Procedimiento para el desanclaje/desprotección de compuestos sintetizados por fase sólida

La presente invención está relacionada con un procedimiento mejorado para Ia preparación de compuestos orgánicos por un método en fase sólida sin usar espaciadores bifuncionales ("linkers", i.e. espaciadores que están anclados a una resina). Más particularmente, Ia invención está relacionada con el desanclaje/desprotección de un péptido de un soporte que es una resina funcionalizada.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

Los fármacos peptídicos representan un mercado de aproximadamente 1000 millones de dólares estadounidenses y alrededor del 1% del total de ventas de principios activos farmacéuticos, con un crecimiento anual del 10-15%. En Ia actualidad, hay más de cuarenta péptidos sintéticos en el mercado y más de 500 moléculas peptídicas nuevas se encuentran en desarrollo, con más de 250 en fase clínica.

Los péptidos pueden sintetizarse tanto por métodos químicos como por métodos recombinantes. La síntesis química por fase sólida ha demostrado ser una metodología efectiva para Ia preparación de péptidos, tanto a escala de miligramos para propósitos de investigación como a escala de toneladas para Ia producción de fármacos. Los péptidos de tamaño medio (10-40 aminoácidos) se preparan satisfactoriamente por técnicas de fase sólida. La síntesis en fase sólida también se puede utilizar como un método efectivo para Ia preparación de otras muchas moléculas orgánicas, incluyendo Ia preparación de bibliotecas combinatorias.

Existen dos estrategias de protección principales para Ia síntesis en fase sólida de péptidos, a saber, Boc / Bn y Fmoc / ¹ Bu. Dado que Ia metodología Boc / Bn requiere el uso de condiciones acidolíticas enérgicas para desanclar el péptido final del soporte sólido (habitualmente HF anhidro), Ia estrategia Fmoc / ¹ Bu es Ia más usada con diferencia tanto a escala de laboratorio como a escala de producción. La síntesis Fmoc / ¹ Bu implica condiciones acidolíticas suaves y un tratamiento sencillo con ácido trifluoroacético (TFA, "trifluoroacetic acid"), que es suficiente para eliminar los grupos protectores

de las cadenas laterales de los aminoácidos y obtener el péptido libre en solución. Para alcanzar buenos resultados durante el proceso de desanclaje/desprotección con dichas condiciones acidolíticas, Ia función carboxilo del primer aminoácido del péptido no se ancla directamente al polímero funcionalizado sino a unas moléculas intermedias especiales denominadas espaciadores bifuncionales ("linkers").

Los espaciadores bifuncionales son compuestos bifuncionales que se unen a Ia resina por medio de un enlace estable con uno de los grupos funcionales mientras que el grupo funcional restante sirve para anclar el primer aminoácido del péptido a sintetizar por medio de un enlace (generalmente un enlace éster o un enlace amida) que es lábil a las condiciones de desanclaje/desprotección deseadas. Dependiendo de Ia reactividad de dicho enlace se pueden emplear distintas condiciones de reacción para desanclar/desproteger el péptido de Ia resina tales como Ia acidolisis suave, Ia eliminación por bases o el desplazamiento nucleófilo.

Los espaciadores bifuncionales más comunes son alcoholes bencílicos y aminas bencílicas o bencidrílicas, que permiten obtener los péptidos en forma de ácidos o amidas normalmente con elevado rendimiento y pureza. La estrategia de protección Fmoc / *Bu es generalmente Ia de elección, como se ha dicho anteriormente. Sin embargo, el hecho de que los espaciadores bifuncionales sean caros incrementa considerablemente los costes de producción de los péptidos.

Se conocen varios reactivos de acidolisis basados en el ácido trifluoroacético para escindir péptidos de resinas. Yajima et al. describieron un proceso para Ia desprotección de grupos protectores de tipo bencilo usando una combinación de ácido trifluoroacético, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo, que actúa como un superácido fuerte en Ia desprotección, y tioanisol, que actúa como base blanda en Ia reacción de desprotección (cf. "New strategy for the chemical synthesis of proteins", Tetrahedron 1988. vol. 44, pp. 805-819). El tioanisol también actúa como capturador para reducir las reacciones secundarias y como acelerador de Ia desprotección. Según el mecanismo de reacción descrito en el artículo de Yahima, aparentemente Ia desprotección tiene lugar por medio de un mecanismo de tipo empujar y salir

("push and pulí"). Generalmente, se forma una sal de sulfonio como subproducto principal.

