本发明涉及化学合成安卓幸（Antrocm) 的方法及其抑制非小细胞肺癌的 应用。 背景技术

全世界近二十余年在牛樟芝所含天然化合物的 研究， 除多醣体等大分子 外， 总共发表了七十八个小分子化合物， 其中包括三十一个三萜类化合物且 大都有相关药理活性研究报告， 尤其着重在该等的抗癌活性， 惟三萜类化合 物各别分子仍须在较高使用量， 才能达到癌症临床化学治疗药物的效果

( Geethangili and Tzeng, Evidence-based Complementary and Alternative Medicine (2011) doi: 10.1093/ecam/nepl08)。 但是， 安卓幸自 1995年首度报导 在牛樟芝中被发现后 （Chiang et al., Phytochemistry (1995) 39, 613-616)， 迄今 十六年间， 除于 2011年 2月 15日发表安卓幸具有抑制乳癌细胞增生的功效� ��

(Rao et al, Chemical Research Toxicology (2011) 24, 238-245)， 未再有任何相 关报导， 相关药理活性报告亦付诸缺如。 究其原因乃该安卓幸在一般牛樟芝 子实体中含量很低而不易分离取得。

肺腺癌一般可以视为恶性肿瘤， 是一种疾病。 其特征为恶性组织的不正 常团块， 起因于过度地细胞分裂。 癌症细胞不具有正常细胞生长的限制， 会 侵入与占领正常留给其它细胞的范围。 癌症治疗的种类包括化学治疗、 手术、 放射线以及这些治疗的结合。 化学治疗通常包括使用一个或多个抑制癌细胞 生长的化合物。 虽然目前已经发展了许多癌症化疗药剂， 但仍然需要更有效 的化学治疗。 发明内容

本发明提供一种化学全合成牛樟芝所含的天然 化合物-安卓幸 （antrocm)

的方法， 其特征在于包括： 歩骤 (a). 将化合物 A

在碱存在的条件下与硫化物及卤垸反应生成 中间物； 和歩骤 (b). 将中间物与 自由基引发剂和自由基源反应， 得到安卓幸， 其中碱较佳为双 （三甲基硅基) 氨基钠， 硫化物较佳为二硫化碳， 卤垸较佳为碘甲垸， 自由基引发剂较佳为 偶氮二异丁腈， 自由基源较佳为三正丁基锡垸。

化合物 A是由化合物 B

通过还原试剂与酸反应得到， 其中还原试剂较佳为碱金属， 酸较佳为盐酸。

化合物 B是由化合物 C

通过金化合物和银盐的催化与醇在有机溶剂中 反应得到， 其中金化合物较佳 为如下结构的金化合物IPr) AuCl： ， 银盐较佳为 A _g SbF ₆ ， 有机溶剂较佳为二 甲垸 ₍

化合物 C是由化合物 D

与第一歩氧化剂反应， 再与第二歩氧化剂在共溶剂中反应得到， 其中第一歩 氧化剂较佳为 2,2,6,6-四甲基 -1-哌啶氧自由基和二乙酸碘苯， 第二歩氧化剂较 佳为亚氯酸钠， 共溶剂较佳为叔丁醇和 pH值为 6.8的磷酸缓冲水溶液。

化合物 D是由化合物 E

在溶剂中与碱反应得到， 其中溶剂较佳为甲醇

与还原试剂反应得到， 其中还原试剂较佳为四氢铝锂 ₍

化合物 F是由化合物 G

在氟源作用下， 与高价碘化合物反应得到， 其中高价碘化合物较佳为如下结 构化合物：

， 氟源较佳为四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液 ₍ 化合物 G是由化合物 H

在铜试剂作用下与格氏试剂反应得到， 其中格氏试剂较佳由如下结构的溴化

TMS ，铜试剂较佳为溴化亚酮与二甲硫醚的络合 本发明还提供一种组合物在制备用于抑制非小 细胞肺癌细胞生长的药物 中的应用， 所述组合物包含有效剂量的安卓幸或其医药上 可接受盐类与医药 上可接受载体， 其用于预防或治疗非小细胞肺癌， 对于人类正常支气管上皮 细胞不具细胞毒性。 其中， 安卓幸是以本发明化学合成安卓幸的方法制得 。 非小细胞肺癌的癌细胞包括 CLl-0、 CLl-5、 A549、 PC9、 H1975或 H441细 胞株， 较佳为 H441细胞株。

本发明的药物组合物主要经由活化半胱天冬酶 -3 (caspase-3 )路径及抑制 XIAP、 NF-kB及细胞周期素 Dl (cyclin Dl )的表达从而抑制非小细胞肺癌细 胞生长并且使非小细胞肺癌细胞的 IFI44、 IFIT1、 MX1、 NFkBl、 IFIT2、 CTN BLK SENP2、 CEACAMK POU5F2、 ABCB5、 ABCG2及 XAF1基因 表达降低。

本发明的药物组合物中， 安卓幸或其医药上可接受盐类的有效剂量为 1 mg/kg/天至 50 mg/kg/天， 较佳为 5 mg/kg/天至 10 mg/kg/天。

先前研究已证实自牛樟芝萃取的天然化合物安 卓幸具有抑制乳癌细胞增 生的功效 （Rao et al., 2011 )。 本发明以化学全合成牛樟芝所含的天然化合物 - 安卓幸， 并探讨其对于人类非小细胞肺癌细胞株生长的 影响。 图 4A显示， 化 学全合成的安卓幸对于数株非小细胞肺癌细胞 （NSCLC) 的生长具有不同程 度的抑制效应， 其中对 H1975及 H441两株非小细胞肺癌细胞的抑制效果最 佳。 虽然化学全合成的安卓幸具有显着的抑制癌细 胞增生的能力， 但更重要 的是， 在相同的处理剂量下， 化学全合成的安卓幸对于人类正常支气管上皮 细胞则几乎不具细胞毒性。

