Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoas¬ says in einem Mehrphasensystem.

Immunologische Nachweisverfahren haben in der in vitro Diagnostik eine hohe Be¬ deutung erlangt. Ursache hierfür ist, daß sie hochspezifisch und äußerst empfindlich sind. Zudem zeichnen sich diese Assays durch eine einfache Handhabung aus. Die Nachweisverfahren beruhen auf der immunologischen Wechselwirkung zwischen dem nachzuweisenden Analyten und seinem Bindungspartner bzw. -partnern.

Im Falle der Sandwich-Assays wird der Analyt von zwei verschiedenen Antikörpern sandwichartig gebunden. Einer der beiden Antikörper trägt eine Markierung (Label, Marker), wodurch seine Konzentration bestimmt werden kann.

Im Falle kleiner Analyte scheidet das Sandwich-Verfahren aus, da z. B. aus steri- schen Gründen nicht gleichzeitig zwei verschiedene Antikörper am Analyten binden können. Hier finden in der Regel die kompetitiven Assays Anwendung. Dabei kon¬ kurrieren z. B. ein Analyt und ein synthetisches Derivat des Analyten um die Bin¬ dungsstellen des Antikörpers. Markiert wird in der Regel entweder das Analytderivat (klassisch kompetitives Verfahren) oder der Antikörper (z.B. SPALT: solid phase an- tigen luminescence technique). Die markierte Komponente wird als Tracer bezeich¬ net.

Nachteil der bekannten kompetitiven Verfahren ist eine im Vergleich zu Sandwich- assays relativ geringe Sensitivität, da anders als bei den. immunometrischen Assays die Nachweisreagenzien nicht im Überschuß eingesetzt werden können und somit eine Verschiebung der Gleichgewichtslage zu Gunsten des zu detektierenden Immunkomplexes nicht im gewünschten Maße möglich ist.

ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26)

Vor der Messung des vom Label ausgesandten Signals ist in der Regel eine Abtren¬ nung des überschüssigen freien Tracerantikörpers (im Falle der Sandwich-Assays und der SPALT-Durchführung) bzw. des ungebundenen Analyttracers (im Falle des klassisch kompetitiven Verfahrens) notwendig.

Bei den als "homogenen Assays" bekannten Verfahren ist eine derartige Trennung nicht erforderlich, da sich die Signale der freien und gebundenen Tracer unterschei¬ den.

Heterogene Assays besitzen den Nachteil, daß vor der Messung des mit der Analyt- konzentration korrelierenden Signals ein oder mehrere Trennschritte erforderlich sind, um den - meist an einer Festphase gebundenen - markierten Immunkomplex von freiem markiertem Reagenz abzutrennen. Im Falle einer manuellen Durchfüh¬ rung ist dies relativ arbeitsaufwendig und erhöht die Fehleranfälligkeit des Verfahrens; auch bei der Durchführung auf einem Analysenautomaten ist der Trennschritt nachteilig, weil für diesen Verfahrensschritt in der Regel eine zusätzliche Baugruppe erforderlich ist.

Es wurden daher schon frühzeitig "homogene Assays" entwickelt. Der homogene Assay, der unter der Bezeichnung EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technol- ogy) bekannt ist (Biochem. Biophys. Res. Comun. 47: 846, 1972) hat sich für den Nachweis kleiner Moleküle, beispielsweise von Arzneimitteln (z.B. Steroiden), bewährt. In einem modifizierten EMIT, wird die Aktivität des als Label dienenden Enzyms verringert, wenn das Analyt-Enzym-Konjugat an den gegen den Analyten gerichteten Antikörper bindet. Verursacht wird dies anscheinend durch eine verringerte Affinität des Substrats zum aktiven Zentrum des Enzyms in Anwesenheit des Antikörpers, oder durch sterische Behinderung oder durch eine konformative Veränderung des Enzyms.

Eine weitere Variante des EMIT beruht auf der Inhibierung der enzymatischen Ak¬ tivität durch das kovalent am Enzym gebundene Analytderivat. Die Aktivität wird in diesem Falle wieder hergestellt, wenn der gegen den Analyten gerichtete Antikörper am Enzym-markierten Analytderivat bindet. Eine andere Variante dieser Methode wurde für größere Analyte, wie beispielsweise IgG entwickelt (Anal. Biochem. 102: 167, 1980). Die mit dieser Methode erzielte Sensitivität ist jedoch recht gering.

Der FETIA (fluorescence excitation transfer immunoassay; J. Biol. Chem. 251 : 4172, 1976) beruht auf dem Energietransfer zwischen zwei fluoreszenten Molekülen, wo¬ bei das eine mit dem Antikörper und das andere mit dem Analytderivat verknüpft ist. Hier verhindert der nachzuweisende Analyt die Bildung des Komplexes zwischen markiertem Antikörper und markiertem Analytderivat.

Der ECIA (enzyme channelling immunoassay; Anal. Biochem. 1056: 223, 1979; Appl. Biochem. Biotechnol. 6, 53-64, 1981) bedient sich eines Antikörpers und eines Analyttracers, von denen jedes ein unterschiedliches Enzym trägt. Das Produkt der ersten enzymatischen Reaktion stellt das Substrat für die zweite enzymatische Re¬ aktion dar. Die Gesamtgeschwindigkeit beider Reaktionen wird durch diese Co-Im- mobilisierung deutlich erhöht.

Beim SLFIA (substrate-labeled fluorescent immunoassay) konkurriert ein Analytderivat, das mit einem Enzymsubstrat markiert ist, mit dem Analyten um die Bindungsstellen des Anti-Analyt-Antikörpers. Durch die Bindung des substratmarkierten Analytderivats an den Antikörper kann das Substrat nicht mehr enzymatisch umgesetzt werden (Burd J.F., Feeney J.E., Carrico R.J., Bogulaski R.C.: Clin. Chem. 23, 1402, 1977; Wong R.C., Burd J.F., Carrico R.J., Buckler R.T., Thoma J., Bogulaski R.C.: Clin. Chem. 25, 686, 1979).

Wird eine fluoreszierende Verbindung in Lösung mit polarisiertem Licht angeregt, so ist auch die beobachtete Emission polarisiert. Der Grad dieser Polarisation hängt von der Beweglichkeit des angeregten Moleküls ab. Die durch die Bindung an einen Antikörper abnehmende Beweglichkeit eines fluoreszierenden Tracers dient beim Fluoreszenz-Polarisationsimmunoassay zur Unterscheidung von freiem und gebundenem Tracer.

Beim Fluoreszenz-Protection-Immunoassay (H. E. Ulimann: Tokai J. Exp. Clin. Med., Vol. 4, Supplement, S. 7 - 32, 1979) handelt es sich um einen homogenen Assay, der nach dem kompetitiven Verfahren arbeitet.

Beim klassisch kompetitiven Assay bleiben im Falle niedriger Analytkonzentrationen genügend Anti-Analyt-Antikörper frei, um den Tracer derart zu binden, daß die Markierung für einen Anti-Fluorescein-Antikörper nicht mehr zugänglich und somit nicht mehr quenchbar wird. Durch Kopplung der Anti-Analyt-Antikörper an eine sterisch anspruchsvolle Komponente kann diese sterische Abschirmung noch effektiver gestaltet werden.

ERSATZBLAπ (REGEL 26)

Bei der solid phase antigen Technik verhindert analog die Bindung eines sperrigen Analytderivates am Tracerantikörper dessen gleichzeitige Bindung an den Anti- Fluorescein-Antikörper.

