技术领域

本发明涉及一种单倍体植物的培育方法，特别 涉及一种采用植物组织培养获得杨树 单倍体的培育方法， 属于杨树单倍体的选育领域。 背景技术

北京杨 Popul beijingensis ) 为青杨和钻天杨的杂交后代， 是新中国成立后林业 界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品 种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点， 是优良的用材林、 防护林、 行道树和"四旁"绿化树种， 主要分布于中国的华北和西北等 地区， 深受群众喜爱。

杨属植物是雌雄异株， 自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的 杂交育种获得 纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯 合的杨树株系， 研究者以往采用自花授粉 或是回交的方法， 但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过 花药培养则可以先获得 目标株系的单倍体， 后将其进行加倍成为双单倍体 (doubled haploids, DHs)， 这样就明显 的缩短育种周期。此外， 随着现代生物分子技术的迅速发展， 植物单倍体及其产物已经 在倍性育种、基因组测序、 图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成 功应用并取得 了很大的成果， 单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者 所青睐。

目前， 植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、 孤雌生殖、 染色体消除等， 其 中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效 的技术。在离体条件下， 用离体的方法培 养花药， 人为的改变小孢子的发育途径， 使其配子体发育途径终止， 转向孢子体发育， 通过器官分化的途径， 获得完整的单倍体植株， 为人工大量生产单倍体提供了有效地手 段。通过这一途径再生的单倍体植株， 经过自发加倍或人工诱导加倍， 获得纯和二倍体 植株， 从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材 料。利用花药花粉培养获得单倍体 进行育种是植物育种技术上的一项重大改革， 它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱 变育种、远缘杂交等方法结合， 用以克服这些方法中的不足， 也可以直接用此方法创造 新的类型。但是， 以杨树花药为外植体选育杨树单倍体的培养过 程中一直存在愈伤组织 诱导率低、愈伤组织器官分化率低等问题， 导致现有的杨树单倍体的培育方法远远不能 满足研究和生产实践的需求， 亟待改进。 发明内容

本发明的主要目的是针对现有的杨树单倍体的 培育方法中所存在的不足，提供一种 新的杨树单倍体的培育方法， 该方法的杨树花药愈伤组织诱导率高、愈伤组 织的器官分 化率和不定芽的生根率高， 可以在较短时间内形成大量优良的杨树单倍体 试管苗， 可进 行规模化、 工厂化生产。

为实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案：

一种杨树单倍体的培育方法， 包括：

1 ) 将消毒处理后的杨树花药接种在愈伤组织诱导 培养基上进行愈伤组织诱导培 养， 获得杨树愈伤组织；

2)将杨树愈伤组织接种于不定芽分化培养基上� ��行不定芽的分化培养， 获得杨树 不定芽；

3 )将杨树不定芽接种于生根培养基上进行生根� �养， 获得试管小苗；

4)经过倍性鉴定， 获得杨树单倍体植株。

其中， 所述的杨树优选为北京杨 iPopul beijingemis 。

为了达到更好的培育效果， 当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期 时， 此时 将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养， 能有效的提高愈伤组织的诱导培养率； 其 中， 杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态 和直径粗略判断小孢子的发育时期。 较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育 阶段，这些方法或手段均为本领域技术人 员所通晓； 本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的 发育时期。