本发明进一歩以 H1975及 H441为细胞模式探讨化学全合成的安卓幸抑 制细胞增生的功效是否与诱导细胞倾向凋亡有 关。如图 4B所示， 细胞以安卓 幸处理 48 小时后显着增加细胞凋亡早期及晚期细胞数的 比例并呈现剂量效 应。 结果显示化学全合成的安卓幸具有诱导 NSCLC细胞凋亡的功效。

在确定了化学全合成的安卓幸的分子抗癌机制 后， 本发明进一歩探讨安 卓幸对于癌细胞的基因水平的影响。 预先以 5 μΜ安卓幸培养 H441细胞 12 小时后， 再分析安卓幸对于基因转录反应的影响。 以 GeneSprmg软件分析经 安卓幸处理后能呈现 3.5倍以上的表现抑制效应的基因为主要的目标 基因，并 以树形图呈现 （图 5 )， 结果显示具有 100个以上的基因明显因安卓幸的处理 而影响其表达。 这些基因对于细胞的增生、 炎症反应、 转移、 侵入、 血管增 生以及细胞周期的调控， 皆扮演重要的角色。 表 1 归纳出因安卓幸的处理而 显着降低表达的基因群。 上述这些基因皆与转录因子 NF-kB有关， 如细胞激 素（IFI44、IFITl、MXl )、发炎反应（NFkBl及IFIT2)、干细胞特性（CTN BLl、 SENP2、 CEACAM1及 POU5F2)以及抗药性反应（ ABCB5、 ABCG2及 XAF1 ) 等。 根据以上微阵列 （nncroarmy) 的结果， 本发明特别针对炎症相关因子、 干细胞特性以及抗药性相关分子的表达作更深 入的探讨。 表 1 经安卓幸处理 H441肺癌细胞而显着降低表达的基因 探针 ID 倍数 基因符号 （Gene Symbol)

人 XIAP相关因子 -1 (XIAP associated factor- 1 , XAF1 ), 基因转录变异型 1，

8004184 12.61

mRNA*

A mRNA, cDNA DKFZp45102417 (来自克隆 DKFZp45102417); 完整编码

7902541 10.74

序列

人 AKT1基质 （substrate) 1 (富含脯氨酸） （AKT1S1 ), 基因转录变异型 1，

8038477 10.29

mRNA*

7949532 9.93 人 FOS样抗原 1 (FOSLl ), mRNA

8084607 8.9 人 SUM01/sentrin/SMT3特异性肽酶 2 (SENP2), mRNA

7902553 8.3 人干扰素诱导蛋白 44 (IFI44), mRNA

7938035 7.65 人含三联基元 22 (tripartite motif-containing 22, TRIM22), mRNA

8011407 7.15 人 Taxi (人类 T细胞白血病病毒 I型） 结合蛋白 3 (TAX1BP3 ), mRNA

7937330 6.16 人干扰素诱导穿膜蛋白 2 ( 1-8D) (IFITM2), mRNA

7958913 5.91 人 2'-5'-寡腺苷酸合成酶 2， 69/7 lkDa (OAS2), 基因转录变异型 2， mRNA 人上皮间质交互作用 （epithelial stromal interaction) 1 (胸部） （EPSTI1 ), 基

7971296 5.61

因转录变异型 1， mRNA

人染色体 7上的 CDC14细胞分裂周期 14同系物（homolog) C ( S. cerevisiae)

8132803 5.49

(CDC14C)

8082585 5.48 人假设蛋白 FLJ35880 (FLJ35880), mRNA

8068713 5.42 人粘液病毒（流感病毒）抗性 1， 干扰素诱导蛋白 p78 (鼠）（MX1)， mRNA 人干扰素诱导蛋白具有四联重复肽 （tetratricopeptide repeats) 1 (IFIT1), 基