Zur Erhöhung des Quencheffektes wird in einer Variante des Fluoreszenz- Protection-Immunoassays die unspezifische Lichtabsorption von Aktivkohle durch deren Kopplung an den Anti-Fluorescein-Antikörper ausgenutzt (scavenging-Effekt).

Andere Techniken wurden beschrieben, wie beispielsweise der ALFPIA (antigen- labelled fluorescence protection assay; Clin. Chem. 25: 1077, 1979) oder der SPA (scintillation proximity assay; US Patent 4.568.649; WO 90/11524), bei dem dadurch ein Signal erzeugt wird, daß ein radioaktiver Tracer nahe an einen Scintillator bin¬ det.

Die dieser Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein verbessertes Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays zur Verfügung zu stellen, das den bekannten Verfahren vor allem in Hinblick auf Sensitivität, Unempfindlichkeit gegenüber potentiell störenden Einflüssen sowie Handhabung überlegen ist.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß neben den üblichen Komponenten eines aus dem Stand der Technik bekannten Immunoassays, wie beispielsweise einem Rezeptor A, der beispielsweise ein Antigen, ein Antigenderivat oder ein Antikörper sein kann und einem Tracer, der abhängig vom gewählten Testaufbau beispielsweise ein markierter Antikörper oder ein markiertes Antigen sein kann, in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren als zusätzliche Komponente ein Rezeptor B eingesetzt wird, der gegen die Markierung gerichtet ist und durch Wechselwirkung mit der Markierung Signal erzeugt oder qualitativ und/oder quantitativ verändert. Dabei wird durch eine geeignete Immobilisierung der Rezeptoren A und B an einer oder mehreren Phasen sichergestellt, daß der Tracer nicht gleichzeitig an die Rezeptoren A und B binden kann. Dies hat den Vorteil, daß ein Tracer, welcher an Rezeptor A gebunden ist und nicht an Rezeptor A gebundener Tracer unmittelbar differenziert werden können, da sie qualitativ und/oder quantitativ unterschiedliche Signale hervorrufen. Damit ist es möglich, Testsysteme zu etablieren, welche gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten eine höhere Sensitivität, verringerte Empfindlichkeit gegenüber potentiellen Störeinflüssen sowie verbesserte Handhabung aufweisen.

ERSATZBLÄΓT (REGEL 26)

Die vorliegenden Erfindung betrifft somit Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, worin eine den nachzuweisenden Analyten enthaltende Probe mit einem Rezeptor A und einem Tracer in Kontakt gebracht werden, so daß der Analyt entweder

a) einen durch die Markierung detektierbaren Komplex mit dem Tracer bildet (immunometrisches Prinzip) oder

b) durch Kompetition mit dem Tracer um die Bindung mit dem gegen den Analyten gerichteten Rezeptor A der Bildung eines Komplexes aus Rezeptor A und Tracer entgegenwirkt (kompetitives Prinzip) oder

c) durch Kompetition mit dem mit dem Analyten strukturidentischen oder dem Analyten strukturähnlichen Rezeptor A der Bildung eines Komplexes aus Rezeptor A und Tracer entgegenwirkt (kompetitives Prinzip),

dadurch gekennzeichnet, daß außerdem

1 ) ein Rezeptor B zugesetzt wird, welcher durch Wechselwirkung mit der Markierung Signal erzeugt oder qualitativ und/oder quantitativ verändert

und daß

2) das durch die Markierung verursachte Signal bestimmt wird,

wobei durch eine geeignete Immobilisierung der Rezeptoren A und B an oder in einer Phase oder mehreren Phasen sichergestellt wird, daß der Tracer keine Bindung unter gleichzeitiger Beteiligung der Rezeptoren A und B eingehen kann oder nur in einem so geringen Ausmaß, daß Nachweis und Differenzierung unterschiedlicher Analytkonzentrationen dennoch möglich sind.

Im einfachsten Fall handelt es sich bei Rezeptor B um einen Antikörper, der gegen das Label gerichtet ist. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, daß es sich im Falle "Label = Enzym" beim Rezeptor B um ein Enzymsubstrat oder um einen Enzyminhibitor handelt. Ebenso ist es beispielsweise möglich, daß es sich beim

Label um ein biotinyliertes Enzym handelt, und bei Rezeptor B um ein Avidin oder Streptavidin, welches durch Bindung an den Biotinrest die katalytische Aktivität des Enzyms inhibiert. Entscheidend ist stets, daß Label und Rezeptor B ein "Paar" bilden, in dem Sinne, daß ihre Wechselwirkung eine Signalerzeugung oder eine Signaländerung zur Folge hat.

Selbstverständlich können auch die Positionen von Label und Rezeptor B vertauscht sein. Beispielsweise wäre dann im Falle eines SPALT-Assays der Anti- Analyt-Antikörper nicht wie üblich mit dem Label markiert, sondern mit dem Rezeptor B konjugiert, während das Label so positioniert ist, daß nur freies (d.h. nicht an dem festphasengebundenen Analyt(derivat) gebundenes) Konjugat aus Anti-Analyt- Antikörper und Rezeptor B eine Bindung mit dem Label eingehen kann.

Unter einem Tracer in seiner allgemeinsten Form wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein markierter Rezeptor verstanden. Die Markierung (auch "das Label" genannt) kann dabei kovalent oder nicht-kovalent an den Rezeptor gebunden sein. Erfindungsgemäß sind alle aus dem Stand der Technik bekannten Tracer sowie Rezeptoren und Label einsetzbar, sofern sie nur in einer dem Fachmann geläufigen Weise und sinnvoll miteiander kombiniert werden. Der Rezeptorteil des Tracers kann entweder ein einzelner Rezeptor sein oder aus zwei oder mehreren Rezeptoren bestehen, welche untereinander wiederum kovalent oder nicht-kovalent verbunden sein können.

Unter einer Markierung (einem Label) wird eine Verbindung verstanden, die zur Signalabgabe oder zur direkten oder indirekten Signalerzeugung befähigt ist; beispielsweise eine luminogene Gruppe oder ein Enzym.

Im Falle eines klassisch kompetitiven Assays kann bei dem hier beschriebenen Verfahren das Gleichgewicht der analytspezifischeη Immunreaktion mit Hilfe einer zugeschalteten Immunreaktion zugunsten der zu detektierenden Immunkomplexe verschoben werden. Dies geschieht im einfachsten Falle dadurch, daß der Analyt einen Analyttracer aus der Bindungsstelle eines Antikörpers A verdrängt und der so "extrahierte" Analyttracer in einer weiteren Immunreaktion von einem Antikörper B gebunden wird.

Während Antikörper A gegen Analyt und Analyttracer gerichtet ist, ist Antikörper B nur in der Lage, den Analyttracer zu binden. Dadurch kann der Analyttracer nicht

ERSATZBLÄΓT (REGEL 26)

mehr in üblicher Weise an der Gleichgewichtsreaktion "Antikörper A / Analyt / Ana¬ lyttracer" teilnehmen.