Posteriormente, otros autores han aplicado el método de Yahima para Ia preparación de péptidos por el método de fase sólida. De acuerdo con las enseñanzas de Yahima, el tioanisol se mantiene en las mezclas acidolíticas usadas para el desanclaje/desprotección del péptido de un soporte sólido. Así, Hughes et al. describieron el desanclaje/desprotección de péptidos de una resina metilbencidrilamina (MBHA) usando una combinación de bromotrimetilsilano, tioanisol y ácido trifluoroacético (cf. "Cleavage deprotection of peptides from MBHA-resin with bromotrimethylsilane", Tetrahedron letters 1993, vol. 34, pp. 7713-7716). Patteux et al. también usaron Ia mezcla acidolítica de Yahima compuesta por ácido trifluoroacético, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo y tioanisol para desanclar/desproteger un péptido quinolina anclado a una resina Merrifield por medio de un enlace éter (cf. "SoNd phase synthesis of a redox delivery system with the aim of targeting peptides into the brain", Ora. Biomol. Chem. 2006, vol. 4, pp. 8177- 825).

Desafortunadamente, el uso de bases blandas en los reactivos da lugar a mezclas complejas y conlleva problemas de aislamiento ("work-up") y dificultades en el proceso de purificación posterior. En particular, el tioanisol posee un alto punto de ebullición y presenta un olor muy malo que es difícil de eliminar completamente, especialmente en instalaciones industriales. Además, Ia sal de sulfonio del tioanisol es de difícil eliminación cuando se genera (especialmente en péptidos protegidos con bencilos).

A pesar de las enseñanzas de todos estos documentos del estado de Ia técnica, Ia investigación de nuevos procesos para Ia preparación de péptidos y otros compuestos orgánicos a escala comercial por el método de fase sólida es aún un campo activo, puesto que Ia explotación industrial de los procedimientos conocidos es difícil a escala industrial o presenta costes elevados. Así, es deseable proporcionar nuevos procedimientos de preparación de péptidos u otros compuestos orgánicos en fase sólida.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

Los inventores han encontrado que las resinas de poliestireno tradicionales en Ia síntesis en fase sólida, tales como Ia 4-metilbencidrilamina o el hidroximetilpoliestireno, son inesperadamente lábiles a los alquilsilanos en presencia de un ácido prótico. Este hecho permite Ia síntesis en fase sólida de compuestos sin Ia necesidad de utilizar espaciadores bifuncionales, ya que los compuestos se pueden desanclar/desproteger de manera sencilla de las resinas utilizando alquilsilanos en presencia de un ácido prótico, sin ser necesaria Ia presencia de bases blandas como el tioanisol, reduciéndose así Ia complejidad de los procesos de desanclaje/desprotección, así como de purificación. En particular, Ia ausencia de tioanisol no sólo facilita el procedimiento para aislar el péptido ("work-up") sino que también proporciona un péptido con pureza elevada y rendimiento alto.

Así, un aspecto de Ia presente invención es el proporcionar un procedimiento para Ia preparación de un compuesto orgánico por el método de síntesis en fase sólida, que comprende el desanclaje/desprotección del compuesto directamente unido sin espaciadores bifuncionales a una resina funcionalizada que comprende poliestireno, por tratamiento del compuesto unido a Ia resina con una mezcla reactiva acidolítica que comprende al menos un ácido prótico y un ácido de Lewis, donde dicha mezcla se usa en ausencia de una base de Lewis. Una base de Lewis es un compuesto con un par de electrones disponible, sea no compartido o en un orbital π. ésta actúa como donadora de electrones. Ejemplos de bases de Lewis incluyen sulfuras tal como el tioanisol o el sulfuro de dimetilo; éteres tal como el anisol; fenoles tal como el cresol; aminas, agua o tioles.

