Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie, eine wässrige Färbelösung zur Verwendung in dem Verfahren, sowie die Verwendung der wässrigen Färbelösung zum Anfärben von Zellproben. Färbemethoden für die Anfärbung von Zellpräparaten werden seit Langem in der Mikroskopie eingesetzt, um tierische oder pflanzliche Zell- und Gewebebestandteile sichtbar zu machen und eine Identifizierung und Differenzierung derartiger Gewebe zu ermöglichen. Färbemethoden finden weite Verbreitung un- ter anderem, in der Histologie, Zytologie und Mikrobiologie.

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) ist eine Standardfärbemethode für die Anfärbung von Zellpräparaten für die Mikroskopie. Sie dient der Unterscheidung verschiedener Gewe- bestrukturen im mikroskopischen Bild anhand von zwei verschiedenen Einzelfärbungen und ist eine der am weitesten verbreiteten Routinefärbemethoden für morphologische Untersuchungen. Mit Hilfe der HE-Färbung können krankhafte Veränderungen in Biopsien und Operationspräparaten untersucht wer- den.

Die HE-Färbung spielt u.a. in der Diagnostik zur Krebsfrüherkennung eine wichtige Rolle, beispielsweise zur Früherkennung von Mundhöhlenkarzinomen oder Zervixkarzinomen .

Bei der HE-Färbung werden die Zellproben nach Fixierung auf einem Objektträger zunächst mit Hämatoxylin gefärbt (Ii- Färbung) . Hämatoxylin färbt alle sauren beziehungsweise ba ^¬ sophilen Strukturen blau, insbesondere Zellkerne mit der dar- in enthaltenen Desoxyribonukleinsäure (DNA) und das mit Ribo- somen angereicherte raue endoplasmatische Retikulum (rER) . Nach der H-Färbung erscheinen die Zellkerne zunächst rötlichbraun aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des pH-Wertes schlägt der Farbton in das typische Blauviolett um (Bläuen) ; dies wird mittels Spülen in Süßwas ^¬ ser mit neutralem pH-Wert z.B. Leitungswasser bewirkt.

Anschließend folgt die Eosin-Färbung (E-Färbung) mit einer Eosin-Lösung. Eosin färbt alle acidophilen beziehungsweise basischen (eosinophilen) Strukturen rot, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst. Es wird Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B verwendet.

Durch weitere Spülschritte über Alkohollösungen in aufstei ^¬ gender Konzentration bis zu absolutem Alkohol wird das Wasser aus dem Gewebeschnitt verdrängt. Schließlich wird der entwäs ^¬ serte Schnitt in einem organischen Lösungsmittel wie bei ^¬ spielsweise Xylol geklärt.

Ein Standardprotokoll zur Durchführung der HE-Färbung umfasst folgende Schritte:

(1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1-2 Spraystöße eines alkoholischen Fixiersprays

(2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) 1-2 min

(3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser

(4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser

(5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem oder demineralisier- tem Wasser

(6) Eosin-Färbung (E-Färbung) 2-3 min

(7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol

(8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol

(9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol

(10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol

(11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol Die Gesamtdauer des Verfahrens liegt bei über 45 min und bei der Entfärbung unter laufendem Wasser in Schritt (3) und (4) werden 3 bis 12 Liter Wasser verwendet. Im Stand der Technik sind verschiedene Färbelösungen zur Anwendung bei der HE-Färbung bekannt.

So sind aus Godwin Avwioro, „Histochemical uses of haematoxy- lin - a review", JPCS Vol (1), 2011; und dem Standardverfah- ren (SOP „Standard operating procedure") Rüegg und Meinen,

„Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle secti- ons", SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, in TREAT-NMD / CURE CMD veröffentlicht, HE-Färbelösungen und -verfahren bekannt. Hämatoxylin-Färbung

Zur Hämatoxylin-Färbung wird beispielsweise saures Hämatoxy- lin nach Ehrlich oder saures Hämalaun nach Mayer verwendet.