Durch diese nur gegen den Analyttracer gerichtete Spezifität von Antikörper B und durch Wahl einer geeignet hohen Konzentration des Antikörpers B kann die Gleich¬ gewichtslage sehr günstig beeinflußt werden. Dadurch können die Nachteile einer normalen kompetitiven Immunreaktion bezüglich der Sensitivität verringert werden. Wird durch die Bindung des Tracers an Antikörper B das vom Label ausgesandte Signal verändert, so kann auf eine Abtrennung der zu messenden Komponente ver¬ zichtet werden, da in diesem Falle die Signaländerung mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten korreliert. Die Änderung des ausgesandten Signals kann entweder direkt durch die Bindung an den Antikörper B oder dadurch bewirkt werden, daß der Tracer über die Bindung an den Antikörper B in eine signalmodulierende Umgebung gebracht wird. Das läßt sich im Falle eines Fluoreszenz-Löscheffekts beispielsweise durch eine Konjugation von Antikörper B mit einer Quench-Substanz erreichen.

Im Falle eines Sandwich-Assays korreliert die Anzahl der sich bildenden Sandwich¬ komplexe (bestehend aus Fängerantikörper A, Analyt und Tracerantikörper) mit der Analytkonzentration. Demzufolge korreliert auch die verbleibende Menge an Tracer, die nicht im Sandwichkomplex gebunden ist, mit der Analytkonzentration. Dieser freie Tracer wird von Antikörper B gebunden.

In der vorliegenden Erfindung wird durch eine geeignete Immobilisierung der beiden Rezeptoren A und B sichergestellt, daß Tracer keine stabilen Immunkomplexe eingehen können, an denen Rezeptor A und B gleichzeitig beteiligt sind (beispielsweise Sandwichkomplex aus Antikörper A, Analyttracer und Antikörper B). Eine Möglichkeit der Realisierung ist die Koppelung der Rezeptoren A und B an verschiedene Partikel, wobei Größe und Zusammensetzung der Partikel so gewählt sind, daß eine Bindung des Tracers, an der gleichzeitig Rezeptor A und B beteiligt sind, erschwert oder verhindert wird. Desweiteren können die Rezeptoren A und B auch auf der gleichen Festphase gebunden sein, jedoch in einem Abstand, der groß genug ist, um eine solche Bindung mit einem Tracer zu erschweren oder zu verhindern, an welcher die Rezeptoren A und B gleichzeitig beteiligt sind.

Beispielhaft ist das Prinzip einiger Möglichkeiten schematisch in Abb. 1 dargestellt.

Beispiele derartiger räumlicher Anordnungen sind z. B. :

1. Fixierung von Antikörper A und Antikörper B an verschiedene Kunststoffkügel- chen, wobei die Größe bzw. die Masse der Kügelchen so groß gewählt wird, daß eine stabile Verbrückung zweier Kügelchen durch eine Bindung, an der Antikörper A und Antikörper B gemeinsam beteiligt sind, nicht möglich ist oder daß aus sterischen Gründen nicht genügend mit Antikörper B beschichtete Kügelchen an ein mit Antikörper A beschichtetes Kügelchen binden können.

2. Fixierung von Antikörper A an ein Kunsstoffkügelchen und Fixierung von Antikör¬ per B an die Innenwand des Reaktionsröhrchens.

Beispiel für eine heterogene Durchführungsvariante:

In ein mit Antikörper B (=Anti-Label-Antikörper) beschichtetes Polystyrolröhrchen werden mit Antikörper A (Anti-Analyt-Antikörper) beschichtete Kunststoffkügelchen, deren immobilisierte Antikörper A zuvor mit Analyttracer abgesättigt wurden, gege¬ ben. Nach Zugabe der den Analyten enthaltenden Probe und Inkubationspuffer wird die Suspension inkubiert, und anschließend werden die Kunststoffkügelchen ent¬ fernt. Das im Röhrchen verbleibende Signal wird gemessen.

3. Fixierung von Antikörper A und Antikörper B in verschiedenen Gelphasen eines Testelements, wie es beispielsweise im OPUS®-System (Fa. BDI, Westwood, MA, USA.) eingesetzt wird (Abb. 2).

3a. Ein OPUS-Testmodul wird in folgender Weise modifiziert: In die obere Agarose- schicht werden Anti-Fluoreszenzlabel-Antikörper (Antikörper B) eingebettet, die mittlere Schicht dient wie gewohnt als optischer Filter, und in die untere Schicht werden Immunkomplexe aus Anti-Analyt-Antikörper (Antikörper A) und fluoreszenz¬ markiertem Analyttracer eingelagert.

Analyte aus der aufgetragenen Probe verdrängen die Tracermoleküle aus den Im¬ munkomplexen; die Tracer diffundieren aus der unteren Schicht hinaus und werden von den Anti-Fluoreszenzlabel-Antikörpern der oberen Schicht gebunden. Das Fluo¬ reszenzsignal der unteren Schicht wird gemessen. Es resultiert eine mit zunehmen¬ der Analytkonzentration abfallende Standardkurve.

3b. Ein OPUS-Testmodul wird in folgender Weise modifiziert: In die unterste Aga- roseschicht werden Anti-Fluoreszenzlabel-Antikörper (Antikörper B) eingebettet, die mittlere Schicht dient wie gewohnt als optischer Filter, und in die obere Schicht wer¬ den Immunkomplexe aus Anti-Analyt-Antikörper (Antikörper A) und fluoreszenzmar¬ kiertem Analyttracer eingelagert.

Analyte aus der aufgetragenen Probe verdrängen die Tracermoleküle aus den Im¬ munkomplexen; die Tracer diffundieren in die untere Schicht und werden von den Anti-Fluoreszenzlabel-Antikörpern gebunden. Das Fluoreszenzsignal der unteren Schicht wird gemessen. Es resultiert eine mit zunehmender Analytkonzentration ansteigende Standardkurve.

4. Fixierung von Antikörper A und Antikörper B an Membranfasern, wobei durch die Entfernung von Antikörper A und Antikörper B auf einer Faser sichergestellt ist, daß beide Antikörper nicht gleichzeitig eine Bindung mit einem Tracer eingehen können.

Bewirkt die Bindung des Tracers an den Antikörper B eine Veränderung des Sig¬ nals, das vom Tracer ausgesandt wird, so kann der Assay in der Weise durchgeführt werden, daß ein Trenn- und/oder Waschschritt überflüssig wird. In diesem Falle korreliert die Signaländerung mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten. Bei der Signaländerung kann es sich um eine qualitative Signaländerung handeln, beispielsweise um eine Verschiebung der Emissionswellenlänge oder/und um eine quantitative Signaländerung, beispielsweise um einen Signalquench. Letzterer ist am Beispiel eines Acridiniumacylsulfonamid-Labels dargestellt in Abb. 3.

Wird das Label/Anti-Label-Antikörper-Paar ersetzt durch ein Enzym-Enzymsubstrat- Paar, so kann an die Stelle einer Signaländerung eine Signalerzeugung treten.

Die Durchführung der lnkubation(sschritte) kann auf verschiedene Weise erfolgen; die Wahl der Reihenfolge ist wie bei der heterogenen Durchführung Teil der normalen Optimierungsarbeit. Beispiele sind:

1. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyttracer wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit t zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen (s. obere Zeile der Abb. 4)

2. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und markiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthaltenden Probe in¬ kubiert. Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen (s. mittlere Zeile der Abb. 4).

3. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und Tracerantikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert. Anstelle des Analyten im präformierten Sandwichkomplex kann auch ein modifizierter Analyt eingesetzt werden, um den präformierten Komplex zu instabilisieren und dadurch die Verdrängung des Tracers zu erleichtern (s. untere Zeile der Abb. 4).

4. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyttracer und Analyt enthaltende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird Antikör¬ per B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 das Signal gemessen (s. obere Zeile der Abb. 5)

5. Die Analyt enthaltende Probe und Tracerantikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikör¬ per A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit t3 das Signal gemessen (s. mittlere Zeile der Abb. 5).

6. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und Tracerantikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkomplexe wird Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Traceranteil von Antikörper B gebunden ' (s. untere Zeile der Abb. 5)

7. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyt oder Analytderivat wird zusammen mit der den Analyten enthaltenden Probe und einem Analyttracer inkubiert. Der nicht vom Antikörper A gebundene Traceran¬ teil wird von Antikörper B gebunden.

Die Assaydurchführung läßt sich weiterhin variieren, indem zur Immunreaktion zwi¬ schen Tracer und Antikörper B eine weitere Immunreaktion zwischen Tracer und einem weiteren Antikörper B' zugeschaltet wird. Während beispielsweise der fest- phasengebundene Antikörper B die Funktion hat, den nach oder während der ana- lytspezifischen Immunreaktion verbliebenen freien Traceranteil zu binden, um des¬ sen Signal vor einer Änderung zu schützen, kann durch die Zugabe eines nicht fest- phasengebunden Antikörpers B' das Signal des in der analytspezifischen Bindung involvierten Tracers selektiv verändert werden.

Dieser zusätzliche Inkubationsschritt kann von Vorteil sein, um beispielsweise bei manueller Durchführung, die Einwirkzeit von Antikörper B genauer steuern zu kön¬ nen oder/und durch entsprechend hohe Konzentrationen an Antikörper B' eine schnellere oder/und deutlicher ausgeprägte Signaländerung zu bewirken, bei¬ spielsweise in Fällen, in denen die Menge an anwesendem oder zufügbaren Antikörper B aufgrund seiner Festphasenbindung limitiert ist.

Im folgenden sind hierzu einige Beispiele aufgeführt:

8. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase)und Analyttracer wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Antikörper B (gebun¬ den an einer anderen Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Antikörper B' zugegeben und das Signal nach einer geeigneten Zeit t3 gemessen.

9. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und markiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthaltenden Probe in¬ kubiert. Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Antikörper B' zugegeben und das Signal nach einer weiteren Inkubationszeit t3 gemessen (s. Abb. 6).

ERSATZBLATT {REGEL 26)

10. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und Tracerantikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert. Anschließend wird Antikörper B' zugegeben und das Signal gemessen.

11. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyttracer und Analyt enthal¬ tende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 Antikörper B" zugesetzt. Anschließend wird das Signal gemessen.

12. Die Analyt enthaltende Probe und Tracerantikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit t wird ein präformierter Komplex aus Antikör¬ per A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit tλ Antikörper B' zugegeben. Anschließend wird das Signal gemessen.

13. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und Tracerantikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkom¬ plexe wird Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Traceranteil von Antikörper B gebunden. Durch Zusatz von Antikörper B' bindet dieser an den im Sandwichkom¬ plex beteiligten Tracer.

Handelt es sich bei der Labelgruppe des Tracers um ein Enzym, so kann Antikörper B durch ein Enzymsubstrat ersetzt werden. In diesem Falle kommt es zu einer Sig¬ nalerzeugung, die durch den Kontakt von Tracer und Enzymsubstrat ermöglicht wird. Auch hier korreliert das erzeugte Signal mit der Konzentration des zu bestim¬ menden Analyten. Beispiele hierfür sind:

14. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyttracer (mit einem Enzym markierten Analytderivat) wird mit der Analyt enthal¬ tenden Probe inkubiert. Ein an einer anderen Festphase immobilisiertes Enzym¬ substrat ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemes¬ sen.

15. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und enzymmarkiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Ein an einer anderen Festphase gebundenes Enzymsubstrat ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf ei¬ ner gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen.

16. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und Tracerantikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit einem Enzymsubstrat (ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert.

17. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyttracer und Analyt enthal¬ tende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein Enzymsubstrat (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 das Signal gemessen.

18. Die den Analyten enthaltende Probe und Tracerantikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird ein Enzymsubstrat (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zuge¬ setzt und nach einer Zeit t3 das Signal gemessen.

19. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und Tracerantikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkom¬ plexe wird ein Enzymsubstrat B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Traceranteil in die Lage versetzt, mit dem Enzymsubstrat zu reagieren.

20. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase)und Analyttracer wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Ein gegen das Enzym gerichteter und die enzymatische Aktivität verringernder oder verhindernder Antikör¬ per B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit t zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Enzymsubstrat zugegeben und das Signal nach einer geeigneten Zeit t3 gemessen.

21. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und enzymmarkiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Der gegen das Enzyπs gerichtete Antikörper B (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit t zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Enzymsubstrat zugegeben und das Signal nach einer weiteren Inkubationszeit t3 gemessen.

22. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und Tracerantikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit Antikörper B (gerichtet gegen das Enzym und ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert. Anschließend wird ein Enzym¬ substrat zugegeben und das Signal gemessen.

23. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyttracer und Analyt enthal¬ tende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird Antikörper B (gerichtet gegen -das Enzym und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 ein Enzymsubstrat zugesetzt. Anschließend wird das Signal gemessen.

24. Die Analyt enthaltende Probe und Tracerantikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikör¬ per A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird Antikörper B (gerichtet gegen das Enzym und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit t3 ein Enzymsubstrat zugegeben. Ansch¬ ließend wird das Signal gemessen.

25. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und Tracerantikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkom¬ plexe wird Antikörper B (gerichtet gegen das Enzym und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Traceranteil von Antikörper B gebunden. Durch Zusatz eines Enzymsubstrats kann der im Sandwichkomplex beteiligte Tracer ein Signal erzeugen.

ERSATZBUTT (REGEL 26)

Alle hier aufgeführten Beispiele lassen sich natürlich auch in einer Variante durch¬ führen, in der die Positionen von Label und Rezeptor B vertauscht sind. Beispiele hierfür sind:

26. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und einem mit Rezeptor B konjugierten Analytderivat wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Das Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewis¬ sen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen.

27. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und einem mit Antikörper B konjugierten Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Ana¬ lyt enthaltenden Probe inkubiert. Das Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen.

28. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und mit Antikörper B markierten Anti-Analyt-Antikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert.

29. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), ein mit Antikörper B konjugiertes Analytderivat und Analyt enthaltende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ab¬ lauf einer gewissen Zeit ti wird Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zu¬ gegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 das Signal gemessen.

30. Die Analyt enthaltende Probe und ein mit Antikörper B konjugierte Anti-Analyt- Antikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit t3 das Signal gemessen.

31. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und ein mit Antikörper B konjugierter Anti-Analyt-Antikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkomplexe wird Label (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene

Anteil an mit Antikörper B konjugierter Anti-Analyt-Antikörper in die Lage versetzt, das Label zu binden.

32. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und mit Enzymsubstrat markiertes Analytderivat wird mit der Analyt enthaltenden Probe inkubiert. Ein an einer anderen Festphase immobilisiertes Enzym ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit t zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen.

33. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und enzymsubstratmarkiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthal¬ tenden Probe inkubiert. Ein an einer anderen Festphase gebundenes Enzym ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf ei¬ ner gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird das Signal gemessen.

34. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und enzymsubstratmarkierter Anti-Analyt-Antikörper, also ein präformierter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit einem Enzym (ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert.

35. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), ein mit Enzymsubstrat markiertes Analytderivat und Analyt enthaltende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ab¬ lauf einer gewissen Zeit ti wird ein Enzym (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 das Signal gemessen.

