WANG WEILIANG (CN)
HUANG JIANKE (CN)
FAN JIANHUA (CN)
WANG JUN (CN)
LIANG SONGTAO (CN)
WANG JUN (CN)
PAN RONGHUA (CN)
CHEN JIE (CN)
SHEN GUOMIN (CN)
| WO2012125959A2 | 2012-09-20 |
| CN102443542A | 2012-05-09 | |||
| CN102583767A | 2012-07-18 |
上海专利商标事务所有限公司 (CN)
| 1 . 一种葡萄藻培养方法， 其特征在于， 该方法包括葡萄藻的异养或混养 培养步骤和以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步 骤。 2. 一种油脂和 /或烃的生产方法， 其特征在于， 所述方法包括葡萄藻藻种 的异养或混养培养步骤、 以异养或混养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养 培养步骤、 以及藻细胞采收及油脂和烃的提取步骤。 3. 一种高效的葡萄藻培养方法或快速生产油脂和 /或烃的方法， 其特征在 于， 该方法包括： ( 1 ) 异养或混养培养葡萄藻， 其中， 培养过程， 通过补料控制 pH恒定以 及碳、 氮和 /或磷等元素稳定在一定浓度范围内， 异养或混养培养结束时控制 碳、 氮和 /或磷等营养成分的浓度较低甚至为零； ( 2 ) 以异养或混养所得藻细胞作为种子实施光自养培养， 以及 ( 3 ) 采收藻细胞， 和分离提取油脂和 /或烃。 4. 如权利要求 1 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 所用葡萄藻藻种 包括但不限于 Botryococcus bmimii， Botryococcus sudeticus, Botryococcus sp.， Botryococcus spp 5. 如权利要求 1一 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 采用分批培养、 补料分批培养、 重复补料分批培养、 半连续培养或连续培养等模式实施所述异 养或混养培养。 6. 如权利要求 1一 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述异养或混养 培养步骤包括： 在生物反应器中加入 pH为 5.0〜1 1.0的培养基， 按工作体积的 0.1〜30%接入微藻藻种进行分批培养、 补料分批培养、 重复补料分批培养、 半 连续培养或连续培养，培养温度为 10〜40 °C，控制 pH小于 10.0，控制溶氧在 1 % 以上。 7. 如权利要求 1一 4中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述葡萄藻藻种 异养培养时， 不需要光照； 所述葡萄藻藻种混养培养时， 需要进行光照， 光强 范围 1〜2500 molm-2s 。 8. 如权利要求 1一 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 以异养或混养培 养所获得的藻细胞作为种子进行光自养培养包括： 将异养或混养培养的藻种接 到光自养培养装置中进行光自养培养， 培养温度为 5〜50°C， 连续光照或间歇 光照， 光照强度为 l〜2500 molm— 2s— 光自养培养周期为 1〜180天， 初始接种 密度为 0.01〜5.0克 /升， 所述培养基不含有机碳源， 其 pH为 4.0〜9.0。 9. 如权利要求 1一 3中任一项所述的方法， 其特征在于， 藻种的异养或混 养培养基含有氮源、 有机碳源、 植物生长激素、 无机盐、 微量元素和水， 或由 所述氮源、 有机碳源、 植物生长激素、 无机盐、 微量元素和水组成； 所述光自 养培养基含有植物生长激素、 氮源、 无机盐和水， 或由植物生长激素、 氮源、 无机盐和水组成。 10. 如权利要求 1一 3 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述异养培养 步骤在摇瓶、 机械搅拌式、 气升式或鼓泡式生物反应器中进行； 所述混养步骤 在摇瓶、 可蒸汽灭菌的封闭式光生物反应器 （透明）， 及机械搅拌式等含光照 系统的生物反应器中进行； 所述光自养培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池 或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反 应器或薄膜立袋或敞开式与封闭式杂交的光自养培养系统或贴壁培养系统等 用于微藻光自养培养的任何装置中进行， 光照条件为自然光或人工光。 |
本发明属于生物能源领域， 涉及一种快速获得具有高油脂和 /或烃产率葡 萄藻的方法。 背景技术
葡萄藻 Botryococcus spp. ) 是一种群体生单细胞微藻， 广泛分布于热带 和温带地区的淡水水域， 偶尔也在半咸水或海水中见到 （Huang et al. 1999; Volova et al. 2003 )。 葡萄藻的一个重要特点就是能够大量合成和积 累各种脂 类、烃 ( Brown and Knights 1969; Knights et al. 1970 )以及醚脂等成分 ( Metzger and Casadevall 1991 ; Metzger 1999)。葡萄藻的含烃量可占细胞干重的 15-80%， 大大高于其它微生物的含烃量 （Banerjee et al. 2002)。 由于含烃量高， 并且在 一定条件下具有大量繁殖的能力 （Wake and Hillen 1980; Townsend 2001) ,葡萄 藻被认为是一种可用来生产液体燃料的可再生 资源 (Casadevall et al. 1985)。