Hämalaun nach Mayer:

Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Natriumj odat , Kali ^¬ alaun, Chloralhydrat , Salzsäure 0.1 %ig, Ammoniaklösung, Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure.

Hämatoxylin nach Ehrlich:

Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Isopropanol 96%ig, Gly- cerin, Kalialaun, Essigsäure, Natriumj odat , Natriumhydrogencarbonat und Ammoniaklösung

Eosinfärbung

Eosinlösung:

Die Eosin-Lösung wird durch Lösen von Eosin G oder B in destilliertem oder demineralisiertem Wasser hergestellt.

Die aus dem Stand der Technik bekannten Färbeprotokolle haben den Nachteil, dass sie Färbelösungen nutzen, die gifti- ge/gesundheitsgefährdende Stoffe enthalten und mehrere Fi ^¬ xier- und Entwässerungsschritte mit giftigen und brennbaren Alkoholen aufweisen. Durch die vielen verschiedenen durchzu- führenden Schritte sind diese Protokolle zeitlich aufwendig und komplex. Außerdem besteht bei der Durchführung der Färbung a) ein Gesundheitsrisiko für das medizinische Personal durch die verwendeten gesundheitsgefährdenden Lösungen und b) ein Bedarf für geeignete technische und persönliche Schutz ^¬ vorkehrungen (z.B. Abzug, Chemikalienlager, Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille) .

Um die Nutzung mikroskopischer Diagnostikverfahren, z.B. zur Krebsfrüherkennung, auch für weniger gut geschultes medizinisches Personal in einer schlecht ausgestatteten Umgebung, beispielsweise in entlegenen Gebieten, die über eine schlechte medizinische Infrastruktur verfügen, nutzbar zu machen, sind einfache Protokolle notwendig, die durch Vermeidung ge- fährlicher Chemikalien ein geringes Gefährdungspotential für die Anwender besitzen, keine Entsorgungsprobleme auslösen und darüber hinaus weniger zeitaufwendig und komplex sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben zu Verfügung zu stellen, durch das Zellproben schnell und ohne Verwendung von gefährlichen oder gesundheitsgefährdeten Stoffen angefärbt werden können .

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben gemäß Patentanspruch 1 und die Verwendung einer Färbe lösung gemäß Patentanspruch 12 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie umfasst die folgenden Schritte:

(a) Aufbringen der Zellprobe auf ein Trägermaterial

(b) Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelö ^¬ sung;

(c) Entfärben der Zellprobe;

(d) Färben der Zellprobe mittels einer zweiten Färbelö ^¬ sung; und

(e) Entfärben der Zellprobe; wobei das Verfahren nach dem Verfahrensschritt (e) keine Fi ^¬ xier- und Entwässerungsschritte mit alkoholischen Lösungen aufweist . Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält Hämatoxylin, Natri- umjodat, Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat und Zitronensäu ^¬ re. Die Färbelösung enthält kein Chloralhydrat .

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten zeigen, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die angefärb ^¬ ten Zellproben überraschenderweise auch ohne zusätzliche Ent- wässerungs- und Fixierungsschritte, nach dem zweiten Entfär ^¬ bungsschritt, über einen längeren Zeitraum

stabil bleiben.

Darüber hinaus konnte eine Färbelösung bereitgestellt werden, die ohne den Zusatz von gesundheitsgefährlichem Chloralhydrat auskommt und überraschenderweise eine Färbeleistung entspre ^¬ chend den aus dem Stand der Technik bekannten Färbelösungen aufweist und über einen längeren Zeitraum stabil ist und wie ^¬ derverwendet werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren minimiert Aufwand, Zeit und Gefährdungspotential sowie den Bedarf an technischer und per- sönlicher Schutzausrüstung. Außerdem bereitet das Verfahren keine Entsorgungsprobleme, da keine gesundheitsgefährdenden Inhaltsstoffe verwendet werden. Es ist daher auch von weniger gut geschultem medizinischen Personal anwendbar. Erfindungsgemäßes Verfahren

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mehrere Verfahrens ^¬ schritte deren vorteilhafte Ausgestaltungen im Folgenden in Bezug auf die beigefügte Figur beschrieben sind.