7929065 5.28

因转录变异型 2， mRNA

8037205 4.99 人癌胚抗原相关的细胞粘附分子 1 (CEACAM1), 基因转录变异型 1， mRNA

8038877 4.94 人唾液酸结合 Ig样凝血素 5 (SIGLEC5), mRNA

7906400 4.9 人干扰素 γ诱导蛋白 16 (IFI16), mRNA

8101126 4.62 人趋化因子 （C-X-C模体） 配体 10 (CXCL10), mRNA

8084732 4.6 人受体 （化学感受 （chemosensory)) 转运蛋白 4 (RTP4), mRNA

人白细胞相关免疫球蛋白样受体 (leukocyte immunoglobulin-like receptor), 亚

8039226 4.58

家族 A (无 TM域）， 成员 3 (LILRA3), mRNA

7929047 4.44 人干扰素诱导蛋白具有四联重复肽（tetratricope ptide repeats ) 2 ( IFIT2 ) , mRNA

8099633 4.44 人过氧化物酶体增殖物激活受体 γ， 辅助激活子 la (PPARGC1A), mRNA

8086125 4.35 人狼疮脑抗原 1 (LBA1)， mRNA

8082100 4.3 人聚 (ADP-核糖)聚合酶家族， 成员 14 (PARP14), mRNA

人血管生成蛋白， 核糖核酸酶， RNaseA家族， 5 (ANG), 基因转录变异型 1，

7973084 4.24

mRNA

7967117 4.09 人 2'-5'-寡腺苷酸合成酶类 （OASL), 基因转录变异型 1， mRNA

8092169 4.09 人肿瘤坏死因子 （配体） 超家族， 成员 10 (TNFSF10), mRNA*

人含不育 α模体域 9样（sterile alpha motif domain containing 9-like, SAMD9L),

8140971 4.08

mRNA

8090018 4.03 人聚 (ADP-核糖)聚合酶家族， 成员 9 (PARP9), mRNA

人 ATP结合盒（ATP-binding cassette),亚家族 G (WHITE),成员 2 (ABCG2),

8101675 3.93

mRNA*

8113094 3.9 人 POU域类 5 (POU domain class 5), 转录因子 2 (POU5F2), mRNA

8096635 3.85 人 B细胞 κ轻肽基因增强子核转录因子 1 (pl05) (NFKB1), mRNA*

8163960 3.83 人嗅感受器， 家族 1， 亚家族 L， 成员 8 (OR1L8), mRNA

8092348 3.8 人溶酶体相关膜蛋白 3 (LAMP3), mRNA

7917276 3.75 人内皮细胞分化， 溶血磷脂酸 G蛋白耦合受体， 7 (EDG7), mRNA

8008802 3.73 人含甘油磷酸二酯磷酸二酯酶结构域 1 (GDPD1)， mRNA

8006531 3.65 人睡眠 （schlafen) 家族成员 5 (SLFN5), mRNA

人 ATP结合盒（ATP-binding cassette)，亚家族 B(MDR/TAP)，成员 5(ABCB5 )，

8137310 3.62

mRNA*

8062409 3.59 人连环素 （catenin), β样 1 (CTN BLl), mRNA*

8044450 3.5 人含锌指 CCCH型 6 (ZC3H6), mRNA 安卓幸具有抑制高度转移能力的 H441细胞的增生功效，随着安卓幸的剂 量升高能显着诱发半胱天冬酶 -3的活化而走向细胞凋亡 （图 6)。 此外， 安卓 幸对于炎症反应相关分子， 包括 XIAP、 NF-kB-p65及细胞周期素 D1的表达 方面， 亦同样呈现剂量的抑制效应。

本发明进一歩探讨安卓幸在活体是否同样具有 抗癌功效。 以萤火虫冷光 及绿荧光蛋白双重载体转染标定的 H441-L2G细胞，经由尾静脉注射的方式 (6 Χ 10 ⁵ /100 μΐ PBS) 打入非肥胖型糖尿病 /重度联合免疫缺陷 （NOD/SCID) 的 小鼠中，再以每日腹腔注射的方式施予安卓幸 (共两组，分别为低剂量 5 mg/kg/ 天及高剂量 10 mg/kg/天）， 持续四周， 并观察肿瘤生长状况。 结果显示， 在给 予低剂量 5 mg/kg/天安卓幸达两周后能抑制半数的实验动物 的肿瘤生长，而第 三周时大多数的动物才被侦测到有肿瘤的存在 （图 7A， 7B)， 另外安卓幸处 理组与对照组间的体重并无显着性的差异 （图 7C)。

在存活率方面， 对照组的存活时间中位数为 28天， 而安卓幸处理组则可 达到 50天以上。 其中低剂量 5 mg/kg/天安卓幸处理组有 75%的动物生存超过 50天， 而且在实验终止时 （第 50天） 至少增加 60%的存活时间中位数 （图 7D) o

安卓幸可拥有一至三个手性中心， 因此具有各种立体异构物形式。 本发 明中提及的安卓幸包括所有此等异构物。 安卓幸具有选择性抑制肺腺癌细胞 生长的功效。 由于其分子量极小， 因此， 可使用较低剂量的安卓幸或其医药 上可接受盐类， 与医药上可接受载体的药物组合物施用， 即可得到渴望的治 疗效果。 本发明的医药组合物可用于抑制癌细胞、 或投予所需的病患 （此病 患具有癌症、 癌症的症状或倾向于癌症的体质） 以治愈、 恢复、 减轻、 缓和、 改变、 治疗、 改善、 改进或影响疾病、 疾病的症状或倾向于疾病的体质为目 的。 此处使用的 "有效剂量"指有效剂量的安卓幸或其医药上可� ��受盐类， 具有抑制或治疗功效的量。 有效剂量可根据给药的途径、 辅药使用 （excipient usage) 以及与其它共同使用 （co-usage) 的活性药剂而改变。

此处的 "肺癌"意指肺细胞肿瘤。 肺癌依组织细胞型态可分为小细胞肺 癌 （SCLC) 与非小细胞肺癌 （NSCLC) , 其中以 NSCLC 为最常见的型态。 在 NSCLC中， 可以细分成腺癌和鳞状细胞癌等， 以肺腺癌最多。肺癌的另一 特征是早发转移， 早期肺癌症 40%的病人会在术后 5年内会发生转移， 且目 前临床 TNM分期的方法无法准确预测病人预后。此处所 指的癌症包括所有种 类的细胞不当增生 ( cancerous growth )或至夂癌过程 (oncogenic processes ) 转 移性的组织或恶性转换的细胞、 组织或器官 （与组织病理学型态无关） 或侵 入阶段。

本发明的安卓幸是以化学全合成方法制备而得 。 安卓幸自 1995年首度报 导在牛樟芝中被发现后 （Chiang et al., 1995)， 迄今十六年间， 除于 2011年 2 月 15日发表安卓幸具有抑制乳癌细胞增生的功效� �� （Rao et al., 2011 )， 未再 有任何相关报导， 相关药理活性报告亦付诸缺如。 究其原因乃该安卓幸在一 般牛樟芝子实体中含量很低而不易分离取得， 本发明以化学全合成安卓幸进 而制备取得。

同时， 本发明发现安卓幸有效抑制人类非小细胞肺癌 的生长， 但对正常 细胞 （正常肺腺上皮细胞 -BEAS2B ) 则几乎不具细胞毒性； 再者， 安卓幸抑 制 H441 细胞的炎症相关基因的表达， 并活化半胱天冬酶 -3 及抑制 XIAP、 NF-kB-p65及细胞周期素 Dl的表达而抑制细胞增生， 并显着抑制活体的肿瘤 生长。 在此必须再强调的是： 安卓幸乃是牛樟芝所含各种天然化合物中， 惟 一经化学全合成制备取得， 并经实验证实其在体外及活体内， 有效抑制人类 非小细胞肺癌细胞的生长。

本发明所使用的安卓幸或其医药上可接受盐类 ， 可同时给药或分开给药， 以口服、非口服、经由吸入喷雾（ inhalation spray)或藉由植入贮存器（ implanted reservoir) 的方式。 此处所使用的 "非口服"指皮下、 皮内、 静脉内、 肌肉内、 关节内、 动脉内、 滑膜 （腔） 内、 胸骨内、 鞘内、 病灶内与颅内注射以及灌 注技术。