布朗葡萄藻 Botryococcus bmunii ) 细胞呈椭圆形， 宽 3〜6微米， 长 6〜12 微米， 嵌在交错成层的漏斗形胶质内， 常为 2个或 4个细胞成一组， 各个胶质 漏斗在中央互相联合， 所有的细胞都或多或少地呈辐射状放射， 细胞靠近周围 紧密相挤，因此，整个群体出现一相当均匀的 形状。群体大小可达 100微米〜 0.5 毫米。 葡萄藻的集落为大小不一的细胞串， 状似葡萄， 胞间以透明的折射细丝 相连。 无鞭毛， 含叶绿素 a， b和 α，β-胡萝卜素、 叶黄素等色素。 根据来源， 特别是所产烃的结构不同， 葡萄藻被分为 A、 B、 L三个品系。 葡萄藻各品系 的最适生长温度有差别， A品系的最适生长温度为 25 °C， 超过了 30 °C生长速 度就变慢； B 品系的适合生长温度比较高， 在 35 °C下仍可以生长， 但在 25 °C 时产烃量最大。 A品系生产 C 23 -C 33 的奇数碳无分枝的直链二烯烃和三烯烃， B 品系生成具有多不饱和酸、支链烃的 C 3Q -C 37 的萜类化合物， L品系生成 C 4( )H 78 这种单一的四烯碳氢化合物。 目前国内外对于葡萄藻培养的研究主要集中在 光自养方面。虽然葡萄藻的 光自养培养过程可积累大量的油脂和烃， 但在细胞内合成高能量的油脂或烃是 一个极其耗能的过程， 这也就意味着葡萄藻的光自养生长速率要比其 他微藻 低， 倍增时间要比其他微藻长。 目前， 对于葡萄藻的光自养培养仍存在以下问 题： 1 ) 接种密度低导致易受到杂菌藻和原生动物的污 染及环境和气候条件影 响等； 2 ) 目前种子扩培均采用光自养培养， 其周期十分漫长 （若得到一定量 的藻种接入大池光自养一般至少需要 1〜2个月）， 藻种在几个月的不断扩培中 需要大量的培养装置及设备且占地面积大， 单位培养产率低； 3 ) 户外光自养 培养的藻种若受到杂藻或原生动物、 浮游生物等污染， 那么本批藻种则就会报 废， 需重新再进行藻种的扩培工作， 还这会导致下一步光自养培养没有藻种用 于培养的问题， 严重影响生产。
另一方面， 异养或混养培养能够获得高细胞密度和高细胞 生长速度， 因而 异养或混养培养能够大大提高葡萄藻的培养密 度和细胞产率，但获得的藻细胞 内油脂和烃的含量较低， 因此也无法用于以高产油脂和烃为目的葡萄藻 规模化 培养。 此外， 异养或混养过程， 通常选择的培养基为普通的微藻培养基， 未添 加促进生长的植物生长激素类物质， 培养过程通常不加以调控或通过间歇流加 未经优化的补料培养基， 这一方法未考虑葡萄藻异养和混养与普通光自 养在营 养需求上存在的差异，造成培养基对细胞的培 养效果不佳，细胞生长相对缓慢。
因此， 本领域亟需一种高效的葡萄藻培养工艺和方法 。 发明内容
针对上述问题， 本发明提供了一种有效的解决方法， 首先采用异养或混养 (又称兼养）培养方式培养葡萄藻， 随后以异养或混养培养所获得的藻细胞作 为种子进行光自养培养。采用本发明方法可充 分发挥葡萄藻在异养或混养阶段 藻细胞快速生长的优势， 为微藻在光自养阶段提供大量藻种以及微藻在 光自养 阶段快速生长并积累有用物质（油脂和烃） 并获得高的细胞产率和代谢物质产 率， 为解决葡萄藻光自养培养过程中细胞生长速率 和有用物质 （油脂和烃） 产 率低的问题提供重要的技术手段。
因此， 本发明第一方面提供一种葡萄藻培养方法， 该方法包括葡萄藻细胞 的异养或混养培养步骤和以异养或混养培养所 获得的藻细胞作为种子实施的 光自养培养步骤。
本发明第二方面提供一种油脂和 /或烃的生产方法， 所述方法包括葡萄藻 细胞的异养或混养培养步骤、 以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子实 施 的光自养培养步骤、 以及藻细胞采收和油脂 /总烃提取的步骤。
在一个具体实施方式中， 本发明上述方法包括：
( 1 ) 异养或混养培养葡萄藻细胞， 其中， 培养过程， 通过补料控制 pH恒 定以及碳、 氮和 /或磷等元素稳定在一定浓度范围内， 异养或混养培养结束时 控制碳、 氮和 /或磷等营养成分的浓度较低甚至为零；
( 2 ) 以异养或混养所得藻细胞作为种子实施光自养 培养， 以及
( 3 ) 采收藻细胞， 和分离提取油脂和 /或烃。
在一个具体实施方式中， 所用葡萄藻藻种包括但不限于 Botryococcus braunii, Botryococcus sudeticus , Botryococcus sp., Botryococcus spp
在一个具体实施方式中， 对于异养或混养所得藻细胞， 可用水稀释， 然后 向稀释藻液中添加光自养培养基后进行光自养 培养； 或直接对异养或混养培养 获得的葡萄藻细胞进行光自养培养。
在一个具体实施方式中， 所述的葡萄藻采用 Sotrjococo^ braw Y A、 B和 L三个品系中的任何一种。
在一个具体实施方式中， 所述葡萄藻藻种异养或混养的步骤包括： 在生物 反应器中加入 pH为 4.0〜1 1.0、 优选 7.5-8.5的培养基， 按工作体积的 0.1〜30% 接入藻种进行分批培养、 补料分批培养、 重复补料分批培养、 半连续培养或连 续培养， 培养温度为 10〜40 °C， 控制 pH小于 10.0、 优选小于 9.0， 控制溶氧在 1 %以上。