由于杨树花为柔荑花序， 花芽表面的鳞片微被毡毛， 步骤 1 )中所述消毒处理采用 如下处理方式具有更好的无菌效果：

1-A)用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗� �芽；

1-B )用酒精浸泡花芽；

1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌， 用无菌水冲洗；

1-D) 吸干花芽表面水分后从花序取出花药， 即得。

优选地， 步骤 1-A) 中无菌水冲洗次数为 4-5次； 步骤 1-B) 中所述酒精的体积百 分比浓度为 70.0%; 浸泡时间为 30 s; 步骤 1-C)中次氯酸钠的质量百分比浓度为 7.0%; 表面灭菌时间为 5 min; 无菌水冲洗次数为 3-5次。 步骤 1 )中所述愈伤组织诱导培养基优选是： H基本培养基 +奈乙酸（NAA) 0.5-1.0 mg/L+ 6-糠氨基嘌呤（KT) 0.5-1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 5.5 g/L; 更优选为： H基 本培养基 +奈乙酸 1.0 mg/L+ 6-糠氨基嘌呤 0.5-1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 5.5g/L; 最 优选为： H基本培养基 +奈乙酸 1.0 mg/L+ 6-糠氨基嘌呤 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 5.5 g/L;进一步优选的，步骤 1 )中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行� �黑暗条件下， 培养温度为 25±1 °C _;

步骤 2)中所述不定芽分化培养基优选是： MS培养基 + 6-苄基腺嘌呤（BAP) 0.6 mg/L+奈乙酸（NAA) 0.2 mg/L+赤霉素 （GA ₃ ) 0.02-0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5g/L _; 更优选为： MS培养基 + 6-苄基腺嘌呤 0.6 mg/L+奈乙酸 0.2 mg/L+赤霉素 0.02 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5g/L _; 进一步优选的， 步骤 2) 中所述不定芽分化培养在以 下条件下进行： 培养温度为 25±1 °C， 光照 1500~2000 lx， 光照时间 16小时 /天；

步骤 3 )中所述生根培养基优选是： 1/2 MS培养基 + n引哚丁酸（IBA) 0.2-0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5 g/L;更优选为： 1/2 MS培养基 +吲哚丁酸 0.3mg/L+蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5.5 g/L; 进一步优选的， 步骤 3 ) 中所述生根培养在以下条件下进行： 培养室温度 为 25±1 °C， 光照 1500~2000 lx， 光照时间 16小时 /天。

本发明杨树单倍体培育方法利用杨树花药经过 诱导愈伤组织后再器官分化为植株， 从而获得杨树单倍体植株。为了提高培养过程 中愈伤组织诱导率、愈伤组织器官分化率 及生根率等问题， 本发明对愈伤组织诱导培养基、不定芽器官分 化培养剂以及生根培养 基的配方进行了优化， 最终筛选得到了不同培养阶段的最适宜的培养 基组成， 显著的提 高了愈伤组织诱导率、 愈伤组织器官分化率及生根率， 最终提高了杨树单倍体的得率， 为杨树的育种、 品质改良、 遗传研究等提供了物质基础。

本发明方法培育的杨树单倍体植株生长健壮、 繁殖系数高， 获得试管小苗移栽成 活率高达 92.0%， 是工厂化大规模生产北京杨植株的简便、 快捷的技术体系。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技 术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神 和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内 。 实施例 1

一、 试验材料

1、 供试材料： 北京杨 iPopulus beijingensis ) ;

2、 植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产 萘乙酸 (NAA)、 6-苄氨基腺嘌呤 ( BAP)、 6-糠氨基嘌呤（KT)、 赤霉素（GA ₃ )、 2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D)、 吲哚丁 酸（ΙΒΑ)。

3、 培养基的配制：

( 1 ) "MS基本培养基"的组成及配制方法：

MS培养基 (Murashige and Skoog, 1962 )

以上各种营养成分的用量， 除了母液 I为 20倍浓缩液外， 其余的均为 200倍 浓缩液。 上述 MS培养基母液配好后， 储存于 4°C冰箱待用。 根据配制培养基的总量， 称量所需的琼脂和蔗糖， 将其倒入欲配培养基体积 3/4的蒸熘水中， 边加热边用玻璃棒 搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移 液管从各种母液中分别取出所需的用量， 如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类 和浓度， 将其与各种母液一起放入搪 瓷量杯中。 每加入一种都充分搅拌， 最后加蒸熘水定容至总体积， 搅拌均匀。 用 pH计 测试培养基酸碱度， 用滴管吸取 1.0 mol/L的 NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中， 边 滴边搅拌， 直到培养基的 pH值调整至 5.8。 (2) H基本培养基"的组成及配制方法:

表 2 H培养基

以上各种营养成分的用量， 除了母液 I为 20倍浓缩液外， 其余的均为 200倍 浓缩液。 上述 H培养基母液配好后， 储存于 4°C冰箱待用。根据配制培养基的总量， 称 量所需的琼脂和蔗糖， 将其倒入欲配培养基体积 3/4的蒸熘水中， 边加热边用玻璃棒搅 拌， 直到液体呈半透明状。 然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所 需的用量， 如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类 和浓度， 将其与各种母液一起放入搪 瓷量杯中。 每加入一种都充分搅拌， 最后加蒸熘水定容至总体积， 搅拌均匀。 用 pH计 测试培养基酸碱度， 用滴管吸取 1.0 mol/L的 NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中， 边 滴边搅拌， 直到培养基的 pH值调整至 5.5。

(3 ) N ₆ 基本培养基的组成及配制方法：

N ₆ 培养基 (北京植物所， 黑龙江农业科学院， 1974)

母液种类 成分名称 浓度 (mg/L) 母液种类 成分名称 浓度 (mg/L) 大量元素 KN0 ₃ 56 000 微量元素 MnS0 ₄ «H ₂ 0 880

(母液 I ) (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 9 260 (母液 II) ZnS0 ₄ «7H ₂ 0 300

KH ₂ P0 ₄ 8 000 KI 160

MgS0 ₄ ·7¾0 3 700 H ₃ B0 ₃ 320 CaCl ₂ «2H ₂ 0 3 300

铁盐 (母液 III) FeS0 ₄ «7H ₂ 0 5 560 铁盐 (母液 III) Na ₂ -EDTA«2H ₂ 0 7 460 有机成分 维生素 Bi 200 维生素 B ₆ 100

(母液 IV) 叶酸 200

以上各种营养成分的用量， 除了母液 I为 20倍浓缩液外， 其余的均为 200倍 浓缩液。 上述 N ₆ 培养基母液配好后， 储存于 4°C冰箱待用。 根据配制培养基的总量， 称量所需的琼脂和蔗糖， 将其倒入欲配培养基体积 3/4的蒸熘水中， 边加热边用玻璃棒 搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移 液管从各种母液中分别取出所需的用量， 如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类 和浓度， 将其与各种母液一起放入搪 瓷量杯中。 每加入一种都充分搅拌， 最后加蒸熘水定容至总体积， 搅拌均匀。 用 pH计 测试培养基酸碱度， 用滴管吸取 1.0 mol/L的 NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中， 边 滴边搅拌， 直到培养基的 pH值调整至 5.8。

(4) 愈伤组织诱导培养基： H基本培养基 + NAA 1.0 mg/L+ KT 1.0 mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 5.5g/L， 调节 pH值为 5.5， 培养基在 121 °C下恒温灭菌 20分钟。

(5 )不定芽分化培养基配方： MS基本培养基 +BAP 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA ₃

0.02 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5 g/L， 调节 pH值为 5.8， 培养基在 121 °C下恒温灭菌 20 分钟。

(6)不定芽生根培养基配方为： 1/2MS基本培养基 +IBA0.2-0.5 mg/L蔗糖 20 g/L+ 琼脂 5.5 g/L， 调节 pH值为 5.8， 培养基在 121 °C下恒温灭菌 20分钟。 实施例 2

1、 离体培养的花药及小孢子的合适发育时期

剪取带有饱满花芽的北京杨花枝于室温 25°C下水培数日。 将杨树花芽放在载玻片 上， 剥出花药， 然后采用醋酸洋红染色， 显微镜镜检观察小孢子的发育时期， 以确定花 粉发育时期。本试验选取小孢子处于单核靠边 期的花药进行接种， 研究结果表明此时正 是花药培养的最佳时期。

2、 外植体消毒

将处于单核靠边期的花芽从柔荑花序上取下， 先用毛笔轻刷北京杨花芽鳞片的表 面， 将外表的污物、 细菌等去掉， 提高消毒效果， 接着用无菌水冲洗 5次， 滤纸吸干水 分。