本发明所使用内安卓幸或其医药上可接受盐类 ， 可与至少一种固体、 液 体或半液体状的赋形剂或辅助剂一同形成适当 的药剂形式。 其形式包括， 但 不限定于， 药锭、 胶囊、 乳剂、 水性悬浮液、 分散液与溶液。 药锭一般所使 用的载体包括乳糖与玉米淀粉。 一般也将润滑剂， 例如硬脂酸镁 （加至药锭 中。 用于胶囊形式的稀释剂包括乳糖与经干燥的玉 米淀粉。 当口服给药为水 性悬浮液或乳剂时， 可悬浮或溶解有效成分于与乳化或悬浮剂结合 的油相。 如果需要， 可加入特定甜味、 调味与着色剂。

本发明所使用的安卓幸或其医药上可接受盐类 ， 亦可配制成无菌注射成 分（例如， 水或油的悬浮液）， 例如利用本技术领域中已知的技术使用适合的 分散或增湿剂 （例如吐温 80) 与悬浮剂。 无菌注射调剂也可以将无菌注射溶 液或悬浮液加入无毒性非口服的稀释剂或溶剂 ， 例如 1,3丁二醇中。可使用的 载体与溶剂包括甘露醇、 水、 林格氏液与等渗透压氯化钠溶液。 此外， 无菌、 固定油常作为溶剂或悬浮媒介 （例如合成的单 -或双 -甘油酯）。 脂肪酸， 例如 油酸与其甘油酯衍生物亦可用在注射剂的调制 ， 其为天然药学上可接受的油， 例如橄栏油、 蓖麻油， 特别是于其聚氧乙基化的变化形式。 这些油溶液或悬 浮液也可包含一长链醇类稀释剂或分散剂， 或者羧甲基纤维素或类似的分散 剂。

本发明所使用的安卓幸或其医药上可接受盐类 ， 亦可根据此技术领域中 所熟知的技术来配制成吸入成分。 例如可制成盐类溶液， 利用苯甲醇或其它 适合的防腐剂、 增强生物可利用性的吸附促进剂、 碳氟化合物或其它本技术 领域中熟知的助溶或分散剂来配制。

用于药学组成物的载体必须是"可接受的"，其� ��配方的有效成分兼容（以 及较佳为具有稳定有效成分的能力） 以及不对病患有害。 例如， 助溶剂 （例 如环糊精 （其与一个或多个萃取物的活性化合物形成特 定更可溶解的复合 物）， 为了有效成分的传送而作为药理学上的辅药。 其它载体的例子包括胶态 二氧化硅、 硬脂酸镁、 纤维素与十二垸基硫酸钠。

另外， 由于抗癌剂如以高剂量投予病患易产生毒性。 是以， 本发明医药 组合物为含有有效剂量的安卓幸， 用于抑制肺癌细胞生长， 其中该有效剂量 为 l mg/kg/天至 50 mg/kg/天， 较佳为 5 mg/kg/天至 10 mg/kg/天。 施予个别病 人的特定剂量是依所有可能存在因素而定， 例如： 所使用的特定化合物的活 性、 年龄、 体重、 一般健康状况、 性别、 进食状况、 施用时间与路径、 排泄 率、 医药物质的组合、 以及所欲治疗疾病的严重程度等。 附图说明

图 1 是本发明的逆合成路线图；

图 2 是化合物 C的合成路线图；

图 3 是安卓幸的合成路线图；

图 4 是合成的安卓幸抑制人类非小细胞肺癌的增生 及诱导细胞凋亡的剂 量效应: (A) 合成的安卓幸抑制人类非小细胞肺癌及支气管 上皮细胞增生的剂 量效应； （B) 合成的安卓幸诱导 H1975及 H441细胞凋亡。

图 5 (A)是以安卓幸处理的 H441细胞的基因图谱， 红色及绿色区块分别 表示具有争议及排除的基因； （BM吏用 STRING9.0 分析软件预测安卓幸影响 H441细胞之讯息传递路径及可能抑制标靶。

图 6 是安卓幸抑制 H441细胞增生主要经由活化半胱天冬酶 -3路径及抑 制 XIAP、 NF-kB及细胞周期素 D1的表现。 以相对倍数呈现安卓幸对相关蛋 白之抑制能力。 β-肌动蛋白为内参照 （loading control) 。 三次独立试验皆呈 现类似的结果。

图 7 是安卓幸抑制肿瘤增生的活体试验： H441-L2G细胞（6 Χ 10 ⁵ /100 μ1

PBS) 以尾静脉注射方式施予免疫不全小鼠。 安卓幸处理组（低剂量 5 mg/kg/ 天及高剂量 10 mg/kg/天） 以腹腔注射的方式连续四周每日投予已注射肿 瘤的 小鼠。 每周观察 (A) VIS影像、 （B) 肿瘤生长、 （C) 体重， 并纪录 (D) 生命曲 线。 具体实施方式

以下实施实例将进 发明特定实施例的各种优点， 但不表示本发明仅局限于此种方式。 实施例 1

制备安卓幸

除非特别说明， 所有反应均在 N ₂ 保护无水条件下进行， 所有试剂都是从 试剂公司购得后未经任何纯化处理直接使用。 试剂纯化参照 Purification of Laboratory Chemicals (Peerrin et al., Pergamon Press: Oxford, 1980)。 四氢呋喃 (THF), 甲苯采用金属钠回流纯化； DCM使用 CaH ₂ 回流纯化。 产率除非特别 指出均是柱层析分离产率。

反应检测时使用的是 0.25mm 青岛海洋化工厂生产的薄层色谱硅胶板 (60F-254)。柱层析使用青岛海洋化工产生产的 200-300目硅胶， 使用石油醚 沸程为 60-90°C。

所有红外数据均是由以下仪器测得： Shimadzu IRPrestige21 _; 所有核磁共 振均由以下仪器测得： Brtiker Advance 500 ( ^J H： 500 MHz, ¹³ C: 125 MHz) , 使用 TMS或氘代溶剂中残留的未氘代溶剂做内标。

安卓幸的反应路径如图 2、 3所示， 依下列歩骤进行： 化合物 F的合成:

将含有镁屑 （0.49 g， 20 mmol) 以及一小块碘的 THF ( 3 mL) 混合液加 热至沸腾。滴加 (4-溴丁 -1-炔基)三甲基硅垸（2.67 g， 13 mmol)的 THF ( 10 mL) 溶液， 加料完毕后继续在室温下搅拌 0.5小时， 制得如下结构的格氏试剂： 在 -78°C下， 将制备的格式试剂加入到 CuBr*Me ₂ S (0.32 g, 1.56 mmol) 的 THF (40 mL)混合液中。之后， 滴加化合物 H (0.95 g， 5.2 mmol)的 THF (27 mL) 溶液。 搅拌 2小时后用饱和的 N¾C1水溶液 （50 mL) 淬灭反应。 EtOAc(40 mLx2)萃取水相，有机相合并干燥，旋蒸浓缩后� ��层析纯化（EtOAc/ 己垸 =1/100)， 得黄色油状液体化合物0。

将化合物 G的 THF (60 mL) 溶液冷却至 -78°C， 加入高碘化物 （2.5 g， 7.3 mmol) 以及 TBAF溶液 （1 M在 THF中， 7.3 mL， 7.3 mmoD o 反应溶液 在 -40°C搅拌 4小时后用饱和的 N¾C1水溶液（50 mL)淬灭。 EtOAc(40 mLx2) 萃取水相， 有机相合并干燥， 旋蒸浓缩后柱层析纯化（EtOAc/己垸 =1/20)， 得 到无色油状液体 1.01 g， 两歩产率为 58%。

IR (纯的， cm ): 3283, 2960, 2174, 1750, 1727, 1434, 1250, 1220, 1135, 844, 760, 641; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 3.78 (s, 3H), 2.85 (td, J = 14.2, 5.9 Hz, 1H), 2.55 (s, 1H), 2.52 - 2.41 (m, 4H), 1.83 (q, J = 6.1, 5.2 Hz, 2H), 1.74 (ddd, J =

13.8, 6.0, 4.1 Hz, 1H), 1.64 (td, J = 13.7, 4.5 Hz, 1H), 1.06 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.14 (s, 9H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC1 ₃ ) δ 201.6, 168.8, 106.9, 85.2, 80.0,

75.9, 60.2, 55.3, 53.2, 40.2, 36.5, 34.4, 31.1, 27.5, 22.1, 20.3, 0.3; HRMS-ESI + H^计算值: 333.1880； 实测值： 333.1883。

在 -40°C下， 将 LiAl¾ (0.49 g， 12.9 mmol) 加入到化合物 F ( 1.07 g， 3.2 mmol) 的 THF (30 mL) 溶液中。 在室温下搅拌 4小时后用饱和的酒石酸 钾钠水溶液 （20 mL) 淬灭反应。 EtOAc (20 mLx3 ) 萃取水相， 有机相合并 干燥， 旋蒸浓缩后柱层析纯化（EtOAc/己垸 =1/3 )， 得到无色油状液体 0.86 g， 产率为 87%。

IR (纯的， cm- ¹ ): 2958, 2920, 2851, 1261, 1249, 1034, 841, 796, 668; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.14 (dd, J = 11.4, 5.8 Hz, 1H), 3.80 (dt, J = 11.4, 4.5 Hz, 1H): 3.58 (dd, J = 11.3, 7.0 Hz, 1H), 3.02 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 2.70 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 2.54 (ddd, J = 16.3, 10.2, 5.7 Hz, 1H), 2.39 (ddd, J = 16.7, 10.4, 6.0 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 1.93 - 1.83 (m, 1H), 1.81 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 1.75 - 1.65 (m, 1H), 1.59 (ddd, J = 11.8, 6.0, 3.0 Hz, 1H), 1.48 (dt, J = 13.9, 3.4 Hz, 1H), 1.39 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 1.32 (td, J = 13.8, 4.1 Hz, 1H), 0.93 (s, 3H), 0.79 (s, 3H), 0.16 (s, 9H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 107.3, 87.0, 84.8, 79.2, 72.7, 61.5, 52.4, 49.0, 39.4, 34.1, 32.6, 27.5, 26.8, 22.9, 22.3, 0.3; HRMS-ESI C ₁₈ H ₃₀ NaO ₂ Si [M + Na+]计算 值： 329.1907； 实测值： 329.1903 ο

室温下，将 KOH (0.76 g， 13.5 mmol)加入到化合物 E (0.84 g， 2.7 mmol) 的 THF/MeOH/¾0 ( 20 mL/10 mL/2 mL )溶液中。 反应体系回流 6小时后冷 却至 0°C， 用饱和^¾ 1水溶液 （20 mL) 淬灭反应。 EtOAc ( 15 mLx2) 萃 取水相， 有机相合并干燥， 旋蒸浓缩后柱层析纯化 （EtOAc/己垸 =1/3 )， 得到 无色油状液体 0. 6 g， 产率为 95%。

IR (纯的， cm- ¹ ): 3299, 2954, 2878, 2115, 1631, 1464, 1434, 1379, 1056, 998, 634; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.14 (dd, J = 11.5, 5.9 Hz, 1H), 3.81 (dt, J = 11.3, 4.4 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 11.4, 7.0 Hz, 1H), 2.97 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 2.51 (dddd, J = 13.1, 10.5, 5.7, 2.6 Hz, 1H), 2.41 - 2.31 (m, 1H), 2.36 (s, 1H), 1.99 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.93 - 1.79 (m, 2H), 1.76 - 1.60 (m, 2H), 1.49 (dt, J = 13.8, 3.5 Hz, 1H), 1.39 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 1.33 (td, J = 13.7, 4.0 Hz, 1H), 0.93 (s, 3H), 0.80 (s, 3H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 87.0, 84.5, 79.2, 72.7, 68.6, 61.5, 52.5, 49.0, 39.4, 34.1, 32.5, 27.6, 26.8, 22.2, 21.5; HRMS-ESI d t^C M + H^计算值： 235.1693 ; 实测值： 235.1695。 化合物 C的合成:

51 % (2步骤） '