36. Die Analyt enthaltende Probe und mit Enzymsubstrat markierter Anti-Analyt-An¬ tikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird ein Enzym (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit t3 das Signal gemessen.

37. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und enzymsubstratmarkierter Anti-Analyt-Antikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkomplexe wird ein Enzym (ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Anteil an enzymsubstratmarkierten Antikörper in die Lage versetzt, mit dem Enzym zu reagieren.

38. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase)und enzymsubstratmarkiertem Analytderivat wird mit der Analyt enthaltenden Probe in¬ kubiert. Ein gegen das Enzymsubstrat gerichteter Antikörper B (hemmt oder verhin¬ dert durch Bindung des Enzymsubstrats dessen enzymatische Umwandlung; Anti¬ körper B ebenfalls gebunden an einer Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Enzym zugegeben und das Signal nach einer geeigneten Zeit t3 gemessen.

39. Ein präformierter Komplex aus Analytderivat (gebunden an einer Festphase) und enzymsubstratmarkiertem Antikörper A (SPALT-Prinzip) wird mit der Analyt enthal¬ tenden Probe inkubiert. Der gegen das Enzymsubstrat gerichtete Antikörper B (ge¬ bunden an einer anderen Festphase) ist während dieser Inkubation von Anfang an anwesend oder wird erst nach Ablauf einer gewissen Zeit ti zugegeben. Nach einer Zeit t2 wird ein Enzym zugegeben und das Signal nach einer weiteren Inkubations¬ zeit t3 gemessen, (s. Abb. 7)

40. Ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase), Analyt und mit Enzymsubstrat markierter Anti-Analyt-Antikörper, also ein präformier¬ ter Sandwichkomplex, wird mit der Analyt enthaltenden Probe und mit Antikörper B (gerichtet gegen das Enzymsubstrat und ebenfalls gebunden an einer Festphase) inkubiert. Anschließend wird ein Enzym zugegeben und das Signal gemessen.

41. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), ein mit Enzymsubstrat markiertes Analytderivat und Analyt enthaltende Probe werden zusammen inkubiert. Nach Ab¬ lauf einer gewissen Zeit t-| wird Antikörper B (gerichtet gegen das Enzymsubstrat und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und nach Ablauf einer Zeit t2 ein Enzym zugesetzt. Anschließend wird das Signal gemessen.

42. Die Analyt enthaltende Probe und mit Enzymsubstrat markierter Anti-Analyt-An¬ tikörper werden zusammen inkubiert und nach Ablauf einer gewissen Zeit ti wird ein präformierter Komplex aus Antikörper A (gebunden an einer Festphase) und Analyt zugegeben. Nach Ablauf einer Zeit t2 wird Antikörper B (gerichtet gegen das Enzymsubstrat und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugesetzt und nach einer Zeit t3 ein Enzym zugegeben. Anschließend wird das Signal gemessen.

43. Antikörper A (gebunden an einer Festphase), die den Analyten enthaltende Probe und enzymsubstratmarkierter Anti-Analyt-Antikörper werden inkubiert. Nach Ausbildung der Sandwichkomplexe wird Antikörper B (gerichtet gegen das Enzym¬ substrat und ebenfalls gebunden an einer Festphase) zugegeben und dadurch der nicht im Sandwichkomplex gebundene Anteil an enzymsubstratmarkiertem Antikör¬ per von Antikörper B gebunden. Durch Zusatz eines Enzyms kann der im Sandwich¬ komplex beteiligte Tracer ein Signal erzeugen.

Die vorliegende Erfindung wird außerdem durch die nachfolgenden Beispiele, welche die Erfindung weiter erläutern aber in keiner Weise einschränken sollen sowie durch die Patentansprüche beschrieben.

Beispiel 1)

Lumineszenzimmunoassay (LIA) zur PSA-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Anti-PSA-Antikörper (BW 92-283/029; Behringwerke AG, Marburg) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil 2, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro ml 10 %ige Magnetpar¬ tikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Ko¬ nzentration von 2,5 mg pro ml Lagerpuffer (50 mM

2-Cyclohexylamino-ethansulfonsäure (CHES), 0,5 g NaN3/l, 3 g Rinderserum- rumalbumin/l, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel wurden wie im Falle der Festphase A mit einem monoklonalen An¬ tikörper, der gegen das Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A-0257 541 und EP-A-0 330 050) gerichtet ist (BW 90-9/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) beschichtet.

Tracer:

Ein monoklonaler Anti-PSA-Antikörper (BW 92-284/03, Behringwerke AG) wurde mit dem Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A-0257 541 und EP-A-0 330 050) im molaren Verhältnis 1 + 1 markiert. Die Markierung wurde nach dem in der Literatur beschriebenen NHS-Verfahren (NHS = N-Hydroxysuccinimid-Reaktivgruppe; A.K.Campbell, Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine, 1. Aufl., VCH/Horwood, Weinheim/Chichester, 1988, S.439.) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte mittels Gelpermeationschromatographie (Sephadex G 25). Aufbewahrt wurde der Tracer in einer Konzentration von 300 ng/ml Tracerpuffer (10 mM Natriumacetat, 150 mM NaCI, 2 g Rinderserumalbumin/I, 0,1% Mergal K9N, pH 5,0).

ERSATZBLATT (REGEL 2D)

PSA-Standards:

Der Puffer, in dem PSA (Prostata-spezifisches Antigen, Behringwerke AG) gelöst wurde, hatte folgende Zusammensetzung: 50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% NaN3, 0,01% Tween 20, 0,5 g Rinder-lgG/l, 40 g Rinderserumalbumin/I, 8 mg Titriplex V/l, pH 7,6. Die Standardkonzentrationen betrugen 0, 50, 100, 200 und 400 ng/ml.

Präformierter Komplex :

Der präformierte Komplex aus Anti-PSA-Antikörper (gebunden an Festphase A) und PSA wurde folgendermaßen gebildet:

1 ml der Festphasen A-Suspension und 1 ml PSA-Lösung [20μg/ml (10mM Phos¬ phatpuffer, pH7,3 mit 1 g Rinder-lgG/l, 0,5 g Natriumazid/I)] wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert, 5 X mit 1 ml Puffer gewaschen (magnetische Abtrennung) und auf ein Endvolumen von 1 ml aufgefüllt.

Assaydurchführung:

10 μl PSA enthaltende Probe wurden mit 10μl Tracer 2 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden 10μl des präformierten Komplexes zugegeben und nach weiteren 2 Minuten 10μl von Festphase B. Die Probe wurde anschließend in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) gemessen (Meßzeit 1 s).

Die Ergebnisse sind in Abb. 8 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 8a dargestellt.

Beispiel 2)

Immunoluminometrischer Assay (ILMA) zur PSA-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Anti-PSA-Antikörper (BW 92-283/029; Behringwerke AG, Marburg) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2 , 1974) beschichtet.

Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro ml 10 %ige Magnetpar¬ tikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Ko¬ nzentration von 10 mg/ml Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3/l, 3 g Rinderserumalbumin/I, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel wurden wie im Falle der Festphase A mit einem monoklonalen An¬ tikörper, der gegen das Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A-0257 541 und EP-A-0330050) gerichtet ist (BW 90-9/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) beschichtet. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg/ml Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3/l, 3 g Rinderserum-albumin/l, pH 8,0).

