Titre : PROCEDE DE CARACTERISATION DE LA DEGRADATION D'UN ORGANE

Domaine de l'invention

[1] La présente invention a pour objet un kit et un procédé in vitro de détection et de caractérisation de la dégradation d'un organe ou d'un tissu particulier, fondé sur l'analyse de la présence d'au moins un ADN acellula ire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un kit et un procédé de détection, et de caractérisation de la dégradation 1) du cerveau au cours d'un épisode d'accident vasculaire cérébral, 2) du poumon au cours d'un épisode de syndrome de détresse respiratoire aiguë et 3) du rein au cours d'un épisode d'insuffisance rénale aiguë et/ou un épisode de rejet et/ou de dysfonctionnement du greffon rénal. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie ou d'une condition impliquant la lyse d'un organe ou d'un tissu.

[2] La présente invention se situe donc dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée au diagnostic médical.

Etat de la technique

[3] Lors de la prise en charge d'un patient atteint d'une pathologie en phase aiguë, une analyse par imagerie médicale, telle qu'un scanner, une radiographie ou une IRM, est réalisée afin d'établir de façon globale le niveau de souffrance et d'atteinte lésionnelle du patient. Ce type d'examen ne permet pourtant pas de distinguer la lyse organique elle-même d'une atteinte de type inflammatoire. Pourtant, le pronostic et l'intervention thérapeutique réalisés par le personnel médical sont très différents selon la nature de l'atteinte de l'organe ou du tissu. De plus, en cas de phase aigüe, des décisions de prise en charge doivent être prises dans un délai extrêmement court.

[4] Certaines pathologies aigües et relativement répandues ont pour caractéristique commune d'impliquer une lyse tissulaire massive.

[5] C'est le cas notamment de l'accident vasculaire cérébral (AVC), dans lequel le tissu cérébral est dégradé, du syndrome de détresse respiratoire aigüe, dans lequel le tissu pulmonaire est dégradé, de l'insuffisance rénale aigue (IRA) d'un rein natif et d'un rein transplanté lors de l'apparition d'un rejet de greffe ou d'un dysfonctionnement du greffon rénal, dans lequel le tissu rénal est dégradé. [6] Par ailleurs, dans le cas de la transplantation rénale, il est essentiel de surveiller l'éventuelle survenue d'un rejet/dysfonctionnement du greffon. Actuellement, le suivi post-opératoire des patients greffés implique une surveillance douloureuse et lourde pour le patient.

[7] Du fait de l'incidence de l'ensemble de ces pathologies parmi la population, il existe un besoin d'outils permettant de détecter de façon fiable, rapide, simple et peu coûteuse l'éventuelle tissulaire dans le cadre de ces différentes pathologies aigües.

[8] L'ADN acellulaire circulant, également désigné par « ADN libre » est connu de façon générale en tant que marqueur tumoral, mais aussi marqueur d'inflammation et marqueur de stress tissulaire. Les cellules immunitaires contribuent majoritairement à l'élévation de la quantité totale d'ADN circulant.

[9] Il a été montré que l'ADN circulant peut éventuellement être utilisé comme biomarqueur potentiel de maladies auto-immunes de type lupus érythémateux systémique ou la polyarthrite rhumatoïde (Duvvuri et al., « Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases », Front. Immunol. 10, 2019).

[10] L'utilisation, chez un sujet sain, de la caractérisation du profil de méthylation de l'ADN circulant pour identifier l'origine tissulaire dudit ADN circulant a été décrite (Moss et al « Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease », Nat. Commun., 9, 1-12, 2018).

[11] L'augmentation de la proportion d'ADN circulant issu des hépatocytes chez des patients atteints de maladie inflammatoire du foie a été décrite, les cellules immunitaires contribuant majoritairement à la quantité d'ADN circulant totale (Liu et al

(« Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing », Clin. Epigenetics, 11, 93 2019).

[12] WO 2021/216985 « Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling » divulgue la détection de la dégradation d'un tissu par l'établissement d'un profil de l'ADN circulant dans le cadre de la transplantation de cellules hématopoïétiques allogènes.

[13] Le document CN 113999901 « Myocardial specific methylation marker » décrit l'identification et l'utilisation d'un marqueur cardiaque spécifique de l'ADN cellulaire méthylé pour le diagnostic d'un infarctus aigu du myocarde, à partir d'un échantillon de plasma. [14] WO2019012544 (Al) « DUAL-PROBE DIGITAL DROPLET PCR STRATEGY FOR SPECIFIC DETECTION OF TISSUE-SPECIFIC CIRCULATING DNA MOLECULES" décrit une méthode de PCR digitale en gouttelettes permettant d'analyser l'état de méthylation de sites de méthylation d'une molécule d'ADN double brin qui comprend au moins deux sites de méthylation par simple brin de la molécule d'ADN double brin à partir d'un échantillon d'un fluide biologique comme le plasma ou l'urine

[15] WO2019012543 (Al) « DNA TARGETS AS TISSUE-SPECIFIC METHYLATION MARKERS" décrit une méthode générale permettant de déterminer l’état de dégradation d'un tissu au cours d'un processus pathologique à partir de l'étude des sites de méthylation d’une molécule d’ADN circulant à partir d'un fluide biologique comme le plasma ou l'urine.

Exposé de l'invention

[16] Les inventeurs ont mis au point un kit et un procédé de détection spécifique et ciblé de l'ADN acellulaire méthylé circulant présent dans un échantillon biologique d'un individu et spécifique du cerveau, du poumon ou du rein. Un procédé selon l'invention permet de détecter spécifiquement l'existence d'une lyse massive d'un de ces organes ou d'un tissu particulier qui le compose au niveau de sa fraction vasculaire ou épithéliale. De plus, ce procédé permet de distinguer la lyse d'un organe d'un phénomène inflammatoire d'origine immunitaire. La distinction d'une atteinte épithéliale ou vasculaire ainsi que l'identification d'une lyse organique plutôt qu'un phénomène inflammatoire d'origine purement immunitaire est majeure pour le diagnostic du patient et ne peut être discriminée par imagerie médicale.

[17] Pour deux de ces organes, à savoir le poumon et le cerveau, les inventeurs ont en effet sélectionné, parmi différentes régions spécifiquement hyperméthylées ou hypométhylées de l'ADN circulant, au moins une région permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe.

[18] Pour un de ces organes, à savoir le rein, les inventeurs ont en outre sélectionné, parmi différentes fractions spécifiquement hyperméthylées ou hypométhylées de l'ADN circulant, au moins trois fractions différentiellement méthylées dans l'épithélium rénal, l'endothélium rénal et le rein total, ces régions peuvent être désignées respectivement par « rein total », la « fraction vasculaire rénale » et la « fraction épithéliale rénale » permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe. [19] Les inventeurs ont ainsi conçu, pour chacune de ces régions, une paire d'amorces d'amplification sélective, des conditions d'amplification et une sonde détectant spécifiquement le produit d'amplification généré en utilisant ladite paire d'amorces.

[20] Les inventeurs ont également identifié, autour de chacune des séquences nucléotidiques sélectivement amplifiée par une paire d'amorces telle que décrite ci- dessus, une région génétique d'intérêt incluant la séquence nucléotidique amplifiée, ladite région génétique étant de taille supérieure à celle du marqueur. La présente invention décrit lesdites « régions génétiques d'intérêt ».

[21] Pour chacun des marqueurs, un kit de détection et un procédé de détection sont ainsi fournis.

[22] L'invention a aussi pour objet un kit et un procédé permettant la détection d'au moins un marqueur spécifique de la lyse d'un organe. L'invention a de plus pour objet un kit et un procédé permettant la détection simultanée d'au moins deux marqueurs de détection spécifique de la lyse d'un organe, permettant ainsi d'améliorer encore la spécificité et la sensibilité du test. Un test selon l'invention présente également une forte performance diagnostique.

