Proteine aus Zellkulturen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung rekombinanter Proteine aus Zellkulturen, die in einer kontinuierlichen Fermentation angezogen werden. Das offenbarte Verfahren erlaubt die stabile Expression rekombinanter Proteine mit einer gleich¬ bleibenden Qualität des rekombinanten Proteins über einen mehrmonatigen Fermentationszeitraum.

Rekombinante Proteine können mit Hilfe von genetisch veränderten Bakterien oder mit Hilfe von Zellkulturen hergestellt werden. Für die Zellkulturen werden Zellen von höheren Organismen eingesetzt. Besonders häufig finden Zellinien Verwendung, die von Menschen, Tieren, Pflanzen oder Insekten abstammen. Beispiele derartiger Zellinien sind Mausfibroblastenzellen, CHO-Zellen (chinese hamster ovary) , Pflanzenzellen oder Insektenzellen.

Die Herstellung der rekombinanten Proteine aus Zellkulturen erfolgt häufig durch eine ansatzweise Fermentation (batch fermentation) . So wird beispielsweise derzeit auch im industriellen Maße rekombinantes tPA aus CHO-Zellen hergestellt. Demgegenüber weist ein kontinuierliches Verfahren verschiedene Vorteile auf, jedoch stellt sich die

optimale Fermentationsführung als schwierig dar. Im industriellen Maßstab wird derzeit beispielsweise der rekombinante Blutgerinnungsfaktor VIII aus BHK-Zellen hergestellt. Vorteil bei den kontinuierlichen Verfahren gegenüber dem ansatzweisen Verfahren ist die hohe Raum-Zeit- Produktausbeute. Dieser Vorteil kann insbesondere dann erzielt werden, wenn es gelingt, die Zellen auf geeignete Weise aus dem abströmenden Zellkulturüberstand abzutrennen und wieder dem Fermentationsprozeß zuzuführen.

Bei der Zeilrückhaltung wird zwischen externer und interner Zeilrückhaltung unterschieden. Bei der externen Zell- rückhaltung wird der Zellkulturüberstand aus dem Fermenter abgezogen. Die zeilhaltige Flüssigkeit durchströmt dann eine Vorrichtung, die eine teilweise oder vollständige Abtrennung der Zellen von der Kulturflüssigkeit ermöglicht . Anschließend werden die abgetrennten Zellen dem Fermenter über eine Rückleitung wieder zugeführt. Hier ist zwar eine Reihe von Verfahren beschrieben, ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch die Belastung der Zellen bei der Rückführung, da mechanische Belastungen (beispielsweise durch Pumpen) und physiologische Belastungen durch unkontrollierte pH-Werte und pθ2-Werte nicht kontrollierbar sind.

Bei der internen Zeilrückhaltung wird bereits im Fermenter eine teilweise oder vollständige Zurückhaltung der Zellen angestrebt. Dadurch können die Nachteile, die bei der externen Zellrückhaltung auftreten, bei der internen Zell-rückhaltung nicht stören. Eine der Möglichkeiten der internen Zellrückhaltung ist der Einsatz von Spinfiltern. Diese Technik wurde zum ersten Mal von Himmelfarb et al . beschrieben (Himmelfarb et al . , Science 164, S. 555-557 (1969) ; Spin filter culture: The propagation of mammalian cells in Suspension) .

Ein Spinfilter besteht im wesentlichen aus einem zu einem Zylinder geformten Maschensieb, das um seine Längsachse rotiert .

Die WO 92/05242 beschreibt einen Perfusionsbioreaktor mit Spinfilter zur Zellkultur. In dieser Literaturstelle werden Siebzylinder verwendet, die bevorzugt eine Maschenweite von 5 μm haben, und die Spinfilter sollen bevorzugt mit Geschwindigkeiten zwischen 100 und 150 Upm rotieren.