(a) Aufbringen der Zellprobe auf ein Trägermaterial Zunächst wird die zu untersuchende Zellprobe auf ein Träger ^¬ material im Schritt Sl aufgebracht. Als Trägermaterial kommt jegliches für die Mikroskopie geeignete Trägermaterial in Be ^¬ tracht. Dem Fachmann sind derartige Trägermaterialen geläu- fig. Vorzugsweise wird ein transparentes Trägermaterial ver ^¬ wendet .

Bevorzugt wird als Trägermaterial ein Objektträger verwendet. Als Objektträger kann ein beliebiger Objektträger wie er dem Fachmann zur Mikroskopie geläufig ist verwendet werden. Der

Objektträger kann aus einem beliebigen Material bestehen, bevorzugt besteht er aus einem Kunststoff oder Glas, besonders bevorzugt aus Glas. Als Zellprobe kann jede beliebige Zellprobe verwendet werden. Es kann sich um eine bakterielle, pflanzliche, tierische oder humane Zellprobe handeln, bevorzugt um eine humane Zellprobe. Bevorzugt handelt es sich um eine Zellprobe der Mundschleim ^¬ haut, der Schleimhaut der Cervix uteri oder der Schleimhaut der Vulva, besonders bevorzugt um eine Probe der Mundschleim ^¬ haut, insbesondere der Plattenepithelzellen der Mundschleimhaut .

Bevorzugt enthält die Zellprobe Karzinomzellen.

Die Zellprobe kann mit jedem dem Fachmann geläufigen Verfahren gewonnen werden, bevorzugt mittels Bürstenbiopsie .

Die Zellprobe wird beispielsweise durch Abstreichen der Probe auf dem Trägermaterial auf dieses aufgebracht.

Die Fixierung der Zellprobe auf dem Trägermaterial erfolgt durch Trocknen der Zellprobe. Die Dauer der Trocknung beträgt vorzugsweise 0,5 - 10 min, besonders bevorzugt 1 - 5 min, ganz besonders bevorzugt 1,5 - 2,5 min, insbesondere 2 min. Die Trocknung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 °C - 30°C, besonders bevorzugt 15 °C - 25 °C, ganz besonders bevorzugt 22°C. Bevorzugt erfolgt eine zusätzliche Fixierung der zu untersu ^¬ chenden Zellen auf dem Objektträger mittels handelsüblicher Fixierlösungen. Bevorzugt wird eine alkoholische Fixierlö ^¬ sung verwendet, besonders bevorzugt eine Fixierlösung enthal ^¬ ten Ethanol. Beispielsweise kann die Fixierung mittels 1-2 Spraystößen des Merckofix® Fixationssprays der Firma Merck, Darmstadt, Deutschland erfolgen.

(b) Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelösung; Die in Schritt (Sl) auf dem Trägermaterial aufgebrachte Zell ^¬ probe wird nun im Schritt 2 mittels einer ersten Färbelösung angefärbt. Zum Färben kann jede dem Fachmann bekannte, handelsübliche Färbelösung zum Anfärben von Zellen verwendet werden. Bevorzugt wird eine wässrige Lösung enthaltend Häma- toxylin verwendet, wie sie der Fachmann bei der HE-Färbung üblicherweise verwendet und sie im Stand der Technik be ^¬ schrieben ist, besonders bevorzugt enthält die Hämatoxylin- Lösung kein Chloralhydrat , ganz besonders bevorzugt wird eine erfindungsgemäße wässrige Färbelösung verwendet, wie sie in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist.

Die Färbung erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen des Objekt ^¬ trägers in die Färbelösung. Vorzugsweise wird der Objektträger 0,2 - 5 min, besonders be ^¬ vorzugt 0,5 - 2,5 min, ganz besonders bevorzugt 0,75 - 2 min, insbesondere 1 min in die erste Färbelösung eingetaucht.