Por "resina funcionalizada que comprende poliestireno" se entiende un soporte polimérico adecuado para síntesis en fase sólida que tiene un grupo funcional apropiado, por ejemplo, un copolímero de poliestireno con otros polímeros tales como polietilenglicol o poliacrilamida.

La expresión en "ausencia de base de Lewis" significa que una base de Lewis o bien no está presente en el medio de reacción, o bien está presente en una cantidad insignificante (aprox. 1 %).

Ejemplos de ácidos próticos apropiados incluyen el ácido trifluoroacético, el bromuro de hidrógeno o una mezcla de bromuro de hidrógeno y ácido acético. Un ácido de Lewis es un compuesto capaz de aceptar un par de electrones. Ejemplos de ácidos de Lewis adecuados son los silanos.

En una realización particular, el desanclaje/desprotección se lleva a cabo con una mezcla reactiva acidolítica que comprende ácido trifluoroacético y al menos un compuesto de fórmula (I):

H _n SiR _m X _y (I)

donde: R es un radical seleccionado entre (d-C-O-alquilo y fenilo; X es independientemente seleccionado entre Cl, Br, I y un sulfonato de fórmula -OSO ₂ Ri donde Ri se selecciona entre CF ₃ , (Ci-C ₄ )-alqu¡lo, fenilo y fenilo mono- o disustituido por un radical seleccionado entre (CrC ₄ )-alquilo, Cl, Br y I; n, m e y son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 4, con Ia condición de que n + m + y = 4. Preferiblemente, Ia mezcla reactiva acidolítica comprende de uno a cuatro compuestos diferentes de fórmula (I), más preferentemente, contiene uno o dos compuestos diferentes de fórmula (I).

En otra realización particular, el desanclaje/desprotección se lleva a cabo con Ia mezcla reactiva acidolítica que comprende ácido trifluoroacético, un haluro de hidrógeno y al menos un compuesto de fórmula (I), donde, opcionalmente, el bromuro de hidrógeno y el compuesto de fórmula (I) se generan in situ por reacción de un halógeno con un compuesto de fórmula (II):

H(n+z)S¡R _m X(y-z) (H)

donde R es un radical seleccionado entre (CrC ₄ )-alquilo y fenilo; X se selecciona entre Cl, Br, I y un sulfonato de fórmula -OSO ₂ R ₁ donde Ri se selecciona del grupo que consiste en CF ₃ , (CrC ₄ )-alqu¡lo, fenilo y fenilo mono- o disustituido por un radical seleccionado entre (CrC ₄ )-alquilo, Cl, Br y I; n, m e y son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 4; y z es un entero seleccionado entre 1-4, con Ia condición de que n + m + y = 4 y z ≤ y. Preferiblemente, Ia mezcla reactiva acidolítica comprende entre uno

a cuatro compuestos diferentes de fórmula (I), más preferentemente, contiene uno o dos compuestos diferentes de fórmula (I).

En una realización preferida, el desanclaje/desprotección se lleva a cabo con Ia mezcla reactiva acidolítica que comprende ácido trifluoroacético, bromuro de hidrógeno y bromoetilsilano, siendo el bromuro de hidrógeno y el bromoetilsilano generados in situ por reacción de bromo (Br ₂ )y trietilsilano.

La mezcla reactiva acidolítica de Ia presente invención es especialmente útil para el desanclaje/desprotección de péptidos preparados por Ia estrategia de protección Fmoc / ¹ Bu, aunque el método se puede extender al desanclaje/desprotección de péptidos preparados por Ia estrategia de protección Boc / Bn u otra combinación de grupos protectores (por ejemplo Fmoc / tBu / Bn / alilo / sulfóxido); Ia síntesis en fase sólida de compuestos no peptídicos (síntesis orgánica en fase sólida); y Ia preparación de péptidos totalmente desprotegidos anclados a soportes poliméricos, útil para el escrutinio de compuestos en fase sólida generados por estrategias de química combinatoria del tipo "one-bead one-compound".

