L'invention a pour objet une méthode pour caractériser l'origine et/ou l'état de cellules pathologiques, notamment cancéreuses, ou de cellules saines. Elle a également pour objet les applications de cette méthode en biologie, comprenant le domaine de la santé du diagnostic et de la recherche.

La caractérisation des cellules, notamment de tumeurs cancéreuses, repose principalement sur la diversité morphologique des cellules.

D'autres techniques, basées sur le phénotype moléculaire (ADN, ARN, et protéines), telles que les puces à ADN et à protéines, se sont développées. Ces techniques peuvent aider à comprendre les mécanismes complexes de la pathologie puisqu'elles permettent d'identifier des milliers de gènes et de protéines impliqués au sein d'une cellule.

Cependant, leur mise en œuvre nécessite des préparations d'échantillons et une analyse des résultats très longue, pas toujours discriminante pour différencier des cellules.

Il est de plus difficile de les utiliser en routine car souvent les résultats ont besoin d'être confirmés gène par gène ou protéine par protéine par d'autres techniques de validation des phénotypes moléculaires les plus courants, comme la Réaction en Chaîne par Polymérase quantitative (qPCR) après transcription inverse pour les profils d'expression génique et immunoblot ou immunocyto/histochimie pour les protéines.

De telles méthodes sont souvent aléatoires, non précises, longues à mettre en œuvre, fastidieuses et coûteuses.

Les travaux des inventeurs ont alors porté sur la recherche d'une méthode analytique simple permettant notamment de différencier avec précision des cellules, en particulier les tumeurs cancéreuses, de différencier également les effets d'une substance sur les cellules pathogènes, dans le cadre d'une évaluation pré-clinique, d'obtenir une analyse rapide, peu coûteuse et facile à mettre en œuvre afin de permettre son usage dans un laboratoire de routine.

Les résultats obtenus ont montré que les mesures des variations de la composition isotopique de certains éléments des cellules dépendent bien des effets isotopiques associés aux processus biochimiques et constituent une signature isotopique permettant de caractériser une cellule pathologique, spécialement une cellule cancéreuse, ou à titre comparatif une cellule saine.

L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle méthode pour caractériser l'origine et/ou l'état de cellules pathologiques. Elle vise en particulier l'identification de cellules saines ou pathologiques, en particulier cancéreuses, basée sur la mesure de variations de la composition isotopique de certains éléments présents dans les cellules.

L'invention vise également à fournir des moyens pour l'étude des perturbations métaboliques de ces cellules.

Elle porte en outre sur les applications de cette méthode pour l'évaluation de l'effet d'un traitement thérapeutique et pour l'élaboration de bases de données. La méthode selon l'invention, pour caractériser l'origine et/ou l'état de cellules pathologiques ou saines, est caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure des variations isotopiques en abondance naturelle d'éléments des cellules, ou d'extraits de cellules, dont les teneurs sont modifiées en situation pathologique la mesure des variations isotopiques de ¹⁵ N et ¹ C avec un Spectromètre de Masse de Rapports Isotopiques (SMRI en abrégé), avantageusement avec un Analyseur Elémentaire couplé à un Spectromètre de Masse de Rapports Isotopiques (AE-SMRI en abrégé) Par extrait de cellules, on entend des cellules lyophilisées et/ou des fractions de ces cellules.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, les variations isotopiques mesurées sont celles de ¹⁵ N et ¹³ C.

Les teneurs isotopiques de ces éléments sont spécialement exprimées par le rapport isotopique R des courants ioniques de la fraction de l'isotope le plus lourd sur l'isotope le plus léger. Il s'agit tout particulièrement des rapports isotopiques ¹⁵ N/ ^I4 N et ¹ C/ ^,2 C.

Selon une disposition supplémentaire, les variations isotopiques en abondance naturelle de ² H et/ou de ^I8 0 et/ou de ⁴ S sont également mesurées.

Ces différentes mesures permettent d'obtenir rapidement, le plus généralement en une dizaine de minutes seulement, une empreinte ou signature isotopique pour chaque type cellulaire étudié.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode ci-dessus est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'une des étapes suivantes :

- l'introduction des extraits de cellules avec un flux contenant de l'oxygène dans le four à combustion d'un AE-SMRI aux fins d'oxydation et/ou de réduction pour la transformation quantitative des cellules en gaz,

- l'élimination de l'eau formée et la séparation des gaz

- l'introduction des gaz dans le SMRI pour introduire des ions moléculaires recueillis dans des collecteurs

- l'établissement des spectres des courants ioniques des isotopomères des éléments isotopiques à mesurer,

- la teneur isotopique des cellules étudiées étant exprimée par le rapport isotopique R des courants ioniques de la fraction de l'isotope le plus lourd sur l'isotope le plus léger et, si souhaité,

- la comparaison des valeurs obtenues avec celle d'un gaz de référence étant exprimée en delta pour mille. Avantageusement, la méthode de l'invention comprend en outre l'introduction des extraits des cellules dans un chromatographe en phase gazeuse pour séparer les molécules, puis dans un four de combustion et réduction pour la transformation quantitative des cellules en gaz, puis après l'élimination de l'eau, l'introduction des gaz dans le SMRI comme indiqué ci-dessus.