(c) Erstes Entfärben der Zellprobe

Nach dem Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelösung erfolgt im Schritt S3 ein erstes Entfärben der im

Schritt S2 angefärbten Zellen. Das Entfärben erfolgt mittels Wasser, bevorzugt nicht durch das Spülen mit fließendem Wasser, besonders bevorzugt durch Eintauchen des Trägermaterials in ein Gefäß mit Wasser.

Zum Entfärben kann jegliches Süsswasser mit einem pH-Wert im neutralen Bereich verwendet werden, bevorzugt wird Leitungs ^¬ wasser verwendet. Sollte das Entfärben mittels Wasser nicht ausreichend sein, kann optional auch mit einer wässrigen Natriumhydrogencarbo ^¬ natlösung entfärbt werden.

Als wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung wird eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat in Wasser verwendet, bevorzugt eine Lösung mit 0,01 - 1 Gew.% Natriumhydrogencarbonat, be ^¬ sonders bevorzugt mit 0,05 - 0,5 Gew.%, ganz besonders bevor ^¬ zugt mit 0,075 - 0,25 Gew.%, insbesondere mit 0,1 Gew.%

Natriumhydrogencarbonat, bezogen auf das Gesamtgewicht der Natriumhydrogencarbonatlösung .

Vorzugsweise erfolgt das Entfärben über einen Zeitraum von 1 Sekunde (sec.) - 5 min, besonders bevorzugt 10 sec. - 2,5 min., ganz besonders bevorzugt 20 sec. - 1 min., insbesondere 30 sec.

Bevorzugt werden zum Entfärben 100 - 2000 ml Wasser verwendet, besonders bevorzugt 200 - 1000 ml, ganz besonders bevor ^¬ zugt 250 - 750 ml, insbesondere 500 ml.

(d) Färben der Zellprobe mittels einer zweiten Färbelösung

Die in Schritt S3 entfärbte Zellprobe wird im Schritt S4 mit ^¬ tels einer zweiten Färbelösung angefärbt. Zum Färben kann je- de dem Fachmann bekannte, handelsübliche Färbelösung zum Anfärben von Zellen verwendet werden. Bevorzugt wird eine wäss ^¬ rige Lösung enthaltend Eosin verwendet, wie sie der Fachmann bei der HE-Färbung üblicherweise verwendet, besonders bevor- zugt eine Eosin-Lösung enthaltend 0.05 - 1 g Eosin, ganz be ^¬ sonders bevorzugt 0.1 - 0.5 g Eosin, insbesondere 0.3 g Eosin in 100 ml Wasser. Es wird Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B verwendet, bevorzugt Eosin G.

Bevorzugt wird für die Eosin-Lösung destilliertes oder demi- neralisiertes Wasser verwendet.

Bevorzugt kann der Eosin-Lösung Glycerin zugesetzt werden, besonders bevorzugt werden pro 100 ml Wasser 1 - 25 ml Wasser durch Glycerin ersetzt, ganz besonders bevorzugt 5 - 20 ml, insbesondere 10 - 15 ml, insbesondere bevorzugt 13 ml.

Bevorzugt werden der Eosin-Lösung pro 100ml Gesamtvolumen 0,01 - 1 g Natriumchlorid zugegeben, besonders bevorzugt 0,05 - 0,5 g, ganz besonders bevorzugt 0,1 g. Die Färbung erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen des Objekt ^¬ trägers in die zweite Färbelösung.

Vorzugsweise wird der Objektträger 0,2 - 5 min, besonders be ^¬ vorzugt 0,5 - 2,5 min, ganz besonders bevorzugt 0,75 - 2 min, insbesondere 1 min in die zweite Färbelösung eingetaucht.

(e) Zweites Entfärben der Zellprobe

Nach dem Färben der Zellprobe in Schritt (S4) mittels einer zweiten Färbelösung erfolgt im Schritt S5 ein zweites Entfärben der Zellprobe.