在一个具体实施方式中， 所述葡萄藻藻种异养培养时， 不需要进行光照。 所述葡萄藻混养培养时， 需要进行光照， 光强范围 1 -2500
在一个具体实施方式中，所述葡萄藻光自养的 步骤包括：将异养或混养（兼 养） 葡萄藻藻种接种到光自养培养装置中进行光自 养， 培养温度为 5〜50 °C， 连续光照或间歇光照，光照强度为 1〜2500 molm— 1 ，光自养培养周期为 1〜180 天、 优选 5〜40天， 初始接种密度为 0.01〜5.0克 /升， 所述培养基不含有机碳 源， 其 pH为 4.0〜9.0。
在一个具体实施方式中， 异养或混养培养基由氮源、 有机碳源、 植物生长 激素、 无机盐、 微量元素和水组成； 光自养培养基由氮源、 植物生长激素、 无 机盐、 微量元素和水组成。
在一个具体实施方式中， 所述异养步骤在摇瓶、 机械搅拌式、 气升式或鼓 泡式可异养培养的生物反应器中进行； 所述藻种混养步骤在摇瓶、 可蒸汽灭菌 的封闭式光生物反应器（透明），及机械搅拌 式等含光照系统的生物反应器（含 外部光源和 /或内部光源） 中进行； 所述光自养培养步骤在摇瓶或选自敞开式 的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应 器或管道式光生物反应器或柱式 光生物反应器或薄膜立袋光生物反应器或敞开 式与封闭式杂交的光自养培养 系统或贴壁培养系统等任何可用于微藻光自养 培养的装置中进行， 光照条件为 自然光或人工光照射。
在一个具体实施方式中， 当藻种为布朗葡萄藻时， 异养或混养所使用的培 养基基本上由以下成分组成： KNO 3 0.1-15 克 /升、 有机碳源 0.1〜50 克 /升、 K 2 HPO 4 0.1〜10.0克 /升、 MgSO 4 '7H 2 O 0.1〜10克 /升、 CaCl 2 '2H 2 O 0.01〜5克 /升、 植物生长激素 2，4-二氯苯氧乙酸 0.001-5毫克 /升、苄氨基嘌呤 0.001-5毫克 /升、 脱落酸 0.001-5毫克 /升、 赤霉素 0.001-5毫克 /升、 3-吲哚丁酸 0.001-5毫克 /升、 萘乙酸 0.001-5毫克 /升、 芸苔素 0.001-5毫克 /升、 柠檬酸铁 0.01〜5克 /升、 柠 檬酸 0.1〜15 克 /升、 微量元素 0.5〜20ml和水， 其中微量元素的组成为 H 3 BO 3 0.1-10 克 /升， ZnSO 4 -7H 2 O 0.1-10.0 克 /升， MnCl 2 -4H 2 O 0.5-10.0 克 /升， (ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01-5克 /升， CuSO 4 -5H 2 O 0.01〜5.0克 /升， Co(NO 3 ) 2 -6H 2 O 0.01〜5克 /升。
在一个具体实施方式中， 有机碳源包括任何可以作为微生物培养的碳源 ， 包括但不限于葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖、 乳糖、 淀粉、 纤维素半纤维素的水解物、 甘油、 醋酸钠、 醋酸。 一般优先考虑葡萄糖。
在一个具体实施例中， 当异养或混养培养液中的有机碳源消耗完后， 结束 异养或混养培养， 并将异养或混养培养所得藻细胞作为种子实施 光自养培养步 骤。
在本申请其它具体实施方式中， 可使用本申请所述的培养基、 培养条件实 施上述葡萄藻培养方法。
以葡萄藻藻种的异养或混养培养和以异养或混 养培养所获得的藻细胞作 为种子的光自养培养生产油脂和 /或烃为例， 详细说明本发明的优点：
( 1 ) 可大大提高藻种培养速率。 以一般户外大池培养微藻的初始接种密 度为 0.05〜0.1g/l， 大池的体积一般为 5000L为例， 若需满足这一要求， 则需要 250〜500g 的微藻。 若采用传统的光自养扩培藻种， 则需要 1〜2 月 （葡萄藻种 光自养扩培 10天的藻细胞密度为 0.2g/l， 培养体积为 500L) ; 而采用异养 /混养 培养藻种， 则只需数天即可完成。
( 2 ) 与传统的藻种光自养培养相比， 可减少藻种培养过程中的装置及设 备数量， 且占地面积小， 单位培养面积产率高。 藻种光自养扩培需要 500L的 培养装置且占用时间较长（1〜2个月） ， 而藻种异养 /混养培养只需 50L的培养 装置且占用时间较短 （10-20天） 。
( 3 ) 与藻种光自养培养相比， 藻种异养或混养培养不受户外天气及环境 的影响。 藻种光自养培养时， 若遇到短期的阴雨天气而无法继续培养时， 则需 要搬入室内并添加人工光来继续光自养培养藻 种， 从而增加了藻种异养培养时 所不需要的人工光照费用。 另外， 户外光自养的藻种若受到原生动物、 浮游生 物等污染， 那么本批藻种则会报废， 需重新再进行藻种的扩培工作， 还会导致 下一步光自养培养没有藻种用于培养的问题， 严重影响生产。
( 4 ) 户外大池培养时， 接种量越大， 越不容易受到其他杂藻或原生动物 等污染。 因此， 藻种的异养或混养培养可及时提供大量光自养 培养时所需的种 子。
( 5 ) 异养或混养细胞作为藻种的活力优于光自养藻 种的活力， 接入相同 藻细胞量分别进行光自养培养时，采收时异养 藻种的藻细胞密度和油脂及总烃 产率均高于光自养藻种的藻细胞密度和油脂及 总烃产率。 因此， 在获得相同油 脂和总烃产率的情况下， 利用异养或混养藻种能使得光自养设备占地面 积少， 面积产率高。 另外， 由于用异养或混养细胞作为藻种进行光自养培 养所获得的 藻细胞密度较大， 因此， 大大降低了葡萄藻采收的成本。
