Die neuen Mikroorganismen bzw. die diesbezüglichen DNA Fragemente oder Polypeptide werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol ausgehend von Isopropylamin (IPA) eingesetzt und für ein neues Verfahren zur Herstellung von y- Glutamylamiden, insbesondere auch zur Herstellung von Theanin ausgehend von Ethylamin.

L-Alaninol ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Pharmazeutika wie beispielsweise zur Herstellung von Ofloxacin (J. Med. Chem 1997, 30, 2283-2286).

Ein biotechnologisches Verfahren für die Herstellung von L-Alaninol ist in WO 99/07199 beschrieben. Die dort beschriebenen Mutanten Pseudomonas sp. KIE171-B und-BI sind befähigt, L-Alaninol aus IPA herzustellen. Allerdings bauen beide Mutanten das enstandenene L-Alaninol wieder ab, was nachteilig für eine industrielle Anwendung dieses Verfahrens ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, ein industriell gangbares Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol und, als Teilschritt, zur Herstellung von N-5-substituierten y- L-Glutamylamiden zur Verfügung zu stellen, mit dem hohe Ausbeuten an L-Alaninol bzw.

N-5-substituierten y-L-Glutamylamiden erzielt werden können.

Diese Aufgabe wird mit den erfindungsgemässen Mikroorganismen, Nukleinsäuren sowie Polypeptiden gemäss den Ansprüchen 1, 4, 10, 11, 12, 13 und 17 und mit den Verfahren gemäss den Ansprüchen 16 und 20 gelöst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach Mikroorganismen, die befähigt sind, IPA zu L-Alaninol zu transformieren und bei denen die Gene ipuH und ipul, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligt sind, inaktiviert sind, sowie zellfreie Enzymextrakte daraus.

Unter Genen, die in inaktiver Form vorliegen, werden Gene verstanden, die z. B. durch Insertion, Mutation oder Deletion auf solche Weise verändert wurden, dass entweder kein Produkt mehr gebildet wird, oder das gebildete Produkt funktionell nicht mehr aktiv ist.

Die Gene ipuH und ipul, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligt sind, können nach bekannten Methoden inaktiviert werden.

Zweckmässige Methoden zur Inaktivierung, sogenannte knock out"-Methoden, sind beispielsweise Mutationsmethoden wie die Punktmutations-Methode, Frameshift-Methode, Deletionsmethode oder die Transposon-Insertionsmethode. Weiter können Methoden zur ortsspezifischen Rekombination der entsprechenden Gene mit einem vorher inaktivierten Gen eingesetzt werden, wie z. B. in Hoang et al., 1998, Gene 212, 77-86 beschrieben, welche bevorzugt eingesetzt werden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Abbildungen näher erläutert. Bei den in Figuren 4, 5 und 6 dargestellten Plasmiden zeigen die Zahlen in Klammern die Position der Nukleotide innerhalb der in SEQ ID No. 1 beschriebenen Nukleotidsequenz des ipuI-Gens.

Bei den in Figuren 7, 8 und 9 dargestellten Plasmiden zeigen die Zahlen in Klammern die Position der Nukleotide innerhalb der Nukleotidsequenz des ipu-operons (Fig. 3).

Fig. 1 zeigt die Enzyme, die an der Verstoffwechselung von IPA und L-Alaninol beteiligt sind und einen neuen Abbauweg für IPA.

Fig. 2 zeigt die Transposoninsertionen und die Anordnung der ipu-Gene von Pseudomonas sp. KIE171-BI (DSM 11629) und Pseudomonas sp. KIE171-BII (DSM 13389).

Fig. 3A bis 3N zeigen die Nukleotid-und die Aminosäuresequenz der Gene ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG und ipuH des ipu-operons.

Fig. 4 zeigt Plasmid pME4254.

Fig. 5 zeigt Plasmid pME4255.

Fig. 6 zeigt Plasmid pME4256.

Fig. 7 zeigt Plasmid pME4257.

Fig. 8 zeigt Plasmid pME4259.

Fig. 9 zeigt Plasmid pME4267.

Fig. 10 zeigt Plasmid pME4275.

Fig. 11 zeigt Plasmid pME4277.

Fig. 12 zeigt die Produktion von L-Alaninol durch Pseudomonas sp. KIE171-BI (DSM 11629) und Pseudomonas sp. KIE171-BIII (DSM 13177).

Fig. 13 zeigt die Substratspezifität der y-Glutamylamid-Synthethase.

Als Ausgangs-Mikroorganismen für die Herstellung der erfindungsgemässen Mikroorganismen können Mikroorganismen dienen, die befähigt sind IPA zu L-Alaninol zu überführen und die die Gene ipuH und ipuI, die für Enzyme der Verstoffwechselung von L-Alaninol codieren, in aktiver Form enthalten bzw. bei denen eines dieser Gene in inaktiver Form vorliegt.

Zweckmässig werden die Ausgangs-Mikroorganismen, in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle, Mineralsalze und eine Vitaminquelle enthält, auf übliche Weise gezüchtet (kultiviert) und bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C, bevorzugt von 30 bis 37 °C, und bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt bei einem pH- Wert von 6 bis 8, kultiviert. Bevorzugt werden als Ausgangs-Mikroorganismen Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, besonders bevorzugt die in der WO 99/07199 des gleichen Anmelders beschriebenen Pseudomonas sp. KIE171-BI (DSM 11629), KIE171-B (DSM 11521) bzw. KIE171 (DSM 12360), eingesetzt.

Vorteilhaft werden diese Mikroorganismen, wie in WO 99/07199 des gleichen Anmelders beschrieben, aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Technilcen angezogen und bzgl. der Transformation von IPA zu L- Alaninol selektioniert.

Die an der Verstoffwechselung von IPA und L-Alaninol beteiligten Gene können unter Zuhilfenahme üblicher Techniken wie z. B. durch Transposon-Insertionsmethode markiert

und anschliessend durch die sogenannte"transposon rescue"Technik wie z. B. in De Lorenzo V., Timmis K. N., Methods Enzymol., 1994, 235, 386-405 beschrieben, identifiziert, isoliert, sequenziert und kloniert werden. Hierbei können die weiter unten beschriebenen erfindungsgemässen DNA-Fragmente aus den Ausgangs-Mikroorganismen isoliert werden. Die durch die DNA-Fragmente codierten Enzyme der Verstoffwechselung von IPA und L-Alaninol können in üblicher Weise zugeordnet werden.

Die Gene ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG, ipuH, ipul wurden hierbei isoliert.

Diesen wurden nach üblichen Vergleichsmethoden mit bekannten Sequenzen die entsprechenden möglichen Enzymfunktionen zugeordnet. Aus diesen möglichen Funktionen der an der Verstoffwechselung von IPA und L-Alaninol beteiligten Enzyme wird (s. Tab. 2) ein neuer Abbauweg für IPA vorgeschlagen (Figur 1).

Je nachdem, ob die Ausgangs-Mikroorganismen wie oben beschrieben die Gene ipuH und ipuI, die für an der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligte Enzyme codieren, entweder beide in alctiver Form enthalten oder eines dieser Gene in inaktiver Form vorliegt, werden zweckmässig eines oder beide der Gene ipuH und ipuI in einen geeigneten Vektor, z. B. ein Plasmid, kloniert und inaktiviert, z. B. durch Insertion einer Markergenkassette wie beispielsweise eines für Antibiotika-Resistenz kodierenden Gens.

Das erhaltene Konstrukt wird zweckmässig in einen Vektor, z. B. ein Plasmid, kloniert, der in einem geeigneten Wirtsorganismus wie z. B. E. coli, nicht aber in dem Ausgangs- Mikroorganismus repliziert werden kann. Nach Übertragung des Vektors z. B. durch Konjugation in den Ausgangsmikroorganismus, Selektion auf das Produkt des entsprechenden Markergens und anschliessender Deletion des ins Chromosom integrierten Plasmids sowie des aktiven ipuH und/oder ipuI Gens kann der erfindungsgemässe Mikroorganismus erhalten werden, bei dem die Gene ipuH und ipuI, die für Enzyme der Verstoffwechselung von L-Alaninol codieren, inaktiviert sind.

Die erfindungsgemässen Mikroorganismen, bei denen die für Enzyme der Verstoffwechselung von L-Alaninol codierenden Gene ipuH und ipuI inaktiviert sind, gehören bevorzugt zur Gattung Pseudomonas, besonders bevorzugt zur Spezies Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas azalaica, Pseudomonas nitroreducens,

Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas aeruginosa oder Pseudomonas putida, am bevorzugtesten zur Species Pseudomonas sp. entsprechend der Species des hinterlegten Stammes Pseudomonas sp. KIE171-BIII (DSM 13177). Mitumfasst sind auch die funlctionell äquivalente Varianten bzw. Mutanten. Der hinterlegte Stamm DSM 13177 stellt eine solche bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Der Mikroorganismus Pseudomonas sp. KIE171-BIII (DSM 13177) wurde am 03. 12. 1999, bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt. Der Stamm KIE171-B (DSM11521), von dem sich die Stammmutanten der B-Serie ableiten, wurde taxonomisch untersucht. Die phylogenetische Analyse ergab die Einordnung als eine eigene neue Spezies der Gattung Pseudomonas, mit der grössten Ähnlichkeit zur bekannten Spezies Pseudomonas citronellolis. Chemotaxonomische Analysen (ausführlich dargestellt in der WO 99/07199) bestätigten die Zugehörigkeit der neuen Spezies zur RNA- Gruppe I der Pseudomonaden (umfassend u. a. Pseudomonas citronellolis und Pseudomonas aeruginosa).

