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Title:
METHOD OF DETECTING ADENOSINE TRIPHOSPHATE (ATP)
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2004/057316
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method of detecting adenosine triphosphate (ATP) involving the use of silicon oxides which are functionalised with organic molecules that can emit a macroscopically-measurable signal when in aqueous suspension and in the presence of ATP. The aforementioned functionalised solids are prepared by activating the surface of the inorganic material, anchoring the active molecule and eliminating the non-anchored reagents. Once the functionalised solid has been obtained, the ATP detection method comprises the following steps consisting in: 1ª) suspending the solid in an aqueous medium; 2ª) mixing the suspension with dissolutions of ATP; and 3ª) measuring the variation in the characteristic signal of the functionalised solid. The materials used have the following compositions: (SiO2)1-x-y[SiO(4-n)/2 (OH)n]x(SiO3/2R)y(SiO2)1-x-y-z(AoOa) z/o (M2O)z' [SiO(4-n)/2 (OH)n]x(SiO3/2R)y; 0 $m(F) x $m(F) 1; 0 < y < 1; 0 $m(F) z $m(F) 1; 0 < z' < 0.5; n=1, 2; A represents a metal from groups (3-7)A and (1-8)B; M represents an alkaline metal; R represents an organic molecule (macroscopic signal in solution). Said materials can be obtained in the form of dispersed powders or monoliths.