综上所述， 本发明以异养或混养培养所获得的藻细胞作为 种子的光自养培 养模式可以完全解决光自养培养时由于藻种培 养效率低且易受污染所造成的 诸多问题及葡萄藻在光自养阶段生长速率慢且 油脂和总烃产率低等问题。 因 此， 本发明为解决葡萄藻光自养培养过程中细胞和 油脂及总烃产率低的问题提 供了重要的技术手段， 特别是为利用葡萄藻生产液体燃料奠定了坚实 的产业化 基础。 附图说明
图 1 显示葡萄藻细胞分别在 500ml摇瓶中异养、 混养和光自养培养生长 过程。
图 2显示葡萄藻在 5L发酵罐中培养过程。 图中， ▲/國表示控制 pH和补 料策略、 且加入了植物生长激素的实施例； Δ/口表示只控制 pH、 未优化补料 培养基和补料策略、 且未加入植物生长激素的实施例； Β/Φ表示控制 p H 和补料 策略、 未加入植物生长激素的实施例。
图 3 显示葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在室内 2L光生物反应 器中进行光自养培养的藻细胞生长过程。
图 4 显示葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在室内 2L光生物反应 器中光自养培养的油脂和总烃含量及产量。
图 5 显示葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在户外 60L塑料盆中 进行光自养培养的藻细胞生长过程。
图 6 显示葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在户外 60L塑料盆中 光自养培养的油脂和总烃含量及产量。 具体实施方式
术语 "基本上由……组成" 表示上述培养基中除了含有主要组分 KNO 3 、 葡萄糖以及无机盐、 微量元素和水外， 还可包含一些对于组合物的基本特性或 新的特性（即可维持葡萄藻在较短的培养周期 内细胞密度达到较高的水平， 同 时烃类物质含量与常规异养培养相比有较大幅 度提高） 没有实质上影响的组 分。 术语 "由……组成"表示上述培养基由所指出的具体 分组成， 没有其他 组分， 但是可以带有含量在通常范围内的杂质。
可采用现有技术已知的各种葡萄藻来实施本发 明的技术方案，包括但不限 于布朗葡萄藻 ( SotryococcMS braunii ) , Botryococcus sudeticus, Botryococcus sp., Botryococcus spp.。 布朗葡萄藻包括 A、 B和 L三个品系。
在具体的实施方式中， 采用布朗葡萄藻 Botryococcus braunif) A品系， A 品系的最适生长温度为 25 °C， 超过了 30 °C生长速度就变慢， A 品系生产 c 23 -c 33 的奇数碳无分枝的直链二烯烃和三烯烃， 也可以在细胞内积累油脂。 异养或混养
可采用本领域熟知的各种培养基来进行葡萄藻 种子的异养或混养培养。与 异养没有光照不同， 混养是有光照。 异养和混养的培养基中都需要添加有机碳 源。 通常， 异养和混养培养基相同， 都含有氮源、 有机碳源、 无机盐、 微量元 素和水。 适用于葡萄藻培养的氮源、 有机碳源、 无机盐、 微量元素等是本领域 周知的。 例如， 作为氮源， 可使用的有尿素或各种硝酸盐， 如 KNO 3 等； 作为 有机碳源， 可使任何可以作为微生物培养的碳源， 包括但不限于葡萄糖、 麦芽 糖、 蔗糖、 乳糖、 甘油、 淀粉。 但未见有在异养或混养培养基中添加植物生长 激素的报道，本发明创造性地在葡萄藻培养基 中添加了植物生长激素可显著促 进细胞生长。
用于本发明培养基 （包括异养、 混养培养基和光自养培养基） 的植物生长 激素可显著促进细胞生长， 这类激素包括但不限于 2，4-二氯苯氧乙酸、 苄氨基 嘌呤、 脱落酸、 赤霉素、 3-吲哚丁酸、 萘乙酸和芸苔素等。 培养基中可含有一 种或多种植物生长激素。 培养基中植物生长激素的总含量可为 0.001 -35 毫克 / 升培养基， 通常在 0.001 -20毫克 /升， 更通常为 0.001 - 15毫克 /升、 0.005- 10毫 克 /升、 0.01 - 10毫克 /升、 0. 1 -5毫克 /升不等。
在具体实施例中， 各植物生长激素若存在， 其浓度可以是， 例如 2，4-二氯 苯氧乙酸 0.001 -5毫克 /升， 苄氨基嘌呤 0.001 -5毫克 /升， 脱落酸 0.001 -5毫克 / 升， 赤霉素 0.001 -5毫克 /升， 3-吲哚丁酸 0.001 -5毫克 /升， 萘乙酸 0.001 -5毫克 /升， 芸苔素 0.001 -5毫克 /升。 各植物生长激素的浓度各自优选为， 例如 0.01 -4 毫克 /升、 0.1 -4毫克 /升、 0.3-4毫克 /升、 0.3-3毫克 /升、 0.5-2.5毫克 /升不等。
可从市售途径获得所述植物生长激素， 然后直接添加到本发明所公开的异 养 /混养以及光自养用的培养基中， 这类培养基的例子如下文所述。 本发明所用的异养和混养培养基基本上由 KNO 3 、葡萄糖、植物生长激素、 无机盐、微量元素和水组成。在所述技术方案 中，所述微量元素宜选自 H 3 BO 3 ， ZnSO 4 · 7H 2 O, MnCl 2 * H 2 O， (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 * 4H 2 O, CuSO 4 · 5H 2 O, Co(NO 3 ) 2 · 6H 2 O中的一种或多种或全部。