Les dispositions qui précédent, en partie ou dans leur totalité, sont appliquées à une fraction cellulaire, en particulier une fraction protéique, ou aux acides aminés et/ou aux métabolites polaires intracellulaires ou non ou, selon une autre variante, aux lipides extraits des cellules.

Le matériau étudié est constitué par des cellules provenant d'un tissu ou d'un milieu biologique, tel que le sang ou l'urine, ou par des cellules d'une lignée cellulaire. Lesdites cellules sont des cellules pathologiques, c.-à-d. des cellules provenant de tout type de pathologie, notamment des cellules cancéreuses. Il peut s'agir également de cellules saines, ce qui permet de faire des comparaisons.

Il est ainsi possible de disposer d'une empreinte isotopique propre à chaque tumeur, pouvant servir de bio-marqueur, et permettant de différencier avec précision des cellules tumorales, des cellules pathologiques et d'évaluer les effets d'une action thérapeutique sur ces cellules, dans le cadre d'une évaluation pré-clinique.

La facilité de mise en ouvre de la méthode de l'invention, la rapidité de son exécution et son faible coût constituent des avantages pour une utilisation en routine.

Les applications de cette méthode sont nombreuses. Parmi les secteurs concernés, on citera :

-les secteurs de la recherche en biologie, biochimie au niveau cellulaire ou tissulaire (caractérisation des cellules et tissus, étude des voies métaboliques, connexions entre l'empreinte isotopique et le processus de la cellule cancéreuse) - les secteurs industriels de la pharmacie (évaluation de l'effet thérapeutique d'une substance sur un patient)

- les secteurs de la santé (diagnostic médical adapté, suivi du patient). La méthode de l'invention possède de nombreux avantages en termes de performances puisque la mesure est reproductible et insensible à la variation biologique (mesures identiques pour des cellules qui ont été divisées plusieurs fois: jusqu'à 48 divisions cellulaires). La mesure peut être facilement comparée avec d'autres laboratoires, étant donné que la déviation isotopique est une mesure relative qui est toujours comparée à une référence internationale. Ainsi les laboratoires possédant un AE-SMRI sont susceptibles d'obtenir une signature unique.

Le coût de l'analyse est dérisoire contrairement aux bio-puces, puisque la préparation d'échantillon et l'analyse sont très simples. Il suffit de récupérer un extrait sec de cellule, de tissu, de sang, d'urine ou autres liquides biologiques, puis de l'introduire dans l' AE- SMRI.

En revanche dans le cas des bio-puces, des étapes d'extraction, de purification de l'ARNm et des protéines de l'échantillon sont nécessaires. L'ARNm est ensuite converti en ADNc par transcription inverse. Les extraits d'ADNc ou de protéines sont ensuite marqués par un fluorochrome de couleurs différentes. Toutes ces étapes complexes de préparations d'échantillons sont des sources d'erreur pour l'analyse. La préparation des bio-puces est aussi longue et fastidieuse, puisqu'elle consiste à immobiliser sur un support solide des sondes (ADN ou anticorps dans le cas des protéines) dont le rôle est de détecter les cibles complémentaires présentes dans le mélange à analyser (ADNc ou protéines). Les résultats sont obtenus après l'analyse d'images à haute résolution qui permet de déceler les gènes ou les protéines dont le taux est modifié au cours de la transformation cancéreuse. La simplicité de la méthode de l'invention, qui demande très peu de préparation d'échantillons et une analyse par AE-SMRI très fiable constituent des atouts, pour la reproductibilité des mesures, ainsi que pour l'utilisation adaptée de cette méthode dans le domaine de la recherche biologique et clinique.

Le fonctionnement de la méthode de l'invention est en outre plus écologique que celui des bio-puces, puisqu'il ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques. Dans le cas des bio-puces, l'utilisation des tampons d'extraction (sodium dodécyl sulfate, mercaptoéthanol et autres détergents...) et du marquage parfois radioactif ou fluorescent sont souvent nocifs pour le manipulateur. Les bio-puces sont jetables, ce qui produit des déchets.