Das Entfärben erfolgt mittels Wasser, bevorzugt nicht durch das Spülen mit fließendem Wasser, besonders bevorzugt durch Eintauchen des Trägermaterials in ein Gefäß mit Wasser. Zum Entfärben kann jegliches Süsswasser mit einem pH-Wert im neutralen Bereich verwendet werden, bevorzugt wird jedoch Leitungswasser verwendet. Vorzugsweise erfolgt das Entfärben über einen Zeitraum von 1 sec. - 5 min, besonders bevorzugt 10 sec. - 2,5 min., ganz besonders bevorzugt 20 sec. - 1 min., insbesondere 30 sec.

Bevorzugt werden zum Entfärben 100 - 2000 ml Wasser verwen- det, besonders bevorzugt 200 - 1000 ml, ganz besonders bevor ^¬ zugt 250 - 750 ml, insbesondere 500 ml.

Zum Entfärben kann das bereits in Verfahrensschritt S3 ver ^¬ wendete Wasser nochmals verwendet werden.

Bevorzugt weist das erfindungsgemäße Verfahren nach dem Ver ^¬ fahrensschritt S5 keine Fixier- und Entwässerungsschritte mit alkoholischen Lösungen auf, besonders bevorzugt weist das er ^¬ findungsgemäße Verfahren nach dem Verfahrensschritt S5 keine Fixier- und Entwässerungsschritte auf, ganz besonders bevor ^¬ zugt weist das erfindungsgemäße Verfahren nach dem Verfah ^¬ rensschritt S5 keinerlei weiteren Verfahrensschritte mehr auf und ist beendet. Überraschenderweise sind die durch das erfindungsgemäße Ver ^¬ fahren gefärbten Zellproben auch ohne zusätzliche Entwässe- rungs- und Fixierungsschritte, über einen längeren Zeitraum stabil. So bleiben die Zellen auch bei höheren Temperaturen um die 40 °C über einen Zeitraum von über zwei Wochen stabil.

Erfindungsgemäßes Färbelösung

Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält Hämatoxylin, Natri- umjodat, Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat und Zitronensäu ^¬ re. Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält kein Chloral- hydrat . Bevorzugt enthält die Färbelösung keine weiteren Komponenten als Hämatoxylin, Natriumj odat , Kaliumaluminiumsulfat- dodecahydrat und Zitronensäure. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Färbelösung durch Lösen der Komponenten in Wasser, besonders bevorzugt in destilliertem oder demineralisiertem Wasser, hergestellt.

Hämatoxylin wird bevorzugt in einer Menge von 0,01 - 10

Gew.%, besonders bevorzugt 0,01 - 5 Gew.%, insbesondere 0,02 - 2 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,03 - 1 Gew.%, insbesonde ^¬ re besonders bevorzugt 0,05 - 0,5 Gew.%, im speziellen 0,1 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt .

Natriumjodat wird bevorzugt in einer Menge von 0,001 - 2 Gew.%, besonders bevorzugt 0,005 - 1,5 Gew.%, insbesondere 0,01 - 1 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,015 - 0,5 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0,018 - 0,1 Gew.%, im spe- ziellen 0,02 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.

Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat wird bevorzugt in einer Menge von 0,1 - 20 Gew.%, besonders bevorzugt 1 - 10 Gew.%, insbesondere 2 - 8 Gew.%, insbesondere bevorzugt 3 - 7 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 4 - 6 Gew.%, im speziellen 5 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt . Zitronensäure wird bevorzugt in einer Menge von 0,01 - 5 Gew.%, besonders bevorzugt 0,05 - 2,5 Gew.%, insbesondere 0,075 - 1 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,08 - 0,5 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0,1 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.

Die erfindungsgemäße Färbelösung kann zur Anfärbung von Zellproben verwendet werden, beispielsweise zur Diagnose von Kar ^¬ zinomzellen . Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Färbelösung in dem erfin ^¬ dungsgemäßen Verfahren verwendet, besonders bevorzugt als erste Färbelösung.