Unter"funlctionell äquivalenten Mutanten"werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen der Ursprungsmilcroorganismen besitzen. Solche genetischen Varianten oder Mutanten können durch hinreichend bekannte Methoden, u. a. Zufallsmutagenese z. B. mit UV-Strahlung oder alkylierende Reagentien (beschrieben in Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972),\'error prone\'-PCR oder Gene-\'shuffling\'von von polymorphen DNA- Sequenzen in vitro und anschliessender Rückübertragung dieser Genfragmente in einen Organismus, oder aber spontan durch die natürliche Mutationsrate von Mikroorganismen erzeugt werden.

Die erfindungsgemässen Enzyme bzw. Enzymextralcte für das zellfreie System können durch Aufschliessen der Mikroorganismen nach üblichen Methoden gewonnen werden.

Hierzu kann beispielsweise die Ultraschall-, French-Press-oder Lysozym-Methode verwendet werden. Die zellfreien Enzyme können auch auf einem geeigneten Trägermaterial immobilisiert werden, wie dem Fachmann hinreichend bekannt.

Zweckmässig werden die erfindungsgemässen Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff-, Stickstoffquelle, Mineralsalze und eine Vitaminquelle enthält, auf übliche Weise, vorteilhaft wie in WO 99/07199 beschrieben, angezüchtet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind isolierte DNA-Fragmente, die eines oder mehrere der Gene ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG, ipuH, ipul umfassen, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von IPA zu L-Alaninol und der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligt sind. Diese erfindungsgemässen DNA- Fragmente werden vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas wie z. B.

Pseudomonas putida, Pseudomonasas citronellolis, Pseudomonas aeruginosa, Pseuodomonas alcaligenes, Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas azalaica isoliert, besonders bevorzugt aus Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas citronellolis oder der Spezies Pseudomonas sp. entsprechend der Species eines der hinterlegten Stämme bzw.

Stammmutanten Pseudomonas sp. KIE171 (DSM 12360), KIE171-B (DSM 11521), KIE171-BI (DSM 11629), Pseudomonas sp. KIE171-BII (DSM 13389) und/oder Pseudomonas sp. KIE171-BIII (DSM 13177), am bevorzugtesten aus Pseudomonas sp.

KIE171 (DSM 12360), Pseudomonas sp. KIE171-BI (DSM 11629) und/oder Pseudomonas sp. KIE171-BII (DSM 13389).

Der Mikroorganismus Pseudomonas sp. KIE171-BII (DSM 13389) wurde am 27. 03. 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt. Die anderen genannten Stämme wurden, wie vorstehend bereits beschrieben, im Rahmen der vorliegenden Anmeldung oder der WO 99/07199 des gleichen Anmelders, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt und sind Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.

Zweckmässig sind die Gene ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG, ohne oder zusammen mit ipuH, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von IPA zu L-Alaninol bzw. dem Katabolismus von L-Alaninol beteiligt sind, in einer bevorzugten Ausführungsform in der Reihenfolge ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG, und optional ipuH, angeordnet und liegen als eine einzige Transkriptionseinheit (Operon) vor.

Das Gen IpuI wird bevorzugt durch die in der SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotid- Sequenz umfasst.

Die Gene ipuA, ipuB, ipuC, ipuD, ipuE, ipuF, ipuG, ipuH werden bevorzugt durch die in Figur 3 dargestellte Nuldeotid-Sequenz umfässt. Hierin umfasst die Nukleotidsequenz von 1314 bis 2339 die Protein codierende Region des Gens ipuA, die Nuldeotidsequenz von 2342 bis 2677 die Protein codierende Region des Gens ipuB, die Nuldeotidsequenz von 2743 bis 4119 die Protein codierende Region des Gens ipuC, die Nukleotidsequenz von 4194 bis 5351 die Protein codierende Region des Gens ipuD, die Nukleotidsequenz von 5371 bis 5562 die Protein codierende Region des Gens ipuE, die Nukleotidsequenz von 5589 bis 6473 die Protein codierende Region des Gens ipuF, die Nukleotidsequenz von 6533 bis 7960 die Protein codierende Region des Gens ipuG und die Nukleotidsequenz von 8051 bis 9571 die Protein codierende Region des Gens ipuH.

Die Gene ipuA und ipuB werden besonders bevorzugt durch die in der SEQ ID No. 3 dargestellte Nulcleotidsequenz umfasst.

Das Gen ipuC wird besonders bevorzugt durch die in der SEQ ID No. 6 dargestellte Nukleotidsequenz umfasst.

Die Gene ipuD, ipuE, ipuF, ipuG und ipuH werden besonders bevorzugt durch die in der SEQ ID No. 8 dargestellte Nukleotidsequenz umfasst.

Diese Nulcleotid-Sequenzen gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen auch funktionell aequivalente genetische Varianten, auch als Allele oder Mutanten bezeichnet, d. h. nicht- identische Gene, die sich in ihrer Basensequenz von den Genen der Organismen, aus denen die Gene isoliert wurden, ableiten und deren Genprodukte (Proteine) die gleiche enzymatischen Funktion ausüben können.

Die funktionell aequivalenten genetischen Varianten bzw. Mutanten umfassen somit beispielsweise Basenaustausche im Rahmen der bekannten Degeneration des genetischen Codes, beipielsweise um die Gensequenz an die bevorzugte Codon-Verwendung eines bestimmten Mikroorganismus, in dem eine künstliche Expression erfolgen soll, anzupassen. Die genetischen Varianten und Mutanten umfassen auch Deletionen, Insertionen und Substitutionen von Basen oder Codons, soweit die Genprodukte derart veränderter Gene in ihrer biologischen Funktion im wesentlichen unverändert bleiben.

Umfasst werden von diesen aequivalenten genetischen Varianten bzw. Mutanten bevorzugt Gensequenzen, die zu den aus den Organismen isolierten Sequenzen eine hohe Sequenzhomologie, beispielsweise höher als 70%, bevorzugt höher als 80%, besonders bevorzugt höher als 90%, aufweisen und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, z.

B. bei Temperaturen zwischen 60 und 70 °C und bei 0, 5 bis 1, 5 M Salzanteil, insbesondere bei einer Temperatur von 62-66 °C und bei 0, 8-1, 2 M Salzanteil zur Hybridisierung mit dem Komplement der isolierten Sequenzen befähigt sind.

Auf der Ebene des Translationsprodulctes, d. h. des Polypeptides oder Proteins, beträgt die Homologie bevorzugt 95%.

Die Isolierung der erfindungsgemassen DNA-Fragmente kann beispielsweise wie oben beschrieben unter Zuhilfenahme üblicher Techniken wie z. B. durch Transposon- Insertionsmethode und anschliessenden Einsatz der"transposon rescue"Technik, oder durch Verwendung einer geeigneten Gensonde zusammen mit einer geeigneten Genbank durchgeführt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Velctoren, die diese DNA-Fragmente enthalten und rekombinante Mikroorganismen, die diese Vektoren enthalten.

Als Vektoren können autonom-und selbstreplizierende Plasmide oder Integrationsvektoren verwendet werden.

Abhängig von der Art der gewählten Vektoren können die ipu-Gene in verschiedene Mikroorganismen eingebracht werden. Als Vektoren eignen sich sowohl Vektoren mit spezifischem Wirtsspektrum als auch Vektoren mit breitem Wirtsspektrum «, broad host range").

Beispiele für Vektoren mit spezifischem Wirtsspektrum z. B. für E. coli sind der handelsübliche pBLUESCRIPT II KS+ (\', pBLUESCRIPT SK+ (8) (Stratagene), pPDl l l oder dessen Derivate (beschrieben in Dersch et al., FEMS Microbiol Lett. 15, 123, 19-26, 1994), pET24a (+) (Novagen) oder pET28a (+) (Novagen). Vorzugsweise wird pBLUESCRIPT II KS+@, pPDl 11 oder dessen Derivate oder pET28a (+) angewendet.

Als"broad host range"Vektoren können alle Vektoren eingesetzt werden, die für Gram- negative Bakterien geeignet sind.

Beispiele für solche"broad host range"Vektoren sind pRK290 (beschrieben in Ditta et al., PNAS, 77, 7347-7351, 1980) oder dessen Derivate, pKT240 (beschrieben in Bagdasarian et al., Gene, 26, 273-282, 1983) oder dessen Derivate, pVK100 (beschrieben in Knauf und Nester, Plasmid, 8, 45-54, 1982) bzw. dessen Derivate, pBBRIMCS (beschrieben in Kovach et al., Biotechniques 16 : 800-802, 1994) bzw. dessen Derivate. Die genannten Vektoren, insbesondere der Expressionsvektor pBBRIMCS, stellen gleichzeitig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

Basierend auf einem solchen Vektor wurde beispielsweise das Plasmid pME4755 erhalten.