将外植体置于超净工作台上， 用体积百分比浓度为 70.0%的酒精浸泡花芽 30 s， 接 着用质量百分比浓度为 7.0%的次氯酸钠溶液中进行表面消毒 5分钟， 然后用无菌水冲 洗 3-5次， 取出花芽。

在解剖镜下将花芽的鳞片剥去， 取花序中部的花药， 接种于培养皿中， 用保鲜膜封 口， 进行暗培养， 每个培养皿接种 30个花药， 每个处理重复 5次。 培养条件： 黑暗条 件， 培养温度 25±1 °C。

3、 愈伤组织诱导培养基的筛选

将处于单核靠边期的花药分别接种于 MS、 H和 N ₆ 三种基本培养基中，每种中添加 1.0 mg/L 2,4-D和 1.0 mg/L BAP, 蔗糖 30 g/L， 琼脂 5.5 g/L， pH 5.8。 每个培养皿接种 30个花药， 每个处理设置 5次重复。 培养条件： 黑暗条件， 培养温度 25±1 °C， 培养 35 天后开始统计各处理形成的愈伤组织数， 培养 120天后计算出愈伤组织诱导率， 统计和 计算结果如表 4。

不同培养基对愈伤组织的诱导效果

表 4的试验结果表明：

1 )采用 H培养基， 杨树花药的愈伤组织诱导率高。

2)花药接种 35天左右， 开始观察到有愈伤组织形成。 在 MS、 H培养基中均观察 到有愈伤组织的形成，该愈伤组织质地紧实， 淡黄色不透明，表面呈颗粒状， 生长缓慢。 在 N ₆ 培养基中没有观察到愈伤组织的形成。

4、 愈伤组织诱导培养基激素种类筛选

根据筛选的 H基本培养基， 筛选不同的激素种类。

将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同 激素种类和浓度的 H培养基中，添加 不同激素种类和浓度的 H培养基如表 5所示。

表 5 含有不同激素种类的 H培养基 培养基编 激素 培养基 激素

号 种类 浓度 （mg/L) 编号 种类 浓度 （mg/L)

0.5 0.5

1 NAA 1.0 2 KT 1.0

1.5 1.5

0.5 0.5

3 2,4-D 1.0 4 BAP 1.0

1.5 1.5

0.5+0.5 0.5+0.5

0.5+ 1.0 0.5+1.0

0.5+1.5 0.5+1.5

1.0+0.5 1.0+0.5

5 NAA + KT 1.0+1.0 6 2,4-D+BAP 1.0+1.0

1.0+1.5 1.0+1.5

1.5+0.5 1.5+0.5

1.5+1.0 1.5+1.0

1.5+1.5 1.5+1.5 每种培养基中添加蔗糖 30 g/L， 琼脂 5.5 g/L， pH5.5。 每个培养皿接种 30个花药， 每个处理重复 3次。 培养条件： 黑暗条件， 培养温度 25±1 °C， 培养 35天后开始统计各 处理形成的愈伤组织数，培养 120天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结 果如表 6。

表 6不同激素种类对愈伤组织诱导的影响

培养基 产生愈伤组织的花 平均愈伤诱导率 接种花药总数 (个）

编号 药总数 (个） (%)

1 270 0 0.0

2 270 0 0.0

3 270 0 0.0

4 450 0 0.0

5 810 75 9.3

6 810 20 2.5 试验结果表明： 激素种类 NAA与 KT组合对花药愈伤组织诱导率最高， 该激素组 合所有处理实验的平均愈伤组织诱导率达到 9.3%， 其次是 2,4-D与 BAP的激素组合。 由表中数据表明， NAA与 KT的激素组合对愈伤组织的诱导效果比较理想� ��

5、 愈伤组织诱导培养基激素浓度筛选

根据筛选的基本培养基和激素种类， 筛选激素的配比。

将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同 浓度的 NAA、 KT的 H培养基中，并 且每种培养基中添加蔗糖 30 g/L， 琼脂 5.5 g/L， pH 5.5。 每个培养皿接种 30个花药， 每个处理设置 3次重复。 培养条件： 黑暗条件， 培养温度 25±1 °C， 培养 35天后开始统 计各处理形成的愈伤组织数， 培养 120天后计算出愈伤组织诱导率， 统计和计算结果如 表 7所示。

表 7不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

试验结果表明:

1 )采用培养基为： H+NAA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L杨树花药的愈伤组织诱导率高，达 到 30.0%。

2)本发明对杨树花药进行愈伤组织诱导过程中� ��添加 l.O mg/L NAA和 1.0 mg/L KT 的 H培养基中愈伤组织的诱导率最高， 达到 30.0%， 其次是 H培养基中添加 1.0 mg/L NAA和 0.5 mg/L KT。 综上， Η培养基中添加适量浓度的 NAA和 KT对小孢子的脱分 化比较有利。 6、 愈伤组织不定芽分化培养基的筛选

愈伤组织不定芽分化培养基以 MS为基本培养基，将培养 35天左右，直径约为 3 mm 的愈伤组织接种到含有不同激素的不定芽分化 培养基中进行分化培养。并且每种培养基 中添加蔗糖 20 g/L， 琼脂 5.5 g/L， pH5.8。 每个培养瓶接种 1个愈伤组织， 每个处理重 复 5次。 培养条件： 培养温度为 25±1 °C， 光照 1500~2000 lx， 光照时间 16小时 /天。 培 养 20天后开始统计各处理分化形成的不定芽数， 计算出不定芽分化率， 统计和计算结 果如表 8所示。

表 8不同激素组合对愈伤组织分化效果的影响

试验结果表明:

1 )愈伤组织接种于分化培养基后， 其颜色由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周 左 右在部分分化培养基中可以看到愈伤组织表面 出现绿色突起的芽点， 接着叶片伸展出 来； 而且添加不同激素组合的分化培养基中不定芽 的茎部发育情况差别较大。

2)采用培养基为： MS+BAP 0.6 mg/L +NAA0.2 mg/L + GA ₃ 0.02-0.2 mg/L的杨树花 药愈伤组织器官分化培养基， 不定芽的分化率高， 无根苗形态特征以及生长情况良好， 达到 100.0%， 说明 GA ₃ 在愈伤组织分化出不定芽的过程中发挥了 关键的作用， 尤其是 在不定芽抽茎、发育成为无根苗的过程中有着 重要的应用价值， 所以将后期得到的愈伤 组织转接到分化效果最好的该培养基中。

7、 不定芽生根培养基的筛选

不定芽生根培养基以 1/2MS为基本培养基，将具有 3-5片幼嫩叶片的不定芽接种到 含有不同激素的不定芽生根培养基中进行生根 培养。并且每种培养基中添加蔗糖 20g/L， 琼脂 5.5g/L， pH5.8。 每个培养瓶接种 3个不定芽， 每个处理重复 5次。 培养条件： 培 养温度为 25±1 °C， 光照 1500~2000 lx， 光照时间 16小时 /天， 培养 20天后统计各处理 生根情况， 计算出不定芽生根率， 统计和计算结果如表 9所示。

表 9 不同激素组合对不定芽生根效果的影响

试验结果表明:

1 )不同的生根培养基对杨树不定芽的生根能力� �同， 但根据生根率、根的数量和质 量，确定 1/2MS+IBA 0.3 mg/L +蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5 g/L， pH5.8的培养基为杨树不定芽 的生根培养基。

2) 由表 5可以看出， IBA在北京杨组培无根苗的生根过程中发挥着关 键的作用， 其 中添加 0.2-0.5 mg/L IBA的 1/2MS生根培养基中均能达到 100.0%的生根率， 其中以 0.3 mg/L的添加最佳， 根部特征正常， 主根粗壮， 须根较多。 实施例 3