[23] L'invention a donc pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d'un échantillon biologique d'un patient. Un kit et un procédé de détection de la lyse cérébrale sont utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de l'AVC. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d'au moins un marqueur choisi parmi « APC2 » et « NBR1 ». ». Le marqueur

« NBR1 » est un marqueur également désigné par « KRT33B ».

[24] L'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse pulmonaire, utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de la détresse respiratoire aigüe ou d'un éventuel rejet de greffon pulmonaire. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection du marqueur « SYNE1 » ». Le marqueur « SYNE1 » est un marqueur également désigné par « LINC00336 ».

[25] L'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, utilisables notamment pour le diagnostic in vitro de l'insuffisance rénale aigue et, dans le cas d'un patient greffé, du rejet de la greffe. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d'au moins un marqueur choisi parmi : PAX2, PDE4D, CTDP1, ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2, LINC01599, FLJ12825, ACSL5. [26] Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, fondés sur la combinaison de la détection en multiplexage d'au moins :

- un marqueur « rein total » : choisi parmi CTDP1

- un marqueur de type « Vasculaire » : choisi parmi les marqueurs ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 et LINC01599 et

- un marqueur de type « épithélial » : choisi parmi les marqueurs FLJ12825, ACSL5, PAX2 et PDE4D.

[27] L'augmentation du nombre de marqueurs détectés simultanément par une analyse en multiplexage garantit une meilleure performance clinique du test en matière de diagnostic, de dépistage, d'optimisation thérapeutique et de suivi du patient.

[28] La biopsie solide, ou ponction rénale, est la méthode de référence pour diagnostiquer le rejet de greffe. Elle permet d'étudier certaines structures anatomiques du greffon au niveau du cortex rénal, situé en périphérie du rein. En fonction du score de Banff, les lésions du greffon peuvent être segmentées par typologie « vasculaire » ou

« épithéliale ». L'étude de ces lésions combinées à l'observation d'infiltrats immunitaires permettent de poser le diagnostic typologique de rejet de greffe rénal comme suit : « pas de rejet », « Rejet de type cellulaire médié par les lymphocytes (TCMR) », « Rejet de type humoral médié par les anticorps (ABMR) » et « Rejet mixte combinant les deux types de rejet ». En fonction de la typologie du rejet, les options thérapeutiques sont différentes.

[29] Des tests diagnostiques du rejet de greffe sont commercialisés, il s'agit de l'Allosure (CareDX) et du ProsperaTM (Natera). Les nouvelles méthodologies de détection du rejet de greffe articulent leur proposition uniquement sur la prédiction du rejet ou du dysfonctionnement du greffon rénal, sans être capables de caractériser et diagnostiquer la nature de celui-ci. Aussi, l'utilisation de la ponction rénale reste toujours d'actualité.

[30] Un kit et un procédé selon l'invention présentent donc le grand avantage d'offrir un test peu invasif, car il est réalisé à partir d'un échantillon biologique aisément prélevé, fiable, rapide et peu coûteux. Du fait de sa nature peu invasive, un procédé selon l'invention peut aisément, si nécessaire, être renouvelé à différents stades de la pathologie, ce qui permet un suivi fiable de l'évolution de ladite pathologie et assure une prise en charge médicale adaptée à chacun de ces stades.

[31] Un kit et un procédé selon l'invention présentent un enjeu majeur pour les spécialistes et anatomopathologistes, car la typologie des lésions d'organe, notamment la typologie des lésions du greffon rénal, conditionne le diagnostic final et la prise en charge thérapeutique du patient.

[32] La sensibilité et la spécificité du test de la présence de chacun des marqueurs ont été vérifiés. Un kit et un procédé selon l'invention présentent en outre l'avantage d'être reproductibles, rapides et peu coûteux.

[33] L'invention a également pour objet l'utilisation d'ADN acellulaire méthylé en tant que marqueur de la dégradation du cerveau, du rein ou du poumon, ou de la dégradation d'un tissu du cerveau, du rein ou du poumon.

[34] L'invention a aussi pour objet les amorces et les sondes utilisables dans un kit et un procédé selon l'invention. En particulier, l'invention a pour objet :

- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52,ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;

- une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53 ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;

- et une sonde, optionnellement marquée, comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences.

[35] L'invention a enfin pour objet un procédé in vitro de détection d'une pathologie ou d'une condition choisie parmi : l'accident vasculaire cérébral (AVC), le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l'insuffisance rénale et le rejet de greffe, notamment le rejet de greffe rénale ou de greffe pulmonaire.

Description détaillée de l'invention

[36] Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'au moins une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein ou d'un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit kit comprenant au moins une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d'ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu.

[37] Selon un mode de réalisation de ce premier aspect, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'au moins une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ledit kit comprenant au moins :

- une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec au moins une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d'ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu, et

- une sonde comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec la séquence nucléotidique cible d'ADN amplifiée.

[38] Par « échantillon biologique » on entend un élément issu du corps, humain ou animal, notamment par exemple : le sang, l'urine, la salive, le plasma ou un fragment d'organe.

[39] Ladite sonde, dite « sonde de détection » est de préférence associée à un marqueur dont la détection est bien connue par une personne du métier. Lorsque plus d'une paire de sonde est utilisée (test multiplexe), la combinaison des marqueurs est choisie afin de distinguer les différentes séquences nucléotidiques amplifiées.

[40] Selon un premier aspect particulier, la présente invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type cellulaire d'un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, ledit kit comprenant : i) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°l, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou - une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5. ii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, au moins : une amorce sens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8, et iii) pour la détection d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, au moins :

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°10, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°ll, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°19, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°19 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°20, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°20, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°22, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°22 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°23, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°23, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°25, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°25 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°26, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°26, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°28, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°28 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°29, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°29, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°31, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°31 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°32, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°32, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°34, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°34 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°35, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°35, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°37, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°37 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°38, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°38, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°40, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°40 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°41, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°41, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°43, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°43 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°44, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°44, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°46, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°46 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°47, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°47, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°49, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°49 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°50, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°50, et/ou

- une amorce sens comprenant une séquence SEQ ID N°52, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°52 et une amorce antisens, comprenant une séquence SEQ ID N°53, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°53.

Selon un aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend au moins :

- une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize, dix-sept, dix-huit, dix-neuf ou vingt paires d'amorces, chacune étant constituée par une amorce sens selon l'invention et une amorce antisens selon l'invention. [41] Selon un aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une amorce

« sens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49 ou SEQ ID N°52.

[42] Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une amorce « antisens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 ou SEQ ID N°53.

[43] Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l'invention comprend une sonde comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d'identité avec l'une desdites séquences nucléotidiques choisie parmi SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54.

[44] Par « au moins 80 % d'identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d'identité après alignement global optimal, c'est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d'identité entre elles. L'alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l'algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l'homme du métier (Needleman & Wunsch, « A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins », J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Une séquence nucléotidique selon l'invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal.

Avantageusement, une séquence nucléotidique selon l'invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal.

[45] Selon cet aspect, une séquence nucléotidique selon l'invention comprenant, ou constituée, d'une séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique de référence est fonctionnelle, c'est-à-dire qu'elle est capable de s'hybrider sur la séquence nucléotidique cible avec une stabilité suffisante pour permettre l'amplification ou la détection de ladite séquence nucléotidique cible.

[46] Les séquences nucléotidiques d'un premier groupe d'amorces sont désignées comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous :

Tableau 1

[47] Les séquences nucléotidiques d'un premier groupe de sondes sont désignées comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2 [48] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, ledit kit comprenant au moins :

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°l, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2, et/ou

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5.