In der EPA 88.118999.7 wird ein kontinuierliches Zeilkulti¬ vierungssystem beschrieben, das vor allem für Säugerzellen geeignet ist. Es wird darauf hingewiesen, daß die Spinfilter zum Verblocken neigen und danach das Medium nicht mehr durchtreten lassen. So wurde beispielsweise bei einer Drehzahl des Spinfilters von 150 Upm eine Verblockung des Filters nach 284 Stunden festgestellt. Die Abtrennung der Zellen von der Kulturflüssigkeit wird daher gemäß der Lehre der EPA 88.118999.7 durch eine externe Zellabtrennung gelöst.

Fenge et al. beschreiben in dem Aufsatz "Spinfilter für kontinuierliche Zellkultur" (BioTec, Nr. 2, März 1993, S. 46- 51) Spinfilter, die bei der kontinuierlichen Fermentation Verwendung finden können. Die Beziehungen zwischen Art der verwendeten Zellen (Zellen auf Microcarriern, aggregat¬ bildende Zellen und Suspensionszellen) , Porenweite des Spinfilters und Umdrehungszahl des Spinfilters werden erörtert. Nicht dargestellt wird jedoch, welchen Einfluß die Verfahrensparameter auf die Qualität und Ausbeute der gebildeten Produkte haben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die rekombinanten Produkte, insbesondere Proteine in einer guten Qualität des Produktes mit einer gleichbleibend hohen Ausbeute über einen langen Zeitraum bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung rekombinanter Proteine aus Zellkulturen umfassend eine kontinuierliche Fermentation, bei der die Zellen in dem Fermentersystem durch wenigstens einen Spinfilter zurückgehalten werden, wobei die Drehzahl des

Spinfilters während der Fermentation zwischen etwa 30 min ^-1 und etwa 50 min ^-1 beträgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Drehzahl des Spinfilters zwischen etwa 40 und etwa 49 min ^-1 . Ganz besonders bevorzugt ist eine Drehzahl von 45 min ^-1 . Bevorzugterweise werden darüber hinaus bei der kontinuierlichen Fermentation täglich Zellen aus dem Kulturmedium entnommen. Die entnommene Menge kann dabei täglich zwischen 10% und 30% der Zellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl, betragen. In bevorzugter Weise wird jedoch mit der täglichen Zellentnahme erst ab dem 10. Tag, gerechnet ab Beginn der kontinuierlichen Fermentation, begonnen.

Auch wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die verschie¬ densten eukaryontischen Zellen verwendet werden können, handelt es sich doch bevorzugt bei den eingesetzten Zellkulturen um tierische Zellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt und der pH-Wert wird bevorzugt auf dem Bereich zwischen 6,7 und 7,2, ganz bevorzugt auf etwa 7,1 eingestellt. Der pθ2 beträgt Vorzugs-weise zwischen 10% und 80% und liegt ganz besonders bevorzugt bei etwa 50%. Die Durchflußrate beträgt vorzugsweise 2 d ^"1 .

Die erfindungsgemäß verwendeten Spinfilter bestehen vorzugsweise aus feinmaschigem Edelstahldrahtgewebe und sind aus einem robusten Filterkörper mit etwa zylindrischer Gestalt aufgebaut. Der Boden ist bevorzugt konisch und in besonders bevorzugter Ausführungsform weist der Spinfilter einen oben offenen Überlauf auf. Der bei dem erfindungs-gemäßen Verfahren verwendete Spinfilter weist bevorzugt eine Porenweite von etwa 20 μm auf.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann das rekombinante Produkt in gleichbleibend guter Qualität mit einer

verhältnismäßig hohen Ausbeute, die gleichmäßig auf relativ hohem Niveau bleibt, hergestellt werden.

Überraschenderweise wurde trotz der erfindungsgemäß verwendeten niedrigen Drehzahl keine Verblockung des Spinfilters über einen Zeitraum von mehr als vier Monaten beobachtet . Bei der bevorzugten Entnahme der Zellen konnte eine Beibehaltung der hohen Vitalität der Zellen beobachtet werden und darüber hinaus konnte eine homogene Verteilung der Zellaggregate erzielt werden.