Tracer:

Ein monoklonaler Anti-PSA-Antikörper (BW 92-284/03, Behringwerke AG) wurde mit dem Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A-0257 541 und EP-A-0330 050) im molaren Verhältnis 1 + 0,5 markiert. Die Markierung wurde nach dem in der Literatur beschriebenen NHS-Verfahren (NHS = N-Hydroxysuccinimid-Reaktivgruppe; A.K.Campbell, Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine, 1. Aufl., VCH/Horwood, Weinheim/Chichester, 1988, S.439.) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte mittels Gelpermeationschromato- graphie (Sephadex G 25). Aufbewahrt wurde der Tracer in einer Konzentration von 30 μg/ml Tracerpuffer (10 mM Natriumacetat, 150 mM NaCI, 2 g Rinderserum- albumin/l, 0,1% Mergal K9N, pH 5,0).

PSA-Standards:

Der Puffer, in dem PSA (Prostata-spezifisches Antigen, Behringwerke AG) gelöst wurde, hatte folgende Zusammensetzung: 50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% NaN3,

0,01 % Tween 20, 0,5 g Rinder-lgG/l, 40 g Rinderserumalbumin/I, 8 mg Titriplex V/ 1, pH 7,6. Die Standardkonzentrationen betrugen 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.2, 12.5 μg/ml.

ErtStf-löLAIl (KEGEL 26)

Assaydurchführung:

10 μl PSA enthaltende Probe wurden mit 10μl Tracer und 10 μl Festphase A 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10μl Festphase B zugegeben und nach weiteren 15 Minuten der Ansatz in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen.

Die Ergebnisse sind in Abb. 9 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 9a dargestellt.

Beispiel 3)

SPALT-Assay zur Thyroxinbestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/20) wurden mit dem im BeriLux T3 verwendeten Protein-T3-Konjugat nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben- Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 0,3 mg Konjugat pro ml 10 %ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchs¬ fertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro ml La¬ gerpuffer (50 mM Tris/Citrat-Puffer, 0,5 g NaN3/l, 3 g Rinderserumalbumin/I, pH 7,0).

Festphase B:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A- 0257 541 und EP-A-0 330 050) gerichtet ist (BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184)nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Pep¬ tiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro ml 10 %ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine

Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg/ml Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3/l, 3 g Rinderserumalbumin/I, pH 8,0).

Tracer:

Ein monoklonaler Anti-T4-Antikörper (BW 86-49/7/1 , Behringwerke AG) wurde mit dem Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A-0257 541 und EP-A-0 330 050) im molaren Verhältnis 1 + 5 markiert. Die Markierung wurde nach dem in der Literatur beschriebenen NHS-Verfahren (NHS = N-Hydroxysuccinimid-Reaktivgruppe; A.K.Campbell, Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine, 1. Aufl., VCH/Horwood, Weinheim/Chichester, 1988, S.439.) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte mittels Gelpermeationschromatographie (Sephadex G 25). Aufbewahrt wurde der Tracer in einer Konzentration von 40 μg/ml Tracerpuffer (50 mM Citronensäure/Phosphat-Puffer, 2 g Polyethylenglykol 6000/I, 2 g Mowiol/I; pH 6,3).

T4-Standards:

Der Puffer für die T4-Standards hatte folgende Zusammensetzung: 10 mM Phos¬ phat, 1 g Rinder-lgG/l, 0,5 g NaN3/l; pH 7,3. Die Standardkonzentrationen betrugen 0, 0.1 , 0.5, 1 , 5, 10, 50 μg/ml.

Präformierter Komplex :

Der präformierte Komplex (an Festphase A gebundener Tracer) wurde folgender¬ maßen hergestellt:

6 ml Festphase A wurden auf 3 ml eingeengt (magnetische Abtrennung der Fest¬ phase und Wiederaufnahme in Puffer). Anschließend wurden 0,2 ml Tracer zuge¬ geben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Mit 10 mM Phosphatpuffer, 1g IgG/l, 0,5 g NaN3/l, pH 7,3 (Waschpuffer) wurde 5 X gewaschen. Die Lagerung erfolgte in 3 ml Waschpuffer.

Assaydurchführung:

10 μl T4 enthaltende Probe wurden mit 10μl präformiertem Komplex 2 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden 10 μl Festphase B zugegeben und nach weite¬ ren 2 Minuten in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen.

Die Ergebnisse sind in Abb. 10 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 10a dargestellt.

Beispiel 4)

LIA zur Thyroxinbestimmung (Protector/Quencher-Methode)

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/20) wurden mit einem monoklonalen Anti-T4-Antikörper (BW 86-49/7/1 , Behringwerke AG) nach der Car¬ bodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 1 ,25 mg Antikörper/ml 10 %ige Magnetpartikel¬ suspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel- Konzentration von 2,5 mg/ ml Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 1 g Rinder-lgG/l, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1-100/40) wurden mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das Acridinium-N-Acylsulfonamid-Label (EP-A- 0257 541 und EP-A-0 330 050)-Label gerichtet ist (Protector-Antikörper, BW 90- 9/016; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2183) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendelberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungs¬ konzentration betrug 6 mg Antikörper/ml 10 %ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg/ml Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 3 g Rinderserumalbumin/I, pH 8,0).

Tracer:

Der im BeriLux FT3 verwendete Tracer wurde in einer Konzentration von 360 ng/ml

Tracerpuffer (10mM Phosphatpuffer, 1g IgG/l, pH 7,3) aufbewahrt.

Quencher-Antikörper:

Der Anti-Label-Antikörper BW 90-8/04 (Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) wurde in einer Konzentration von 0,1 mg/ml Puffer (10mM Phosphat, 1g IgG/l, 0,5 g Natriumazid / 1, pH 7,3) aufbewahrt.

T4-Standards:

Es wurden die BeriLux® T4 Standards (Behringwerke AG) mit einer Konzentration von 0; 18; 40; 85; 175; 340 ng/ml Serummatrix eingesetzt.

Präformierter Komplex :

Der präformierte Komplex (an Festphase A gebundener Tracer) wurde folgender¬ maßen hergestellt:

Zu 2 ml Festphase A wurden wurden 2 ml Tracer gegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Mit 10 mM Phosphatpuffer, 1g IgG/l, 0,5 g Natriumazid/I, pH 7,3 wurde 5 X gewaschen und auf 2 ml aufgefüllt. Anschließend wurden 2 mg ANS (8-Anilino- naphthalin-1 -sulfonsäure) zugesetzt.

Assaydurchführung:

10 μl präformierter Komplex und 10 μl T4 enthaltende Probe wurden 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden im Abstand von jeweils 10 Minuten 10 μl Festphase B und 10 μl Quencher-Antikörper zugegeben und die Suspension in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen. Die Inkubationstemperatur betrug stets 37°C.

Die Ergebnisse sind in Abb. 11 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 11a dargestellt.

Beispiel 5)

LIA zur Thyroxinbestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/20) wurden mit einem monoklonalen Anti-T4-Antikörper (BW 86-49/7/1 , Behringwerke AG) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 1 ,25 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 1 g Rinder-IgG pro Liter, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das BeriLux-Label gerichtet ist (Quencher- Antikörper BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184)) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben- Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 3 g Rinderserumalbumin pro Liter, pH 8,0).

Tracer:

Der im BeriLux FT3 verwendete Tracer wurde in einer Konzentration von 360 ng/mL

Tracerpuffer (10mM Phosphatpuffer, 1 g IgG/L, 0,5 g NaN3/L, pH 7,3) aufbewahrt.