Así, en el caso de los péptidos, el primer aminoácido se hace reaccionar directamente sobre una resina funcionalizada que comprende poliestireno tal como el hidroximetilpoliestireno o Ia 4-metilbencidrilamina-poliestireno, y Ia sequencia peptídica se construye preferiblemente por Ia estrategia de protección Fmoc / ¹ Bu. Una vez el péptido protegido se ha sintetizado completamente sobre Ia resina, se usa Ia mezcla reactiva acidolítica de Ia presente invención para desanclar el peptido de Ia resina y desproteger simultáneamente los grupos protectores. Así, no se necesitan condiciones acidas drásticas o equipamientos especiales, particularmente línea de vacio de teflon, para desanclar el peptido de Ia resina y desproteger simultáneamente los grupos protectores. Los componentes de dicha mezcla reactiva acidolítica también proporcionan las mismas ventajas que los conocidos tratamientos con ácido trifluoroacético y, en realidad, el ácido trifluoroacético es uno de sus componentes principales aunque por si sólo no es capaz de desanclar el péptido de las resinas funcionalizadas que comprenden poliestireno mencionadas anteriormente.

Entre las ventajas del proceso de Ia presente invención se pueden mencionar las siguientes: (a) hay un buen hinchamiento del soporte de poliestireno; (b) Ia mezcla reactiva acidolítica es líquida y los componentes son volátiles y por ello pueden eliminarse fácilmente al vacio; (c) se obtienen péptidos con excelentes rendimiento y pureza. Preferibelmente, se aplica a Ia producción de compuestos de tipo peptídico, particularmente a péptidos amida, es decir, cualquier péptido que tenga un grupo amida como parte del aminoácido C-terminal, o a Ia producción de péptidos ácido, es decir, cualquier péptido que tenga un grupo ácido carboxílico como parte del aminoácido C-terminal.

El procedimiento de Ia presente invención es especialmente ventajoso para Ia producción de péptidos por síntesis en fase sólida usando Ia estrategia de protección Fmoc / 'Bu evitando el uso de espaciadores bifuncionales que tienen un elevado coste y eliminando algunas etapas sintéticas. El procedimiento permite el uso de resinas de poliestireno, que se usan en Ia estrategia de protección Boc / Bn, también en Ia estrategia de protección Fmoc / ¹ Bu sin Ia necesidad de usar un espaciador bifuncional. Ejemplos de resinas adecuadas son el hidroximetilpoliestireno, Ia metilbencidrilamina o Ia resina de Merrifield (resina de poliestireno basada en un copolímero de estireno retículado con divinilbenceno). La más preferida es la resina metilbencidrilamina.

En una realización particular, se usa una mezcla reactiva acidolítica que consiste en ácido trifluoroacético y al menos un compuesto de fórmula (I). También se obtienen buenos resultados cuando el desanclaje/desprotección se lleva a cabo con una mezcla acidolítica según Ia presente invención, que además comprende bromuro de hidrógeno.

En una realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es aquél donde R es isopropilo o etilo. En otra realización preferida, el compuesto de fórmula (I) es aquél donde n=1 , m=3, y y=0, o n=0, m=3, y y=1. En otra realización preferida, X se selecciona del grupo que consiste en Cl, Br y I.

En una realización más preferida, Ia mezcla reactiva acidolítica es una mezcla de ácido trifluoroacético; y un compuesto de fórmula (I) con n=1 , m=3, y=0 y R seleccionado entre etilo e isopropilo, preferentemente en una proporción entre 75:25 y 95:5.

En otra realización más preferida, Ia mezcla reactiva acidolítica es una mezcla de ácido trifluoroacético; un compuesto de fórmula (I) con n=1 , m=3, y=0 y R seleccionado entre etilo e ¡sopropilo; y un compuesto de fórmula (I) con n=0, m=3, y=1 , R = metilo y X = Cl; preferiblemente en una proporción entre 65:5:30 y 70:5:25.

En una realización particular, Ia mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en: (a) ácido trifluoroacético; (b) ácido bromhídrico; (c) trietilsüano; y (d) clorotrimetilsilano.