在该培养基中， 培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对 微藻细胞密 度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分 的用量不应受实施例的严格限制。 如本领域技术人员所熟知的，培养基中还可加 入无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、 硫酸亚铁和磷酸盐等， 以及微量元素如 Mn、 Zn、 B、 I、 M、 Cu、 Co等。
在本发明中， 较佳的微量元素组分宜选自 H 3 BO 3 ， ZnSO 4 - 7H 2 O, MnCl 2 - H 2 O， (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 *4H 2 O, CuSO 4 * 5H 2 O, Co(NO 3 ) 2 *6H 2 O中的一种或多种。 无 机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。
本发明所采用的异养和混养培养基基本上由以 下成分组成： KNO 3 0.1-15 克 /升、 葡萄糖 0.1〜50克 /升、 K 2 HPO 4 0.1〜10.0克 /升、 MgSO 4 '7H 2 O 0.1〜10克 / 升、 CaCl 2 '2H 2 O 0.01〜5克 /升、 柠檬酸铁 0.01〜5克 /升、 柠檬酸 0.1〜15克 /升、 2，4-二氯苯氧乙酸 0.001-5毫克 /升、苄氨基嘌呤 0.001-5毫克 /升、脱落酸 0.001-5 毫克 /升、 赤霉素 0.001-5毫克 /升、 3-吲哚丁酸 0.001-5毫克 /升、 萘乙酸 0.001-5 毫克 /升、 芸苔素 0.001-5毫克 /升、 微量元素 0.5〜20ml和水， 其中微量元素的 组成为 H 3 BO 3 0.1-10克 /升， ZnSO 4 -7H 2 O 0.1-10.0克 /升， MnCl 2 -4H 2 O 0.5〜10.0 克 /升， （ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01〜5 克 /升， CuSO 4 '5H 2 O 0.01〜5.0 克 /升， Co(NO 3 ) 2 -6H 2 O 0.01〜5克 /升。
在一个实施例中， 本发明所采用的异养和混养培养基基本上由以 下成分组 成： KNO 3 0.2〜5克 /升、葡萄糖 1〜15克 /升、 K 2 HPO 4 0.1〜2.0克 /升、 MgSO 4 '7H 2 O 0.1-2.0克 /升、 CaCl 2 -2H 2 O 0.05-1.0克 /升、 柠檬酸铁 0·05〜0·5克 /升、 柠檬酸 0.1-1.5克 /升、 脱落酸 0.001-5毫克 /升、 赤霉素 0.001-5毫克 /升、 3-吲哚丁酸 0.001-5毫克 /升、 芸苔素 0.001-5毫克 /升、 微量元素 0.5〜10ml和水， 其中微量 元素的组成为 H 3 BO 3 1-5克 /升、 ZnSO 4 '7H 2 O 0.1〜1.5克 /升、 MnCl 2 '4H 2 O 0.5〜5.0 克 /升、 (ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0·01〜0·2 克 /升、 CuSO 4 -5H 2 O 0.01-0.5 克 /升和 Co(NO 3 ) 2 -6H 2 O 0.05〜0.5克 /升。
在一个较佳的实施方案中，本发明的异养和混 养培养基组合物宜由以下成 分组成： KNO 3 1.2克 /升、 葡萄糖 5克 /升、 K 2 HPO 4 0.6克 /升、 MgSO 4 *7H 2 O 0.8 克 /升、 CaCl 2 0.2克 /升、 柠檬酸铁 0.1克 /升、 柠檬酸 0.6克 /升、 脱落酸 1毫克 /升、 赤霉素 0.8毫克 /升、 芸苔素 2毫克 /升、 微量元素 6 ml和 1000 ml水， 其 中微量元素的组成为 H 3 BO 3 2〜3克 /升， ZnSO 4 *7H 2 O 0.1〜0.3克/升， MnCl 2 H 2 O 1-2.5 克 /升，（ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01-0.04克 /升， CuSO 4 *5H 2 O 0.05〜0.1克 /升， Co(NO 3 ) 2 *6H 2 O 0. 5〜0.1克 /升。
在根据上述配方配制培养基后， 可用常规手段如酸或碱将所述培养基的 pH调为 5.0〜11.0、 优选 7.0〜9.0， 并在 115〜120°C下高压灭菌 15〜20分钟。 可 采用分批培养、 补料分批培养、 重复补料分批培养、 半连续培养或连续培养等 模式实施所述异养或混养培养。
当进行种子异养或混养培养时， 将相应配制好的培养基加入到生物反应器 中， 补加水至工作体积， 通常装料系数为 0.6〜0.8， 然后蒸汽灭菌 （121 °C， 维 持约 20分钟）， 当温度降至 20〜30°C时， 按工作体积的 1〜15%接入葡萄藻开始 异养或混养培养。
当葡萄藻异养培养时， 不需要光照。 当葡萄藻混养培养时， 需要光照， 光 照可以利用自然光 （阳光）， 也可以是人工光， 如荧光灯、 LED灯等。 人工光 源可以在培养液的外部 （外部光源） 或也可以深入到培养液内部 （内部光源）。 光照强度范围 1〜2500 molm-'s- 1 , 在较佳的实施方案中， 光强为 1〜900 molm" 2 s _1 。