L'invention vise également l'application de la méthode définie ci-dessus, pour discriminer un type cellulaire et/ou des sous-types, identifier l'état pathologique ou sain des cellules étudiées, déterminer les perturbations biologiques liées aux mesures effectuées, et/ou évaluer l'efficacité d'une action thérapeutique et/ou pour constituer une base de données servant de référentiel pour identifier le type et le stade de la pathologie et permettre ainsi le traitement adapté à celle-ci.

Ces bases de données entrent également dans le champ de l'invention. Elles sont caractérisées en ce qu'elles renferment les données relatives aux empreintes isotopiques telles qu'établies selon la méthode définie ci-dessus pour différents types cellulaires et tissus, en particulier cancéreux.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et sont illustrés par les résultats donnés dans les Figures 1 et 2, qui représentent respectivement la méthode de l'invention

- la Figure 1, la description schématique des étapes de la méthode de l'invention, permettant d'obtenir l'abondance naturelle des isotopes de l'azote 15 et du carbone 13 par exemple dans des cellules cancéreuses

et

- la Figure 2, les valeurs des déviations isotopiques δ N et δ C des cellules de différentes lignées par AE-SMRI . Exemple 1 : étude de lignées cellulaires humaines du cancer du sein.

Les lignées cellulaires étudiées sont les lignées MDA MB-468, MDA MB-231, SkBr3,

Cal 51, ZR 75-1 et MCF-10A et sont décrites dans le tableau I.

Tableau I : Caractéristiques des lignées du cancer du sein étudiées. Le nom et la numérotation utilisée par l'ATCC (American Type Culture Collection) sont donnés pour chaque lignée. Les signes + et - traduisent la présence et l'absence des récepteurs correspondants aux récepteurs des oestrogènes (ER), des progestérones (PR) et à un des membres des récepteurs à tyrosines kinases (ErbB), nommé HER2.

Lignées cellulaires N°ATCC ER PR HER2 Pathologie

MDA-MB468 HTB-132 métastase d'adénocarcinome

MDA-MB231 HTB-26 + métastase d'adénocarcinome

SKBr3 HTB-30 ++ adénocarcinome

Cal51 DSZM- - adénocarcinome

ACC302

ZR75-1 CRL-1500 + - carcinome canalaire invasif

MCF-10A CRL-10317 - maladie fibrokystique (non cancéreuse)

Toutes les lignées cellulaires sont cultivées dans 15 ml de milieu de culture nutritif dans une flasque d'une surface de 75 cm ² .

Pour toutes les lignées cellulaires, excepté pour la lignée MCF-10A, le milieu contient du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% pénicilline-streptomycine (Invitrogen).

Pour les cellules de la lignée MCF-10A, le milieu utilisé est le DMEM F12 (Invitrogen) contenant 5% de Sérum de cheval, 20 ng/ml d'EGF (Epidermal Growth Factor),

2mg/ml de toxine cholérique, 0,01 mg/ml d'insuline, 0,5 μg ml d'hydrocortisone, 1% de L-Glutamine Glutamax, 1% de pénicilline-streptomycine, 1% d'Hépès (produits Sigma).

Les flasques contenant les cellules sont placées dans un incubateur à humidité et atmosphère contrôlées (5% C0 ₂ ), à une température de 37°C. Lorsque les cellules sont confluentes (à peu près 2 000 000 de cellules), le milieu de culture est éliminé. Les cellules sont rincées 2 fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) de pH=7,4 afin d'éliminer entièrement le milieu nutritif. Puis les cellules sont récupérées et détachées à l'aide d'un grattoir dans 3 ml d'eau distillée. Elles sont ensuite stockées à -20°C puis lyophilisées (Fig. 1 A).

Environ 0,7 mg d'extrait sec de cellules est ensuite pesé avec une balance de précision 10 ^"5 g (Ohaus Discovery DV215CD, Pine Brook, New Jersey, USA) dans des capsules en étain (tin capsules for solids « light » 5 x 9mm, Thermo Fisher Scientific, Brème, Allemagne), pour permettre l'analyse dans un Analyseur Elémentaire (AE ; Flash EA 1112HT, Thermo Fisher Scientific, Brème, Allemagne) couplé via une interface conflo (Finnigan Conflo III, Thermo Fisher Scientific, Brème, Allemagne) à un Spectromètre de Masse de Rapports Isotopiques (SMRI ; IRMS Delta V Advantage, Thermo Fisher Scientific, Brème, Allemagne).