Die erfindungsgemäße Färbelösung erreicht überraschenderweise auch ohne den Zusatz von Chloralhydrat eine Färbeleistung entsprechend der aus dem Stand der Technik bekannten Färbelö ^¬ sungen und ist über einen längeren Zeitraum stabil und kann wiederverwendet werden.

Beispiele Beispiel 1

Hämatoxylin Lösung

Benötigte Chemikalien :

Hämatoxylin, Natriumj odat , Kaliumaluminiumsulfat- dodecahydrat , Zitronensäure, Eosin

• Stocklösung :

1 g Hämatoxylin wird in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst und es werden 0,2 g Natriumj odat und 50 g Natriumaluminiumsulfat-dodecahydrat zugegeben.

• Gebrauchslösung:

In 100 ml der Stocklösung werden 0.1 g Zitronensäure gelöst.

Beispiel 2

• Eosinlösung:

Es werden 0,3 g Eosin in 87 ml destilliertem Wasser gelöst und anschließend 13 ml Gycerin und 0,1 g NaCl zugesetzt. Beispiel 3

Mittels Bürstenbiopsie gewonnenen Plattenepithelzellen der Mundschleimhaut wurden auf einen Glasobjektträger aufgebracht . Die Zellen wurden durch Antrocknen der Zellen auf dem Objektträger für 2 min bei Raumtemperatur (20 °C) getrocknet. Anschließend wurde eine Hämatoxylin (H) Färbung durch Eintau- chen des Objektträgers für 1 Minute in 300 ml der Gebrauchs ^¬ lösung gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Färbelösung wurde in einem Färbetrog (PMP) der Firma Th. Geyer Gmbh, Renningen, Deutschland (mit den Maßen 80 mm x 100 mm x 70 mm (Breite x Länge x Höhe) vorgelegt. Der Objektträger wurde mittels eines Färbegestells der Firma Th. Geyer Gmbh, mit horizontalem Boden für 20 Objektträger, in die Lösung eingetaucht.

Anschließend erfolgte eine Entfärbung durch Eintauchen des Objektträgers in ein Glasgefäß mit 500 ml Leitungswasser für 30 Sekunden.

Anschließend wurde eine Eosin (E) Färbung durch Eintauchen des Objektträgers für 1 Minute in 300 ml der Eosinlösung ge ^¬ mäß Beispiel 2 durchgeführt. Die Färbelösung wurde in einem Färbetrog (PMP) der Firma Th. Geyer Gmbh, Deutschland (mit den Maßen 80 mm x 100 mm x 70 mm (Breite x Länge x Höhe) vor ^¬ gelegt. Der Objektträger wurde mittels eines Färbegestells der Firma Th. Geyer Gmbh, mit horizontalem Boden für 20 Objektträger, in die Lösung eingetaucht.

Anschließend erfolgte eine zweite Entfärbung durch Eintauchen des Objektträgers für 30 Sekunden in das Glasgefäß mit 500 ml Leitungswasser, welches bereits für die erste Entfärbung verwendet wurde.

Der Vergleich der erfindungsgemäßen Färbelösung gemäß Beispiel 1 mit Hämatoxylin-Färbelösungen aus dem Stand der Technik zeigt, dass die erfindungsgemäße Färbelösung eine Färbe ^¬ leistung entsprechend den aus dem Stand der Technik bekannten Färbelösungen aufweist und über einen längeren Zeitraum stabil ist und wiederverwendet werden kann. Der Vergleich der in Beispiel 3 mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens angefärbten Zellprobe mit einer Zellprobe die nach einem Verfahren gemäß den Stand der Technik angefärbt wurde, zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Zeitaufwand und die Anzahl der Verfahrensschritte deutlich minimiert, und trotzdem zu gefärbten Zellproben führt, die über einen längeren Zeitraum stabil sind.