无论采用分批培养、 补料分批培养、 重复补料分批培养、 半连续培养或连 续培养中的任何一种培养方式， 在培养过程中， 须控制适合的培养条件使微藻 种子正常生长。 通常， 控制温度为 20〜35 °C， 例如 22〜30°C， 溶氧不低于 5%的 空气饱和浓度， pH控制在 6.0〜9.0。 在优选的实施例中， 温度为 24〜28°C， 溶 氧不低于 10%的空气饱和浓度， pH控制在 7.5〜8.0。
异养培养可以在摇瓶、 机械搅拌式、 气升式、 鼓泡式等可异养培养的生物 反应器中进行。 藻种混养可以在摇瓶、 可蒸汽灭菌的封闭式光生物反应器 （透 明）， 及机械搅拌式等含光照系统的生物反应器 （含外部光源和 /或内部光源） 中进行。
当种子异养和混养培养液中的葡萄糖消耗完后 ， 则种子异养或混养培养结 束。 异养或混养的时间通常在 3-20天左右。
在本发明的方法中， 异养或混养培养葡萄藻过程中， 通过补料控制 pH恒 定以及碳、 氮和 /或磷等元素稳定在一定浓度范围内， 且异养或混养培养结束 时控制碳、 氮和 /或磷等营养成分的浓度较低甚至为零。
异养或混养过程中， 通过补料将藻液的 pH控制在 6.0-10.0的范围内的一 个恒定值，例如 pH 8.0。通常将藻液的 pH控制在 7.5-9.0范围内的一个恒定值， 更优选控制在 7.8-8.5的范围内。
应理解， pH值的些许变动是允许的。 例如， 可允许 pH有士 Y的变动， 其 中 Y 1.0， 例如 Y 0.2、 Y^O. l o 在某些实施例中， Y=0。 因此， 在一个具体 实施例中， 通过补料将藻液的 pH控制为 Χ±Υ， 其中， 该 5.0 Χ士 Υ 9.0。 例如， 在本发明的一个实施方式中， 通过补料将藻液的 pH控制在 8.0± 0.3的 范围之内。
异养或混养培养微藻过程中， 可通过补料将藻液中碳的含量控制在 2-20mM 的范围内， 氮的含量控制在 0.5-10mM 的范围内， 磷的含量控制在 0.05-3.5mM的范围内。
在一具体实施例中， 可通过补料将藻液中碳的含量控制在 2-12mM的范围 内， 氮的含量控制在 l-6mM的范围内， 磷的含量控制在 0.1-2.5mM的范围内。
还包括通过补料将藻液中镁的含量控制在 0.05-3mM的范围内。 在一个具 体实施例中， 通过补料将藻液中镁的含量控制在 0.10-2.0mM的范围内。
异养或混养培养结束时， 将碳、 氮和 /或磷等营养成分的浓度控制为基本 消耗完毕甚至为零， 例如， 碳源的浓度为零， 氮源和 /或磷源 /或镁源的浓度控 制在 O.OlmM以下。 光自养
可先向所获得的葡萄藻异养或混养培养液中添 加光自养培养基， 并添加水 稀释后进行光自养培养。
或者， 可直接对异养或混养培养获得的葡萄藻细胞进 行光自养培养， 即直 接添加光自养培养基进行光自养培养。
随后， 接种到光自养培养装置中进行光自养培养， 即不添加有机化合物， 在必需无机养分和光能存在的情况下， 对作为碳源的 CO 2 进行还原同化， 合成 细胞内所有的有机代谢物进行的培养模式。光 自养培养的初始接种密度通常为
0.01〜1克 /升， 温度为 5〜50°C， 光照强度为 1-2500 μιηοΐιη-^" 1 , 连续光照或间 歇光照， ρΗ为 4.0〜9.0， 通气量为 0.05〜5wm， 通入 CO 2 浓度为 0.03〜10%。
当藻细胞生长处于稳定期时 （即藻细胞密度不增加时）， 则结束光自养培 养， 对藻细胞进行采收。 光自养时间通常为 1-50天。
可采用本领域熟知的各种光自养培养基来进行 光自养培养。 通常， 光自养 培养基含有氮源、 磷源、 无机碳源、 无机盐、 微量元素和水。 适用于微藻培养 的氮源、 磷源、 无机碳源、 无机盐、 微量元素等是本领域周知的。 例如， 作为 氮源， 可使用的有尿素或各种硝酸盐， 如 KNO 3 等； 作为磷源， 可使用的有例 如 K 2 HPO 4 ; 作为无机碳源， 可使用的有例如 CO 2 等。 为了促进细胞快速生长， 本发明创造性地在光自养培养基中添加了植物 生长激素。
本发明所采用的光自养培养基基本上由以下成 分组成： KNO 3 0.1-15 克 / 升、 K 2 HPO 4 0.1〜10.0克 /升、 MgSO 4 '7H 2 O 0.1〜10克 /升、 CaCl 2 '2H 2 O 0.01〜5克 /升、 柠檬酸铁 0.01〜5克 /升、 柠檬酸 0.1〜15克 /升、 2，4-二氯苯氧乙酸 0.001-5 毫克 /升、苄氨基嘌呤 0.001-5毫克 /升、脱落酸 0.001-5毫克 /升、赤霉素 0.001-5 毫克 /升、 3-吲哚丁酸 0.001-5毫克 /升、萘乙酸 0.001-5毫克 /升、 芸苔素 0.001-5 毫克 /升、 微量元素 0.5〜20ml和水， 其中微量元素的组成为 H 3 BO 3 0.1〜10克 / 升 ， ZnSO 4 '7H 2 O 0.1〜10.0 克 / 升 ， MnCl 2 '4H 2 O 0.5〜10.0 克 / 升 ， (ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01-5克 /升， CuSO 4 -5H 2 O 0.01〜5.0克 /升， Co(NO 3 ) 2 -6H 2 O 0.01〜5克 /升。