室温下， 向化合物 D (0.34 g， 1.45 mmol) 的 DCM ( 14 mL) 溶液中分 别加入 TEMPO (2,2,6,6-四甲基 -1-呱啶氧自由基）（0.16 g， 1.03 mmol)和 BAIB (二乙酸碘苯 X0.56 g， 1.74 mmol)。反应体系搅拌 12小时后用饱和的 Na ₂ S ₂ 0 ₃ 水溶液 （10 mL) 淬灭。 DCM (8 mLx2) 萃取水相， 有机相合并干燥， 旋蒸 浓缩后柱层析纯化 （EtOAc/己垸 =1/8)， 得到无色油状液体。

将上述产物溶于 iBuOH (8 mL) 和磷酸缓冲溶液 （pH=6.8， 8 mL) 中， 室温下加入 NaClO ₂ ( 1.05 g, 11.6 mmol)和 90%的异丁烯（4.3 mL, 36.3 mmol)。 反应体系搅拌 15小时后用 EtOAc (6 mLx3 )萃取水相。 有机相合并干燥， 旋 蒸浓缩后柱层析纯化（EtOAc/己垸 =1/2)， 得到黄色固体 0.185 g， 两歩总产率 为 51%。

IR (纯的， cm- ¹ ): 3297, 2962, 2870, 2118, 1709, 1460, 1392, 1370, 1264, 1229 1071, 932, 640; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 7.52 (br.s, 1H), 3.70 (dd, J = 11.9, 4.4 Hz, 1H), 2.49 (br, 1H), 2.37 (s, 1H), 2.43 - 2.30 (m, 2H), 2.03 - 1.92 (m, 1H), 1.97 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 1.89 - 1.80 (m, 1H), 1.76 (ddt, J = 14.9, 9.8, 5.4 Hz, 1H), 1.50 (dt, J = 13.7, 3.7 Hz, 1H), 1.42 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 1.34 (td, J = 13.6, 4.0 Hz, 1H), 0.96 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 174.6, 84.5, 83.9, 77.3, 72.3, 68.6, 53.8, 51.1, 39.3, 34.6, 31.6, 27.6, 27.6, 21.3, 20.7; HRMS-ESI C ₁₅ H ₂₁ 0 ₃ + 计算值: 249.1485； 实测值： 249.1488。

室温下， 向化合物 C ( 74.5 mg, 0.3 mmol) 的 DCM (6 mL) 溶液中分别 加入加入 (IPr)AuCl ( 18.6 mg, 0.03 mmol) , 苄醇（93 0.9 mmol)和 A _g SbF ₆ ( 10.3 mg, 0.03 mmoD o 反应体系室温下搅拌 1小时后旋蒸浓缩， 经柱层析纯 化 （EtOAc/己垸 =1/10)， 得到白色固体 58 mg, 产率为 54%。

IR (纯的， cm- ¹ ): 3486, 2949, 2869, 1778, 1455, 1357, 1144, 1086, 967, 740, 698; ^J H NMR (500 MHz, CDC") δ 7.35 (q, J = 6.4, 5.9 Hz, 5H), 5.19 (s, 1H), 4.93 (d, J = 10.7 Hz, 2H), 4.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.60 - 3.53 (m, 1H), 2.95 (s, 1H), 2.30 (ddt, J = 13.8, 11.3, 2.5 Hz, 1H), 2.19 (td, J = 14.9, 13.3, 6.4 Hz, 1H), 2.07 (tdd, J = 14.2, 11.5, 3.1 Hz, 1H), 1.85 - 1.73 (m, 1H), 1.73 - 1.66 (m, 1H), 1.63 - 1.52 (m, 2H), 1.30 (ddd, J = 26.8, 13.7, 4.2 Hz, 2H), 1.17 (s, 3H), 0.90 (s, 3H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 175.6, 143.5, 135.7, 128.8, 128.5, 128.4, 114.0, 103.9, 77.8, 71.1, 60.8, 55.0, 44.6, 39.5, 32.9, 32.5, 27.0, 26.3, 21.9, 20.6; HRMS-ESI C ₂₂ H ₂₉ 0 ₄ [M + ίί]计算值： 357.2060； 实测值： 357.2066。

在 -78°C下， 将钠 (23 mg, 1 mmol)加入到液氨 (3 mL) 中， 并搅拌 0.2 小时。 之后滴加入化合物 B ( 18 mg， 0.05 mmol) 的 THF (2.4 mL) 溶液。 反 应体系搅拌 0.6小时后用饱和的 N¾C1水溶液（2 mL)淬灭。 EtOAc (2 mLx2) 萃取水相， 有机相合并干燥， 旋蒸浓缩后得到粗产物。

将上述出粗产物溶于 MeOH (2.5 mL) 中， 室温下加入 5 M的 HC1水溶 液至反应体系 pH=2。 反应液在 50°C搅拌 3小时后用饱和的 NaHC0 ₃ 水溶液 (2 mL) 淬灭。 用 EtOAc (3 mLx3 ) 萃取水相， 有机相合并干燥， 旋蒸浓缩 后柱层析纯化（EtOAc/己垸 =1/6)， 得到白色固体 57 mg， 两歩总产率为 71%。

IR (纯的， cm" ¹ ): 3428, 2958, 2928, 2854, 1765, 1746, 1382, 1261, 1161, 1055, 802; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.79 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 4.77 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 4.57 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 3.62 - 3.55 (m, 1H), 3.16 (dt, J= 8.7, 2.3 Hz, 1H), 2.43 - 2.34 (m, 1H), 2.30 (ddt, J = 14.5, 11.4, 2.7 Hz, 1H), 2.19 (dtd, J = 13.5, 11.7, 11.1, 2.5 Hz, 1H), 1.77 (ddt, J = 16.5, 11.3, 5.6 Hz, 1H), 1.65 - 1.52 (m, 3H), 1.34 (dd, J = 13.0, 4.5 Hz, 2H), 1.16 (s, 3H), 0.91 (s, 3H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 177.7, 147.0, 112.1, 79.3, 71.6, 54.9, 53.4, 45.4, 40.0, 33.0, 32.7, 28.5, 27.0, 22.0, 20.9; HRMS-ESI C ₁₅ H ₂₃ 0 ₃ [M + ίί]计算值： 251.1642； 实测值： 251.1648。