Vorzugsweise wird ein Vektor mit spezifischem Wirtsspektrum, insbesondere bevorzugt pPDl 11, pBLUESCRIPT II KS+\'@ oder pET28a (+) eingesetzt.

Auf diese Weise wurden beispielsweise die Plasmide pME4254, pME4255, pME4256, pME4257, pME4259, pME4267, pME4275 und pME4277 erhalten.

Zweckmässige Mikroorganismen, die die genannten Vektoren enthalten, sind Mikroorganismen der Gattung Escherichia, bevorzugt der Spezies Escherichia coli, besonders bevorzugt der Spezies Escherichia coli DH5a und Escherichia coli XLl-Blue.

Insbesonders bevorzugte Vektoren sind Vektoren wie Plasmid pME4255 wie hinterlegt in E. coli DH5a (DSM 13178), Plasmid pME4755 wie hinterlegt in E. coli XLl-Blue (DSM \'13388), Plasmid pME4267 wie hinterlegt in E. coli XLl-Blue (DSM 13179), und Plasmid pME4259 wie hinterlegt in E. coli XLl-Blue (DSM13417).

Die Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli DH5a (DSM 13178) und Escherichia coli XLl-Blue (DSM 13179), jeweils enthaltend Plasmid pME4255 bzw. pME4267, wurden am 03. 12. 1999 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt. Der Mikroorganismus der Spezies Escherichia XLl-Blue (DSM 13417),

enthaltend Plasmid pME4259, wurde am 31. 3. 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt. Der Mikroorganismus der Spezies Escherichia XL1- Blue (DSM 13388), enthaltend Plasmid pME4755, wurde am 24. 3. 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg I b, D-3 8124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von L-Alaninol, das einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Anmeldung darstellt, umfasst die Umsetzung von Isopropylamin (IPA) zu L-Alaninol mittels den bereits oben beschriebenen erfindungsgemässen Mikroorganismen, bei denen die Gene ipuH und ipul, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligt sind, inaktiviert sind, oder mittels Enzymextrakten aus diesen Mikroorganismen. L-Alaninol im Sinne der vorliegenden Erfindung ist L-2-Amino-l-propanol.

Die Biotransformation kann im Falle der Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen Mikroorganismen, bei denen die Gene ipuH und ipul, die für Enzyme codieren, welche an der Verstoffwechselung von L-Alaninol beteiligt sind, inaktiviert sind oder die generell nicht befähigt sind, L-Alaninol zu verstoffwechseln, aber über die notwendigen Biosynthesegene verfügen, wie bereits in WO 99/07199 beschrieben durchgeführt werden. Die diesbezüglichen Angaben der WO 99/07199 zum Biotranformationsverfahren, der Isolation des L-Alaninols und zur Anzucht der erfindungsgemässen Mikroorganismen ist integraler Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Eine erste Analyse des mehrstufigen Biosyntheseweges und der darin beteiligten Enzymaktivitäten ist, wie bereits oben gesagt, in Fig. 1 gegeben. Die oben beschriebenen erfindungsgemässen Mikroorganismen verfügen entweder als Wildtyp über die notwendigen Biosynthesegene, oder aber sind rekombinant mit den entsprechenden erfindungsgemässen DNA-Fragmenten bzw. Proteinexpressionsvektoren wie z. B. pME4755 in E. coli, ausgestattet worden. Es ist auch möglich, in den erfindungsgemässen, zur L-Alaninol Biosynthese befähigten Mikroorganismen rekombinant einzelne oder mehrer ipu-Gene, zusätzlich rekombiant zu exprimieren.

Die Biotransformation kann mit ruhenden Zellen (nicht wachsenden Zellen, die keine C- und Energiequelle mehr benötigen bzw. diese nicht zur Verfügung steht) oder mit wachsenden Zellen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird mit einer Zellsuspension mit einer Zelldichte von OD650 = 40-60 gearbeitet.

Als Medien für die Biotransformation können die fachmännisch üblichen, beispielsweise niedermolare Phosphatpuffer, Hepes-Puffer und Vollmedien wie"Nutrient Yeast Broth" (NYB) oder Mineralsalzmedien wie beispielsweise beschrieben bei Kulla et al., (Arch.

Microbiol. 135, 1 (1983)), oder in W099/07199 (Tabelle 1) verwendet werden.

Bevorzugt werden Mineralsalzmedien wie beispielsweise beschrieben bei Kulla et al., (Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)), oder in W099/07199 (Tabelle 1) verwendet.

Bevorzugt wird die Biotransformation unter eimnaliger oder kontinuierlicher Zugabe von IPA so durchgeführt, dass die Konzentration an IPA 10 Gew. %, vorzugsweise 1 Gew. % nicht übersteigt.

Der pH-Wert kann in einem Bereich von 4 bis 10 vorzugsweise von 5 bis 9 liegen. Die Biotransformation wird zweckmässig bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C, vorzugsweise von 20 bis 40 °C, am bevorzugtesten von 25-35 °C, durchgeführt Vorzugsweise findet die Biotransformation in Gegenwart von von 5 bis 100 mM Glutamat, vorzugsweise 10 bis 30 mM Glutamat statt.

Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 100 h, vorzugsweise höchstens 30 h, kann L-Alaninol durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie beispielsweise durch Extralction oder Destillation der basischen, zellfreien Fermentationsbrühe isoliert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Polypeptid mit y-Glutamylamid- Synthetase-Aktivität, das befähigt ist y-Glutamylamide der allgemeinen Formel oder der allgemeinen Formel

worin R\'eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppe, eine gegebenenfalls substituierte Alkoxyalkylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe, W Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe und n eins bis fünf bedeuten, zu synthetisieren. Vorzugsweise ist Rl substituierte oder unsubstituierte Alkyl-oder Arylgruppe, bevorzugter eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe. Unter, gegebenenfalls substituiert\'ist substituiert oder unsubstituiert zu verstehen.

Unter einer Allcylgruppe ist eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe, vorzugsweise mit 1 bis 6 C-Atomen zu verstehen.

Namentlich erwähnt seien Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Pentyl und seine Isomeren sowie Hexyl und seine Isomeren. Zweclanassige Substituenten der Alkylgruppe sind beispielsweise Hydroxy, Oxo, Cyano oder Amino. Bevorzugter Substituent ist Hydroxy.

Unter einer Arylgruppe ist Phenyl oder Napthyl, unter Aralkyl beispielsweise Benzyl zu verstehen. Zweckmässiger Substituent der Arylgruppe ist Nitro.

Beipiele für Alkoxyalkyl sind z. B. Methoxy-ethyl, Ethoxy-ethyl.

Bevorzugt hat R1 die Bedeutung von Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec- Butyl, tert-Butyl, Pentyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-Hydroxyethyl, 1- Hydroxybutyl, 2, 2-Dihydroxyisopropyl. Besonders bevorzugt hat R\'die Bedeutung von 2- Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxybutyl. W hat bevorzugt die Bedeutung von Methyl, n hat bevorzugt die Bedeutung von eins oder zwei.

Das erfindungsgemässe Polypeptid kann wie oben erwähnt durch Einsatz üblicher Methoden zum Aufschliessen von Mikroorganismen, die dieses Polypeptid bzw. das für das Polypeptid codierende Gen ipuC von Natur aus enthalten, gewonnen werden.

Alternativ kann das für das Polypeptid codierende Gen ipuC aus Mikroorganismen, die ein für das Polypeptid codierendes Gen ipuC enthalten, wie oben beschrieben isoliert, wie oben beschreiben kloniert und z. B. in E. coli BL21 mittels eines geeigneten Expressionsvektors, wie vorstehend beschrieben, exprimiert werden. Bevorzugt wird das Polypeptid bzw. das für das Polypeptid codierende Gen ipuC aus Mikroorganismen isoliert, die befähigt sind IPA in L-Alaninol zu transformieren.

Bevorzugt werden hierbei Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, besonders bevorzugt die in WO 99/07199 beschriebenen Pseudomonas sp. KIE171 (DSM 12360), KIE171-B (DSM 11521), KIE171-BI (DSM 11629), oder die erfindungsgemässen KIE171-BIII (DSM 13177) eingesetzt.

; Bevorzugt wird das erhaltene Gen ipuC nach der Isolation nach üblichen Methoden amplifiziert und in einen Vektor z. B. Vektor pET 28a (+) (Novagen) oder pET24a (+) (Novagen) ligiert und anschliessend in kompetente Zellen von E. coli z. B E. coli BL21 (DE3) transformiert.

Unter kompetenten Zellen werden Zellen verstanden, die in der Lage sind freie, auch artfremde DNA aufzunehmen.