在一个实施方式中， 本发明所采用的光自养培养基基本上由以下成 分组 成： ΚΝΟ 3 0·2〜5克 /升、 Κ 2 ΗΡΟ 4 0· 1〜2·0克 /升、 MgSO 4 -7H 2 O 0· 1〜2·0克 /升、 CaCl 2 -2H 2 O 0.05〜1.0克 /升、 柠檬酸铁 0.05〜0.5克 /升、 柠檬酸 0.1〜1.5克 /升、 脱落酸 0.001-5毫克 /升、 赤霉素 0.001-5毫克 /升、 3-吲哚丁酸 0.001-5毫克 /升、 芸苔素 0.001-5毫克 /升、微量元素 0.5〜10ml和水，其中微量元素的组成为 H 3 BO 3 1-5 克 /升、 ZnSO 4 -7H 2 O 0.1〜1.5 克 /升、 MnCl 2 -4H 2 O 0.5〜5.0 克 /升、 (ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01-0.2 克 /升 、 CuSO 4 '5H 2 O 0·01〜0·5 克 /升 和 Co(NO 3 ) 2 -6H 2 O 0.05〜0.5克 /升。 在一个较佳的实施方案中，本发明的光自养培 养基组合物宜由以下成分组 成： KNO 3 1.2克 /升、 K 2 HPO 4 0.6克 /升、 MgSO 4 *7H 2 O 0.8克 /升、 CaCl 2 0.2克 /升、 柠檬酸铁 0.1克 /升、 柠檬酸 0.6克 /升、 脱落酸 1毫克 /升、 赤霉素 0.8毫 克 /升、 芸苔素 2毫克 /升、 微量元素 6 ml和 1000 ml水， 其中微量元素的组成 为 H 3 BO 3 2-3 克 /升， ZnSO 4 *7H 2 O 0.1〜0.3 克 /升， MnCl 2 *4H 2 O 1-2.5 克 /升， (ΝΗ 4 ) 6 Μο 7 Ο 24 ·4Η 2 Ο 0.01〜0.04克 /升， CuSO 4 *5H 2 O 0.05〜0.1克 /升， Co(NO 3 ) 2 * 6H 2 O 0. 5〜0.1克 /升。
在根据上述配方配制培养基后， 可用常规手段如酸或碱将所述培养基的 pH调为 6.0〜9.0， 并在 115〜120°C下高压灭菌 15〜20分钟或采用次氯酸钠消毒 灭菌 2〜20 h， 然后用硫代硫酸钠进行中和。 可采用分批培养、 补料分批培养、 半连续培养 （带放） 或连续培养等四种方式实施光自养培养。 藻细胞采收及细胞内总烃的提取
光自养培养结束后， 对葡萄藻进行离心采收， 获得湿藻体。 藻细胞的采收 方法包括但不限于高速离心、 絮凝， 气浮或过滤等技术； 藻细胞破壁方法包括 但不限于藻体自溶、 高压匀浆、 酶水解、 水相热解等湿法破壁方法。
胞内油脂的提取测定方法包括但不限于有机溶 剂萃取法， 即： 将藻体于 80〜105 °C下干燥至恒重，研磨藻粉后采用氯仿甲醇标 准萃取溶剂从干藻粉中提 取油脂， 萃取溶剂反复提取直至藻粉颜色变为白色， 旋转蒸发去除溶剂。
胞内总烃的提取测定方法包括但不限于有机溶 剂萃取法， 即： 将藻体于 80〜105 °C下干燥至恒重， 研磨藻粉后采用正己垸从干藻粉中提取总烃， 萃取溶 剂反复提取直至藻粉颜色变为白色， 用氮气吹干去除溶剂。 总烃的提取方法也 包括直接从培养液中分离细胞中分泌的烃。
本文中涉及到藻细胞干重和总烃含量的测定方 法如下：
藻细胞干重测定： 在葡萄藻培养过程中取培养液 V毫升， 8000 rpm离心 10分钟， 将离心后的藻体用去离子水洗涤 3次， 转移至称量瓶（W1 (克）） 中， 在 80°C烘箱中烘干至恒重 W2 (克）。 藻体干重 Cx可根据下式计算： Cx (克 / 升） = (W2-W1 ) /V/ 1000
油脂测定： 取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞， 在研钵中研磨至粉 末状， 称取适量藻粉（0.2〜0.5 g )小心转移至离心管中， 加入适量萃取溶剂（氯 仿：甲醇 =2: 1 ) 于超声振荡器中超声振荡 30min， 8000rpm离心 10min， 将上清 转移至已知重量的干燥旋转蒸发瓶中， 重复上述步骤直至上清无色。 合并上清 后旋转蒸干， 称重并计算油脂含量。
油脂含量 （％) 按下式计算：
油脂 （％) = ( W2-W0 ) / W1 X 100
式中： W1 为藻粉重量， g 为烘干至恒重的旋转蒸发瓶重量， g; W2 为油脂萃取液蒸干后蒸发瓶的重量， g。
总烃测定： 取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞， 在研钵中研磨至粉 末状， 称取适量藻粉（0.2〜0.5 g )小心转移至离心管中， 加入适量萃取溶剂（正 己垸） 于超声振荡器中超声振荡 30min， 5000rpm离心 10min， 将上清转移至 已知重量的螺口试管中， 重复上述步骤直至上清无色。 合并上清后在室温下用 氮气将正己垸吹干， 称重并计算总烃含量。
总烃含量 （％) 按下式计算：
总烃 （％) = ( W2-W0 ) / W1 X 100
式中： W1 为藻粉重量， g ; wo __为烘干至恒重的螺口试管重量， g ;
W2——为萃取液吹干后螺口试管的重量， g。
以下将通过实施例对本发明的有关内容作进 一步的说明。 除非另有所述， 本发明采用的培养基中各组分含量均用克 /升 (g/L)表示。应理解， 本申请中 "含 有"、 "包含" 也包括 "由……组成"、 "由……构成" 的含义。
实施例 1 : 布朗葡萄藻 iBotryococcus braunii) 细胞异养、 混养及光自养 培养过程中藻细胞生长的研究