T4-Standards:

Es wurden die BeriLux® T4 Standards (Behringwerke AG) mit einer Konzentration von 0; 18; 40; 85; 175; 340 ng/mL Serummatrix eingesetzt.

Präformierter Komplex :

Der präformierte Komplex (an Festphase A gebundener Tracer) wurde folgendermaßen hergestellt:

Zu 2 mL Festphase A wurden wurden 2 mL Tracer gegeben und 30 Minuten bei

37°C inkubiert. Mit 10 mM Phosphatpuffer, 1g IgG/L, 0,5 g Natriumazid/L, pH 7,3 wurde 5 X gewaschen und auf 2 mL aufgefüllt. Anschließend wurden 2 mg ANS (8-

Anilino-naphthalin-1 -sulfonsäure) zugesetzt.

Assaydurchführung:

10 μL präformierter Komplex und 10 μL T4 enthaltende Probe wurden 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 10 μL Festphase B zugegeben und weitere 10 Minuten inkubiert, bevor die Suspension in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen wurde. Die Inkubationstemperatur betrug stets 37°C.

Die Ergebnisse sind in Abb. 12 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 12a dargestellt

Beispiel 6)

LIA zur FT3-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/20) wurden mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper (BeriLux FT3-Antikörper) nach der Carbodiimid- Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 0,25 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 1 g Rinder-IgG pro Liter, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das BeriLux-Label gerichtet ist (Quencher- Antikörper, BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger et al., Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben- Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 3 g Rinderserumalbumin pro Liter, pH 8,0).

Tracer:

1 ng Haptentracer (T3-Acridiniumtracer; siehe Abb. 17) / mL Tracerpuffer (50 mM Tris/HCI; 150 mM NaCI; 0,5 mg Natriumazid / L; 0,1 g Tween 20 / L; 0,5 g Rinder- IgG / L; 40 g Rinderserumalbumin / L; 8 mg Titriplex V / L; pH 7,6).

FT3-Standards:

Es wurden FT3-Standards in Serummatrix im Konzentrationsbereich von 0 bis 22 pg/mL eingesetzt.

Assaydurchführung:

50 μL Probe wurden mit 10 μL Tracer und 10 μL Festphase A 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 10 μL Festphase B zugegeben und weitere 10 Minuten inkubiert, bevor die Suspension in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen wurde. Die Inkubationstemperatur betrug stets 37°C.

Die Ergebnisse sind in Abb. 13, und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 13a dargestellt

Beispiel 7)

Immunoluminometrischer Assay (ILMA) zur PSA-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Anti-PSA-Antikörper (BW 92-283/029; Behringwerke AG, Marburg) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger, P.Stelzel, Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 10 mg pro mL Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3 / L, 3 g Rinderserumalbumin / L, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel wurden wie im Falle der Festphase A mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das BeriLux-Label gerichtet ist (BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) beschichtet. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel- Konzentration von 5 mg pro mL Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3 / L, 3 g Rinderserumalbumin / L, pH 8,0).

Tracerkonzentrat:

Ein monoklonaler Anti-PSA-Antikörper (BW 92-284/03, Behringwerke AG) wurde mit dem BeriLux®-Label im molaren Verhältnis 1 + 10 markiert. Die Markierung wurde nach dem in der Literatur beschriebenen NHS-Verfahren (NHS = N- Hydroxysuccinimid-Reaktivgruppe; A.K.Campbell, Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine, 1. Aufl., VCH/Horwood, Weinheim/Chichester, 1988, S.439.) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte mittels Gelpermeationschromatographie (Sephadex G 25). Aufbewahrt wurde der Tracer in einer Konzentration von 30 μg/mL Tracerpuffer (10 mM Natriumacetat, 150 mM NaCI, 2 g Rinderserumalbumin / L, 0,1% Mergal K9N, pH 5,0).

Tracer:

Zur Herstellung des gebrauchsfertigen Tracers wird das Tracerkonzentrat mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3 mit 0,15 M NaCI und 1 g Rinderserumalbumin pro Liter) im Verhältnis 1 : 200 verdünnt.

PSA-Standards:

Der Puffer, in dem PSA (Prostata-spezifisches Antigen, Behringwerke AG) gelöst wurde, hatte folgende Zusammensetzung: 50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% NaN3, 0,01% Tween 20, 0,5 g Rinder-IgG / L, 40 g Rinderserumalbumin / L, 8 mg Titriplex V / L, pH 7,6. Die Standardkonzentrationen betrugen 0, 0.5, 3.2, 10.6, 32, 80, 160 ng / mL.

Assaydurchführung:

10 μL PSA enthaltende Probe wurden mit 10 μL Festphase A und 20μL Tracer 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10μL Festphase B zugegeben und nach weiteren 5 Minuten der Ansatz in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 0,7 s gemessen. Als Lichtauslösereagenzien wurden 20 mM HNO3 mit 0,5% H2O2 und 125 mM NaOH verwendet.

Die Ergebnisse sind in Abb. 14, und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 9a dargestellt.

Beispiel 8)

Immunoluminometrischer Assay (ILMA) zur PSA-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/40) wurden mit einem monoklonalen Anti-PSA-Antikörper (BW 92-283/029; Behringwerke AG, Marburg) nach der Carbodiimid-Methode (G. Wendlberger, P.Stelzel, Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974) beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro mL ,10%ige

Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 10 mg pro mL Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3 / L, 3 g Rinderserumalbumin / L, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel wurden wie im Falle der Festphase A mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das BeriLux-Label gerichtet ist (BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) beschichtet. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel- Konzentration von 5 mg pro mL Lagerpuffer (50 mM CHES, 0,5 g NaN3 / L, 3 g Rinderserumalbumin / L, pH 8,0).

Tracerkonzentrat:

Ein monoklonaler Anti-PSA-Antikörper (BW 92-284/03, Behringwerke AG) wurde mit dem BeriLux®-Label im molaren Verhältnis 1 + 10 markiert. Die Markierung wurde nach dem in der Literatur beschriebenen NHS-Verfahren (NHS = N- Hydroxysuccinimid-Reaktivgruppe; A.K.Campbell, Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine, 1. Aufl., VCH/Horwood, Weinheim/Chichester, 1988, S.439.) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte mittels Gelpermeationschromatographie (Sephadex G 25). Aufbewahrt wurde der Tracer in einer Konzentration von 30 μg/mL Tracerpuffer (10 mM Natriumacetat, 150 mM NaCI, 2 g Rinderserumalbumin / L, 0,1% Mergal K9N, pH 5,0).

Tracer:

Zur Herstellung des gebrauchsfertigen Tracers wird das Tracerkonzentrat mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3 mit 0,15 M NaCI und 1 g Rinderserumalbumin pro Liter) im Verhältnis 1 : 200 verdünnt.

Meßpuffer:

12,1 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 8,8 g Natriumchlorid, 0,1 g Natriumazid und 10 g Tween 20 werden i990 mL dem. Wasser gelöst und mit 25%iger Salzsäure ein pH von 8,0 eingestellt.

Durch den Einsatz des Meßpuffers in Verbindung mit geeigneten

Lichtauslösereagentien (siehe Assaydurchführung) lassen sich Matrixeffekte reduzieren.

