Procédé de détection d'au moins un mécanisme de résistance aux glycopeptides par spectrométrie de masse

La présente invention concerne le domaine de la microbiologie. Plus précisément, l'invention concerne la détection, par spectrométrie de masse, d'au moins un mécanisme de résistance aux glycopeptides d'au moins un microorganisme issu d'un échantillon.

Depuis la découverte des microbes par Pasteur, les microorganismes sont étudiés par microscopie et analyses biochimiques. Ces méthodes traditionnelles sont souvent longues et fastidieuses et des alternatives analytiques ont très tôt été recherchées. C'est ainsi que l'analyse de bactéries par spectrométrie de masse a été initiée dès 1975 par J. Anhalt et C. Fenselau [1].

Ces travaux préliminaires ont été suivis par l'étude en chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) d'acides gras de la paroi des microorganismes [2]. Cette méthode a été popularisée sous l'appellation anglo-saxonne de FAME pour Fatty Acid Methyl Ester. Elle constitue actuellement une méthode de référence pour les études taxonomiques. Son utilisation reste cependant limitée à certains laboratoires spécialisés maîtrisant le traitement de l'échantillon par saponification, hydrolyse et dérivation.

En 1996, les travaux de M. Claydon et al [3] ainsi que de T. Krishnamurthy et P. Ross [4] ont montré la possibilité d'identifier différentes espèces bactériennes avec un spectromètre de masse de type MALDI-TOF (acronyme de l'anglais Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time Of Flight). L'analyse associe l'acquisition d'un spectre de masse et l'interprétation d'un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes. Elle se diffuse actuellement dans les laboratoires d'analyses médicales [5]. Son utilisation clinique est cependant limitée à l'identification d'espèces bactériennes et de levures. Elle n'est pas utilisée en routine pour l'identification des résistances aux antimicrobiens.

Or l'identification de résistances aux antimicrobiens tels que les antibiotiques est un élément essentiel pour assurer une prise en charge optimale des patients. D'autres procédés de spectrométrie de masse, notamment en tandem, ont été proposés pour répondre à ces besoins. A titre d'exemple, il est possible de citer les travaux de C. Fenselau et al. pour l'identification de β-Lactamase avec un quadripôle-TOF (Q-TOF) [6].

Cependant ces résultats de recherche ne sont pas applicables à une utilisation clinique de routine. Ils ont été obtenus avec des instruments de recherche nécessitant un personnel hautement qualifié. Les temps d'analyse, souvent supérieurs à une heure par échantillon, sont incompatibles avec la charge de travail d'un laboratoire d'analyse microbiologique.

Plus récemment S. Hofstadler et al. [7] ont proposé un procédé associant une amplification du génome microbien par PCR à une détection des produits de PCR par électrospray-TOF (ESI-TOF). Ce procédé est maintenant totalement automatisé [8]. Toutefois, il nécessite une amplification par PCR avec les défauts inhérents à la biologie moléculaire, à savoir rendement d'extraction, coût des sondes, etc.

Dans ce contexte, l'objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection de mécanismes de résistance aux glycopeptides, qui permette de palier les inconvénients des procédés de l'art antérieur, à savoir fournir un procédé peu coûteux, sans réactif spécifique à chaque espèce, notamment par rapport aux procédés de biologie moléculaire, donnant un résultat en un temps court, inférieur à une heure, et utilisable en clinique de routine, sans nécessiter un personnel hautement qualifié.

A cette fin, l'invention propose un nouveau procédé de détection, pour au moins un microorganisme compris dans un échantillon, d'au moins un marqueur de résistance à un glycopeptide, comprenant la détection, par spectrométrie de masse, d'au moins un peptide ou une protéine dudit microorganisme.

Avantageusement, des marqueurs de résistance à plusieurs antimicrobiens différents peuvent être détectés simultanément. De façon surprenante et inattendue, le procédé de la présente invention permet de détecter l'existence de mécanismes de résistance inductibles, en l'absence d'induction.