[49] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, ledit kit comprenant au moins une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8.

[50] Les séquences nucléotidiques des amorces spécifiques d'un type de cellules présent dans le rein, sont désignées comme indiqué dans le tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3

[51] Les séquences nucléotidiques des sondes spécifiques d'un type de cellules présent dans le rein, sont désignées comme indiqué dans le tableau 4 ci-dessous :

Tableau 4

[52] Parmi les tissus présents dans le rein, on peut notamment citer : le tissu, épithélial rénal et le tissu vasculaire rénal

[53] Les marqueurs dédiés au suivi de l'état de souffrance rénale sont caractérisés comme indiqué dans le tableau 5 ci-dessous :

Tableau 5 [54] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit qui contient les réactifs nécessaire (amorces et sondes) à l’amplification d’au moins un amplicon de PCR inférieur à < 85 pb (préférentiellement < 70 pb) dans une région génomique comprise parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70 et SEQ ID N° 71 selon le statut de méthylation de ladite région génomique.

[55] Les marqueurs utilisés dans un kit et un procédé selon l'invention sont donc susceptibles d'être classés en marqueurs :

- « de type vasculaire » : choisi parmi les marqueurs ALDH1A1, ARID3A, GATA2, LOC124903692, NRN1, SEPT5-GP1BB, TNS2-AS1 RHBDF2 et LINC01599,

- « de type épithélial » : choisi parmi les marqueurs FLJ 12825, ACSL5, PAX2 et PDE4D,

- « de type rein total » : choisi parmi CTDP1.

[56] Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins :

-une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total », et/ou

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire », et/ou

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial ».

[57] De préférence, selon cet aspect plus particulier, l'invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins :

-une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type rein total » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marquer « de type rein total », ledit marqueur étant CTDP1 et

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type vasculaire », ledit marqueur étant choisi parmi GATA2, TNS2-AS1 et

- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial » et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique susceptible de détecter un marqueur « de type épithélial », ledit marqueur étant choisi parmi : PAX2, ACSL5 ou PDE4D.

[58] Les marqueurs utilisés dans un kit et un procédé selon l'invention seront maintenant décrits de façon plus détaillée. Les noms des marqueurs correspondent au nom du gène sur lesquels ces marqueurs sont localisés.

[59] La région génétique "PDE4D" selon l'invention désigne une séquence codant pour une protéine de la famille des phosphodiestérases. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 5 en position 58,969,038-60,522,128, de manière plus spécifique au niveau du locus 5qll.2-ql2.1. Il contient 42 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000005.10. Il est transcrit en la séquence NM_006203.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 5 position 59,039,300- 59,039,420 (SEQ ID N° 55), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable notamment pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[60] La région génétique « PAX2 » selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des box-paired 2. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 10 en position 100,735,396-100,829,944, de manière plus spécifique au niveau du locus 10q24.31. Il contient 14 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000010.11. Il est transcrit en la séquence NM_000278.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 10 position 100,828,800- 100,829,020 (SEQ ID N° 56), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent d'utiliser notamment ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[61] La région génétique « FLJ12825 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète non codante pour des protéines. Il permet la transcription d'ARN longs non codants et est présent sur le locus non caractérisé LOC440101 du gène FLJ12825. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 12 en position 54,058,254-54,122,234, de manière plus spécifique au niveau du locus 12ql3.13 dans une séquence intronique. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000012.12. Il est transcrit en 1 variant d'ARN nommé NR_026655.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 12 : Position 54,106,357- 54,106,526 (SEQ ID N° 57), comme étant spécifiquement hyper-méthylé dans la fraction épithéliale rénale. Ils proposent notamment d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[62] La région génétique « ALDH1A1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des aldéhydes déshydrogénase de type 1 (membre Al). Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 9 en position 72,900,671-72,953,063, de manière plus spécifique au niveau du locus 9q21.13. Il contient 13 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_005224.3. Il est transcrit en 1 variants à d'ARN nommé NM_005224.3. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 9 :

Position 72,952,933-72,953,059 (SEQ ID N° 58), comme étant spécifiquement hyper- méthylé dans la fraction vasculaire rénale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[63] La région génétique « ARID3A » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des protéines de liaison à ADN ARID (AT-rich interaction domain). Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 19 en position 925,732-975,939, de manière plus spécifique au niveau du locus 19pl3.3. Il contient 12 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000019.10. Il est transcrit en 1 variants à ARN nommé NM_000689.5. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 19 :

Position 940,667-941,160 (SEQ ID N° 59), comme étant spécifiquement hyper-méthylé dans la fraction vasculaire rénale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[64] La région génétique « ACSL5 » selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des ligases. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 10 en position 112,374,116-112,428,376, de manière plus spécifique au niveau du locus 10q25.2. Il contient 23 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000010.11. Il est transcrit en la séquence NM_016234.4. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 10 position 112,376,275-112,376,398 (SEQ ID N° 60), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction épithéliale. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins

[65] La région génétique "CTDP1" selon l'invention désigne une séquence non caractérisée intronique située entre le gène CTDP1 et KCNG2. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 18 entre les positions des gènes CTDP1 (chrl8 : 79,756,625-79,787,722) et KCNG2 (chrl8 : 79,797,938-79,900,100). Il contient 0 exons. Sa séquence d'ADN n'est pas référencée dans le NCBI. Il n'y a pas de transcrit identifié.

Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 18 position 79,791,700-79,791,820 (SEQ ID N° 61), comme étant spécifiquement hyper- méthylée dans la fraction totale du rein. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[66] La région génétique "GATA2" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des facteurs de transcription de l’ADN à doigts de zinc. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 3 en position 128,479,422-128,493,201, de manière plus spécifique au niveau du locus 3q21.3. Il contient 8 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000003.12. Il est transcrit en la séquence NM_032638.5. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 3 position 128,491,794-128,492,245 (SEQ ID N° 62), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[67] La région génétique « LOC124903692 » selon l'invention désigne une séquence non caractérisée et non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 16 en position 54,936,014-54,938,671, de manière plus spécifique au niveau du locus 16ql2.2. Il contient 3 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000016.10. Il est transcrit en la séquence XR_007065074.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 16 position 54,937,300- 54,937,500 (SEQ ID N° 63), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[68] La région génétique "NRN1" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine de la famille des neuritines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 6 en position 5,997,999-6,007,518, de manière plus spécifique au niveau du locus

6p25.1. Il contient 7 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000006.12. Il est transcrit en la séquence NM_016588.3. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 6 position 5,998,924-5,999,075 (SEQ ID N° 64), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[69] La région génétique "SEPT5-GP1BB " selon l'invention désigne une séquence non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 22 en position 19,717,220-19,724,774, de manière plus spécifique au niveau du locus 22qll.21. Il contient 12 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000022.11. Il est transcrit en la séquence NR_037611.1. Les présents inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 22 position 19,724,235- 19,724,340 (SEQ ID N° 65), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénal chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[70] La région génétique "TNS2-AS1" selon l'invention désigne une séquence non codante pour des protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 12 en position 53,043,189-53,054,438, de manière plus spécifique au niveau du locus 12ql3.13. Il contient 4 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000012.12. Il est transcrit en la séquence NR_033854.1. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 12 position 53,054,207-53,054,329 (SEQ ID N° 66), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[71] La région génétique "RHBDF2" selon l'invention désigne une séquence codante pour une protéine permettant d’activer l'activité de transporteur de protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 17 en position 76,470,893-76,501,427, de manière plus spécifique au niveau du locus 17q25.1. Il contient 21 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000017.11. Il est transcrit en la séquence NM_024599.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 17 position 76,500,822 -76,500,937 (SEQ ID N° 67), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non- invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[72] La région génétique « LINC01599 » selon l'invention désigne une séquence permettant la transcription d'ARN intergéniques non codants pour les protéines. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 14 en position 50,007,313-50,105,043, de manière plus spécifique au niveau du locus 14q21.3. Il contient 9 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000014.9. Il est transcrit en la séquence NR_131171.1. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 14 position 50,056,666-50,056,758 (SEQ ID N° 68), comme étant spécifiquement hypo- méthylée dans la fraction vasculaire. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un rejet de greffe rénale chez le patient transplanté du rein, ou dans un kit utile à de telles fins.