Die nachfolgenden Beispiele belegen die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Als Modellsystem in den Beispielen wurde die Herstellung von rekombinantem humanem Interleukin-4 Rezeptor (rhu IL-4R) aus CHO-Zellen gewählt. Die Zellen wurden in einem 10 1 Fermenter (Biostat E, B. Braun Biotec International, Melsungen, BRD) verwendet, auf dessen Rührwelle ein Spinfilter befestigt war. Der Spinfilter wurde von der Firma B. Braun Biotec International, Melsungen, BRD, bezogen und wies einen Durchmesser von 105 mm bei einer Höhe von 260 mm auf. Die Porenweite betrug 20 μm. Unterhalb des Spinfilterkonus waren zwei Schrägblattrührer befestigt, die um 90° gegeneinander versetzt waren. Der Membranbegasungskorb des Fermenters diente als Leitrohr, so daß eine gerichtete UmwurfStrömung im Fermenter realisiert werden konnte. Als Medium wurde serumfreies Ultra-CHO Medium, das käuflich von Bio Whittaker, USA, erworben wurde, eingesetzt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die Produktion von rhu IL-4R über einen langen Zeitraum ständig zurückging, wenn der Spinfilter bei hoher Drehzahl bewegt wurde und keine Zellen entnommen wurden. Durch den Einsatz einer niedrigen Drehzahl konnte die Produktbildung stabilisiert werden und weiterhin durch eine Zellentnahme verbessert werden.

Durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung wurde erst nach sehr langen Zeiträumen (etwa vier Monaten) eine Verblockung des Siebes beobachtet. Durch die bevorzugte Konstruktion, nämlich den oben offenen Überlauf des Siebfilters, war es dennoch möglich, die Zelldichte auf einem hohen Niveau zu stabilisieren.

Beispiel 1

In Abbildung 1 ist die Zelldichte und die Produkt- konzentration (rhu IL-4 Rezeptor) über einen Zeitraum von etwa vier Monaten angegeben. Der 10 1 Fermenter wurde mit einem Spinfilter versehen, der mit einer Drehzahl von etwa 50 Upm betrieben wurde.

Ab dem 15. Tag wurden etwa 10% der Zellen entnommen. Die Zellentnahme wurde auf etwa 20% ab dem 84. Tag erhöht. Es wurde beobachtet, daß sich die Produktkonzentration stabil auf einem Wert zwischen 20 und 60 mg/1 einstellte.

Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)

Abbildung 2 zeigt die Zelldichte und die Produktkonzentration über einen Zeitraum von etwa zwei Monaten.

Die Zellen wurden in einem 10 1 Fermenter angezogen. Der Spinfilter wurde mit einer Drehzahl von 150 Upm betrieben und es fand keine Zellentnahme statt. Es wurde beobachtet, daß die Produktkonzentration ab dem 55. Tag unter 10 mg/1 absank.

Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)

In Abbildung 3 ist die Zelldichte und Produktkonzentration über einen Zeitraum von etwa drei Monaten dargestellt.

Die Zellen wurden in einem 2 1 Fermenter angezogen, wobei der Spinfilter bei einer Drehzahl von 200 Upm betrieben wurde. Es wurden folgende Mengen an Zellen entnommen:

ab Tag 38 10% ab Tag 52 20% ab Tag 63 30% ab Tag 70 10%

Es wurde festgestellt, daß die Produktkonzentration am Tag 70 unter 10 mg/1 fiel trotz Zellentnahme bei hoher Drehzahl. Durch eine Verminderung der Zellentnahme konnte nur kurzfristig eine höhere Produktkonzentration erzielt werden. Am Tag 90 fiel die Produktkonzentration abermals auf 10 mg/1.