Inventors:
MARTINEZ MANEZ RAMON (ES)
SOTO CAMINO JUAN (ES)
MARCOS MARTINEZ MARIA-DOLORES (ES)
DESCALZO LOPEZ ANA-BELEN (ES)
JIMENEZ HUERTA DIEGO-JOSE (ES)
AMOROS DEL TORO PEDRO-JOSE (ES)
BELTRAN PORTER DANIEL (ES)
EL HASKOURI JAMAL (ES)
Application Number:
PCT/ES2003/000653
Publication Date:
July 08, 2004
Filing Date:
December 22, 2003
Export Citation:
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Assignee:
UNIV VALENCIA POLITECNICA (ES)
UNIV VALENCIA (ES)
MARTINEZ MANEZ RAMON (ES)
SOTO CAMINO JUAN (ES)
MARCOS MARTINEZ MARIA-DOLORES (ES)
DESCALZO LOPEZ ANA-BELEN (ES)
JIMENEZ HUERTA DIEGO-JOSE (ES)
AMOROS DEL TORO PEDRO-JOSE (ES)
BELTRAN PORTER DANIEL (ES)
EL HASKOURI JAMAL (ES)
International Classes:
C07H19/167; G01N21/64; G01N21/78; (IPC1-7): G01N21/78; C07H19/167
Domestic Patent References:
WO2003065408A22003-08-07
Other References:
DESCALZO ANA B. ET AL.: "A new approach to chemosensors for anions using MCM-41 grafted with amino groups", ADV. MATER., vol. 14, no. 13-14, 4 July 2002 (2002-07-04), pages 966 - 969, XP001130564, DOI: doi:10.1002/1521-4095(20020704)14:13/14<966::AID-ADMA966>3.0.CO;2-G
DATABASE HCAPLUS [online] OHNO Y. ET AL.: "Selective dtermination of chemiluminiscence method", Database accession no. 1993:423922
DATABASE HCAPLUS [online] STN; OHNO Y. ET AL.: "Sensitive chemiluminescent detection of nucleosides and their derivatives using the material exchange of chemically cooper(II)-modified natural zeolite", Database accession no. 1993:32369
BEER PAUL D. ET AL.: "Phosphate anion binding and luminisecent sensing in aqueous solution by ruthenium (II) bipyridyl polyaza receptors", NEW J. CHEM., no. 23, 1999, pages 347 - 349
Attorney, Agent or Firm:
Durán, Ortega Sila (CTT- Edif. I2 y I2 Camino de Vera s/n, Valencia, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES
1. Un método para la determinación de trifosfato de adenosina (ATP) en un medio acuoso, que comprende las siguientes etapas: a) preparar una suspension de una matriz silicea de tipo UVM7, UVM8, MUVM7 o MUVM8 funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolucion, que, en su forma anhidra e indistintamente de que se trate de polvos o monolitos, tiene la formula (I) 6 (in) : (Si02) lxy [SiO (4n) l2 (OH) n] x (SiO3/2R) y (I) (Si02) 1xyz (AoOa) z/o (M20) z' [S10 (4n)/2 (OH) n] x (Si03/2R) y (II) en donde "x","y","z"y"z"'representan fracciones molares que definen la composicion empirica del material funcionalizado anhidro y toman valores reales definidos por las condiciones siguientes: x es un numéro mayor que 0 y menor que 1; y es un numéro mayor que 0 y menor que 1; z es un numéro mayor que 0 y menor que 0.5 ; z'es un numéro inferior a z/2; "n"representa un numéro entero menor que cuatro y mayor que cero; "A"representa un metal de valencia"p"seleccionado entre: un metal perteneciente al grupo 3A, preferentemente B y Al ; un metal perteneciente al grupo 3B, preferentemente Sc, Y, La y los lantánidos ; un metal perteneciente al grupo 4A, preferentemente Ge, Sn y Pb; un metal perteneciente al grupo 5B, preferentemente P y Bi; un metal perteneciente al grupo 4B, preferentemente Ti y Zr; un metal perteneciente al grupo 5B, preferentemente V; un metal perteneciente al grupo 6B, preferentemente Mo; un metal perteneciente al grupo 7B, preferentemente Mn; un metal perteneciente al grupo 8B, preferentemente Fe, Co y Ni; un metal perteneciente al grupo 1B, preferentemente Cu; y un metal perteneciente al grupo 2B, preferentemente Zn; "M"representa uno o mas elementos monovalentes, preferentemente Na; "R"representa el resto de un compuesto organic anclado a la matriz de silice a través de un enlace directo carbonosilicio; y en la formula (In, los subindices"o"y"a"representan numeros de atomos por formula que satisfacen la relation : o x p = 2 x a; b) anadir la disolución que contiene ATP a ensayar sobre dicha suspension preparada en la etapa a); y c) medir la senal macroscópicamente observable y/o medible producida y, si se desea, cuantificar la concentración de ATP en la disolución que contiene ATP ensayada por interpolación en una curva de calibrado.
2. Método segun la reivindicación 1, en el que dicha matriz silicea de tipo UVM7, UVM8, MWM7 o MUVM8 funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscopicamente observable y/o medible en disolución, que, en su forma anhidra e indistintamente de que se trate de polvos o monolitos, tiene dicha formula (1) 6 (II) y esta formada por un agregado de particulas microporosas o mesoporosas soldadas de un tamano comprendido entre 12 y 70 nm, y un segundo sistema de poros de tamano comprendido entre 20 y 100 nm.
3. Método segun la reivindicación 1, en el que dicha matriz silicea de tipo UVM7, UVM8, MUVM7 o MUVM8 funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución, que, en su forma anhidra e indistintamente de que se trate de polvos o monolitos, tiene dicha formula (1) 6 (II) y se presenta en la forma de un monolito obtenible mediante moldeo o extrusion.
4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución es una senal detectable mediante un sistema optico.
5. Método segun la reivindicación 4, en el que dicha senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución es una senal detectable mediante un sistema fluorimetrico o colorimétrico.
6. Método segun la reivindicación 1, en el que dicha matriz silicea funcionalizada se suspende en agua o en cualquier otro medio en el que sea soluble el ATP.
7. Método segun la reivindicación 1, en el que dicha disolución que contiene ATP a ensayar es una disolución acuosa de ATP o una disolución de ATP en cualquier otro disolvente o mezcla de disolventes que sean capaces de disolver al ATP.
8. Método segun la reivindicación 1, en el que el producto resultante de anadir la disolución que contiene ATP a ensayar a la suspension de la matriz silicea funcionalizada, se homogeniza, y se deja que el ATP reaccione con la matriz silicea funcionalizada durante el periodo de tiempo necesario hasta obtener una respuesta de la senal macroscopicamente observable y/o medible constante.
9. Método segun la reivindicación 1, en el que dicha matriz silicea es una slice del tipo UVM7, con una superficie especifica de aproximadamente 1.000 m2/g.
10. Método segun la reivindicación 1, en el que la determinación del ATP se basa en el efecto quenching sobre la fluorescencia tipica del antraceno que se genera al coordinarse el ATP a dicho grupo organic.
11. Método segun la reivindicación 10, en el que el resto del compuesto organic anclado a la matriz de silice a través de un enlace carbonosilicio que proporciona la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución es un resto de un compuesto organic que contiene un grupo antraceno.
12. Método según la reivindicación 11, en el que el compuesto organic anclado a la matriz de silice a travers de un enlace directo carbonosilicio contiene un grupo antraceno y tiene la formula : n[antraceno(m'R')] R ; donde R'representa la cadena carbonada que une el grupo antraceno a la matriz silicea, que puede ser una amina, poliamina, acido, alcohol, polialcohol o cualquier otra function organic capaz de aumentar la interacción con el ATP; n es el n° del carbono en el grupo antraceno en el que se inserta dicha cadena carbonada de union a la matriz ; y (miRi) representa las posibles derivatizaciones del grupo antraceno.
13. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 11 6 12, en el que la mezcla resultante de poner en contacto la disolucion acuosa que contiene ATP con la suspension acuosa de la matriz silicea funcionalizada se homogeniza, se introduce en una celda de medida de un sistema fluorimetrico y se mide la senal macroscopciamente observable y/o medible en disolución.
14. Método segun la reivindicación 1, implementado en un equipo de medida rapid que comprende un dispositivo mecánico que permita la reaction entre la matriz silicea funcionalizada y el ATP presente en la disolución a ensayar y el calculo de su concentración por comparación con un patron de concentraciones.
15. Método segun la reivindicación 14, en el que dicho dispositivo mecánico en el que se implementa comprende tiras o bandas para ensayos analiticos.
Description:
METODO PARA LA DETERMINACION DE TRIFOSFATO DE ADENOSINA (ATP) CAMPO DE LA INVENCION La invention se refiere a un método para la determinación de trifosfato de adenosina (ATP) en un medio acuoso basado en el empleo de una matriz silicea funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Durante los ultimos anos se ha puesto de manifiesto un creciente interns en el estudio y desarrollo de nuevos sensores quimicos para aniones que fueran capaces de desarrollar una senal macroscópica de tipo optico. En presencia de los aniones a detectar, estos sensores espectroscópicos deberían responder mediante una variation de la fluorescencia (fluoroionoforos) o mediante un cambio en la absorbancia (cromoionoforos). Ejemplos de sensores de aniones de tipo fluorescente son: D. H. Vance et al. J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) pag. 9397-9398; G. D. Santis et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35 (1996) pag.