En otra realización particular, Ia mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en: (a) ácido trifluoroacético; (b) bromuro de hidrógeno; (c) trietilsilano; y (d) bromo trietilsüano; donde preferiblemente el bromuro de hidrógeno y el bromo trietilsüano son generados in situ por reacción de bromo con trietilsüano.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El contenido del resumen de Ia solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

EJEMPLOS

Abreviaciones: Acm, acetamidometilo; AcOH, ácido acético; Boc, terc- butoxicarbonilo; Bn, bencilo; DMAP, NJ^dimetüaminopiridina; DIEA, N.N- diisopropiletilamina; DIPCDI, λ/,λ/'-diisopropücarbodiim¡da; DMF, N. N- dimetüformamida; ES, electrospray; Fmoc, 9-fluorenümetoxicarbonilo; HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; HPLC, cromatografía liquida de alta eficacia; MALDI- TOF, ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo ("matrix-assisted láser desorption ionization time-of-flight"); MBHA, resina 4-metübencidrüamina; Pmc, 2,2,5,7,8-pentametü-cromano-6-sulfon¡lo; TES:

trietilsilano; TFA, ácido trifluoroacético; TIS: trüsopropilsilano; TMS-CI ₁ cloruro de trimetilsililo; Trt, tritilo.

Ejemplo 1 : Preparación de qonadorelina (análogo LH-RH): Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-GIv-Leu-Arq-Pro-GIv-amida

Aminoácidos protegidos: pGlu-OH, Fmoc-H¡s(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-SerfBiO-OH, Fmoc-Tyr( ^ι Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH. Se llevó a cabo una síntesis de péptidos manual siguiendo el procedimiento estándar Fmoc / ¹ Bu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido, Fmoc-Gly-OH, se ancló directamente sobre una resina de poliestireno 4-MBHA (102.3 mg, f=0,98 mmol/g) siguiendo el procedimiento manual estándar. La síntesis manual constó de las siguientes etapas: i) lavado de Ia resina con DMF (5 x 30 s); ii) tratamiento con 20 % piperidina/DMF (1 x 1 min + 2 x 10 min, eliminación del Fmoc); iii) lavado con DMF (5 x 30 s); iv) acilación con el Fmoc-aminoácido (3 veces de exceso de Fmoc aminoácido) y DIPCDI/HOBt en Ia cantidad mínima de DMF; v) lavado con DMF (5 x 30 s) y CH ₂ CI ₂ (5 x 30 s); vi) prueba de Kaiser (con una muestra de Ia péptido-resina); y vi) lavado con DMF (5 x 30 s).

Una vez sintetizada Ia totalidad de Ia secuencia, el desanclaje y desprotección del péptido se llevó a cabo por acidólisis con TFA:TMS-CI:HBr (33% en AcOH)TIS (6.36 mi TFA, 2.55 mi TMS-CI, 0,49 mi TIS, 0.49 mi HBr, volumen total, 9.9 mi) durante 4 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 119.9 mg (rendimiento cuantitativo, 100%).

El péptido se caracterizó por análisis de aminoácidos con un analizador

Beckman 6300 y por espectrometría de masas MALDI-TOF con instrumentos Bruker model Biflex III or a FisonsVG-Quattro. La homogeneidad del crudo se comprobó por HPLC analítica empleando columnas de fase reversa Nucleosil C18 (4 x 250 mm, 5 μm de diámetro de partícula y poro de 120 A). La elución se llevó a cabo a flujo de 1 ml/min ^"1 con mezclas de H ₂ O-0.045% TFA y MeCN-0.036% TFA y detección de UV a 220 nm. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC) « 85%

MALDI-TOF: m/z 1182.55 ([M+H]\ 100%), 1204.56 ([M+Na] ⁺ , 90.3%), 1220.49 ([M+K] ⁺ , 14.2%).