1、 制备无菌花药

取单核靠边期的杨树花芽， 用无菌水冲洗花芽 3-5次， 用滤纸吸干水分后用体积百 分比浓度为 70.0%的酒精浸泡花芽 30 s，接着用质量百分比浓度为 7.0%的次氯酸钠溶液 消毒 5 min， 然后用无菌水冲洗花芽 3-5次。 在超净工作台上剥去花芽的鳞片， 取出花 序中部的花药， 即得。

2、 愈伤组织诱导培养 将花药接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培 养， 培养条件： 黑暗条件下， 培养温 度为 25±1 °C， 培养 120天， 统计花药愈伤组织诱导率为 30.0%， 其中， 愈伤组织诱导培 养基为： H + NAA 1.0 mg/L+ KT 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 5.5 g/L， pH5.5。

3、 不定芽分化培养

将培养得到的直径为 3 mm左右的杨树花药愈伤组织接种到不定芽分化� ��养基中进 行不定芽分化培养， 培养条件： 温度为 25±1 °C， 光照 1500~2000 1x， 光照时间 16小时 / 天。分化培养过程中， 杨树花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为 绿色， 一周后在愈 伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶 片伸展出来，然后抽茎， 20天左右不定芽 生长高度可达 1.5~2 cm。 培养 20天后统计不定芽的分化率为 100.0%， 其中， 不定芽分 化培养基配方为： MS+BAP 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA ₃ 0.02 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 5.5g/L， pH5.8。

4、 生根培养

将培养至具有 3-5片幼嫩叶片的不定芽接种到生根培养基中进 行生根培养， 培养条 件： 培养温度为 25±1 °C， 光照 1500~2000 lx， 光照时间 16小时 /天， 培养 20天后统计 不定芽的生根情况， 生根率达到 100.0%， 得到杨树试管小苗， 其中， 不定芽生根培养 基配方为： 1/2MS+IBA 0.3mg/L +蔗糖 20g/L+琼脂 5.5g/L， pH5.8。

5、 炼苗、 移栽

选取生根较好的试管小苗， 放置在温室中的遮阴棚中炼苗培养 2-3天， 然后取出小 苗并洗净根部培养基， 移栽到杨树无土栽培基质（珍珠岩和蛭石的混 合物） 中， 无土栽 培基质为珍珠岩与蛭石的体积之比为 1 : 1的混合物。移栽后浇透水， 15天后统计移栽成 活率， 成活率为 92.0%。 实施例 4 花药诱导植株的倍性鉴定

取适量核酸裂解液于小培养皿（1 1号）中，剪取适量待测幼苗的嫩叶置于上述� �养 皿中， 用刀片将叶片组织切成小块， 使其与裂解液充分接触， 接着过滤至 1.5μί的离心 管中，往滤液中添加浓度为 5.0 μΒ/mL的 DAPI染液 65 μί,置于流式细胞仪中进行植株 嫩叶的倍性检测。

取初步筛选为单倍体的植株的根尖， 采用染色体常规技术压片， 用对二氯苯饱和溶 液预处理 3.5 h， 并用蒸熘水冲洗； 后在卡诺固定液 (酒精： 冰醋酸 =3: 1)中固定 24 h _; 蒸 熘水冲洗后， 于解离液 （盐酸：酒精 =1 : 1) 中解离 15 min; 接着在蒸熘水冲洗 3次， 每次 12 min,； 采用卡宝品红染色后即在显微镜 （10 X 80) 下观察， 计数染色体数目。

北京杨单倍体植株的染色体数目为 19， 二倍体植株的染色体数目为 38， 经过显微 镜检查， 北京杨花药诱导获得的植株中， 单倍体植株的比例为 10.3%， 镜检结果如表 10 所示。

表 10 单倍体植株的比例

实际应用表明： 本发明方法可在多次不同充分试验中获得杨树 单倍体植株， 可靠性 强。 将单倍体植株经天然加倍或人工用秋水仙碱处 理生长点， 得到纯和的二倍体。