202; M. T. Albelda et al. , J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 (1999) pag. 2545-2549; R.

Prohens et al., Chem. Commun., 2001 pag. 1456; M. E. Padilla-Tosta et al, Eur. J. Inorg.

Client., 2001 pag. 1221-1226; y sensores colorimétricos de aniones: S. Watanabe et al., J.

Am. Chem. Soc., 120 (1998) pag. 229-230; K. Niikura et al. , J. Am. Client. Soc., 120 (1998) pag. 8533-8534; J. J. Lavigne, E. V. Anslyn, Angew. Client. Iras. Ed., 38 (1999) pag. 3666-3669; P. Anzenbacher, Jr. et al. , Am. Chem. Soc., 122 (2000) pag. 10268- 10272; F. Sancenón et al., Anges. Chem. Int. Ed., 40 (2001) pag. 2640-2643. Entre todos los sensores desarrollados, son de especial interns los basados en cambios de absorbancia puesto que de esta forma la presencia de las especies aniónicas a determinar puede ser fácilmente reconocible a través de un simple cambio de color. El diseno de nuevos sensores quimicos se ha abordado desde diferentes enfoques, en la mayor de los casos el proceso implica el acoplamiento de una molécula capaz de enlazar con el/los aniones a determinar, con otra molécula que genere la correspondiente senal macroscópica, bien sea por fluorescencia o por cambio de absorción. Sin embargo, en la mayoria de los casos la senal

optic es solamente observable en disolventes no acuosos como por ejemplo cloroformo o acetonitrilo, y son realmente escasos los ejemplos de sensores quimicos para aniones que sean capaces de trabajar en medio acuoso. Un enfoque alternativo a este, basado en el reconocimiento de aniones, es la utilización de reacciones especificas producidas por los aniones que se desean detectar, convenientemente acopladas con un proceso simultane que de lugar a una senal macroscópicamente medible.

Estas ideas han sido principalmente aplicadas en el desarrollo de sistemas receptores que funcionan en disolución. Una aproximación diferente supone el aprovechar las cavidades de matrices sólidas que, a la vez, son capaces de conectarse a las moléculas sensoras. Un acoplamiento adecuado entre la matriz inorganic y las moléculas organisas podna satisfacer no solo las necesidades de enlace, sino zambien otros aspectos relacionados con el tamano y la forma de las especies a detectar.

Entre los solids inorgánicos utilizados como matrices huésped para la realización de la llamada quimica fina, la silice destaca por su elevada estabilidad quimica y termina.