Ejemplo 2a: Preparación a pequeña escala de Ala-Ala-Ser-lle-Lvs-Val-Ala- Val-amida

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser( ^ι Bu)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH. Se llevó a cabo una síntesis de péptidos manual siguiendo el procedimiento estándar Fmoc / ⁴ Bu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno.EI primer aminoácido, Fmoc-Val-OH, se ancló directamente sobre una resina de poliestireno 4-MBHA (159.7 mg, f=0,98 mmol/g) siguiendo el procedimiento manual estándar tal y como se describe en el Ejemplo 1. Una vez Ia totalidad de Ia secuencia se sintetizó, se llevó a cabo una prueba de desanclaje y desprotección. Una porción de Ia péptido-resina (21 mg) se trató con TFA:trietilsilano (95:5; v/v, total 990 μl) a 45 ⁰ C durante 3 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue esencialmente cuantitativo. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC) =90%. MALDI-TOF: m/z 757.57 ([M+H] ⁺ , 64.9%), 779.57 ([M+Na] ⁺ , 100%), 795.56 ([M+K] ⁺ , 9.9%).

Ejemplo 2b: Desanclaje/desprotección de Ala-Ala-Ser-lle-Lvs-Val-Ala-Val- amida por generación in situ de bromuro de hidrógeno (HBr) v bromotrietilsilano

Una porción de Ia péptido-resina anterior (aprox. 12.6 mg, example 2a) se trató con TFA:bromo:trietilsilano (volumen en μL: 595:103.3:370) a temperatura ambiente. Este reactivo de acidólisis genera in situ bromuro de hidrógeno (16.5% peso/volumen) y bromotrietilsilano (35% v/v). Se adicionó bromo (min. 99,8%; 103.3 μl; 2.02 mmol) sobre TFA (595 μl) y a continuación se añadió el trietilsilano (370 μl; 2.33 mmol; 1.15 eq.). La coloración anaranjada de Ia solución desapareció en unos segundos y a continuación se adicionó sobre Ia peptido-resina. Transcurridas 3 horas, Ia mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue esencialmente

cuantitativo. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC) « 90%. MALDI-TOF: m/z 757.37 ([M+H] ⁺ , 50%), 779.35 ([IvHNa] ⁺ , 100%), 795.30 ([M+K] ⁺ , 4.1 %).

Ejemplo 3a: Preparación a pequeña escala de Dab-Cvs(Acm)-Dab-DPhe- Leu-Dap-Dab-Cvs (Acm)-amida

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc- Dap(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH. Se llevó a cabo una síntesis de péptidos manual siguiendo el procedimiento estándar Fmoc / ¹ Bu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido, Fmoc- Cys(Acm)-OH, se ancló directamente sobre una resina de poliestireno 4-MBHA (94 mg, f=0,98 mmol/g)) siguiendo el procedimiento manual estándar tal y como se describe en el Ejemplo 1. Una vez Ia totalidad de Ia secuencia se sintetizó, se llevó a cabo una prueba de desanclaje y desprotección. Una porción de Ia péptido-resina (aprox. 20 mg) se trató con TFA:TMS-CI:HBr (33% en AcOH):trietils¡lano (volume en μL: 636:255:49.5:49.5) durante 3 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue esencialmente cuantitativo. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC a 200 nm) = 90%. MALDI-TOF: m/z 1012.68 ([M+H] ⁺ , 55.6%), 1034.74 ([M+Na] ⁺ , 100%).

Ejemplo comparativo 3b: Preparación a pequeña escala de Dab-Cvs(Acm)- Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cvs (Acm)-amide (desanclaje/desprotección con Ia base blanda tioanisol según Hughes v col.)

Una muestra de Ia péptido-resina anterior (aprox.19 mg, ejemplo 3a) se trató con TFATMS-CI: tioanisol (500:255:235) durante 3 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El rendimiento de recuperación del péptido fue esencialmente cuantitativo. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC a 200 nm) ~ 49%. El cromatograma de HPLC demostró Ia no conveniencia de usar tioanisol debido a Ia generación de Ia sal de

sulfonio. MALDI-TOF: m/z 215.27 (100%, PhCH ₂ -S ⁺ (CH ₃ )C ₆ H ₅ ), 1012.94 ([M+H] ⁺ , 11 %), 1034.98 ([M+Na] ⁺ , 7.2 %).