PSA-Standards:

Der Puffer, in dem PSA (Prostata-spezifisches Antigen, Behringwerke AG) gelöst wurde, hatte folgende Zusammensetzung: 50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% NaN3,

0,01 % Tween 20, 0,5 g Rinder-IgG / L, 40 g Rinderserumalbumin / L, 8 mg Titriplex

V / L, pH 7,6. Die Standardkonzentrationen betrugen 0, 3.2, 10.6, 32, 80, 160 ng / mL

Assaydurchführung:

10 μL PSA enthaltende Probe wurden mit 10 μL Festphase A und 20μL Tracer 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10μL Festphase B zugegeben und nach weiteren 5 Minuten 200 μL Meßpuffer. Der Ansatz wurde in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 0,7 s gemessen. Als Lichtauslösereagenzien wurden 20 mM HNO3 mit 0,5% H2O2 und 125 mM NaOH verwendet.

Die Ergebnisse sind in Abb. 15 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 9a dargestellt.

Beispiel 9)

LIA zur T3-Bestimmung

Herstellung der Reagenzien:

Festphase A:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/20) wurden mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper (BeriLux FT3-Antikörper) nach der Carbodiimid- Methode [G.Wendlberger, P.Stelzel, Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974] beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 0,25 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 3 g Rinderserumalbumin pro Liter, pH 8,0).

Festphase B:

Magnetpartikel der Fa.Rhone-Poulenc (Artikel-Nr. EM1 -100/60) wurden mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das BeriLux-Label gerichtet ist (Quencher- Antikörper, BW 90-8/04; Behringwerke AG; hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2184) nach der Carbodiimid-Methode [G.Wendlberger, P.Stelzel, Synthese von Peptiden, Teil II, Methoden Org. Chem. (Houben-Weyl) 4th ed. 1952, Bd. XV/2, 1974] beschichtet. Die Beschichtungskonzentration betrug 6 mg Antikörper pro mL 10%ige Magnetpartikelsuspension. Die gebrauchsfertige Suspension hatte eine Magnetpartikel-Konzentration von 2,5 mg pro mL Lagerpuffer (10,36 g CHES, 0,5 g Natriumazid, 3 g Rinderserumalbumin pro Liter, pH 8,0).

Synthese des Tracers

Schritt 1: Herstellung eines Streptavidin-T3-Koniuαats a) 3 mg Streptavidin werden in 1.7 mL 0.1 M Na-tetraboratpuffer (mit 10% Dioxan), pH 8.0 gelöst. 28 μL GMBS-Lösung (5 mg g-Maleinimidobutansäure-N- succinimidylester / mL Dioxan) werden zugesetzt. Nach 1 stündiger Reaktion bei RT wird über eine PD10/G25m-Säule in 0.1 M Phosphatpuffer (enthält 5mM EDTA), pH 6.0 umgepuffert. Das resultierende Eluat ("Lösung 1") hat ein Volumen von 2 mL und eine Konzentration von 0.9 mg Streptavidin / mL. b) 7 mg Triiodthyronin (T3) werden in 700μL DMSO gelöst. Es werden 10 μL N- Ethylmorpholin und 1.6 mg SAMBA (S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid), gelöst in 80 μL DMSO, zugegeben. Nach 30 Minuten werden 100 μL 1 M wäßrige Hydroxylaminlösung zupipettiert. Die resultierende Lösung ("Lösung 2") wird 15 Minuten bei RT inkubiert. c) 1.76 mL Lösung 1 und 41.5 μL Lösung 2 werden gemischt und 1 Stunde bei RT stehengelassen. Anschließend wird über eine PD10/G25m-Säule (Sephadex) in 0.1M K-Phosphatpuffer, pH 7.2, umgepuffert ("Lösung 3"). Nach dem Umpuffem beträgt die Konzentration an Streptavidin-T3-Konjugat 0.6 mg/mL

Schritt 2: Markierung des Streptavidin-T3-Koniuαats mit BeriLux-Label a) Synthese des BeriLux-Labels mit Biotin-Gruppe:

Man legt 200 mg (0.26 mmol) BeriLux-Label (mit NHS-Reaktivgruppe) in 30 mL

Acetonitril vor und tropft bei RT eine Lösung von 98 mg (0.26 mmol) N-Biotin-1 ,8- diamino-3,6-dioxaoctan (Boehringer Mannheim) und 46 μL (0.3 mmol) Triethylamin in 5 mL Acetonitril zu und rührt die Mischung 12 h bei RT, wobei sich die

Reaktionsmischung grün färbt. Die Mischung wird filtriert und das Lösungsmittel im

Vakuum abdestilliert. Der Rückstand (400 mg; grünes öl) wird durch präparative Mitteldruckchromatographie (System Büchi) an einer Reversed-Phase Säule [Stationäre Phase: LichroPrep C-18 (Fa. Merck); Mobile Phase: Gradient von Acetonitril/Wasser = 33: 67 + 0.1 Vol% Trifluoressigsäure nach Acetonitril/Wasser = 45: 55 + 0.1Vol.% Trifluoressigsäure] gereinigt. Man isoliert nach Abdestillieren des Acetonitrils i. Vak. und Entfernung des Wassers durch Gefriertrocknung 170 mg gelbes Pulver. MS (FAB): [C47H55Nδθ9S2] ⁺ (berechnet: 911.347; gefunden: 911.350) [CF3CO2]- (113). b) 182 μL Lösung 3 (0.1 mg Streptavidin-T3-Konjugat), 718 μL 0.1 M K- Phosphatpuffer, pH 7.2, 14 μL Acetonitril und 86 μL einer Markierungslösung [10 mg BeriLux-Label (mit Biotingruppe) pro mL Acetonitril] werden zusammenpipettiert und 30 Minuten bei RT inkubiert. Der Tracer wird gelchromatographisch über PD10/G25m gereinigt.

Herstellung der Tracerlösung

6 ng Tracer / mL Tracerpuffer

Tracerpuffer: 100 mM PBS, pH 6,3 mit 0.2% Rinder-IgG, 0,1% Mergal und 0.025%

ANS.

T3-Standards:

Es wurden T3-Standards in Serummatrix im Konzentrationsbereich von 0 bis 7,5 ng/mL eingesetzt.

Meßpuffer:

100 mM Tris-Puffer, pH 8.0 mit 150 mM NaCI, 1 % Tween 20 und 0,01 % Natriumazid.

Assaydurchführung:

50 μL Probe wurden mit 100 μL Tracer und 20 μL Festphase A 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10 μL Festphase B zugegeben und nach 10 minütiger Inkubation bei RT 200μL Meßpuffer zupipettiert. Die Suspension wurde in einem Luminometer (BeriLux® Analyzer) 1 s gemessen (Auslösereagenzien R1 = 20mM Salpetersäure mit 0,5% Wasserstoffperoxid; R2 = 125 mM Natronlauge).

Die Ergebnisse sind in Abb. 16 und die Assaydurchführung ist schematisch in Abb. 13a dargestellt.

Legende zu Abb. 3

Die Abbildung zeigt die quenchende Wirkung von drei verschiedenen Anti-Label- Antikörpern auf einen mit BeriLux® - Label (Acridiniumacylsulfonamid-Label) markierten Tracerantikörper (Signalaktivität ohne Zusatz eines Anti-Label- Antikörpers = 100 %).

Während sich der Antikörper BW 90-9/016 besonders zum Schutz des Labels vor signaländernden Reagenzien eignet, kann BW 90-8/04 als signaländernder (hier signalquenchender) Antikörper eingesetzt werden. BW 89-191/019 ist für beide Anwendungen weniger gut geeignet. Die Meßzeit im BeriLux® Analyzer beträgt 1 Sekunde.