Ademas, la amplia disponibilidad de precursores y la lenta cinética que presentan la mayoria de ellos hace que sea posible la obtention de matrices silices con muy diferentes características tanto a nivel macroscópico como microscópico. De especial interns son las silices de elevada superficie especifica, y entre estas, los materiales denominados como MCM-41, que son solids porosos, en el rango de los mesoporos (2-50 nm), con topologfa y tamano de poro altamente controlado. Estos materiales son especialmente interesantes debido a la posibilidad de controlar mediante parámetros de síntesis habituales <BR> <BR> (temperatura, tiempo, pH, etc. ) las características de la superficie accesible y la morfologia de las particulas y conglomerados que forman los solids.

Se ha dedicado un esfuerzo enorme por parte de la comunidad cientifica al estudio de estos materiales y a la exploración de sus posibles aplicaciones. Entre la bibliografia relacionada cabe destacar los trabajos en los que se plantea la modificación de la matriz de slice mediante el anclaje en la superficie de moléculas organicas con funciones definidas, como por ejemplo, X. Feng et al. que en Science 276 (1997) pag. 923 presentan la sfntesis de silices mesoporosas modificadas con una monocapa de propilmercaptano unido covalentemente a la superficie. Es interesante el trabajo de G. Wirnsberger et al. en Chem.

Com., 2001 pag. 119 en el cual se describe el anclaje de grupos fluorescentes sobre matrices de silice y los trabajos de H. S Zhou et al. en Adv. Mater., 11 (1999) pag. 683 y B. Lebeau et al. en J. Mater. Chem. 10 (2000) pag. 2105 en los que se describe el anclaje de colorantes.

Zambien es interesante el trabajo de J. Ph. Soumillion et al. en Tetrahedron Lett. 39 (1996) pag. 7039, en el que describen la utilizacion de un gel de silice corriente funcionalizada con aminometilantraceno como un indicador fluorescente de pH, mientras que D. Wöhrle et al. en Anges. Chem. Int. Ed. 39 (2000) pag. 161 describen el anclaje en MCM-41 de la sulforhodamina B y de un colorante azoico mediante co-condensación hidrotermal asistida por microondas, pero no plantean ninguna aplicación de los materiales obtenidos. Debido al gran interns que ha suscitado este tema, se han publicado varias revisiones bibliográficas dedicadas exclusivamente a materiales tipo MCM-41 en los que la superficie se ha modificado con moléculas organicas, como por ejemplo K. Moller et al. en Chem. Mater 10 (1998) pag. 2950, o zambien A. Stein en Adv. Mater. 12 (2000) pag. 1403.

A pesar del gran número de trabajos publicados en este tema, no existe ningun ejemplo de materiales ordenados a escala nanometrica que hayan sido aplicados para la determinación de ATP. El método habitual y casi unico de determinar el ATP esta basado en una reaction encimática de la lucifenn luciferasa que da lugar a la formation de un producto luminiscente.

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención se enfrenta, en general, con el problema de proporcionar un método alternativo para la determinación de ATP en medio acuoso.

La solution proporcionada por esta invention se basa en el cambio que se produce en las propiedades cromóforas y/o fluoróforas de diversas moléculas organisas ancladas en la superficie de una matriz silicea cuando dicha matriz silicea funcionalizada se pone en contacto con la disolución que contiene ATP. Por tanto, la invention proporciona un método para determinar ATP en un medio acuoso que comprende poner en contacto la disolución de ATP a ensayar con la matriz silicea que previamente ha sido funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscopicamente observable y/o medible y evaluar la aparición de un evento macroscópicamente observable

y/o medible, en donde la aparición de dicho evento es indicativo de la presencia de ATP en dicha disolución de ATP ensayada, y, si se desea, calcular la concentración de ATP en dicha disolución de ATP ensayada por interpolación en una curva de calibrado.

Un método como el proporcionado por esta invention permite detectar y, si se desea, cuantificar, la presencia de ATP en un medio acuoso, de forma rapida, sencilla y reproducible. Ademas, mediante la puesta en practice de dicho método se eliminan interferentes propios de otros métodos de determinación de ATP.

Por consiguiente, un aspecto de la invention se relaciona con un método para la determinación de ATP en un medio acuoso que comprende el empleo de una matriz silicea funcionalizada mediante el anclaje de un sistema organico capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible.

Otro aspecto de la invención se relaciona con la utilización como sensor selectivo de ATP de dicha matriz silicea funcionalizada mediante el anclaje de un sistema organic fluorogenico o cromogénico capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible.

