤是最关键的。 其中, 在尝试制备关键中间体 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二 羟基己酸叔丁酷的研究中, 利用还原酶从 (S)-6-氯 -5羰基- 3-羟基己酸叔丁酯一步还原得到目 标产物, 以其高效率、 高选择性的特点成为化学和制药工业界重点研 究的对象。

[0003] 在已经公开的制备 (3R,5S 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁難的方法中, 化学还原方法的反 应条件往往需要低温 (如- 70°C) , 及易燃的硼垸类化合物参与, 是极为危险和难以实用化的 (Angew. Chem. Int Ed. 2000, 39: 4306-4307}„ 相比较而言, 生物法的应用条件更加温和, 因 此也更加实用和环保,, 例如美国专利 US2008/0248539 A1 公幵了一种利用来自于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的酮还原酶及其突变株还原法生产 (3R,5S 6 -氯- 3,5-二羟基己酸叔 丁酯的方法。 为了实现辅酶的原位循环, 该专利采用了添加辅助的葡萄糖脱氢酶和蔔萄 糖的 方法。 该方法虽然较化学法有诸多优势; 但是其辅酶循环体系会产生与产物等当量的葡 萄糖 酸, 为了维持反应体系的 pH, 需要加入等当量的碱进行中和, 不但影响反应的工艺经济性 和原子经济性, 反应体系中产生的酸和添加的碱还可能对酶的 活力产生一定的影响, 并非该 路线的最佳选择。

[0004] 本专利公开了一种改进的利用酮还原酶生产 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的方 法, 不仅避免了化学法中存在的种种问题, 还对生物法进行了合理的改进, 具有重要的工业 应用价值。

[0005] 发明内容;

本发明的目的在于提供一种改迸的 (3R,5S 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。

[0006] 为解决以上技术问题, 本发明釆用如下技术方案: 一种 (3R,5S)- 6氯- 3,5-二羟基己酸 叔丁酯的生物制备方法, 其以 (S)-6-氯- 5-羰基- 3-羟基己酸叔丁酯为底物, 该底物在生物催化 剂、 辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成 (3R,5S)- 6-氯 -3,5-二羟基己酸叔丁酯。 生物 催化剂为重组刚还原酶, 重组酮还原酶的制备方法为: 将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌 单菡落接种到含卡纳霉素抗性的液体 LB培养基中, 于 35~40Ό下摇床活化 8〜12小时, 将活 化后得到的培养物接种到含卡纳霉素抗性的液 体 LB 培养基中, 于 35、40υ下摇床扩大培 养, 培养至 OD600值达到 0.6 0.8时, 加入诱导剂, 于 25~33°C下继续培养 8〜'12小时, 离 心, 收集沉淀物, 加入磷酸盐缓冲液得悬浮液, 将悬浮液置于冰水浴中超声破碎 8〜12 分 钟, 再离心, 将上清液预冻至温度降至- 10〜25 , 然后再冻千 24〜48 小时, 即得冻千粉状 的重组酮还原酶。 重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮,, 辅因子为 NAD/NADH 或 NADP/NADPH o 氢供体为异丙醇。 还原反应在 pH为 6.C 9.0的水相缓冲液中进行。

[0007] 在一种优选的实施例中, 在反应起始时的反应体系中, 重组酮还原酶与 (S 6-氯- 5-羰 基3-羟基己酸叔丁酯的质量百分比为 2'、4%, 辅因子与 (S)- 6-氯- 5羰基 羟基己酸叔丁酯的 质量百分比为 0.05 0.2%, 异丙醇相对 (S)-6-氯 -5-羰基 -3-羟基己酸叔丁酯的物质的量百分比 为勝- 50%。

10008] 优选地, 在制备重组酮还原酶中所使用的诱导剂为异丙 基 硫代半乳糖昔 或 L糖。

【0009 j 优选地, 辅因子为: AD/NADH 。

[001ΘΪ 优选地, 水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、 Tm- Ηα缓冲溶液或 Ξ乙醇餒盐酸缓冲溶液。

[0011] 优选地, 还原反应在 ρΗ为 8,0的水相缓冲液中进行。

[0012] 具体地。 (3:R.,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法的实施 过程如下: 在反 应容器中依次加入底物 (S)-6-氯- 5-羰基 羟基己酸叔丁酯, 异丙醇, 水相缓冲液, 搅拌均 匀, 继续加入重组酮还原酶和辅因子, 在 25〜45Ό下 搅拌反应, 利用 HPLC- MS检测反应 进程, 待转化率达 90〜99%时, 加入乙酸乙酯进行多次萃取, 合并有机相并蒸发脱去溶剂, 即得 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯产品。

[0013] 根据本发明, 除重组酮还原酶, 其余原料均可由通用渠道商购获得 >

[0014] 本发明的有益效果在于: 本发明方法通过采用重组的酮还原酶, 避免了因添加辅助 的葡萄糖鋭氢酶和葡萄糖而导致的使酶失活和 产品提 ¾困难等问题; 并且采用改进的工艺, 使得反应条件温和, 反应效率提高, 操作简便。