在 -78°C下，将 NaHMDS (双 (三甲硅基)氨基钠）（2 M在 THF中， 33 μ , 0.066 mmol) 滴加到化合物 A ( ll mg, 0.044 mmol) 的 THF (2 mL) 中。 在 0°C搅拌 0.5小时， 加入二硫化碳 （8 μ , 0.132 mmol)。 再在室温下搅拌 1 小时后加入 Mel ( 19 L， 0.308 mmol)。 反应液搅拌 2小时后用饱和的 N¾C1 水溶液 （2 mL) 淬灭。 用 EtOAc (3 mLx2) 萃取水相， 有机相合并干燥， 旋 蒸浓缩后柱层析纯化 （EtOAc/己垸 =1/30)， 得到油状物。

将上述油状物溶于甲苯 （2 mL)， 室温下加入《Bu ₃ SnH (23 μ , 0.088 mmoD o 混合物加热到 110°C后加入 AIBN (偶氮二异丁腈） （2 mg)。 反应体 系搅拌 1小时后冷却至室温， 旋蒸浓缩后柱层析纯化（EtOAc/己垸 =1/30)， 得 到 8 mg天然产物安卓幸 (antrocin), 两歩产率为 78%。

IR (纯的， cm ): 2934, 2854, 1768, 1457, 1375, 1368, 1190, 1121, 1055, 894; ^J H NMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 4.84 (s, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.48 (dd, J = 9.5, 6.8 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 9.5, 1.5 Hz, 1H), 2.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 2.42 - 2.31 (m, 1H), 2.25 (ddd, J = 14.3, 8.6, 5.5 Hz, 1H), 2.20 - 2.11 (m, 1H), 1.80 (dddd, J = 13.6, 10.7, 6.8, 3.5 Hz, 2H), 1.61 - 1.50 (m, 2H), 1.48 (dq, J = 14.0, 3.3 Hz, 1H), 1.44 - 1.32 (m, 2H), 1.23 (dd, J = 13.6, 3.3 Hz, 2H), 1.19 (s, 3H), 0.94 (s, 3H); ¹³ C NMR (126 MHz, CDC") δ 178.3, 146.8, 111.2, 69.4, 54.3, 48.5, 46.8, 42.1, 37.0, 33.3, 33.2, 30.4, 22.4, 22.2, 18.8; HRMS-ESI C ₁₅ H ₂₃ 0 ₂ [M + ίί]计算值： 235.1693； 实 测值： 235.1699。 实施例 2

安卓幸生物活性分析

(Α) 活化冷冻细胞 冷冻细胞的活化原则为快速解冻， 以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤 害， 导致细胞死亡。 细胞活化后， 约需数日， 或继代一至二代， 其细胞生长 或特性表现才会恢复正常 （例如产生单株抗体或是其它蛋白质） 。 冷冻的细 胞快速解冻的方法为：将冷冻管由液氮或干冰 容器中取出，立即放入 37 °C水 槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在 3分钟内全部融化， 以 70% 酒精擦拭保存 管的外部， 移入无菌操作台内。 取出解冻的细胞悬浮液， 缓缓加入有培养基 的培养容器内 （稀释比例为 1 :10-1 :15) ， 混合均匀， 放入 C0 ₂ 培养箱培养。 在解冻培养后隔日更换培养基。

(B) 人类肺癌细胞的培养

人类肺癌细胞株 （CLl-0、 CLl-5、 H1975、 H441、 PC9、 Α549) 及人类 支气管上皮细胞 （BEAS-2B) 皆来自台北医学大学临床医学研究所， 以含有 10%胎牛血清、 2 mM谷酰胺， 10( _g /ml链霉素和 100 U/ml青霉素的 DMEM 培养基 （Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 中 RPMI基础培养基维持生长 并培养于 5% C0 ₂ 的湿式培养箱中。

(C) 肺癌细胞药物处理

所有实验的肺癌细胞皆培养于含 10%胎牛血清的培养液中， 待细胞长到 约八成满时， 将旧培养液抽干并以 PBS缓冲液 （磷酸盐缓冲液） 溶液清洗细 胞后， 加入 10毫升不含血清的培养液。 依实验目的不同加入不同的药物， 于 37 °C恒温培养箱中进行反应。

(D) 细胞毒性实验

将人类肺癌细胞株 （CLl-0、 CLl-5、 H1975、 H441、 PC9、 Α549) 及人 类支气管上皮细胞 （BEAS-2B) 放置于 96孔培养板 （2000细胞 /孔） ， 以及 将其隔夜培养于 ΙΟΟ μΙ的完全 DMEM中。 将 50 μΐ包含安卓幸 （0.5-10 μΜ) 的完全 DMEM等量样品加入培养盘的不同孔中。另外，� �制组则只加入 100 μΐ 的完全 DMEM。 于培养 2天之后， 以磺酰罗丹明 B (sulforhodamine B) (蛋 白质结合染剂）分析测定每孔中的细胞数目。 简单地说， 固定细胞于 10% 三 氯醋酸中， 以 0.4 %磺酰罗丹明 B将其染色。 染色 20分钟后再以 1 %乙酸清 洗， 之后， 将与细胞结合的磺酰罗丹明 B溶解于 10 mM的 Tris base中。 以微 量滴定盘检测器 （microtiter plate reader) 在 562 nm下测定光密度。 上述方法 亦用来测试 CLl-0、 CLl-5、 H1975、 H441、 PC9、 Α549及 BEAS-2B细胞株 等细胞对安卓幸的敏感性。

(E) 细胞凋亡检测：

恶性肺癌细胞 （H441 ) 经安卓幸处理后， 以胰蛋白-乙二胺四乙酸 (trypsin-EDTA)处理细胞，与培养液一起收集，离� ��后去掉上清液，并以 4 °C 磷酸盐缓冲液清洗后， 加入 1毫升冰冷的 75% 酒精， 放入 4°C冰箱过夜， 以 固定细胞。离心后，续以 1毫升 PBS悬浮，加入适量的核糖核酸 A(RNase A)， 于 37°C作用 30分钟，最后加入 40mg/ml的碘化丙啶（PI, Sigma Chemical Co. , cat. No P-4170 ) 避光作用半小时， 以 35mm尼龙网过滤后， 以 495nm波长激 发后， 于 637nm波长侦测细胞荧光含量， 以流式细胞仪进行分析。