BREVE DESCRIPCI6N DE LAS FIGURAS La Figura l. a) es un esquema ilustrativo del procedimiento de obtención de los materiales de matriz silicea funcionalizados con un sistema organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible. La Figura l. b) muestra la estructura molecular del compuesto organic utilizado como modelo molecular para la cuantificación del efecto del anclaje del grupo organic sobre la matriz silicea (vease la Figura 6).

La Figura 2 es una gráfica que muestra el espectro de difracción de rayos X (radiación CuKoc) del óxido de silicio mesoporoso UVM-7 funcionalizado con antraceno preparado segun el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 3 es una imagen de SEM (microscopia electrónica de barrido) del producto obtenido en el Ejemplo 1 (la barra corresponde a 1 pm).

La Figura 4 es una gráfica que muestra las isotermas de adsorción-desorción de nitrogen (cruces y circulos blancos, respectivamente) del producto del Ejemplo 1 (curva b). La curva"a"corresponde al material UVM-7 antes de funcionalizar. En el recuadro

pequeno se muestran las distribuciones de poro antes (a) y después (b) del anclaje de las moléculas organisas capaces de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible.

La Figura 5 muestra el espectro de RMN de 29Si del producto obtenido en el Ejemplo 1.

La Figura 6 es una representación grafica de la respuesta obtenida a partir del producto obtenido en el Ejemplo 1 (rombos negros) frente a la adición de ATP siguiendo el método descrito en el Ejemplo 2. Se muestra zambien con fines comparativos la respuesta de la slice de alta superficie pero no porosa igualmente funcionalizada (triangulos negros) y la respuesta de un detector de ATP de base molecular cuya estructura es semejante al grupo detector anclado en la matriz silicea [Ll en la Figura l. b)] (triangulos blancos).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un primer aspecto, la invention se relaciona con un método para la determinación de ATP en un medio acuoso, en adelante método de la invencion, que comprende las siguientes etapas: a) preparar una suspension de una matriz silicea de tipo UVM-7, WM-8, M-UVM-7 o M-UVM-8 funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución, que, en su forma anhidra e indistintamente de que se trate de polvos o monolitos, tiene la formula (I) 6 (n) : (Si02) l x y [siO (4 n)/2 (OH) n] x (SiO3/2R) y (I) (Si02) 1-x-y-z (AoOa) z/o (M20) z' [SiO (4-n)/2 (OH) n] x (SiO3/2R) y (IT) en donde x","y","z"y"z"'representan fracciones molares que definen la composicion empirica del material funcionalizado anhidro y toman valores reales definidos por

las condiciones siguientes: - x es un numero mayor que 0 y menor que 1; - y es un numéro mayor que 0 y menor que 1; - z es un numero mayor que 0 y menor que 0.5 ; - z'es un número inferior a z/2; "n"representa un numero entero menor que cuatro y mayor que cero; "A"representa un metal de valencia"p"seleccionado entre: un metal perteneciente al grupo 3A, preferentemente B y Al ; un metal perteneciente al grupo 3B, preferentemente Sc, Y, La y los lantánidos ; un metal perteneciente al grupo 4A, preferentemente Ge, Sn y Pb; un metal perteneciente al grupo 5B, preferentemente P y Bi; un metal perteneciente al grupo 4B, preferentemente Ti y Zr; un metal perteneciente al grupo 5B, preferentemente V; un metal perteneciente al grupo 6B, preferentemente Mo; un metal perteneciente al grupo 7B, preferentemente Mn ; un metal perteneciente al grupo 8B, preferentemente Fe, Co y Ni; un metal perteneciente al grupo 1B, preferentemente Cu; y un metal perteneciente al grupo 2B, preferentemente Zn; "M"representa uno o mas elementos monovalentes, preferentemente Na; "R"representa el resto de un compuesto organic anclado a la matriz de silice a través de un enlace directo carbono-silicio; y en la formula (II), los subíndices"o"y"a"representan numerous de atomos por formula que satisfacen la relation : o x p = 2 x a; b) anadir la disolución que contiene ATP a ensayar sobre dicha suspension preparada en la etapa a); y c) medir la senal macroscópicamente observable y/o medible producida y, si se desea,

cuantificar la concentración de ATP en la disolución que contiene ATP ensayada por interpolación en una curva de calibrado.

Tal como se utiliza en esta descripcion, la expresion"matriz silicea funcionalizada" se refiere a dicha matriz silfcea de tipo UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M-UVM-8 funcionalizada con un compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución, que, en su forma anhidra e indistintamente de que se trate de polvos o monolitos, tiene la formula (I) 6 (II) previamente definidas.