Comme indiqué dans la demande WO201 1045544, des marqueurs de typage et/ou de virulence des microorganismes peuvent être détectés, de la même façon, par spectrométrie de masse, préalablement ou simultanément à la détection des marqueurs de mécanisme de résistance.

Par marqueurs de la résistance à au moins un antimicrobien de la classe des glycopeptides, on entend des molécules d'origine protéique qui sont caractéristiques desdites propriétés de résistance.

Les glycopeptides sont des antibiotiques tels que la vancomycine, la téicoplanine la telavancine, la bleomycine, la ramoplanine, et la decaplanine. La vancomycine est un glycopeptide proprement dit, la téicoplanine est un lipoglycopeptide. Ces 2 molécules viennent inhiber la synthèse de la paroi bactérienne par inhibition de la synthèse du peptidoglycane. En effet, leur structure tri-dimensionnelle, en forme de poche, recouvre le dipeptide D-Ala D-Ala précurseur de la synthèse du peptidoglycane, empêche l'action des glycosyltransférases et des transpeptidases et bloque l'élongation du peptidoglycane. La résistance aux glycopeptides est due à la présence d'opérons codant des enzymes catalysant la formation de précurseurs de faible affinité et des enzymes éliminant les précurseurs de haute affinité produits par la bactérie hôte. Divers types de résistance sont connus selon les enzymes présentes dans l'opéron. La classification de la résistance aux glycopeptides est basée sur la séquence primaire des gènes de structure des ligases de résistance plutôt que sur les niveaux de résistances aux glycopeptides, dans la mesure où les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des divers types se chevauchent. Neuf types de résistance ont été individualisés. Huit résultent d'une résistance acquise (VanA, B, D, E, G, L, M et N) et un (VanC) est une résistance naturelle présente chez £. gallinarum et à E. casseliflavus. (pour une revue voir [9], Sujatha,S. & Praharaj,!. Glycopeptide Résistance in Gram-Positive Cocci: A Review. Interdiscip. Perspect. Infect. Dis 2012, 781679 (2012))

Le type de résistance VanA est caractérisé par une résistance inductible de haut niveau à la vancomycine et à la téicoplanine. A noter que la transmission du type VanA vers S. aureus a été mise en évidence mais est toutefois assez rare.

Le type de résistance VanB est caractérisé par une résistance inductible de niveau modéré à haut à la vancomycine et est sensible à la téicoplanine.

En général, les phénotypes VanA et VanB sont les cas cliniques les plus importants et sont fréquemment retrouvés chez E.faecalis et chez E.faecium.

Le type de résistance VanD est caractérisé par une résistance constitutive de niveau modéré à la vancomycine et à la téicoplanine.

Les types de résistance VanC, E, G, L et N sont caractérisés par une résistance de bas niveau à la vancomycine et par une sensiblité à la téicoplanine.

La résistance peut s'exprimer en absence d'antibiotique, elle est alors dite constitutive. Elle peut aussi s'exprimer en présence d'une certaine concentration d'antibiotique, elle est alors dite inductible. La culture du microorganisme en présence d'une certaine concentration d'antibiotique est alors appelée culture avec induction.

Par détermination de la résistance à au moins un antimicrobien, on entend l'impossibilité de détruire les bactéries ou d'inhiber leur multiplication à une concentration définie en fonction des paramètres pharmocodynamiques et pharmacocinétiques propres à chaque antibiotique.

Par détermination d'un mécanisme de résistance à au moins un antibiotique, on entend la mise en évidence d'au moins un composé synthétisé par la bactérie, lui permettant d'échapper au moins partiellement à l'action de l'antibiotique, le plus souvent par modification de la structure de l'antibiotique ou bien de sa cible métabolique, ou bien encore par sa diminution de pénétration dans la bactérie. Préférentiellement, ledit composé synthétisé par la bactérie est une protéine.