La capsule en étain contenant les cellules est introduite grâce à un flux d'hélium et d'oxygène dans le four de combustion de ΓΑΕ à 1020°C. A cette température, l'étain permet par sa sublimation, un transfert d'énergie à l'échantillon de cellules qui est oxydé très rapidement. La composition du four de combustion (oxyde de chrome, cuivre réduit, oxyde de cobalt et cobalt d'argent) et la quantité d'oxygène introduite permettent de transformer quantitativement l'échantillon de cellules en gaz N ₂ , C0 ₂ et H ₂ 0.

Les gaz passent au travers d'un piège à anhydrone (perchlorate de magnésium) retenant l'eau.

Les gaz N ₂ et C0 ₂ sont ensuite séparés par une colonne de chromatographie, puis introduits successivement dans le SMRI (Fig. 1B). Le N ₂ et C0 ₂ produits au cours de la combustion de l'échantillon arrivent dans la source du SMRI où ils sont ionisés par impact électronique à 120 eV(électron Volt), sous une pression de 10 ^"6 mbar.

Les ions moléculaires produits (Ν ₂ ^+' et C0 ₂ ^+' sont ensuite accélérés par un potentiel de 3 kV et sont projetés dans un champ magnétique uniforme. Ces ions sont ensuite déviés par ce champ magnétique de 0.75 Tesla et sont recueillis simultanément dans des collecteurs (cages de Faraday). Les cages de Faraday sont reliées à des amplificateurs et les courants produits sont proportionnels à la quantité respective de chaque espèce d'ions collectés.

Un spectre des courants ioniques des isotopomères de N ₂ et C0 ₂ est obtenu en 10 minutes (Fig. 1C).

Pour l'azote, il s'agit des isotopomères de masses atomiques 28, 29, 30 correspondant respectivement aux isotopes du diazote ¹⁴ N ¹ N, ¹⁴ N ¹⁵ N, ¹⁵ N ¹⁵ N.

De même pour le carbone, les isotopomères de masses atomiques 44, 45 et 46 sont détectés et correspondent respectivement aux isotopes du dioxyde de carbone ¹² C ¹⁶ 0 ₂ , ¹³ C ^,6 0 ₂ ou ¹² C ¹⁷ 0 ¹⁶ 0, ¹² C ¹⁷ 0 ₂ .

La teneur isotopique de l'échantillon est exprimée par le rapport isotopique R des courants ioniques qui est la fraction de l'isotope le plus lourd sur l'isotope le plus léger soit ^,3 C/ ¹² C et ^l5 N/ ¹ N.

L'utilisation d'une référence permet de comparer le rapport isotopique de l'échantillon à celui de la référence et d'obtenir ainsi une grande précision des résultats qui sont exprimés dans l'échelle relative delta δ(%ο) : ô (°/oo) = [(R échantillon " R référence)/ R référence] X 1000 Les références internationales repérées dans la formule par R référence sont le carbonate Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) pour le ô ¹³ C (R _ré férence = 0,01 12372) et l'azote atmosphérique pour le δ ¹⁵ Ν (R référence = 0,0036765). Une valeur positive signifie une teneur plus élevée en isotope lourd que la référence, c'est-à-dire un enrichissement ; alors qu'une valeur négative exprime une teneur moins élevée en isotope lourd que la référence c'est-à-dire un appauvrissement.

Comme standard de travail, l'acide glutamique a été utilisé ; ses δ C et δ N sont connus et stables, respectivement -27,48%o ± 0,05 et -4,80%o ± 0,08.

Deux capsules d'acide glutamique ont été placées tous les 5 échantillons afin de contrôler une éventuelle dérive de l'appareil au cours de la série de mesure. La linéarité de l'appareil est de ±0,06 o ; la précision est de ±0,02 ₀ pour ô ¹³ C et pour δ ¹⁵ Ν (données de Thermo Fisher Scientific).

Le processus de recueil de données a été effectué à l'aide du logiciel d'acquisition Isodat NT 2.5 (Thermo Fisher Scientific, Brème, Allemagne) qui inclut la correction automatique pour la fraction ¹⁷ 0 de la masse 45 par la correction de Craig. Les valeurs de pourcentages de carbone (%C) et d'azote (%N) sont calculées à partir du rapport d'aire sous la courbe du pic de l'échantillon sur le pic du standard de travail, l'acide glutamique. Chaque extrait cellulaire a fait l'objet de 2 analyses. Le résultat pris en compte est la moyenne des deux résultats de mesure. Pour chaque lignée, l'analyse a été effectuée sur 3 à 6 échantillons d'une division cellulaire, afin d'avoir une valeur isotopique représentative de la lignée. Statistiques

Les données ont été exportées du logiciel d'acquisition vers un tableur Microsoft Excel 2003 où ont été effectuées les moyennes et écarts-types des ô ¹³ C et δ ¹⁵ Ν de chaque lignée cellulaire, ayant subi plusieurs divisions cellulaires.