(F) 生物发光成像 ( Bioluminescence imaging, BLI)

H441 肺癌干细胞将先利用转基因方式加入萤火虫冷 光基因 （firefly luciferase)， 再利用 FACS方法分离出肺癌细胞（这些肺癌细胞就具� �萤火虫 冷光基因） 然后植入免疫缺陷小鼠皮下或是由尾静脉进入 循环系统。 本实施 例利用 IVIS造影系统 （IVIS® Imaging System 200 Series, Xenogen) 进行生 物发光成像， 首先老鼠以腹腔注射 150 mg/kg D-luciferin， 10分钟后将老鼠固 定于仪器暗箱中进行造影， 由 IVIS200系统高灵敏度的 CCD照相机测试由具 有萤火虫冷光基因的肺癌细胞所释放出的冷光 ， 造影时间从 120秒开始， 并 依据防止讯号强度饱和而缩短时间，本实验中 老鼠全程以气体麻醉（2% 异氟 垸与 98%氧） 。 冷光的讯号强度可以利用 IVIS200分析软件做肿瘤大小和讯 号强弱的比较和分析。 之后利用此生物发光成像系统评估安卓幸对人 类肺癌 细胞的抑制效果。 安卓幸有效抑制人类非小细胞肺癌生长

先前研究已证实天然型态的安卓幸具有抑制乳 癌细胞增生的功效（Rao et al., 2011 ) 。 本研究进一歩以合成的安卓幸探讨其对于非小 细胞肺癌细胞株生 长的影响。 图 4A显示， 合成的安卓幸对于数株非小细胞肺癌细胞 （NSCLC) 的生长具有不同程度的抑制效应， 其中更以 H1975及 H441的抑制效应最佳。 虽然合成的安卓幸具有显着的抑制癌细胞增生 的能力， 但更重要的是， 在相 同的处理剂量下， 合成的安卓幸对于人类正常支气管上皮细胞却 不具有显着 的毒性效应。

我们进一歩以 H1975及 H441为目标探讨合成的安卓幸抑制细胞增生的 功效是否与诱导细胞倾向凋亡有关。 如图 4B所示， 细胞以安卓幸处理 48小 时后显着增加早期及晚期细胞的比例并呈现剂 量效应。 结果显示合成的安卓 幸具有诱导 NSCLC走向细胞凋亡的功效。 安卓幸抑制 H441细胞炎症相关基因的表达

在确定了安卓幸的抗癌机制后， 进一歩探讨安卓幸对于癌细胞的基因水 平的影响。预先以 5 μΜ安卓幸培养 H441细胞 12小时后，再分析安卓幸对于 基因转录反应的影响。 以 GeneSprmg软件分析经安卓幸处理后能呈现 3.5倍 以上的表达抑制效应为主要的目标基因并以树 形图呈现， 并利用 STRING9.0 分析软件预测安卓幸影响 H441细胞之讯息传递路径及可能抑制标靶（图 5)， 结果显示具有 100个以上的基因明显因安卓幸的处理而影响其 表现。 这些基 因对于细胞的增生、 炎症反应、 转移、 侵入、 血管增生以及细胞周期的调控 皆扮演重要的角色。 表 1 归纳出因安卓幸的处理而显着降低表达的基因 群。 有趣的是我们发现上述基因皆与转录因子 NF-kB有关， 如细胞激素 （IFI44、 IFIT1及 MX1 ) 、 炎症反应 （NFkBl及 IFIT2) 、 干细胞特性 （CTN BL1、 SENP2、 CEACAM1及 POU5F2)以及抗药性反应（ ABCB5、 ABCG2及 XAF1 ) 等。 根据以上微阵列 （nncroarmy) 的结果， 本实施例将特别针对炎症相关因 子、 干细胞特性以及抗药性相关分子的表达作更深 入的探讨。 安卓幸经由活化半胱天冬酶 -3及抑制 XIAP、 NF-kB-p65及细胞周期素 D1的 表达而抑制细胞增生。

安卓幸具有抑制高度转移能力的 H441细胞的增生功效，随着安卓幸的剂 量升高能显着诱发半胱天冬酶 -3的活化而凋亡（图 6) 。 此外， 安卓幸对于炎 症反应相关分子， 包涵 XIAP、 NF-kB-p65及细胞周期素 D1的表达方面亦同 样呈现剂量的抑制效应。 安卓幸显著抑制肿瘤生长的活体试验

本实施例进一歩探讨安卓幸在活体是否同样具 有抗癌功效。 以萤火虫冷 光及绿荧光蛋白双重载体转染标定的 H441-L2G细胞经由尾静脉注射的方式 (6 Χ 10 ⁵ /100 μΐ PBS) 打入非肥胖型糖尿病 /重度联合免疫缺陷 （NOD/SCID) 的小鼠中， 再以每日腹腔注射的方式施予安卓幸 （共两组， 分别为低剂量 5 mg/kg/天及高剂量 10 mg/kg/天） 持续四周并观察肿瘤生长状况。 结果显示在 投予低剂量 5 mg/kg/天安卓幸达两周后能抑制半数的实验动物 的肿瘤的生长， 而第三周时大多数的动物才被侦测到有肿瘤的 存在（图 7A， 7B) ， 另外安卓 幸处理组与控制组间的体重并无显着性的差异 （图 7C) 。

在存活率方面， 控制组的存活时间中位数为 28天， 而安卓幸处理组则可 达到 50天以上。 其中低剂量 5 mg/kg/天安卓幸处理组有 75% 的动物生存超 过 50天，而且在实验终止时（第 50天）至少增加 60% 的存活时间中位数（图 7D) 。 虽然本发明已以较佳实施例揭露如上， 但其并非用以限定本发明。 本领 域的普通技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围内， 所作的改变或修饰， 均属本发明的保护范围。