La matriz silfcea funcionalizada se caracteriza, ademas de por su composición quimica, porque la matriz silicea es una matriz de una silice mesoporosa del tipo UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M-UVM-8, y, consecuentemente, dicha matriz silicea funcionalizada presenta, entre otras, las caracteristicas distintivas de los materiales descritos en la solicitud de patente espanola P200102777J.

En una realización particular, la matriz silicea funcionalizada esta formada por un agregado de particulas microporosas o mesoporosas soldadas de tamano nanométrico, comprendido entre 12 y 70 nm, lo que genera un segundo sistema de poros de mayor tamano, comprendido entre 20 y 100 nm, entre mesoporos grandes y macroporos. Asimismo, en una realización particular, dicha matriz silicea funcionalizada se presenta en la forma de un monolito obtenible mediante moldeo o extrusion.

La matriz silicea funcionalizada, asf como un procedimiento para su obtention, se describe en la solicitud de patente espanola P200200307.

Brevemente, la obtention de dicha matriz silicea funcionalizada consta dos etapas bien diferenciadas, una primera etapa que comprende la obtention de la matriz silice, y una segunda etapa que comprende la funcionalización de la superficie de dicha matriz silicea con compuestos orgánicos capaces de proporcionar una senal macroscopicamente observable y/o medible en disolución.

La matriz silicea se puede obtener mediante el procedimiento de sintesis descrito por S. Cabrera et al., en Solid State Sciences, 2 (2000), pag. 405; J. El Haskouri et al., Chem.

Commun (2002), pag. 330; P. Amorous et al. , solicitud de patente PCT WO 01/72635 ; y P.<BR> <P>Amorous et al. , solicitud de patente espanola P200102777J. Posteriormente, la

funcionalización con los compuestos orgánicos encargados de proporcionar la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución, se lleva a cabo por reaction de los silanoles de la matriz silicea con diferentes alcoxisilanos que quedarán anclados a la superficie de la matriz silicea por condensación. Una vez anclado el silano a la superficie de la matriz silicea, se hace reaccionar convenientemente la cadena carbonada para conseguir la function organic que dard lugar a la generation de la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución. Este proceso de funcionalización ha sido descrito por A. B. <BR> <BR> <P>Descalzo et al., Clzem. Comnaurz (2002), pag. 562; y R. Martínez-Máñez et al. , solicitud de patente espanola P200200307.

La senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución puede ser cualquier senal detectable mediante un sistema optic apropiado, por ejemplo, por un sistema fluorimetrico o colorimetrico. Por tanto, el compuesto capaz de proporcionar la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución puede ser cualquier compuesto susceptible de ser detectado en disolución por un sistema optico. En una realización particular, dicho compuesto capaz de proporcionar la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución es un compuesto fluorogenico o cromogénico.

La matriz silicea funcionalizada se suspende en un disolvente apropiado, por ejemplo, agua, aunque zambien puede ser cualquier otro disolvente o mezcla de ellos según convenga por el tipo de muestra que se desee medir, siempre y cuando el medio elegido sea capaz de disolver al ATP. Sobre la suspension resultante se anade la disolución que contiene ATP a ensayar, tal como una disolución acuosa de ATP, aunque podia ser cualquier otro disolvente que disuelva al ATP y sea miscible con el utilizado para la suspension de la matriz. Zambien podia suspenderse la matriz silicea funcionalizada directamente en la disolución que contiene el ATP a determinar. El producto resultante de mezclar la suspension de la matriz silicea funcionalizada con la disolución que contiene ATP a ensayar, se homogeniza, por ejemplo, mediante agitacion, y se deja que el ATP reaccione con la matriz silicea funcionalizada de forma que el compuesto organic anclado sobre la matriz desarrolle la senal macroscópicamente observable y/o medible, y se obtenga una respuesta constante. La senal macroscópicamente observable y/o medible producida se mide utilizando el sistema de detection y medida apropiado y, si se desea, se cuantifica la concentración de ATP en la disolución que contiene ATP ensayada por interpolación en

una curva de calibrado, tal como una curva de calibrado que relaciona la concentración de ATP con el valor de la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución.