[73] La région génétique « APC2 » selon l'invention désigne une séquence molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des régulateurs APC de la voie Wnt. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 19 en position 1,446,230- 1,473,244, de manière plus spécifique au niveau du locus 19pl3.3. Il contient 17 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000019.10. Il est transcrit en la séquence NM_005883.3. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 19 position 1,467,853-1,468,054 (SEQ ID N°69), comme étant spécifiquement hyper- méthylée dans les neurones. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer un AVC, ou dans un kit utile à de telles fins. La région génétique « NBR1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de la famille des récepteurs spécifiques de l’autophagie. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 17 en position 43,170,409-43,211,900, de manière plus spécifique au niveau du locus 17q21.31. Il contient 23 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000017.11. Il est transcrit en la séquence NM_005899.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 17 position 43,211,655-43,211,856 (SEQ ID N° 70), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans les neurones. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer un AVC, ou dans un kit utile à de telles fins. [74] La région génétique « SYNE1 » selon l'invention désigne une molécule génomique complète codante pour une protéine de l'enveloppe nucléaire contenant des séquences répétées de spectrine. Sa séquence d'ADN est localisée sur le chromosome 6 en position 152,121,687-152,637,362, de manière plus spécifique au niveau du locus 6p25.2. Il contient 153 exons. Sa séquence d'ADN est référée en tant que NC_000006.12. Il est transcrit en la séquence NM_033071.5. Les inventeurs ont identifié la région d'ADN comprise dans le chromosome 6 position 152,302,152-152,302,353 (SEQ ID N°71), comme étant spécifiquement hyper-méthylée dans les pneumocytes/alvéoles pulmonaires. Ils proposent donc d'utiliser ce gène dans une méthode non-invasive, sensible et fiable pour notamment diagnostiquer ou identifier un SDRA, ou dans un kit utile à de telles fins.

[75] Un kit selon l'invention comprend, de façon optionnelle une ou plusieurs paires d'amorces constituées par une amorce sens et une amorce antisens, destinées à détecter la présence d'un élément contrôle dans l'échantillon biologique. Cet élément contrôle peut être tout élément approprié choisi par une personne du métier. Ledit élément contrôle peut notamment être l'albumine. Plus particulièrement, un kit selon l'invention peut comprendre une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°16, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°16 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°17, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°17.

[76] Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé d'identification d'une séquence cible d'ADN acellulaire spécifique d'un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l'ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilôts CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe, b) Identification, dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilôts CpG spécifiquement hyperméthylés, c) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG d'un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire, d) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c), e) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des organes autres dudit premier organe, f) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN génomique des globules blancs sains, g) Comparaison du degré de méthylation des ilôts CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilôts CpG de l'ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains, h) Sélection des îlots CpG uniquement hyperméthylés dans l'ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g) i) Identification d'une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d'ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l'étape h).

[77] L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé identifiée au moyen d'un procédé selon l'invention, pour son utilisation dans la détection de la lyse d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d'un échantillon biologique d'un patient.

[78] Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ou d'un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b).

[79] L'ADN acellulaire est extrait en utilisant un kit commercial, bien connu de la personne du métier et nécessite la présence d'au moins 0,15 ng/mL d'ADN cible dans l'échantillon urinaire ou plasmatique.

[80] La réaction d'amplification est réalisée au moyen de toute technique ou protocole bien connu par la personne du métier. Parmi les exemples non limitatifs de ces techniques, on peut citer : l'amplification par PCR, l'amplification par PCR digitale (dPCR), le séquençage nouvelle génération. [81] Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau.

[82] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le cerveau, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°1 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°l) et une amorce antisens SEQ ID N°2 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°2), ou bien une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°4 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°4) et une amorce antisens SEQ ID N°5 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°5), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, respectivement selon les paires d'amorces utilisées.

[83] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le poumon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :

- Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par

- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°7 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°7) et une amorce antisens SEQ ID N°8 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°8), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible, c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°9.

[84] Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d'une séquence nucléotidique cible d'ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d'un type de cellules présent dans le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :

- a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l'ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d'une paire d'amorces constituée par

- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°10 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°10) et une amorce antisens SEQ ID N°ll (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°ll), ou bien

- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°13 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°13) et une amorce antisens SEQ ID N°14 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N°14), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d'ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,

- b) Réaction d'amplification de ladite séquence cible,

- c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l'étape b), au moyen d'une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15, respectivement selon les paires d'amorces utilisées.

[85] Les tests diagnostiques décrits s'inscrivent dans un processus analytique composé de 2 étapes préliminaires : l'extraction de l'ADN circulant et la conversion épigénétique (par bisulfite, réaction enzymatique). Les tests diagnostiques sont compatibles avec différents kits d'extractions de l'ADN circulant tels que le QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID: 55114 (Qiagen) ; EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. I ID: 954854 (Qiagen) ; Kit d'isolement d'ADN acellulaire MagMAX™ (Référence: A29319, Thermofisher) ; Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref : A6030, Promega). Les ADNs acellulaires une fois extraits sont dosés par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d'ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subissent une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent enzymatique (NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (Référence E7125S / E7125L)) commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)) (compatible également avec des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).

[86] Les tests diagnostiques décrits sont compatibles avec l'ensemble des plateformes de PCR digital sur le marché (microgouttelettes et/ou micro-compartiments). Parmi elles, nous trouvons des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System - QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).

[87] Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité, la reproductibilité et la sensibilité du test. Pour quantifier la dégradation rénale, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique.

[88] De préférence, pour quantifier la dégradation rénale, il est préférable de détecter au moins un marqueur "rein entier", un marqueur de "type vasculaire" et un marqueur de "type épithélial" quantifié dans un test en multiplexage. Plus on augmente le nombre de marqueurs dans chacun de ces catégories, plus on augmente la performance clinique du test. La détection de plusieurs marqueurs par catégorie parmi les marqueurs « rein entier », « type vasculaire » et « type épithélial » renforce la donnée biologique.

[89] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/oule suivi de l'évolution d'un AVC et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'AVC.

[90] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/ou le suivi de l'évolution d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë.

[91] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit ou d'un procédé selon l'invention, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic, et/ou le dépistage et/ou le suivi de l'évolution d'un d'un rejet/dysfonctionnement de greffe rénal et/ou d'un épisode d'insuffisance rénale aiguë et/ou l'optimisation thérapeutique du patient atteint d'un rejet/dysfonctionnement de greffe rénale et/ou d'une insuffisance rénale aiguë.

[92] Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi :

- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°l, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34, SEQ ID N°37, SEQ ID N°40, SEQ ID N°43, SEQ ID N°46, SEQ ID N°49, SEQ ID N°52,ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ;

- une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°14, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32, SEQ ID N°35, SEQ ID N°38, SEQ ID N°41, SEQ ID N°44, SEQ ID N°47, SEQ ID N°50 et SEQ ID N°53, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences ; et

- une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33, SEQ ID N°36, SEQ ID N°39, SEQ ID N°42, SEQ ID N°45, SEQ ID N°48, SEQ ID N°51 et SEQ ID N°54, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences.