[0015] 附图谅明;

附图 1为转化率随 pH变化图。

10016] 具体实施方式:

本发明的反应式如下;

X

下面的实施例可以使本专业的技术人员更全 面 *理解本发明, 但不以任何方式限制本发明。

[0017] 实施例一 重组酮还原酶酶粉摇瓶生产工艺

将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落 从 油管或转化平板接种到 4 mL,含卡纳抗性的 液体 LB培养基活化过夜 (37Ό , 200 ipm) 0 丛过夜培养物以 1/100接种量转接 100 mL含卡 纳抗性的液体 LB培养基, TTC、 200 rpm振荡培养至 OD600值达到 0.6-0.8 , 加入 IPTG 0.5 mM于 30°C继续培养过夜。 离心收集细胞, 用 10 mL磷酸盐缓冲液 (2 mM , ρΐΐί 7.0) 悬浮 细胞。 细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎 10分钟。 离心, 上清液预冻过夜。 冻干 48h后得 到重组酮还原酶粉。

[0018] 实施例二: 辅因子再生体系验证

取重组酮还原酶酶粉 1 mg, 加入 1 mL磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.0, 50 mM), 异丙醇 0Ό1 mL, NAD 15 mg, 于 5 mL离心管中, 30°C水浴恒温磁力搅拌 ί rain, 加入〗 mL乙酸丁酯萃取, 气相色谱分析。 检测结果表明有丙酮生成, 异丙醇被转化, 根据峰面积计算转化率为 10,5%。

[0019] 实施例三: 反应监测方法

采用 HPLC- MS检测方法测定 (S)- 6-氯 -5-羰基- 3-羟基己酸叔丁酯到 (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己 酸叔丁酯的转化。 样品处理: 取不同 T间点反应液 50 i-i L, 加入甲醇 950 M L, 混匀后^ 0.45 μ πι微孔滤膜过滤, 然后进样检测 (进样量 1 L;)。 色谱条件为: 色谱柱 SB- C18 2.1 X 50 mm, 3.5 μ m, 流动相 A水 (0.1%HCOOH) -B 乙腈, 流速 0.3 mL/miti , 0-5 nun 32%B。 质谱条件 干燥气流速 12 L/min, 鞘气压力 40 PSI, 干燥气温度 350°C, 毛细管电压 3500 V, 检测模式为正离子模式。 检测离子 181.1, 183.1, 185.1, 203.1, 205.1 , 237.1 , 239.1 , (S)- 6-氯- 5-羰基- 3-羟基己酸叔丁酯保留时间 3.8 rain, (3R,5S)- 6-氯- 3,5-二羟基己酸叔丁酯保留 时间 2.6 min。

Ι002Θ] 实施例四: pH条件优化

取重组酮还原酶酶粉 10 mg, 加入 10 mL磷酸盐缓冲溶液 (100 mM, pH分别为 6.0, 6.5, 7,0, 7,5 , 8,0, 8,5), 底物 1 g, 异丙醇 0.65 m:L, NAD 5 mg, 于 50 mL离心管中, 35°C水 浴恒温磁力搅拌 5小时, 取 0,1 mL加入 1 mL甲醇淬灭反应, HPLC-MS分析, 如图 1所 示, 转化率分别为 39. :ί %, 49.8%, 51.0%, 54.2% ; 60.3%, 57.2%。 根据此结果, 选取规格 为 pH 8.0的缓冲液作为最优选。

[0021] 实施倒五: 克级制备工艺

在 100 mL三口烧瓶中依次加入 5 g (S)- 6-氯 -5羰基- 3-羟基己酸叔丁酯, 3.75 mL异丙醇, 2 mL 磷酸盐缓冲溶液 (pH 8.0) , 搅拌均勾, 之后加入 0.2 g 重组酮还原酶冻千粉, NAD 5 mg, 30Ό下 800 rpm磁力搅摔开始计时反应, 取样 HPLC- MS分析监控反应进程, 反应 24 h 后, 转化率 >99%, 产物立体构型纯度 (d.e.)>99%。

[0022] 实施例六: 百克级制备工艺

在反应器中依次加入 500 g (S 6-氯 -5-羰基 -3-羟基己酸叔丁酯, 375 mL异丙醇, 4.2 L磷酸 盐缓冲溶液 (pH 8.0, 100 n M), 搅拌均匀, 之后加入 20 g重组酮还原酶冻干粉, NAD 0.5 g, 30Ό下机械搅拌开始计时反应, 取样 HPLC-MS分析监控反应进程, 反应 24 h后, 转化 率>99%, 产物立体构型纯度 (d.e.)>99%。 反应结束后, 加入等体积乙酸乙酯萃取两次, 合并 有机相并蒸发脱去溶剂, 得到产物 490〜500 g。

[0023; 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点 , 其 g的在于让熟悉此项技术的人士 能够了解本发明的内容并据以实施, 并不能以此限制本发明的保护范围。 1根据本发明精神 实质所作的等效变化或修饰, 都应涵盖在本发明的保护范围之内。