Para la elaboración de la curva de calibrado que relaciona la concentración de ATP con el valor de la senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución, la suspension de matriz silicea funcionalizada se distribuye en alicuotas y sobre ellas se anaden unas disoluciones patron de ATP en medio acuoso, preparadas disolviendo cantidades conocidas de ATP en volumens conocidos de agua. Zambien podria realizarse la curva de calibrado en cualquier otro disolvente (o mezcla de disolventes) que pudiera convenir por el tipo de muestra a analizar, siempre que el disolvente (o mezcla) elegido disuelva al ATP. La medida de la senal macroscópicamente observable y/o medible en las suspensiones resultantes de adicionar las disoluciones patron de ATP sobre dichas alicuotas preparadas a partir de dicha suspension de matriz silicea funcionalizada proporciona los distintos puntos de calibrado.

En una realización concreta del método de la invention (vease el Ejemplo 2), este se basa en el efecto quenching sobre la fluorescencia tipica del antraceno que se genera al coordinarse el ATP a dicho grupo organic. De esta forma, en una realización particular, el compuesto organic anclado a la matriz de silice a través de un enlace directo carbono-silicio que contiene un grupo antraceno tiene la formula : n- [antraceno- (m i-R i)] R, donde R' representa la cadena carbonada que une el grupo antraceno a la matriz silicea, que puede ser una amina, poliamina, acido, alcohol, polialcohol o cualquier otra function organic capaz de aumentar la interacción con el ATP; n es el n° del carbono en el grupo antraceno en el que se inserta dicha cadena carbonada de union a la matriz silicea ; y (mi-Ri) representa las posibles derivatizaciones del grupo antraceno. En la Figura l. a) se representa una matriz silicea funcionalizada con el grupo 3- [antraceno-9-metil] aminopropilo.

La suspension acuosa de la matriz silicea funcionalizada se pone en contacto con una disolución acuosa de ATP. La mezcla resultante se homogeniza, se introduce en la celda de medida y se obtiene la respuesta por el método correspondiente, por ejemplo, fluorimetrico, resultando en una disminución de la senal a medida que la concentración de ATP aumenta, tal y como se muestra en la Figura 6. En dicha figura se compara el efecto quenching generado por la interacción de ATP sobre el grupo antraceno en distintos casos, concretamente, (i) soportado sobre silice porosa bimodal del tipo UVM-7 como el grupo 3-

[antraceno-9-metil] aminopropilo, (ii) soportado sobre silice masiva no porosa de alta superficie zambien como 3- [antraceno-9-metil] aminopropilo; y (iii) en disolución formando parte del ligando Ll (8- [antraceno-9-metil] aminooctilo), que es el equivalente molecular al grupo activo anclado sobre dichos solids [vease el Ejemplo 2 para una breve discussion de los resultados obtenidos].

La metodologia propuesta en la presente invention para la detection de ATP se basa en el perfecto acoplamiento existente entre las caracteristicas de la matriz silicea y el compuesto que proporciona la senal macroscopicamente observable y/o medible en disolución para la detection del ATP. En una realización particular, la matriz silicea elegida ha sido una silice de la familia denominada UVM-7. Esta matriz ha sido escogida por su gran superficie especifica (aproximadamente 1.000 m2/g), que permite el maxim grado de anclaje de moléculas del compuesto organic capaz de proporcionar una senal macroscopicamente observable y/o medible cuando esta en disolución. Ademas, el empleo de una matriz silicea de tipo LTVM-7, descrita en la solicitud de patente P200102777J, como matriz silicea para el anclaje de los compuestos capaces de proporcionar una senal macroscópicamente observable y/o medible en disolución presenta la ventaja adicional frente a otros sistemas mesoporosos de disponer de un sistema bimodal de poros; es decir, dicha matriz silicea de tipo UVM-7 esta estructurada en forma de particulas mesoporosas que se unen entre si para formar conglomerados nanométricos, dando lugar a la formation de un segundo sistema de poros que esta situado en el intervalo comprendido desde los mesoporos grandes hasta los macroporos. Aunque el proceso de funcionalización de la matriz de lugar a una obturation del sistema de mesoporos ordenados, el segundo sistema de poros, que queda todavia abierto, permitira una mejor accesibilidad de la especie quimica a detectar (ATP) hasta las particulas funcionalizadas y, por tanto, una respuesta mas rapida y fiable de la matriz silicea funcionalizada a la presencia de ATP en el medio.

El método para la determinación de ATP proporcionado por esta invention puede ser implementado en un equipo de medida rapid que comprende un dispositivo mecánico que permita la reaction entre la matriz silicea funcionalizada y el ATP presente en la disolución a ensayar y el calculo de su concentración por comparación con un patron de concentraciones.