本实施例的葡萄藻分别在 500ml的摇瓶中进行异养、 混养和光自养培养。 葡萄藻异养培养的接种密度为 0.05g/l， 温度为 25 °C， 转速为 150rmp。 葡萄藻 混养培养的条件与异养培养一致， 除外部有光照， 光强为 SO molm— 葡萄 藻异养和混养培养到 12d， 培养液中的葡萄糖耗完， 藻细胞密度为 0.70g/l 和 0.78g/L， 可用于下一步光自养培养的种子； 葡萄藻种子光自养培养时的接种密 度为 0.05g/l， 温度为 25°C， 光照强度为 SOO molm— 1 , 连续光照， 培养到 12 d时， 藻细胞密度仅为 0.20g/l， 用于下一步光自养培养的种子 （图 1)。 由此可 见， 与光自养培养相比， 异养培养和混养培养的藻细胞生长速率比光自 养培养 的细胞生长速率快 （分别是光自养培养生长速率的 3.5和 3.9倍） 实施例 2: 控制不同培养工艺条件下的布朗葡萄藻（Sotrj^ coco^ brim Y) 在 5L生物反应器中异养和混养培养过程比较
在 5L生物反应器中加入所述异养或混养培养基和 至 2.5L后进行蒸汽灭 菌， 然后当温度降到 25°C时接入葡萄藻， 开始异养或混养培养。 混养培养时， 外部光照为 OO molm— 在异养或混养培养时， 即开始补料， 通过控制补料 培养基的连续流加将 pH恒定在 8.0±0.3。补料培养基包括有机碳源（葡萄糖） 氮源 （KNO 3 ) 、 植物生长激素、 和无机盐等营养盐， 补加的营养盐是经浓缩 后的上述相应培养基， 促使微藻继续生长， 同时及时监测发酵液中碳、氮、磷、 镁的含量， 适当调整该 4类物质在补料培养基含量， 以保证发酵液中该 4类物 质浓度稳定。 在未加激素的情况下， 其他操作和实验条件皆相同， 仅培养基中 不含有植物生长激素。 而在未优化控制的情况下， 仅监测发酵液中的 pH， 通 过补料培养基保持 pH恒定在 8.0±0.3， 其他物质如碳、 氮、 磷、 镁的含量不 做控制， 并且激素类物质亦不添加， 其他实验条件和操作相同。
结果见图 2。 在异养培养结束时， 控制 pH和补料策略， 且加入植物激素 的异养培养， 其细胞干重达到 15.6 g/1; 而只控制 pH和补料策略但不加入植物 激素的异养培养， 其细胞干重达到 6.5g/l; 而未优化补料策略且不加入植物激 素的异养培养， 其细胞干重仅为 4.1 g/l。 因此， 控制补料策略优化且加入植物 激素的异养培养， 与单纯控制 pH但未优化补料策略且未加植物生长激素的异 养培养相比， 细胞密度提高了 2.8倍； 而与只控制 pH和补料策略但不加入植 物激素的异养培养相比， 细胞密度提高了 1.4倍。 在混养培养结束时， 控制 pH 和补料策略， 且加入植物激素的异养培养， 其细胞干重达到 16.5 g/1; 而只控 制 pH和补料策略但不加入植物激素的异养培养， 其细胞干重达到 7.6g/l; 而 未优化补料策略且不加入植物激素的异养培养 ， 其细胞干重仅为 4.8 g/lo 实施例 3 : 葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在室内 2L光生物反 应器中进行光自养培养的研究
本实施例在室内 2L圆柱型气升式光生物反应器中光自养培养异 、 混养 及光自养的葡萄藻种子， 分别测定了异养、 混养和光自养种子在其光自养过程 中的藻细胞密度、 最终油脂和总烃含量及产率。 异养、 混养和光自养种子的接 种密度均为 0.3g/l， 光自养培养温度均为 25 °C， 均通入 2%的 CO 2 ， 通气量均 为 0.25vvm。 在混养和光自养培养时光照强度为 l l l molm— 2 s— 连续光照。 光 自养培养到 12 d， 异养种子的藻细胞密度为 1.98g/l， 总烃产率为 50.58mg/l/d， 油脂产率 33.61 mg/1/d ; 混养种子的藻细胞密度为 2.1g/L， 总烃产率为 58.13mg/l/d, 油脂产率为 37.35 mg/1/d; 光自养种子的藻细胞密度仅为 0.98g/l， 总烃产率仅为 21.08mg/l/d， 油脂产率 13.62 mg/1/d (图 3和图 4)。 由此可见， 与光自养种子相比， 异养和混养种子的活力更强， 相同培养时间的藻细胞密度 更高 （分别是光自养种子的 2.02和 2.14倍）， 总烃产率更高 （分别是光自养种 子的 2.40和 2.76倍）， 油脂产率更高 （分别是光自养种子的 2.47和 2.74倍）。 实施例 4 : 葡萄藻异养种子、 混养种子和光自养种子在户外 60L (装液量 40L) 塑料盆中进行光自养培养的研究
本实施例在户外 60L塑料盆中光自养培养异养、混养及光自养的 葡萄藻种 子， 分别测定了异养、 混养和光自养种子在其光自养过程中的藻细胞 生长及总 烃产率。 初始接种密度为 0.15g/l， 温度及光强均为户外自然温度和光强， 通气 量为 0.3wm。 光自养培养到 12 d。 异养种子的藻细胞密度为 0.92g/l， 总烃产 率为 21.85mg/l/d， 油脂产率 16.28 mg/1/d; 混养种子的藻细胞密度为 0.95g/L， 总烃产率为 23.32mg/l/d， 油脂产率 17.37 mg/1/d; 光自养种子的藻细胞密度仅 为 0.45g/l， 总烃产率仅为 9.49mg/l/d， 油脂产率 7.5 mg/1/d (见图 5和图 6)。 由此可见， 与光自养种子相比， 异养和混养种子的活力更强， 相同培养时间的 藻细胞密度更高 （分别是光自养种子的 1.92和 1.98倍）， 总烃产率更高 （分别 是光自养种子的 2.30和 2.46倍）， 油脂产率更高 （分别是光自养种子的 2.17 和 2.31倍）。 尽管上面已经描述了本发明的具体例子， 但是有一点对于本领域技术人员 来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对 本发明作各种变 化和改动。 因此， 所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内 的变动。