[93] Selon un autre aspect, l'invention a pour objet de diagnostic, ou de suivi de la dégradation d'un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, comprenant les étapes suivantes :

- Extraction de l'ADN acellulaire méthylé d'un échantillon biologique d'un individu

- Conversion de l'ADN acellulaire méthylé (bisulfite et/ou conversion enzymatique)

- Mise en présence de l'ADN et d'une paire d'amorces appropriée dans des conditions permettant l'hybridation,

- Amplification de ladite séquence,

- Détection de la séquence amplifiée, au moyen de la sonde de détection appropriée.

Description des figures et modes de réalisation

[94] D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :

[95] La Figure 1 représente la proportion de neurones marqués lors de l'utilisation du marqueur anti-NeuN (gauche), du marqueur APC2 (centre) et du marqueur NBR1 (droite). [96] La Figure 2 représente les données normalisées de la moyenne des marqueurs NBR1 et APC2, sur une échelle logarithmique dans le cas de l'AIT (gauche), et de l'AVC (droite).

[97] La Figure 3 représente la quantité de marqueurs rénaux dans le plasma (en ng/ml) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).

[98] La Figure 4 représente la fraction d'ADN circulant d'origine rénale, sur le total d'ADN circulant dans le plasma (en %) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).

[99] La Figure 5 représente la quantité de marqueurs rénaux en ng/ml d'urine dans le cas de patients avec rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou sans rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).

[100] La Figure 6 représente la corrélation entre le marquage histologique TTF-1 (axe des abscisses) et l'utilisation du marqueur SYNE1 (axe des ordonnées) selon l'invention.

[101] La Figure 7 représente la discrimination entre les sous-groupes de patients avec SDRA modérée (gauche), SDRA sévère (centre) ou SDRA critique (droite) fondée sur les résultats obtenus avec le marqueur SYNE1 (ordonnées).

[102] Les Figures 8A et 8B représentent respectivement : (A) la détection des marqueurs SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 et TNS2-AS1/ACSL5 dans de l'ADN 100% méthylé ; (B) la détection des marqueurs SEPT5/GATA2, PDE4D, CTDP1, PAX2 et TNS2-AS1/ACSL5 dans de l'ADN non méthylé, c'est-à-dire le contrôle négatif, les résultants montrant une absence de détection dans l'ADN non méthylé.

[103] La Figure 9 représente la quantification relative des marqueurs SEPT5, GATA2, TNS2-AS1, PDE4D, ACSL5, PAX2 et CTDP1, avec normalisation par le marqueur ubiquitaire albumine (contrôle interne correspondant au nombre de génomes totaux présents dans l'échantillon) dans des échantillons d’ADN génomique (ADNg) extraits de tissus sains : rein, foie, globules blancs, ADN circulant plasmatique et ADN circulant urinaire.

[104] La Figure 10 représente la corrélation (R ² = 0,5) entre les quantifications relatives normalisées (via un marqueur interne albumine) des marqueurs PAX2 et ACSL5 dans n = 22 ADNg rénaux. [105] La Figure 11 représente la corrélation (R ² = 0,8087) entre les quantifications relatives normalisées (via un marqueur interne Albumine) des marqueurs PAX2 et ACSL5 dans n = 15 cf-ADN urinaire.

[106] Les Figures 12A et 12 B) représentent respectivement la comparaison de 2 méthodes quantitatives de la fraction épithéliale rénale sur n = 22 échantillons de rein sain. CD10 est un marqueur histologique de l'épithélium rénal. PAX2 et ACSL5 sont des marqueurs moléculaires ciblant spécifiquement l'épithélium rénal.

[107] La Figure 13 représente la différence significative de quantification du marqueur CTDP1 dans les urines entre des patients présentant un rejet de greffe et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (histogramme de gauche) et un modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 et SEPT5 pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite)

[108] La Figure 14 représente la différence significative de quantification du biomarqueur CTDP1 dans les plasmas entre des patients présentant un rejet de greffe (avec lésions tissulaires sur le greffon) et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (sans lésions tissulaires sur le greffon) (histogramme de gauche) et un modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, GATA2, TNS2-AS1, PAX2 et PDE4D pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite).

[109] La Figure 15 représente la différence significative de quantification du biomarqueur GATA2 dans les plasmas entre des patients présentant des lésions vasculaires du greffon et ceux ne présentant pas de lésions vasculaires du greffon (graphique de gauche) et unmodèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, GATA2, et TNS2-ASl pour prédire la présence ou l'absence de lésions vasculaires sur le greffon (graphique de droite).

[110] Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à de l'état de la technique antérieur. La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée. EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Identification de biomarqueurs

[111] Les îlots CpG présents au niveau des promoteurs de certains gènes se retrouvent à différents niveaux de méthylation selon la nature du tissu. A partir d'exploitation de bases de données de méthylation TCGA (The Cancer Genome Atlas) et DeepBlue (Epigenomic Data Server - DeepBlue) , Gene Expression Omnibus (ID : GSE186458)les positions et les degrés de méthylation d'un grand nombre d'îlots CpG sont répertoriés pour de nombreux types de tissus différents, incluant les sous-types de pneumocytes pulmonaires (poumon), les neurones (cerveau) et les cellules rénales (rein) (Moss et al. Nat Commun, déc 2018;9(l):5068. ; Liu X et al. Clin Epigenetics. déc 2019;ll(l):93 ; Silva TC et a/. Bioinformatics. 1 juin 2019;35(ll): 1974-7 ; Zhou W et a/. Nucleic Acids Res. 24 oct 2016;gkw967. ; Albrecht F et al. Nucleic Acids Res. 8 juill 2016;44(Wl):W581-6). Par traitement bio-informatique, les inventeurs ont identifié différentes positions hyperméthylées dans les tissus sains de cerveau, de poumon et de rein. Cette identification comporte 5 étapes et est décrite ci-dessous dans l'exemple de la détection de la dégradation pulmonaire.

[112] Dans le cas de la détection de la dégradation pulmonaire, les inventeurs ont sélectionné des positions non-méthylées dans l'ADN issu des globules blancs, PBMCs et cellules immunitaires, à partir d'une analyse de données issues du sang total.

[113] Les inventeurs ont ensuite détecté les îlots CpG hyperméthylés et/ou hypométhylés dans le tissu sain, dans une base de données établie à partir de tissu pulmonaire sain. Ces données ont été séparées en un jeu de données de découverte (« training ») et un jeu de données de validation (« test »).

[114] Des îlots CpG différentiellement méthylés du tissu pulmonaire par rapport aux îlots CpG de tissu sain d'autres organes (rein, cerveau, muscle, estomac, foie, cœur, intestin) ont ensuite été identifiés. Les positions les plus différentiellement méthylées ont été sélectionnées, 432 positions ont donc été retenues.

[115] Parmi ces 432 positions, un affinage a été réalisé par une sélection manuelle. Des positions sont retenues en fonction de leur moyenne de méthylation dans les tissus pulmonaires et non pulmonaires. 4 positions candidates ont été sélectionnées.

[116] Les performances de ces quatre positions pour discriminer un tissu pulmonaire d'un tissu non pulmonaire ont été analysées, au moyen d'un modèle de régression logistique pénalisée selon la méthode LASSO. Le test statistique AUROC obtenu permet de conclure que plusieurs îlots CpG permettent d'identifier un tissu pulmonaire avec une forte performance prédictive.

[117] Le tableau 6 ci-dessous rassemble les marqueurs sélectionnés pour chacun des organes cibles. Tableau 6

[118] Différents amplicons ont été générés afin de discriminer chacune des positions identifiées. Les caractéristiques techniques des amorces et sondes sont décrites dans le tableau 4 ci-dessous. Les températures d'hybridation des sondes ont été choisies entre 40° et 54°C pour les sondes et 52 et 60°C pour les amorces, la différence de température d'hybridation entre amorces et sondes est de 5 à 10°C.