Die Kultivation der so erhaltenen transformierten Zellen erfolgt in den üblichen Nähr- Medien, die eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle, Mineralsalze und eine Vitaminquelle enthalten, z. B. in LB-Medium, wobei das erfindungsgemässe Polypeptid mit y- Glutamylamid-Synthetase-Aktivität wie bereits oben erwähnt durch Aufschliessen der

Mikroorganismen mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen werden kann oder aber die ganzen Zellen als solche, optional nach Vorbehandlung mit permeabilisierenden Agentien, mit dem darin exprimiertem rekombinantem Protein für die Biotransformation verwandt werden können.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemässe Polypeptid ein für eine vereinfachte Aufreinigung getagtes Protein, insbesondere His6Tag-y-Glutamylamid-Synthetase wie exprimierbar von pME4275.

Durch Einbau des Gens ipuC in Vektor pET24a (+) wurde Plasmid pME4277 erhalten.

Vorteilhaft wird das Gen ipuC in Vektor pET 28a (+) eingebaut, welcher in E. coli BL21 (DE3) transformiert wird. Auf diese Weise wurde Plasmid pME4275 erhalten, welches das Gen ipuC angrenzend an eine DNA-Sequenz, die für sechs Histidine kodiert enthält, und welches für das Polypeptid y-Glutamylamid-Synthetase, an welches sechs Histidinreste angehängt sind (His6Tag-y-Glutamylamid-Synthetase), codiert. Vermittels des Histidin- Tags ist eine einfache, schnelle Auf-oder Anreinigung des getaggten Proteins möglich, z. B. für den Einsatz in einem Enzymreaktor. Es ist auch möglich, andere Tag-Sequenzen zu verwenden, wie dem Fachmann hinreichend bekannt, beispielsweise Protein A- Fusionen oder das FLAG-Tag.

Mikroorganismen der Spezies E. coli BL21 (DE 3) (DSM 13180) enthaltend Plasmid pME4275 wurden am 03. 12. 1999, bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.

Das erfindungsgemässe Polypeptid mit y-Glutamylamid-Synthetase-Aktivität, das befähigt ist y-Glutamylamide der allgemeinen Formel I oder II zu synthetisieren ist vorzugsweise durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet : a) Substratspezifität für Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin, Glycinmethylester, Propylamin, l-Amino-2- propanol, 3-Amino-l-propanol, Isopropylamin, L-Alaninol, D-Alaninol, 2-Amino-1, 3-

propandiol, Butylamin, 4-Aminobutyratmethylester, Isobutylamin, sec-Butylamin, S-2- Amino-1-butanol, R-2-Amino-l-butanol, tert-Butylamin und/oder Pentylamin. b) Molekulargewicht des Monomers : 52478 Da Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von y- Glutamylamiden der allgemeinen Formel I oder II, welches derart durchgeführt wird, dass L-Glutamat mit einem Amin der allgemeinen Formel oder der allgemeinen Formel worin Rl und R2 die oben genannte Bedeutung haben, mittels eines erfindungsgemassen Mikroorganismus oder mittels eines das IpuC-Gen erfindungsgemäss rekombinant exprimierenden Mikroorganismus oder mittels eines erfindungsgemässen Polypeptides, wie sämtlich oben beschrieben, zum Produkt der allgemeinen Formel I oder II umgesetzt wird.

Die Umsetzung kann auch mit im wesentlichem zellfreie Enzymextrakt aus den entsprechenden Mikroorganismen oder mit gereinigtem Polypeptid durchgeführt werden.

Methoden zur Herstellung eines Enzymextraktes sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen z. B. den Zellaufschluss mittels French Press, die Lysozymmethode, Ultraschallbehandlung.

Die Umsetzung kann beispielsweise in einem Puffer wie beispielsweise Tris-HCl zusammen mit Imidazol unter Zugabe von ATP und-Magnesium Ionen durchgeführt werden.

Der pH-Wert kann in einem Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 5 bis 8 liegen. Die Umsetzung wird zweckmässig bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C, vorzugsweise von 20 bis 40 °C, am bevorzugtesten von 25 bis 35 °C, durchgeführt.

Beispiele geeigneter Amine für das vorliegende Verfahren sind z. B. im Abschnitt, Weitere gebildete Glutamylverbindungen\', auf S. 23, Beispiel 4, aufgelistet.

Die Glutamatkonzentration ist bevorzugt 1 bis 100 mM, weiter bevorzugt 10-30 mM. Geeignete Substratkonzentrationen für das Amin sind beispielszweise 1-200 mM, vorzugsweise 10-100 mM.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Amin ein primäres Amin der allgemeinen Formel III. Beispiele sind Benzylamin, Ethylamin, Isopropylamin, Butylamin, Isobutylamin, Hydroxy-Butylamin. Die oben gegebenen Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen von R\'gelten entsprechend.

Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 20 h können y-Glutamylisopropylamide der allgemeinen Formel I oder II durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie beispielsweise durch isoelektrische Fokussierung oder Extraktion isoliert werden.

Bevorzugt wird das Verfahren mit ganzen Zellen durchgeführt, analog der Herstellung von L-Alaninol. Die dort gemachten Angaben zur Verfahrensdurchführung gelten entsprechend. Bevorzugt wird dazu bei der Aufzucht der Biomasse bzw. bei Verwendung wachsender Zellen eines erfindungsgemässen Mikroorganismus als Zusatz zum Biotransformationsmedium neben dem als Substratmolelcül der Formel III oder IV dienendem Amin eine weiteres, primäres niedermolekulares C1-C4 Alkyl-Amin, beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Isopropylamin, als Erizyminduktor hinzugegeben. Am

bevorzugtesten handelt es sich um IPA, zweckmässig in einer Konzentration von 1-20 mM, vorzugsweise in einer Konzentration von 1-10 mM. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft bei Verwendung eines erfindungsgemässen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, insbesondere des Stammes KIE-171-BIII (DSM 13177).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Theanin ausgehend von Ethylamin genutzt. Das Verfahren kann mit erfindungsgemässen Mikroorganismen, gereinigtem Polypeptid oder Enzymextrakten wie oben genannt durchgeführt werden. Bevorzugt werden zur Theaninherstellung wachsende Zellen bei niedriger Zelldichte, zweckmässig bei einer Zelldichte von OD650=5 bis 20, am bevorzugtesten bei einer Zelldichte von ungefähr OD650=10, verwandt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration von Ethylamin 5-60 mM und wird während der Biotransformation, durch wiederholte oder kontinuierliche Zugabe von Ethylamin, ungefähr konstant gehalten. Theanin im Sinne der vorliegenden Anmeldung ist N-5-Ethyl-L-glutamin entsprechend der Formel I.

Beispiele : Beispiel 1 Aufklärung des ipu-operons Klonierung des ipu-operons Gene, die für Proteine kodieren, welche am IPA-Abbau beteiligt sind, konnten dank der Transposon Mutanten BI (Pseudomonas sp. KIE171-BI (DSM 11629)) und BII (Pseudomonas sp. KIE171-BII) ermittelt werden. Die Herstellung von Transposon Mutanten wurde in WO 99/07199 (Beispiel 2b) für die Herstellung von Mutante BI beschrieben. Die Mutante BI kann L-Alaninol aus IPA herstellen baut dieses aber bei einer Biotransformation mit hohen OD650 (>5) wieder ab.

Entsprechend diesem Verfahren wurde ebenfalls die Mutante BII hergestellt. Die Mutante BII wuchs weder auf IPA noch auf L-Alaninol, konnte aber weiterhin L-Alanin, L-Lactat und L-Alanin, und L-Glutamat verwerten. Die Mutante BII stellt kein L-Alaninol her.

Die durch die Transposon Insertion unterbrochenen Gene der Mutanten BI und BII konnten durch die\'transposon rescue\'Technik kloniert, und deren Sequenz konnte ermittelt werden. Dazu wurden die DNA-Fragmente, die das inaktivierte Gen enthielten, in einen geeigneten Vektor kloniert. Die\'upstream\'und\'downstream\'Regionen dieser Insertion wurden sequenziert. DNA-Sequenzen und die abgeleiteten Proteinsequenzen wurden mit dem GCG Software Paket analysiert. Anhand dieser Ergebnisse wurde ein neuer Abbauweg von IPA postuliert.

Konstruktion der Plasmide Die durch die Transposon Insertion unterbrochenen Gene der Mutanten BI und BII wurden entsprechend der\'transposon rescue\'Technik kloniert. Es wurden je 25 ml Übernacht- Kulturen der Mutanten BI und BII in Minimalmedium (MM) (WO 99/07199, Beispiel l, Tabelle) in Anwesenheit von L-Glutamat (20 mM) und mit Kanamycin (Km) (50 pg/ml) in einer 50 ml Flasche angezogen. Davon wurden 10 ml bei 4000 g während 10 Minuten zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde die genomische DNA aus dem Sediment isoliert. Die präzipitierte genomische DNA wurde in 100 je. l sterilem Wasser gelöst. Anschließend wurde die genomische DNA der Mutante BI und BII sowie der

Vektor pBluescript KS+ sowie der Vektor pPDl 11 mit den Restriktionsenzymen XhoI, SacI, oder NotI und XhoI entsprechend dem üblichen Protokoll verdaut.