En una realización particular, dicho dispositivo mecánico en el que se implementa el método de determinación de ATP proporcionado por esta invention comprende tiras o bandas para

ensayos analiticos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con la utilización como sensor selectivo de ATP de dicha matriz silicea funcionalizada previamente definida.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 Obtention de oxido de silicio con sistema bimodal de poros funcionalizado con antraceno [Figura 1] La matriz silicea UVM-7 (oxido de silicio con sistema bimodal de poros obtenido segun la solicitud de patente P200102777J) se seca en estufa a 110°C para eliminar el agua adsorbida, se suspende en tolueno anhidro (tipicamente 1 g de solido/30 mL tolueno) y se anade 3-aminopropiltrietoxisilano en exceso para favorecer la maxima funcionalización posible del material (0,013 mol/g solido) bajo atmósfera inerte de argon. Se calienta a unos 110°C y se mantiene en agitation durante un dia. El producto asi obtenido se filtra y se lava con diclorometano y etanol para eliminar el exceso de reactivo que no ha condensado con los grupos silanoles (SiOH) de la pared del solid y se deja secando en la estufa a 70°C durante un par de horas.

Se prepara una suspension de dicho solid en etanol absoluto (1 g/30 mL EtOH), se anaden 0,5 g de 9-antraldehido y se calienta a 45°C durante 1 dia. Sobre esta misma mezcla de reaction se anade NaBH4 en exceso para la reduction de la imina formada y se deja agitando a temperatura ambiente durante 10-12 h. El producto asi obtenido se filtra y se lava con HC1 10-2 M para neutralizar el NaBH4 y con agua destilada hasta pH = 5-6.

El solid obtenido se mantiene en extraction en un Soxhlet con etanol durante 1-2 dias. El material final presenta un difractograma de rayos X [Figura 2] con un pico a un angulo correspondiente a 35A caracteristico de materiales tipo UVM-7. En la Figura 3 se muestra una imagen de SEM representativa de este solid donde se pueden apreciar las particulas nanométricas que caracterizan a este material. En la Figura 4 se muestra una curva de adsorcion/desorcion tipica de este material en la que aparece el salto a altas presiones que indica presencia de macroporosidad de tipo textural. En la Figura 5 se

muestra un espectro de 29Si-RMN que muestra claramente que el 22% de los centros de silicio han sido funcionalizados, lo que se manifiesta en la senal de tipo T que aparece centrada a-63 ppm.

EJEMPLO 2 Determinacion de ATP mediante fluorimetria utilizando el material funcionalizado del Ejemplo 1 Se prepara una suspension acuosa del solid funcionalizado obtenido segun el Ejemplo 1, con una concentración aproximada de grupos antraceno de 0,88x 10-4 M a pH 2,8 y se distribuye en alicuotas.

Por otra parte, se preparan distintas disoluciones acuosas de ATP, con cantidades diferentes de ATP en cada una de ellas, e incluidas en el intervalo de concentración correspondiente a Log (ATP) entre-10 y-2.

A cada alicuota conteniendo la suspension acuosa de dicho solid funcionalizado se le anade una de las disoluciones acuosas de ATP previamente preparadas. Las suspensiones resultantes se homogeneizan y se introducen en una cubeta de cuarzo para medir la fluorescencia, con los siguientes parametros : XExcitación = 370 nm - Emision = 420 nm La respuesta obtenida [intensidad de la emision relativa (Ireceptor+ATp/Ireceptor)] para las diferentes concentraciones de ATP se muestra en la Figura 6 (rombos negros).

Con fines comparativos, en la Figura 6 se muestra la respuesta de una silice masiva no porosa funcionalizada con la cadena organic 3- [antraceno-9-metil] aminopropilo (triangulos negros) y la respuesta del ligando L1 libre en disolución (N-octil- (9- antracenilmetil) amina) que se puede considerar como el analogo molecular de la cadena anclada sobre la matriz silicea. Como se puede apreciar, la respuesta del ligando Ll en disolución es bastante pobre y solo se produce quenching en la fluorescencia del antraceno en una extension de aproximadamente el 20%, y solo a elevadas concentraciones de ATP.

Por el contrario, los solids del tipo UVM-7 funcionalizados (Ejemplo 1) permiten la detection de ATP en disolución acuosa en concentraciones muy bajas (0,5 ppm), mostrando un efecto quenching significativo de la fluorescencia de los grupos antraceno. La silice masiva no porosa funcionalizada presenta un comportamiento intermedio entre el ligando libre L1 y el material tipo UVM-7.