Tableau 7

[119] Pour chaque organe, un test en multiplexage a été construit. Un contrôle interne de la quantité d'ADN circulant total, détectant la quantité d'ADN codant pour l'albumine, est implémenté dans le test.

EXEMPLE 2 : Validation des biomarqueurs de la dégradation neuronale dans la prise en charge de l'AVC en phase aigüe [120] La validation des biomarqueurs selon l'invention comprend les étapes suivantes :

- l'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, - la validation du test de PCR digitale sur de l'ADN synthétique 100 % méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial,

- la détermination des paramètres métrologiques,

- un contrôle négatif démontrant la spécificité du test,

- un contrôle positif sur des échantillons d'ADN génomique issu de coupes de tissus sains, et la comparaison avec le marquage histologique de référence

[121] L'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes est commune aux différents marqueurs. L'ADN acellulaire est d'abord extrait par un procédé d'extraction commercial dédis à l'ADN acellulaire via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Référence Cat. No. I ID : 55114, Qiagen). L'ADN acellulaire est dosé par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d'ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subit une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)).

[122] Le design des amorces et sondes nécessaires à la réaction de PCR pour les cibles APC2 et NBR1 sont mentionnés dans le Tableau 7. Des sondes de type Taqman-Mgb sont utilisées (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec). La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR est effectuée en un procédé comprenant 3 étapes principales présentées ci-dessous, ce procédé est désigné

« amplification par PCR selon l'invention » dans le reste du texte de la présente demande.

[123] La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 8 suivant.

Tableau 8

[124] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 9 suivant.

Tableau 9

[125] La réaction de PCR est présentée dans le Tableau 10. Table 10

[126] Les plaques sont lues selon le réglage d'acquisition suivant : 120 ms canal FAM (bleu) - 180 ms canal HEX/VIC (vert) - 38 ms canal Cy5 (Rouge)) pour une lecture avec le système Naica de STILLA Technologies. [127] Validation du test de PCR digitale : Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2.

[128] Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes NBR1 et APC2 sont bien détectés et quantifiables par le test selon l'invention. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que les marqueurs NBR1 et APC2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.

[129] La spécificité du test a été vérifiée par un contrôle en présence d'ADN issu de cellules mononucléées de sang périphérique, dites « PBMC » (Peripheral Blood Monocyte Cells) de sujets sains.

[130] 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite.

[131] Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que le test est spécifique car il ne présente pas de bruit biologique au niveau de l'ADN génomique issu des globules blancs. Par « bruit biologique » on entend un bruit de fond des marqueurs épigénétiques sur des échantillons considérés comme négatifs ou non méthylés. En d'autres termes, la détection des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 génère un signal négligeable sur des échantillons considérés comme non négatifs ou non méthylés.

[132] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci ne présente pas de bruit biologique au niveau de l'ADN acellulaire/plasmatique issu du plasma de sujets sains.

[133] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologique des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d'ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. Les résultats montrent un bruit biologique très faible dans les tissus d'ADN génomique autre que les tissus d'origine cérébrale. Si les deux biomarqueurs APC2 et NBR1 sont pris en compte, le bruit biologique est inférieur à 2%. Les résultats du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci présente un bruit biologique négligeable voir absent au niveau de l'ADN génomique issu des différentes coupes tissulaires (autre que le cerveau).

[134] Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus cérébraux sains, par comparaison avec le marquage histologique anti-NeuN.

[135] 12 échantillons de tissus cérébraux sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologique MTA n° VAL 2022/2022-234/01 auprès du service d'anatomopathologie de l'hôpital Lariboisière du Pr Homa Adie Biassette). 1 échantillon = Lame blanche marquée par l'anticorps anti-neuN (anticorps neuronal, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) et 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine.

[136] Les cellules neuronales marquées par l'anticorps anti-NeuN ont été comptées par le logiciel de précision « HALO® image analysis ». Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit « Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit » (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d'ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques NBR1 et APC2 selon l'invention décrite. [137] Les marqueurs neuronaux APC2 et NBR1 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Une proportion identique de neurones dans les coupes tissulaires cérébrales saines est observée entre le marqueur histologique anti-NeuN et les marqueurs épigénétiques APC2 et NBR1. Une corrélation entre les marqueurs épigénétiques APC2 / NBR1 et le marqueur histologique anti-NeuN est relevée (Coefficient R de Pearson = 0,44 et 0,46 respectivement pour les marquages épigénétiques APC2 et NBR1 par rapport au marquage anti-NeuN). Les résultats sont indiqués dans le tableau 11 ci-dessous et dans la Figure 1.

Tableau 11

[138] Les données de la corrélation entre le dosage quantitatif des marqueurs cérébraux (neurones) et du marquage histologique Anti-NeuN (marqueur cellulaire neuronal) montrent une corrélation entre les marquages moléculaires et histologiques (coefficient de Pearson R = 0,46 et 0,44 respectivement pour NBR1 et APC2) confirmant la spécificité neuronale (cellules cérébrales) du test.

[139] Dans une application clinique, un test selon l'invention permet de stratifier les patients atteints d'AVC selon son indice de sévérité. Les résultats montrent une élévation de la moyenne quantitative des marqueurs APC2 et NBR1 chez les patients atteints d'un AVC ischémique aiguë (AVC) par rapport aux patients atteints d'un AVC ischémique transitoire (AIT) (moyenne respective de 11,32 copies/ml de plasma pour l'AIT versus 75 copies/mL de plasma pour l'AIA). Les résultats sont présentés dans la Figure 2.

EXEMPLE 3 : Validation d'un premier groupe biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du rein [140] La validation des biomarqueurs PDE4D et PAX2 comprend l'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l'exemple 2 (cf : Méthodologie d'analyse partie commune). La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR comprend la préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le tableau 12 suivant.

Tableau 12

[141] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le tableau 13 suivant. Tableau 13

[142] La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le tableau 10 (exemple 2).

Les plaques sont lues comme indiqué dans l'exemple 2. [143] Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2. Les résultats sur des ADN synthétiques montrent que : 1/ Sur les contrôles ADN 100% méthylés : les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes PDE4D et Pax2 sont bien détectés et quantifiables par notre test. 2/ Sur les contrôles ADN non méthylés : Les marqueurs PDE4D et Pax2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.

[144] Les résultats montrent que les cibles PDE4D et PAX2 ne sont pas détectées dans de l'ADN non méthylé commercial.

[145] Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité et la sensibilité du test. Le test est répétable avec un coefficient de variation de 4,5% et de 0,6% respectivement pour les marqueurs Pax2 et PDE4D. Le test est sensible à 0,01% et permet une quantification jusqu'à une limite de respectivement 0,15 ng et 0,3 ng d'ADN pour les marqueurs PDE4D et Pax2.

[146] La spécificité du test a été vérifiée en présence d'ADN issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN des PBMCs.

[147] 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse des ADNs génomiques issus des culots de globules blancs de sujets sains (= absence de bruit de fond biologique).

[148] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN plasmatique (ADN cellulaire) de sujets sains.

[149] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique issus d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l'Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques PDE4D et Pax2 montrent que ceux-ci n'ont pas été détectés dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le rein confirmant l'absence d'un bruit biologique.

[150] Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus rénaux sains. 12 échantillons de tissus rénaux sains ont été recueillis auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l'invention décrite.

[151] Les marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Ainsi, ces travaux confirment la spécificité rénale du test de digital PCR PDE4D et Pax2 décrit.