Die DNA-Fragmente der Mutanten BI und BII wurden in die Vektoren pBluescript oder pPD 111 ligiert. Die Ligationsmischung wurde für die Transformation von kompetenten E. coli DH5a oder kompetenten E. coli XL-I Blue Zellen verwendet.

Die transformierten Zellen wurden auf LB-Platten mit Km (50 llg/ml) oder Ampicillin (Amp) (200 tg/ml) bzw. Chloramphenicol (Cm) (30 llg/ml) ausplattiert und bei 37 °C 16 h inkubiert. Die daraufhin erhaltenen Kolonien wurden auf das Vorhandensein der Plasmide pME4254, pME4255, pME4256, pME4257, pME4259 und pME4267 (Tabelle 1) getestet.

Tabelle 1 Plasmid Genotyp oder Beschreibung pME4254 8 kb ClaI Insert von BI in pBluescript II KS+ pME4255 5, 2-kb NotI-XhoI Insert von BI in pBluescript II KS+ pME4256 3 kb SfiI A Insert in pME4255 pME4257 18-23 kb, NotI-XhoI Insert von BII in pBluescript II KS+ pME4259 19-23 kb, XhoI Insert von BII in pBluescript II KS+ pME4267 8 kb SacI Insert von BII in pPD111 pME4755 ipuABCDEFG Operon unter Kontrolle T7 Promotor Um die Lange der zu sequenzierenden DNA zu verkürzen, wurde das DNA-Fragment des Kanamycin-Resistenz-Gens, welches durch das Mini-Tn5 eingebracht worden war, durch Verdauung mit dem Enzym SfI und anschliessende Ligation im Plasmid pME4255 entfernt. Es entstand das Plasmid pME4256.

Um die ipuABCDEFG-Gene als ein Operon unter die Kontrolle des T7-RNA-Polymerase- Promotors zu stellen, wurden sie in pBBRIMCS (Kovach et al., ibd.) kloniert. Zunächst wurde ein 3, 8 kb XhoI-SacI Fragment aus pME4259 in die XhoI-Sacl Restriktionsstellen von pBluescript II KS (+) kloniert. The 3 kb Bgl II-SacI Transposon-Insertion in ipuC, die dieses Plasmid noch enthielt, wurde durch das 0. 95 kb BglII-SacI Fragment der nativen ipuC Sequenz ersetzt ; das so entstandene Plasmid umfasst ipuB und ipuC. Aus diesem Vektor wurde ein 1. 6 kboI-PvMlI Fragment ausgeschnitten und zusammen mit einem weitere ipu-Gene umfassendem 4. 4 kb PvuII-PstI Fragment enthalten in pME4257 in pBBRl-MCS, der zuvor mitXhoI-PstI linearisiert worden war, kloniert. Das so entstandene intermediäre Plasmid umfasste die Gene ipuBCDEFG. Um ipuA ohne den Promotor hinzuzufügen, wurde ein XbaI Schnittstelle unmittelbar upstream des ipuA-Gens mit PCR und den Primern GCCTTCTAGAATTCTTGTAGG und CACCCAGCCTAATCGTGTCG erzeugt. Das PCR Fragment wurde mit XbaI und SoI verdaut und in pBBRIMCS kloniert. Die Abwesenheit einer durch die PCR erzeugten unbeabsichtigten Mutation in der ipuA-Sequenz wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Schliesslich wurde das 11. 6 kb Plasmid pME4755 durch Umklonieren des 0. 9 kb XbaI- XhoI ipuA-Fragmentes in das intermediäre Plasmid, das mit XbaI-XhzoI linearisiert worden war, erzeugt.

Sequenzierung Die Sequenzierung wurde durch die Firma Microsynth durchgeführt. Die DNA Sequenzen wurden doppelsträngig nach der\'dideoxy chain termination method\'nach Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1977, 5463-5467, ermittelt. Zum Sequenzieren wurden die Plasmide pME4254, pME4256, pME4259, pME4267 und pME4275 verwendet.

Analyse der DNA und Proteinsequenz Die Analyse von DNA-Sequenzen und von Protein-Sequenzen wurde mit der\'Genetics Computer Group Package Version 9\'durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Anhand dieser Resultate wird der Abbauweg von IPA, wie in Figur 1 beschrieben, postuliert.

Tabelle 2 ORF (aa) identität (aa) AC Funktion Organismus (aa) BI IpuI 546 29.7% Identität in 481 P41751 Aldehyd Dehydrogenase Aspergillus niger 497 30.8% Identität in 481 P08157 Aldehyd Dehydrogenase Emericella nidulans 497 29.9% Identität in 481 P40108 Aldehyd Dehydrogenase Cladosporium herbarum 496 BII IpuA 343 26.8% Identität in 325 P80880 Thioredoxin Reductase Bacillus subtilis 315 28.9% Identität in 308 P23160 Thioredoxin Reductase Clostridium pasteurianum 308 27.3% Identität in 297 Q05741 Thioredoxin Reductase Streptomyces clayuligerus 321 IpuB 113 48.0% Identität in 100 Q1839 Ferredoxin Streptomyces griseus 105 43.1% Identität in 102 P13279 Ferredoxin Mycobacterium smegmatis 106 42.7% Identität in 103 P00215 Ferredoxin Saccharopolyspora erythraea 105 IpuC 460 33.5% Identität in 421 P36205 Glutamin Synthetase Thermotoga maritima 439 30.1% Identität in 419 p10656 Glutamin Synthetase Clostridium acetobutylicum 443 28.6% Identität in 385 P45627 Glutamin Synthetase Lactobacillus delbrueckii 445 IpuD 387 30.9% Identität in 340 p00183 Cytochrome p450-cam Pseudomonas putida 414 27.5% Identität in 360 P26911 Cytochrome p450-soy Streptomyces griseus 412 30.1% Identität in 375 O08469 Cytochrome p450 Bacillus subtilis 410 IpuE 65 32.8% Identität in 64 P18325 Ferredoxin Streptomyces griseolus 64 40.3% Identität in 62 P29603 Ferredoxin Pyrococcus furiosus 66 37.1% Identität in 62 P00203 Ferredoxin Moorella thermoacetica 63 IpuF 296 24.3% Identität in 173 P04079 gmp Synthase Escherichia coli 525 25.4% Identität in 142 P29727 gmp Synthase Dictyostelium discoideum 718 26.4% Identität in 140 P44335 gmp Synthase Haemophilus influenzae 523 IpuG 477 21.5% Identität in 455 P24207 Phenylalanin-specifische permease Escherichia coli 456 17.7% Identität in 453 P46349 gaba Permease Bacillus subtilis 469 23.0% Identität in 370 Q46170 Arginine/Ornithine Antiporter Clostridium perfringens 476 IpuH 508 42.1% Identität in 484 O94788 Retinaldehyde-specific Dehydrogenase Typ 2 Homo sapiens (Human) 499 43.9% Identität in 481 P05091 Aldehyd Dehydrogenase, mitochondrial. Precursor Homo sapiens (Human) 517 42.3% Identität in 487 P47895 Aldehyd Dehydrogenase 6 Homo sapiens (Human) 512

Beispiel 2 Herstellung der Mutante BIII (Pseudomonas sp. KIE171-BIII (DSM 13177)) Das Plasmid pME4259 wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut und die Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Das 7 Icb Fragment wurde isoliert und gereinigt. Anschliessend fand ein zweiter Verdau des 7 kb Fragments mit SalI statt und eine erneute Auftrennung der DNA-Fragmente. Das 2. 7 kb SalllSmaI Fragment wurde isoliert und gereinigt und in den ebenfalls Sal1/SmaI verdauten \'low copy\' Vektor pPD111 kloniert. Das neu entstandene Plasmid pME4268 enthält das Gen ipuH als 2. 7 kb Insert.

Die Unterbrechung des ipuH-Genes fand durch Insertion eines Gentamycin-Resistenz- Genes statt. Dazu wurde pME4268 mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und die 5\'- überhängende Restriktionsenden wurden durch das Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I in einer\'fill-in\'-Reaktion unter Zusatz der vier Desoxynukleotide in glatte Enden umgewandelt. Das Gentamycin-Resistenz-Gen wurde aus dem Plasmid pUCGM durch Verdauung mit Snial als 855bp langes Fragment mit glatten Enden erhalten. Das Gentamycin-Resistenz-Gen wurde dann in das lineare pME4268 ligiert, so dass das SalllSmaI Insert eine Länge von 3. 55 kb aufweist. Das neu entstandene Plasmid ist pME4269.

Nach Sall/SmaI Verdauung des Plasmids pME4269 wurde das 3. 55 kb Fragment mit dem inaktiven ipuH in den ebenfalls mit sal1/SmaI verdauten Velctor pEXTC 18 umklolliert.