Résultats

Les résultats obtenus (valeurs des déviations isotopiques δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C et des pourcentages d'azote %N et de carbone %C) pour les lignées étudiées sont rassemblés dans le tableau II et représentés dans la figure 2.

Tableau II : Valeurs des déviations isotopiques (δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C) et des pourcentages d'azote et de carbone (%N et %C), mesurées par AE-SMRI, dans les échantillons de cellules de différentes lignées étudiées en fonction du nombre de divisions cellulaires (NDC) et du nombre de jours de croissance (NJC).

Lignées cellulaires NDC NJC δ ¹⁵ Ν (%o) 5 ¹³ C (%o) %N

MDA-MB468 -2.06 -15.56 7.36 29.45

-2.28 -15.28 8.67 33.53

-2.03 -15.1 8.02 32.91

-2.14 -15.33 8.24 33.35

-2.15 -15.26 7.77 31.7

-1.94 -15.44 7.79 31 .5

MDA-MB231 -1.16 -16.59 5.21 21 .69

-0.97 -17.12 5.33 24.84

-1 .3 -16.53 5.31 22.53

-1.25 -16.65 5.67 22.72

SKBr3 -0.69 -16.92 5.13 22.41

-0.64 -16.6 4.05 16.12

-0.62 -16.02 5.06 19.94

-0.6 -16.51 4.86 19.64

-0.74 -16.58 6.26 24.41

-0.76 -16.74 4.01 18.76 Cal51 3 3 -0.95 -15.24 6.59 28.29

4 2 -1.14 -15.42 6.25 26.79

7 2 -1.28 -15.2 7.38 29.88

6 3 -1.01 -14.96 7.52 30.95

6 3 -1.34 -15.15 7.29 29.16

ZR75-1 4 3 0.99 -18.96 2.36 12.92

5 3 0.47 -18.68 1.97 1 1.37

6 4 0.63 -18.73 1.76 12.38

MCF-10A 5 -0.75 -19.83 3.5 20.16

5 -0.67 -19.95 3.65 20.97

Les valeurs de δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C ont été mesurées pour chaque lignée à divers nombres de divisions cellulaires et de jours de croissance. Les écarts-types obtenus pour chaque lignée cellulaire en fonction du nombre de divisions cellulaires et du nombre de jours de croissance étaient inférieurs à 0,3 o pour les δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C (Fig. 2). Ces résultats montrent l'absence de fractionnement isotopique (tableau II) induit lors de la croissance cellulaire et du nombre de divisions cellulaires, condition sine qua non pour s'assurer que la discrimination isotopique provient uniquement de la cellule elle-même. De la même façon les teneurs isotopiques des milieux nutritifs utilisés pour la croissance de chaque lignée ont été mesurées régulièrement. Elles étaient identiques pour les milieux nutritifs des lignées tumorales (δ ¹⁵ Ν = 3,98 ± 0, 1896ο et Ô ¹³ C = -12,91 ± 0, 13%o). Concernant le milieu utilisé pour la croissance des MCF-10A qui est une lignée non tumorale nécessitant un milieu particulier, la teneur isotopique était aussi constante avec un δ ¹⁵ Ν = 2,39%o ± 0, 10 et un ⁿ C = -19,39%o ± 0,01). Les résultats montrent l'absence de fractionnement isotopique induit par le milieu de culture. Dans ces conditions de culture, les résultats sont très satisfaisants au regard des valeurs des δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C obtenues sur les cellules des différentes lignées, respectivement comprises entre -2,28 et +0,99 %o et entre - 19,95 et -15, 1 %> (Fig. 2). Les valeurs de δ ¹⁵ Ν et ô ¹³ C sont représentatives de chaque lignée. En effet, la variation enregistrée sur 6 lignées cellulaires, cultivées et prélevées à des périodes différentes, ne dépasse pas 0,3 %o. De même, les écart-types enregistrés pour les milieux nutritifs utilisés pour chaque lignée sont négligeables. Ces résultats montrent que l'analyse isotopique simultanée du N et du C réalisée sur chaque lignée constitue une signature caractéristique du type de cancer.

L'invention fournit ainsi un procédé simple et peu coûteux pour identifier une cellule, en particulier pour différencier les tumeurs cancéreuses et évaluer un effet thérapeutique sur ces tumeurs.