Ejemplo 4: Síntesis preparativa de Glv-lle-cvclo(S-S)[Cvs-Pro-Leu-Cvs^-Met- amida

Aminoácidos protegidos: Boc-Met(O)-OH, Boc-Cys(Acm)-OH, Boc-Leu- OH.H2O, Boc-Pro-OH, Boc-lle-OH, Boc-Gly-OH. Se llevó a cabo una síntesis de péptidos manual siguiendo un procedimiento estándar Boc / Bn en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido, Boc- Met(O)-OH, se ancló directamente sobre una resina de poliestireno 4- MBHA (124.7 mg, f=0,98 mmol/g) según un protocolo manual de síntesis. Brevemente, Ia síntesis manual constó de las siguientes etapas: i) lavado de Ia resina con CH ₂ CI ₂ (5 x 30 s); ¡i) tratamiento con 40% TFA/CH ₂ CI ₂ (1 x 1 min + 2 x 10 min, eliminación del Boc); iii) lavado de Ia resina con CH ₂ CI ₂ ; ¡v) tratamiento con 5% DIEA/CH ₂ CI ₂ (3 x 2 min, neutralización); v) lavado con CH ₂ CI ₂ ( 5 x 30 s); vi) lavado con DMF (5 x 30 s); vü) acilación con el Boc- aminoácido (3 veces de exceso de Boc-aminoácido) y DIPCDI/HOBt en Ia cantidad mínima de DMF; viii) lavado con DMF (5 x 30 s) y CH ₂ CI ₂ (5 x 30 s); viii) prueba de Kaiser (con una muestra de peptido-resina); y ix) lavado con CH ₂ CI ₂ (5 x 30 s).

Una vez se sintetizó Ia secuencia completa, Ia desprotección del grupo Acm con formación simultánea del enlace disulfuro se llevó a cabo con TI(CF ₃ COO) ₃ (1 ,2 eq.) en TFA: anisol (95.5: 4.5; v/v) durante 2 horas a temperatura ambiente. El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:TMS-CI: trietilsilano (6.86 mi TFA, 2.55 mi TMS-CI, 0.49 mi TES, volumen total 9.9 mi) durante 2 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 71.4 mg (rendimiento: 80%). Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC a 200 nm) ^« 90%. MALDI-TOF: m/z 733.33 ([M+H]+, 7.3%), 755.45 ([M+Na]+, 100%), 771.36 ([M+K]+, 78.2%).

Ejemplo 5: Síntesis a pequeña escala de Tyr-lle-GIv-Ser-Arq

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Tyr( ^ι Bu)-OH; Fmoc-I Ie-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-Ser^BuJ-OH; Fmoc-Arg(Pmc)-OH. Se llevó a cabo una síntesis de péptidos manual siguiendo el procedimiento estándar Fmoc / ⁴ Bu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido se ancló directamente sobre una resina de hidroximetilpoliestireno (219 mg, f=0,87 mmol/g) usando 4 veces de exceso de Fmoc-Arg(Pmc)-OH y DIPCDI, y 0.4 equivalentes de DMAP, en Ia mínima cantidad de DMF. Esta reacción se repitió una segunda vez. Los siguientes Fmoc-aminoácidos se acoplaron directamente siguiendo un protocolo de síntesis manual tal y como se describe en el Ejemplo 1.

Una vez Ia totalidad de Ia secuencia se sintetizó, se llevó a cabo una prueba de desanclaje y desprotección. Una porción de Ia péptido-resina (ca 21 mg) se trató con TFA:TMS-CI:HBr (33% en AcOH):triet¡lsilano (volumen en μl_: 636:255:49.5:49.5) durante 3 horas. La mezcla de acidólisis se evaporó con corriente de nitrógeno y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se separó por centrifugación y decantación de Ia fase etérea. El peso del crudo peptídico fue esencialmente cuantitativo. Caracterización: Homogeneidad (por integración de Ia traza de HPLC a 220 nm) = 90%. MALDI-TOF: m/z 594.93 ([M+H]+, 100%), 616.94 ([M+Na]+, 54.1 %), 632.89 ([M+K]+, 5.5%).