Plasmid pEXTC18 kann in Pseudomonaden nicht replizieren. Das neu entstandene Plasmid pME4270 trägt die Resistenzgene für Gm und Tetracyclin (Tc). Das Plasmid pME4270 wurde in E. coli S 17-kpir nach der CaCl2-Methode transformiert. S 17-kpir sind E. coli Zellen die für die Konjugation mit der Mutante BI geeignet sind.

E. coli S 17-Apir, welches das Plasmid pME4270 mit dem Gentamycin-und Tetracyclin- Resistenz-Gen enthält, wurde mit der Mutante BI konjugiert. Dabei wurde das Vorgehen, wie in WO 99/07199, Beispiel 2b beschrieben, gewählt. Unterschiede dazu sind : E. coli S 17-Xpir wurde in Anwesenheit der Antibiotika Gm (25 llg/ml) und Tc (35 llg/ml) auf LB bei 37°C aufgezogen. Die Mutante BI wurde in 25 ml MM mit L-Glutamat (20 mM) und Km (50, ug/ml) bei 30 °C aufgezogen. 300 p1 der Zellsuspension wurden direkt auf MM- Platten mit L-Glutamat (20 mM) und Gm (25 J. g/ml) ausplatiert und bei 30°C inkubiert.

Die daraufhin erhaltenen Kolonien wurden dann auf MM-Platten mit Tc (35 pg/ml) auf Wachstum getestet. Bei den Kolonien die in Gegenwart beider Antibiotika wachsen konnten, fand ein erfolgreicher erstes\'crossover\'des Plasmids pME4270 in die chromosomale DNA der Mutante BI statt.

Eine dieser Kolonien wurde auf MM-Flüssigkultur mit L-Glutamat (20 mM) und den Antibiotika Gm (25 pg/ml), Tc (35 llg/ml) und Km (50 ag/ml) über Nacht bei 30°C bei 150 rpm aufgezogen. Davon wurden je 300 u. l auf einer frischen LB-Platte mit Saccharose (5%) ausplatiert und bei 30°C über Nacht inkubiert. Die daraufhin erhaltenen Kolonien wurden auf Wachstum auf MM-Platten mit L-Glutamat (20 mM) und Tc (35 llg/ml) getestet. Die Mutante BIII (Pseudomonas sp. KIE171-BIII, Stamm DSM 13177) die aus diesem Vorgehen entstanden ist, hat den Phänotyp auf MM-Platten mit L-Glutamat (20 mM) und Gin (25 llg/ml) oder Km (50 llg/ml) wachsen zu können aber nicht mit Tc (35 u. g/ml). Bei Ihr hat ein zweites\'crossover\'stattgefunden. Dabei hat sie das ins Chromosom integrierte Plasmid mit dem aktiven ipuH Gen deletiert. Dies ermöglicht Saccharose zu tolerieren. Die Mutante BIII besitzt nur noch das durch Insertion der Gm-Resistenz Kassette inaktivierte ipuH Gen.

Beispiel 3 Biotransformation von IPA zu L-Alaninol mit der Mutante BIII Für die Biotransformation von IPA zu L-Alaninol benützte man eine 25 ml Übernacht- Vorkultur der Mutante BIII (Stamm DSM 13177). Diese wurde auf MM-Medium mit L- Glutamat (20 mM) angezogen und zum Animpfen einer Kultur von 250 ml in einer 11 Flasche des selben Mediums benützt. Nach Kultivierung von BIII bis zum Beginn der exponentiellen Phase (OD650 von 0. 3 bis 0. 6) wurde IPA (10 mM) zugegeben. Nach Erreichen einer OD650 von 1-1. 3 wurde die Kultur bei 4000 rpm 15 min. zentrifugiert und das Sediment zweimal mit der halben Menge an Kulturmedium ohne C-Quelle gewaschen.

Anschliessend konnten die Zellen im gewünschten Volumen MM-Medium mit L-Glutamat (25 mM) aufgenommen werden, so dass 3 ml konzentrierter Zellsuspension (ODso50) erhalten wurden. Die Kultur wurde bei 4°C 16 Stunden gelagert. Nach Zugabe von IPA (20, 50 bzw. 100 mM) schüttelt man diese Kultur mit 150 rpm bei 30 °C. Die Entnahme der Proben fand zu verschiedenen Zeitpunkten (1 h, 3 h, 5 h, 7 h, 23 h und 58 h) statt. Mit

den drei Anfangskonzentrationen von IPA (20, 50 bzw. 100 mM) wurde nach 58 h der Biotransformation eine L-Alaninol Endkonzentration von 8, 14. 5 bzw. 19 mM erreicht.

Dies entspricht einer molaren Ausbeute von 40, 29 bzw. 19 %. Es fand kein Abbau von L- Alaninol mehr statt. Der Verlauf der Biotransformation von BIII bei einer Anfangs- konzentration von 20 mM ist, verglichen mit der Biotransformation von BI, in Figur 12 dargestellt.

Beispiel 4 Herstellung von Glutamylisopropylamiden Klonierung des ipuC Gens : Es wurden 25 ml einer Übernacht-Kultur von Pseudomonas sp. KIE171 (DSM 12360) in MM (WO 99/07199, Beispiel l, Tabellel) in Anwesenheit von IPA (20 mM) bei 30 °C in einer 50 ml Flasche angezogen. Davon wurden 10 ml bei 4000 g während 10 Minuten zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde die genomische DNA aus dem Sediment isoliert. Die präzipitierte genomische DNA wurde in 20 µl sterilem Wasser gelöst und durch Messung der Absorption bei 260 nm quantifiziert.

Das ipuC Gen wurde mittels PCR aus der genomischen DNA von Pseudomonas sp.

KIE171 (DSM 12360) amplifiziert. Dafür wurden 2 ng/ul genomischer DNA, 0. 6 IM der Primer 5\'-AACAGGTGATACATATGAGCGAAG-3\'sowie 5\'-TTTGAAGCTTAGGATCTGGGCG-3\', 0. 2 mM dNTP, 1. 75 mM MgCl2, Pfu Puffer und 0. 015 U/µl Pfu DNA Polymerase in einem Endvolumen von 50 pu verwendet. Das 1. 4 kb große PCR Produkt wurde gereinigt und danach mit den Enzymen NdeI und HindIII verdaut und nochmals gereinigt. Das verdaute 1. 4 kb PCR Produkt wurde in den Vektor pET28a (+) (Novagen), welcher ebenfalls mit den Enzymen NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. Das neu entstandene Plasmid wurde pME4275 benannt und in kompetente Zellen von E. coli BL21 (DE3) nach der CaCl2-Methode transformiert. Analog wurde das verdaute 1, 4 kb PCR-Produlct in den Vektor pET24a (+) (Novagen) ligiert, was Plasmid pME4277 ergab.

Plasmid pME4275 enthält das Gen ipuC angrenzend an eine DNA-Sequenz, welche für sechs Histidine kodiert. Diese Fusion fand durch die Klonierung von ipuC in den Vektor pET28a (+) statt. Die somit neu entstandene DNA-Sequenz kodiert für das Polypeptid Tag-

y-Glutamylamid-Synthetase. Das Protein Tag-y-Glutamylamid-Synthetase wurde dann mit Chelat Affinität Chromatorgaphie mit\'HisBind Resin\'gereinigt. Dabei interagiert das N- terminale Histidinende des rekombinanten Proteins mit dem Trägermaterial\'His\'Bind Resin\'.

Überexpression und Reinigung von Tag-y-Glutamylamid-Synthetase (His6-ipuCp) Für die Herstellung von reiner Tag-y-Glutamylamid-Synthetase benützte man eine Übernacht-VorkulturvonE. coliBL21 (DE3) (DSM 13180) enthaltend pME4275. Diese wurde auf 5 ml LB-Medium bei 37°C mit Km (5011g/ml) angezogen und zum Animpfen einer Kultur von 100 ml in einer 500 ml Flasche des selben Mediums benützt. Nach Erreichen einer OD650 von 1. 0 wurde die Kultur mit 0. 4 mM IPTG bei 30° während 3 Stunden induziert. Anschließend wurde die Kultur für 5 Minuten auf Eis gekühlt und danach bei 4 °C und 5000g zentrifugiert. Das Sediment wurde mit kaltem 50 mM Tris- HCl mit 2 mM EDTA bei pH 8. 0 gewaschen und nochmals unter den selben Bedingungen zentrifugiert. Das Sediment konnte dann bei-20 °C gelagert werden.