[152] La quantité d’ADN circulant d’origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les premiers jours post-greffe rénale (Figure 3).

[153] La fraction d’ADN circulant d’origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les 1ers jours post-greffe rénale (Figure 4). [154] Le dosage quantitatif des marqueurs PD4ED et Pax2 dans les urines par le test décrit est plus élevé chez les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie que chez des patients ne présentant pas de rejet de greffe. Ce dosage permet de stratifier les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie et les patients ne présentant pas de rejet de greffe (Figure 5).

EXEMPLE 4 : Validation du biomarqueur SYNE1 de la dégradation pulmonaire dans la prise en charge de l'insuffisance respiratoire aigüe

[155] La méthodologie d'analyse moléculaire de la conversion de l'ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB- MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l'exemple 2. La mise en œuvre de la réaction d'amplification par PCR est effectuée comme suit. La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le tableau 14 suivant.

Tableau 14

[156] La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le tableau 15 suivant.

Tableau 15

[157] La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le tableau 10 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l'exemple 2.

[158] Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l'ADN synthétique 100% méthylé et sur de l'ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d'ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d'ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1.

[159] Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que le marqueur épigénétique ciblé sur le gène SYNE1 est bien détecté et quantifiable par un test selon l'invention mettant en œuvre ce marqueur. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que le marqueur SYNE1 développé est bien détectable si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n'y a pas de détection du marqueur dans les contrôles d'ADN non méthylés.

[160] La spécificité du test a été vérifiée en présence d'ADN génomique issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. 10 échantillons d'ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Le marqueur n'est pas détecté lors de l'analyse de l'ADN génomique issu des PBMCs

[161] La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d'ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d'ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. I ID : 55104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l'analyse dans l'ADN génomique de sujets sains.

[162] Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d'ADN génomique d'autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d'échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l'Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 pm d'épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d'origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite. Les résultats négatifs du test pour le marqueur épigénétique SYNE1 montrent que celui-ci n'est pas été détecté dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le poumon confirmant l'absence d'un bruit biologique.

[163] Contrôle positif : Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d'ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus pulmonaires sains, par comparaison avec le marquage histologique. 18 échantillons de tissus pulmonaires sains (1 lame blanche et 3 copeaux de 8 pm d'épaisseurs préparés en paraffine) ont été recueillis auprès du service d'anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Pour chaque échantillon, un marquage par un anticorps anti-TTFl sur les lames blanches a été effectuées (anticorps TTF1, Référence : DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) et chaque cellule marquée TTF1 (= pneumocytes pulmonaires) a été comptée au moyen du logiciel « HALO® image analysis ». Les échantillons ont été marqués par l'anticorps TTF1. En parallèle, les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires de 8 pm d'épaisseur préparé en paraffine ont été extrait via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire SYNE1 selon l'invention décrite.

[164] Les résultats montrent que la cible hyperméthylée SYNE1 est détectée et quantifiée uniquement dans de l'ADN génomique issu de coupes pulmonaires saines confirmant la spécificité pulmonaire. La corrélation entre le marquage histologique TTF1 (=pneumocytes pulmonaires) et le test pulmonaire décrit est de 0,6 (coefficient R- Pearson) démontrant la spécificité pulmonaire et pneumocytaire de l'analyse (Figure 6). [165] Dans une application clinique, un test selon l'invention permet de stratifier les patients atteints d'un syndrome de détresse respiratoire en phase aigüe (SDRA) selon un indice de sévérité désigné comme faible, sévère ou critique (classification de Berlin). Les résultats montrent que la cible hyperméthylée SYNE1 permet de discriminer chaque sous-groupe de patient (SDRA modéré, sévère, critique). Une différence significative a été observée entre ces 3 groupes (p-value = 0,0073, test Jonckheere-Terpstra). (Figure 7)

[166] Par ailleurs, les résultats du test selon l'invention permettent de suivre l'état pulmonaire de patient atteint d'un SDRA avec des indicateurs de corrélation entre le résultat quantitatif de la cible hyperméthylée SYNE1 et les marqueurs ventilatoire 02 max / FiO2 / PAO2 (respectivement coefficient de corrélation de Pearson de 0,44, 0,29 et 0,29).

EXEMPLE 5 : Validation d'un deuxième groupe biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du rein

[167] Deux types de tests diagnostiques ciblant le rejet de greffe rénale et la typologie des lésions rénales (total, vasculaire et épithélial) ont été développés en sélectionnant parmi les marqueurs identifiés par les inventeurs.

[168] Selon le prototype 1, les marqueurs SEPT5 (marqueur endothélial glomérulaire) ; PDE4D / PAX2 / ACSL5 (marqueur épithélial tubulaire) ; CTDP1 (marqueur rein total) sont testés sur des échantillons urinaires.

[169] Selon le prototype 2, les marqueurs GATA2 (marqueur endothélial rénal) ; TNS2-AS1 (marqueur endothélial capillaires rénaux) / PDE4D / PAX2 (marqueur épithélial tubulaire) ; CTDP1 (marqueur rein total) sont testés sur des échantillons plasmatiques.

[170] Pour les 2 prototypes, le marqueur « Albumine » est utilisé en tant que marqueur ubiquitaire quantifiant tous les génomes présents dans l'échantillon. Les échantillons biologiques ont été obtenus par l'intermédiaire de partenaires hospitaliers des services de néphrologie de Necker et de l'hôpital Tenon-Pitié-Salpêtrière.

[171] Les concentrations des différents biomarqueurs associés en multiplex (ici sur un mix PCR) composant le kit dédié au suivi de l'état de la souffrance tissulaire rénal dans le cadre de la transplantation rénale au niveau de l'organe total, de sa fraction épithéliale et de sa fraction vasculaire sont utilisés selon les concentrations données dans le tableau 16 ci-dessous.

Tableau 16

[172] Après validation de ces 2 prototypes au niveau métrologique (précision, répétabilité, reproductibilité), les 2 prototypes ont été testés sur différents contrôles biologiques dits « positifs » (ADN génomique issu de rein) et des contrôles dit « négatifs » (ADN génomique issu du foie, des globules blancs et d'ADN circulant plasmatique et urinaire issus de sujets sains) (Figure 9). L'ADN génomique du foie ainsi que des globules blancs sont des contrôles évalués dans le design de ce test et de cette méthodologie car ils sont des contributeurs de l'ADN circulant urinaire et plasmatique chez le sujet sain. [173] Ces analyses ont permis de confirmer l'absence de détection ou la détection à très bas bruit de nos biomarqueurs dans des échantillons biologiques de contrôles négatifs : N = 20 échantillons d'ADN génomiques extraits à partir de culots cellulaires de sujets sains, N = 30 échantillons d'ADN plasmatique de sujets sains, N = 15 échantillons d'ADN urinaire de sujets sains, N = 5 échantillons d'ADN génomiques extraits de coupes tissulaires (5 ADNg foie). [174] Ces ADNg ont été mentionnés comme potentiels contributeurs à bas bruit de l'ADN circulant chez le sujet sain : respectivement cf-DNA urinaire et cf-DNA plasmatique 5.

Résultats :

[175]Les marqueurs cités ci-dessus marqueurs sont détectés dans 100% des ADN génomiques extraits à partir de coupes tissulaires rénales (N = 22).

[176]Les marqueurs proposés dans ce prototype de test de diagnostic in vitro permettent de détecter de l'ADN rénal, de façon spécifique avec un très faible bruit biologique dans l'ADN génomique du foie et des globules blancs (principaux contributeurs de l'ADN circulant) (Figure 8). Dans l'ADN circulant plasmatique de sujets sains, il y a un bruit de fond biologique très faible (un peu plus haut pour le marqueur endothélial GATA2 (cohérent avec la littérature)). Concernant l'ADN circulant urinaire de sujets sains, les marqueurs épithéliaux rénaux et pan-rein sont retrouvés, correspondant probablement à la fraction rénale physiologiquement présente dans les urines, en accord avec la littérature.