Um den Zellextrakt herzustellen, wurde das gefrorene Sediment in 4 ml Bindungs-Puffer (enthaltend 10 pg/ml DNase I) resuspendiert. Der Zellextrakt wurde nach zwei Passagen durch die French-Press bei 5. 5 Mpa und anschließender Zentrifugation bei 39000g wahrend 20 Minuten erhalten. Der Überstand wurde durch ein 0. 2 um Filter filtriert. Tag-y- Glutamylamid-Synthetase wurde bei 4°C mit"HisBind Resin"gereinigt. Die für die Chromatographie verwendeten Lösungen waren folgende : Bindungs-Puffer : 5 mM Imidazol, 0. 5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 7. 9 Elutions-Puffer : 1 M Imidazol, 0. 5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 9 NiS04-Lösung : 50 mM NiSO4 Wasch-Puffer : 60 mM Imidazol, 0. 5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 7. 9 Die Reinigung von Tag-y-Glutamylamid-Synthetase wurde auf folgende Weise durchgeführt. 2. 5 ml Trägermaterial\'His\'Bind Resin\'\'wurden in eine Kolonne eingeführt und zuerst mit 7. 5 ml sterilem Wasser gewaschen. Anschließend wurden 12. 5 ml NiSO4- Lösung durchlaufen gelassen und erneut mit 7. 5 ml sterilem Wasser gewaschen. 7. 5 ml Bindungs-Puffer wurden benützt um die Durchflussrate auf 25 ml pro Stunde einzustellen.

Der Zellextrakt wurde auf die Kolonne aufgeladen und diese wurde mit 25 ml Bindungs-

Puffer sowie 15 ml Wasch-Puffer gewaschen. Die gebundene Tag-y-Glutamylamid- Synthetase konnte anschliessend mit 15 ml Elutions-Puffer eluiert und bei 4°C gelagert werden. Das Molekulargewicht des Monomers der Tag-y-Glutamylamid-Synthetase beträgt 52478 Da.

Biotransformation von Ethylamin und L-Glutamat zu Theanin mit dem Protein Tag- y-Glutamylamid-Synthetase (His6-IpuCp) Für die Biotransformation von Ethylamin mit L-Glutamat zu Theanin wurden 10 mM ATP (pH 7), 10 mM IPA (pH 7), 10 mM L-Glutamat (pH 7), 50 mM MgCl2 (pH 7), 50 mM Imidazol (pH 7), 3. 5 mM NaCl, 0. 1 mM Tris-HCl (pH 7) und 57 ng/pLl Tag-Y- Glutamylamid-Synthetase in einem Endvolumen von 400 pl miteinander vermengt und bei 25 C reagieren gelassen. Nach einem Zeitraum von fünf Stunden war 8 mM Theanin entstanden. Dies entspricht einer molaren Ausbeute von 80%.

Nachweis von Theanin mittels HPLC Theanin, welches durch die Biotransformation des Enzyms IpuC hergestellt worden war, konnte mittels HPLC nachgewiesen und durch Cochromatographie mit der reinen Verbindung in seiner Identität bestätigt werden. Dafür wurde die Probe vorgängig der HPLC mit Phenylisothiocyanat derivatisiert. Zur Analyse wurde eine Nucleosil-C18 \'reverse-phase\'\'Kolonne bei 25 °C verwendet. Die Detektion erfolgte bei 254 nm.

Laufinittel : Lösung A 10 mM Kaliumphosphat Puffer (pH 6. 5) Lösung B 10 mM Kaliumphosphat Puffer (pH 6. 5) mit 80% (v/v) Methanol Zeit %B Durchflussrate (min) ml/Minute 0 0 0.5 4 0 0.5 11 55 1 21 55 1 22 100 1 27 10 1 28 0 1 33 0 1

Retentionszeiten : Theanin 13. 3 min L-Glutamat 8. 2 min Ethylamin 16. 0 min Nachweis von Theanin mittels GC-MS Theanin, konnte ebenfalls mittels GC-MS nachgewiesen werden. Das Fragmentierungsmuster war identisch mit demjenigen der Referenzverbindung.

Weitere gebildete y-Glutamylamidverbindungen Anstelle von Ethylamin konnten weitere Verbindungen eingesetzt werden : Methylamin, Ethanolamin, Glycinmethylester, Propylamin, l-Amino-2-propanol, 3-Amino-l-propanol, Isopropylamin, L-Alaninol, D-Alaninol, 2-Amino-1, 3-propandiol, Butylamin, 4- Aminobutyratmethylester, Isobutylamin, sec-Butylamin, S-2-Amino-l-butanol, R-2- Amino-1-butanol, tert-Butylamin und Pentylamin. Die Umsetzung dieser Verbindungen wurde analog der oben beschriebenen Biotransformation von Ethylamin und L-Glutamat zu Theamin bei pH 7 durchgeführt (die Umsetzung vom Pentylamin wurde bei pH 8 durchgeführt) und mittels Messung des entstanden anorganischen Phosphats analysiert (s.

Fig. 12). Mit HPLC konnte die Entstehung neuer Peaks der möglichen y-Glutamylamidverbindungen beobachtet werden.

Beispiel 5 Biotransformation von Ethylamin zu Theanin mit der Mutante BIII Die Biotransformation wurde im wesentlichen analog zum Beispiel 3 mit dem Stamm KIE171-BIII (DSM 13177) durchgeführt, mit dem Unterschied, dass wachsenden Zellen bei niedriger Zelldichte (OD650=10) verwandt wurden. In Gegenwart von 20 mM Glutamate und 5 mM Isopropylamin, wurden mit 50 mM Ethylamin als Substrat nach 24 h 31. 8 mM Theanin (Ausbeute 63%) erhalten. Die Produktausbeute wurde mit HPLC bestimmt. Eine niedrige Zelldichte erwies sich als wesentlich für die Erzielung hoher Volumenausbeuten.

Die Umsetzung konnte auch mit ruhenden Zellen bei gleicher Zelldichte durchgeführt werden, wenn auch mit schlechteren Ausbeuten (max. 45% bei 20 mM Ethylamin als Ausgangsmaterial und 18 h Realctionszeit). Höhere Ausgangskonzentrationen an Ethylamine sowie höhere Zelldichten verringerten die Volumenausbeute.

Beispiel 6 Biotransformation von IPA zu L-Alaninol mit einem Expressionsvektor in E. coli.

Mit dem Expressionsvektor pME4755 transformierte E. coli BL21 (DE3) wurden bis zur stationären Phase bei 37°C und 180 rpm in 25 ml Medium umfassend 64 mM Kalium phosphate (pH 7. 2), 33 mM NH4C12, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 0. 5 I1M (NH4) 2SO4, 1% trace elements (Thurnheer et al., J. Gen. Microbiol. 132 : 1215 ff, 1986) and 20 u, g/ml chloramphenicol. Die Vorkultur wurde benutzt, um 100 ml Medium mit einer OD650 von 0. 15 zu inoculieren und dann auf 0. 4 aufwachsen zu lassen. Nach Induktion mit 400 LM IPTG (thio-beta-D-1-Galactosid) wurde die Kultur bis zu einer OD650 von 0. 8 weiter angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 g/10 min. bei Raumtemperatur geerntet und zu einer Zellsuspension mit OD650 50 in Medium ohne Chloramphenicol aufgenommen. Nach Lagerung für 14 h bei 4°C wurden 20 mM IPA

(Isopropylamin) zugegeben und die Kultur bei 30°C geschüttelt (150 rpm). Produkt-und Eduktkonzentrationen wurden mit HPLC bestimmt. Nach 22 h wurde das Edukt IPA mit 13 mM, das Produkt L-Alaninol mit 4 mM bestimmt. Nach total 58 h waren diese Werte nur geringfügig verändert. L-Alaninol wurde durch den E. coli Expressionsstamm nicht abgebaut.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : XL1-Blue/pME4259 DSM 13417 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONONC DESIGNATION The microorganism identified under I. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). 111. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under 1. above, which was received by it on 2 0 0 0-0 3-31 (Date of the original deposit)\'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-3S124 Braunschweig Date : 2000-04-03 Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of intemational depositary authority was acquired.

Form DSMZ-BP/4 (sole page) 0196 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by the Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13417 CH-3930 Visp Date ofthe deposit or the transfer\' : 2000-03-31 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under 11 above was tested on 2 0 0 0-0 3-3 1 On that date, the said microorganism was (X)\'viable ()\'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig g 64/2e 4 Date : 2000-04-03 \'Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by the Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL OEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13389 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer\' : 2000-03-24 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under 11 above was tested on 2 0 0 0-0 3-2 4 On that date, the said microorganism was (X)\'viable ()\'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS EBEN PERFORMED\' V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig v c, e * Date : 2000-03-27 \'Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

3 Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM I Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : KIE171-BII DSM 13389 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under 1. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). Ill. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above, which was received by it on 2 0 0 0-0 3-2 4 (Date of the original deposit) t. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or, of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig 6//cveæ > Date : 2000-03-27 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by die Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13388 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer\' : 2000-03-24 Ill. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under II above was tested on 2 0 0 0-O 3-2 4 On that date, the said microorganism was (X)\'viable ()\'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Date : 2000-03-27 Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

3 Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : XL1-Blue/pME4755 DSM 13388 If. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMC DESIGNATION The microorganism identified under I. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above, which was received by it on 2 0 0 0-0 3-2 4 (Date of the original deposit)\'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or, of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb g D-38124 Braunschweig Date : 2000-03-27 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : BL21/pME4275 DSM 13180 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under I. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under 1. above, which was received by it on 19 9 9-12-0 3 (Date of the original deposit) t. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) ofperson (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or, of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig > >/M2 g Date : 1999-12-06 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by the Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13180 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer : 1999-12-03 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under II above was tested on 19 9 9-12-O 3 Z. On that date, the said microorganism was (X)\'viable ()\'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFoRMED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig K WJZ 4 Date : 1999-12-06 Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

\'Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : XL1-Blue/pME4267 DSM 13179 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identifled under I. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cmss where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above, which was received by it on 19 9 9-12-0 3 (Date of the original deposit)\'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or, of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig v. >t S Date : 1999-12-06 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. DEPOSITOR n. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by the Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13179 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer\' : 1999-12-03 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under Il above was tested on 19 9 9-12-0 3 On that date, the said microorganism was (X)\'viable () \'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED\'\' V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized officiai (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig r Bt Gtg Date : 1999-12-06 \'Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

3 Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza. AG Accessionnumbergivenbythe Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13178 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer\' : 1999-12-03 m. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under 11 above was tested on 19 9 9-12-0 3 1. On that date, the said microorganism was (X)\'viable ()\'no longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig -" C-. *. Date : 1999-12-06 Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

\'Mark with a cross the applicable box.

Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : DH5a/pME4255 DSM 13178 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under 1 above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under 1. above, which was received by it on 19 9 9-12-0 3 (Date of the original deposit)\'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Date : 1999-12-06 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : KIE171-BIII DSM 13177 II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under 1. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under 1. above, which was received by it on 19 9 9-12-0 3 (Date of the original deposit)\'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig irez Date : 1999-12-06 \'Where Rule 6. 4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM Lonza AG Abt. Biotechnologie CH-3930 Visp VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10. 2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page 1. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Lonza AG Accession number given by the Abt. Biotechnologie INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Address : DSM 13177 CH-3930 Visp Date of the deposit or the transfer\' : 1999-12-03 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under 11 above was tested on 19 9 9-12-0 3 On that date, the said microorganism was ) 3 viable () longer viable IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) of person (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized official (s) : Address : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Date : 1999-12-06 Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10. 2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

3 Mark with a cross the applicable box.

4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative. INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. The indications madebelowrelate to themicroorganism referredto inthe description onpage zu line 32 B. IDENd IIFICATIONOFDEPOS1T Further deposits are identified on an additional sheet Nameofdepositaryinstitution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution (including postal code and country) Mascheroderweg 1b 38124 Braunschweig Deutschland Dateofdeposit AccessionNumber 31. 03. 2000 (31. März 2000) DSM 13417 C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank ifrtot applicable) This information is continued on an additional sheet Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (iftlie indications are notforall desigiiatedstates) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leaveblankifnotapplicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (spec the general nature ofthe irdimkoror e. g.,\'Accession Number of Deposit") Forreceiving Officeuse only ForIntemationalBureauuse only This Thissheetwasreceivedwiththe internationalapplication ThissheetwasreceivedbytheInternational Bureauon : Authorizedofficer Authorizedoffimr 0. Gorge I Y INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. The indications made belowrelate to the microorganismreferredto in the description onpage 10 line 32 B. IDENTMCATIONOFDEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet Name of depositary institution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution (including postal code and country) Mascheroderweg 1 b 38124 Braunschweig Deutschland Dateofdeposit AecessionNumber 24. 03. 2000 (24. März 2000) DSM 13388 C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank ifnot applicable) This information is continued on an additional sheet Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (ifthe indieations arenotforall designated States) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leaveblanlcifnotapplicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (specify the general nature of the iridicatiorrs e. g,\'Accession Nuntber of Deposit\') Forreeeiving Officeuse only ForInternational Bureauuse only This Thissheetwasreceivedwiththeinternationalapplication This sheetwasreceivedbytheInternationalBureauon : n Authorized officer Authorized officer GoOL-4 D. Gorge INDICATIONS RELATING TO DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. Theindications made belowrelatetothemicroorganism referred to inthe description onpage 9, line 32 B. IDEN2\'IFICATIONOFDEPOSTT Further deposits are identifiedon an additional sheet Name ofdepositary institution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zefikufturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution rncluding postal code and countly) Mascheroderweg 1 b 38124 Braunschweig Deutschland Date of deposit AccessionNumber 31. 03. 2000 (31. März 2000) DSM 13180 C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable) This information is continued on an additional sheet z Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (iftke indications are notforall designated States) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF 3NDICATIONS (leaveblankifnotapplicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (specify the general nature of d : e indicadons e. g.,\'Accessiori Number of Deposit) For receiving Office use only For International Bureauuse only Etn Thissheetwas receivedwiththeinternationalapplication CF This sheetwasreceivedbythelnternational Bureauon : Audiorizedofficer « Authorized officer iC, tiorge , INDICATIONS RELATING TO DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. The indications made belowrelatetothemicroorganism referredto in thedescription onpage 14, line 29 B. IDENTTFICATIONOFDEPOSIT Furtherdeposittsareidentifiedonanadditionalsheet Name ofdepositary institution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution (includirag postal eode atd country) Mascheroderweg 1 b 38124 Braunschweig Deutschland Dateofdeposit AccessionNumber 03. 12. 1999 (03. Dezember 1999) DSM 13180 C. ADDITIONAL INDICATIONS qeave blank ifnot applicable) This information is continued on an additional sheet Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (iftlie indications arenotforall designated States) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leaveblanlcifnotapplicable) The indications listed below will be submitted to the Internationat Bureau later (spec tlie gerieral nature ofthe indications e. g.,\'Accession Number of Deposit) ForreceivingOfficeuse only ForInternational Bureauuse only This Thissheetwasreceivedwithtlieinternationalapplication ThissheetwasreceivedbytheInternational Bureauon : Authorized officer Authorized officer Fotgjb INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. The indications made below relate to the microorganism referred to in the description onpage 9, line 29 B. IDEMTFICATIONOFDEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet Name of depositary institution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution (including postal code and country) Mascheroderweg 1b 38124 Braunschweig Deutschland Dateofdeposit AccessionNumber 03. 12. 1999 (03. Dezember 1999) DSM 13179 C. ADDITIONAL INDICATIONS fleave blankif not applicable) This info7mationis continuedon anadditional sheet 2 Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATEDSTATESFORW13ICHINDICATIONS ARE MADE (iftlaeindications arenotfor alldesigraated States) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blankifrtotapplicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (specify diegeneral nature oftle urdicationse. g.,\'Accession Nunabe7 of Deposit\') Forreceiving Officeuse only ForInternational Bureauuse only This This sheetwas receivedwiththeinternationalapplication Cl This sheetwas receivedbythelntornational Bureauon : 8 w Autliorizedofficer,/r Authorizedofficer Q. Gorge l INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. The indications made belowrelatetothemicroorganismreferredtointhe description onpage 9 1 line 28 B. IDEN1TICATIONOFDEPOSrT Further deposits are identified on an additional sheet » Name ofdepositary institution Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution finclmding postal code and country) Mascheroderweg 1b 38124 Braunschweig Deutschland Dateofdeposit AccessionNumber 03. 12. 1999 (03. Dezember 1999) DSM 13178 C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if noí applicable) This infonnation is continued on an additional sheet Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden. Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zurückweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FORWWIICH INDICATIONS ARE MADE (ifthe indications arenotforalldesignatedStates) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS aeaveblankiftiotapplicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (specify the gereral riature ofthe irdications e. ,"Accessiori Nvraber oJDeposit") For receiving Office use only For Ititemational Bureauuse only Thissheetwasreceivedwiththeinternationalapplication ThissheetwasreceivedbytheInternational Bureauon : Authorizedofficer Authorized officer . Gorge ( <0. Gorge INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis) A. Theindications made below relateto the microorganismreferredtointhe description onpage 5, line 7 B. mENTIIICATIONOFDEPOS1T Further depositsareidentifiedon an additionalssheet Name of depositary institution Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) Address of depositary institution fincluding postal code and country) Mascheroderweg 1 b 38124 Braunschweig Deutschland Date ofdeposit AccessionNumber 24. 03. 2000 (24. März 2000) DSM 13177 C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable) This information is continued on an additional sheet Zugang zu dem hinterlegtem biologischem Material soll nur im Rahmen der Expertenlösungen, wie vorgesehen in R. 28 (4) EPUe bzw. Regulation 3. 25 (3) Australian Patents Act, d. h. durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden Diese Regelung gilt, vorbehaltlich der genauen Bestimmungen des EPUe bzw. Patent Act, auch nach Zurücknahme oder Zuruckweisung der Patentanmeldung oder aber bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des jeweiligen Patentes bekannt gemacht wird. D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if the indicationsarenotforall designated States) EP, AU E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leaveblarakifriotapplicable) The indications listed below will be submitted to the InternationalBureaulater (specthegaleralsatusEoftllebldicationseg Accession Number of Deposit") Forreceiving Office use only For Intemational Bureauuse only This Thissheetwas receivedwiththeinternationalapplication jj This sheetwas reeeivedbytheInternational Bureauon : Authorized officer Authorized officer 0, GO e