[177]Le marqueur « rein total » CTDP1 permet de quantifier les fractions endothéliales et épithéliales du rein. Il est retrouvé en plus haute quantité dans les ADN génomiques de rein par rapport aux marqueurs ciblant uniquement la fraction épithéliale et endothéliale. De même, les marqueurs ciblant la fraction endothéliale du rein (GATA2) sont retrouvés en plus grande quantité que les marqueurs TNS2-AS1 et SEPT5 ciblant respectivement des fractions vasculaires plus petites (restreintes respectivement au glomérule et au tubule).

Exemple 6 : Validation de la spécificité des marqueurs épithéliaux rénaux : Comparaison des marqueurs moléculaires (PAX2 / ACSL5) et du marqueur histologique de l'épithélium rénal CD10

[178]Les inventeurs ont montré que les marqueurs PAX2 et ACSL5 ciblent spécifiquement l'épithélium rénal. Ces marqueurs ont donc été testés pour quantifier l'épithélium rénal. Dans l'ADNg de rein total (n=22) et dans l'ADN circulant plasmatique urinaire, ces marqueurs ont montré une corrélation bonne de respectivement R ² = 0,5 et R ² = 0,8, comme indiqué dans la Figure 10 et Figure 11.

[179]La publication de Erger et al. a montré qu'une fraction variant de 20 à 50% de l'ADN circulant urinaire total chez le sujet sain a une origine rénale (Erger et al. Genome Medicine, (2020), doi.org/10.1186/sl3073-020-00750-5) en proposant un modèle de déconvolution bio-informatique (cfNOMe) de l'ADN circulant urinaire par séquençage NGS. Cette proportion est confirmée par les présents résultat, suggérant une bonne spécificité des marqueurs en termes de détection de l'ADN circulant d'origine rénale. Par ailleurs, l'ADN circulant urinaire d'origine rénale est plutôt d'origine épithéliale (absence de détection de signal des marqueurs vasculaires ex : GATA2, TNS2-AS1 et SEPT-5 et détection des marqueurs PAX2, ACSL5 et PDE4D (R ² corrélation (PAX2/ACSL5) = 0,80 pour les n = 15 échantillons d'ADN circulant urinaire extraits de sujets sains).

[180]Les résultats montrent que les marqueurs PAX2 & ACSL5 ciblent de manière spécifique l'épithélium rénal. Afin de renforcer les résultats obtenus, des comparaisons entre les données moléculaires des marqueurs PAX2 et ACSL5 et des données histologiques (marquage des cellules épithéliales rénales sur des lames blanches de rein par l'anticorps anti-CD10) ont été effectuées. Pour les n = 22 ADN génomique de rein sain pour lesquels PAX2 et ACSL5 ont été quantifiés, un marquage immunohistochimique des cellules épithéliales rénales via l'anticorps anti-CD10 sur lame blanche appariée a été effectuée. Le CD10 est un marqueur de surface ciblant de manière spécifique les cellules épithéliales au sein d'une coupe de rein. Les données histologiques et moléculaires montrent que la proportion de cellules épithéliales sur ces lames et ADNg appariés de rein varient entre 11 et 40% et qu'il n'y a pas de différence significative entre les marqueurs moléculaires et les marqueurs histologiques ciblant l'épithélium rénal (Figures 12A et 12B).

Exemple 7 : Analyse sur des échantillons urinaires de patients transplantés du rein

[181]Afin de valider la pertinence clinique du premier prototype, une collaboration clinique en partenariat avec l'hôpital Necker et Tenon-Pitié Salpêtrière - Service de néphrologie / transplantation a permis d'analyser respectivement N = 50 échantillons urinaires de patients transplantés du rein avec / sans rejet de greffe, confirmé par analyse anatomopathologie de la biopsie solide, et n = 55 échantillons plasmatiques de patients transplantés du rein présentant des biopsies avec et sans lésions cellulaires, confirmées par l'analyse anatomopathologie. Ces biomarqueurs visent à détecter spécifiquement l'origine cellulaire de la lyse rénale, et ainsi le type de rejet en accord avec la classification du rejet de greffe rénal selon la classification de Banff.

[182]50 échantillons biologiques (2 ml d'échantillons urinaires) de patients transplantés du rein, présentant ou non un rejet de greffe rénal (rejet confirmé par biopsie solide) ont été analysés. Parmi ces patients, 20 présentaient un rejet de greffe de type cellulaire (TCMR) et 30 ne présentaient pas de rejet de greffe.

[183]2mL d'urine ont été recueillis le jour de la biopsie rénale. L'ADN circulant a été extrait et l'ensemble des biomarqueurs (SEPT-5, ACSL5, PAX2, PDE4D, CTDP1) a été analysé, en simultané, par PCR digitale en multiplex (6 couleurs, un pour chaque marqueur et le contrôle interne albumine).

[184]Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs a été observé dans les urines des patients présentant un rejet de type cellulaire (Wilcoxon test, p-value < 0,001). Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique de respectivement 0,83 et 0,85, avec un score AUC de 0.88.

[185]La Figure 13 montre la différence significative de quantification du biomarqueur CTDP1 dans les urines entre des patients présentant un rejet de greffe et ceux ne présentant pas de rejet de greffe rénal (graphique de gauche). Modèle de régression logistique compilant les données quantitatives des biomarqueurs CTDP1, PAX2, PDE4D, ACSL5 et SEPT5 pour prédire la présence ou l'absence d'un rejet de greffe (graphique de droite).

Exemple 8 : Analyse sur des échantillons plasmatiques de patients transplantés du rein

[186] 55 échantillons biologiques de patients transplantés du rein, présentant ou non un rejet de greffe rénal (rejet confirmé par biopsie solide avec des biopsies présentant des lésions du greffon de type glomérulaire (g), tubulaire (t), vasculaire (v) et capillaire (ptc)) ont été analysés.

[187]0,6 à 1,5 mL de plasma ont été recueillis le jour de la biopsie rénale. L'ADN circulant a été extrait et l'ensemble des biomarqueurs (GATA2, TNS2-AS1, PAX2, PDE4D, CTDP1) a été analysé, en simultané, par PCR digitale en multiplex (6 couleurs, un pour chaque marqueur + Contrôle interne Albumine).

[188]Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs a également été observé dans les plasmas des patients transplantés présentant une dégradation du greffon rénal. Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique de respectivement 0,96 et 0,75, avec un score AUC de 0.82. Ces résultats soulignent la fiabilité du test dans l'analyse du rejet de greffe dans des échantillons plasmatique. Une augmentation importante de la quantité des biomarqueurs vasculaires (spécifiquement les marqueurs GATA2 et TNS2-AS1) a également été observé dans les plasmas des patients présentant des lésions vasculaires du greffon rénal comme attendu (Figure 14).

[189]Un modèle de régression appliqué aux biomarqueurs « rein total » et « vasculaires » (spécifiquement les marqueurs CTDP1, GATA2 et TNS2-ASl) a montré une bonne sensibilité et spécificité du test diagnostique, avec un AUC de 0.878 (Figure 15). [190]Ensemble, ces résultats démontrent :

-la fiabilité technique du test développé dans la détection des biomarqueurs d'intérêt dans les urines et le plasma des patients,

- la sensibilité et la spécificité technique du test développé, - l'intérêt clinique du test développé dans la détection d'un rejet de greffe de rein,

- l'intérêt clinique du test développé dans la caractérisation des lésions, épithéliales et/ou vasculaires, du greffon rénal.