Le procédé de l'invention peut être mis en œuvre pour détecter des mécanismes de résistance aux glycopeptides chez des bactéries. Ainsi, par exemple, à titre de bactéries chez lesquelles il est possible de rechercher un mécanisme de résistance aux glycopeptides selon le procédé de l'invention, on peut citer, de façon non exhaustive Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus avium, Enterococcus raffinosus ou Staphylococcus aureus. Les agents, majoritairement, responsables d'infections sont les Entérocoques et plus particulièrement Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium.

Ainsi, le procédé selon l'invention permet également de détecter un mécanisme de résistance auxdits antibiotiques.

On entend par échantillon une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. L'échantillon sur lequel le procédé de l'invention peut être mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir un microorganisme cible. L'échantillon peut être d'origine biologique, soit animale, végétale ou humaine. Il peut alors correspondre à un prélèvement de fluide biologique (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, par exemple), un prélèvement tissulaire ou des cellules isolées. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel, c'est-à-dire que les marqueurs des mécanismes de résistance des bactéries aux glycopeptides sont potentiellement détectables directement dans l'échantillon testé, ou bien il peut subir préalablement à l'analyse, une préparation de type enrichissement, extraction, concentration, purification, culture, selon des méthodes connues de l'homme du métier.

L'échantillon peut être d'origine industrielle, soit, selon une liste non exhaustive un prélèvement d'air, un prélèvement d'eau, un prélèvement effectué sur une surface, une pièce ou un produit manufacturé, un produit d'origine alimentaire. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produit lacté (yaourts, fromages), de viande, de poisson, d'œuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales. En amont de la détection par spectrométrie de masse, l'échantillon à analyser est préférentiellement traité au préalable pour générer des peptides à partir de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon pour fragmenter ces protéines en peptides, par exemple par digestion avec une enzyme protéolytique (protéase), ou par action d'un réactif chimique. En effet, le clivage des protéines peut être fait par un traitement physico-chimique, par un traitement biologique ou par une combinaison des deux traitements. Parmi les traitements utilisables, on peut citer le traitement par des radicaux hydroxyle, notamment avec de ΙΉ ₂ Ο ₂ . Le traitement par les radicaux hydroxyle provoque une coupure des liaisons peptidiques qui se fait de manière aléatoire sur n'importe quelle liaison peptidique de la protéine. La concentration en radicaux hydroxyle conditionne le nombre de clivages opérés et donc la longueur des fragments peptidiques obtenus. D'autres traitements chimiques peuvent également être utilisés comme, par exemple, le traitement au bromure de cyanogène (CNBr) qui scinde spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxylique des résidus méthionyle. Il est également possible de réaliser un clivage acide partiel au niveau des résidus aspartyle par chauffage à 1000°C d'une solution de protéines dans de l'acide trifluoroacétique.

Le traitement des protéines par digestion enzymatique est néanmoins préféré par rapport au traitement physico-chimique car il préserve davantage la structure des protéines, et est plus facile à contrôler. Par « digestion enzymatique », on entend l'action simple ou combinée d'une ou de plusieurs enzymes dans des conditions de réaction appropriées. Les enzymes effectuant la protéolyse, appelées protéases, coupent les protéines à des endroits spécifiques. Chaque protéase reconnaît généralement une séquence d'acides aminés au sein desquels elle effectue toujours la même coupure. Certaines protéases reconnaissent un seul acide aminé ou une séquence de deux acides aminés entre lesquels elles opèrent un clivage, d'autres protéases ne reconnaissent que des séquences plus longues. Ces protéases peuvent être des endoprotéases ou des exoprotéases. Parmi les protéases connues on peut citer, comme décrit dans WO2005/098017:

- les enzymes spécifiques comme la trypsine qui scinde la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus Arg et Lys, l'endolysine qui clive la liaison peptidique du groupe -CO des lysines, la chymotrypsine qui hydrolyse la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la pepsine qui coupe au niveau du groupe NH ₂ des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la protéase V8 de la souche V8 de Staphylococcus aureus qui clive la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique du résidu Glu ;

- les enzymes non-spécifiques comme la thermolysine provenant de la bactérie Bacillus thermoproteolyticus qui hydrolyse la liaison peptidique du groupe NH ₂ des acides aminés hydrophobes (Xaa-Leu, Xaa-lle, Xaa-Phe), la subtilisine et la pronase qui sont des protéases bactériennes qui hydrolysent pratiquement toutes les liaisons et peuvent transformer les protéines en oligopeptides dans des conditions de réaction contrôlées (concentration en enzyme et durée de réaction).

Plusieurs protéases peuvent être utilisées de façon simultanée, si leurs modes d'action sont compatibles, ou elles peuvent être utilisées de façon successive. Dans le cadre de l'invention, la digestion de l'échantillon est, de préférence, réalisée par action d'une enzyme protéase, par exemple la trypsine.

La génération de peptides à l'aide d'un réactif chimique ou d'une protéase, peut être obtenu par simple réaction en solution. Elle peut également être mise en œuvre avec un four à micro-ondes [10], ou sous pression [1 1], ou bien encore avec un dispositif à ultrasons [12]. Dans ces trois derniers cas, le protocole sera beaucoup plus rapide.

Parmi les peptides ainsi obtenus, les peptides spécifiques de la protéine, sont nommés peptides protéotypiques. Ce sont eux qui seront dosés par spectrométrie de masse.

Selon l'invention, les marqueurs des mécanismes de résistance des bactéries aux glycopeptides sont des protéines de la bactérie chez laquelle les mécanismes de résistance aux glycopeptides sont à rechercher. En particulier, lesdites protéines sont digérées en peptides, de préférence par une enzyme, de préférence encore par la trypsine.

De même, l'échantillon contenant des marqueurs protéiques de caractérisation des mécanismes de résistance des bactéries aux glycopeptides peut également être préalablement traité à des fins de purification. Ce traitement préalable de purification peut être mis en œuvre avant ou après l'étape de génération de peptides tels que décrits précédemment.

Le traitement préalable de purification d'échantillon est largement connu de l'homme du métier et pourra notamment mettre en œuvre des techniques de centrifugation, de filtration, d'électrophorèse ou de chromatographie. Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d'échange d'ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortin et al. [13], ou H. Keshishian et al. [14]. Dans ces publications, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide).

La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d'accroître la spécificité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse.

Une alternative aux techniques d'électrophorèse ou de chromatographie, pour le fractionnement des peptides, consiste à purifier spécifiquement les N- glycopeptides ([15] et demande de brevet WO 2008/066629). Néanmoins, une telle purification ne permet que la quantification des peptides ayant subi une modification post-traductionnelle de type N-glycosylation. Or toutes les protéines ne sont pas glycosylées, ce qui limite donc son utilisation. La spectrométrie de masse à mettre en œuvre dans le procédé de l'invention est largement connue de l'homme du métier comme un outil puissant pour l'analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l'aide d'un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d'origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d'ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d'ionisation des marqueurs de caractérisation, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse.

Tous les spectromètres de masse comportent :

- une source d'ionisation destinée à ioniser les marqueurs présents dans l'échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces marqueurs;

- un analyseur de masse destiné à séparer les marqueurs ionisés, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ;

- un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci-après.

L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment :

- l'ionisation électronique (El), l'ionisation chimique (Cl) et la désorption-ionisation chimique (DCI) - le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS)

- le couplage plasma inductif (ICP)

- l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI)

- l'électronébulisation ou électrospray (ESI)

-la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)

- l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART) Notamment, l'ionisation peut être mise en œuvre comme suit : l'échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation, où les molécules sont ionisées à l'état gazeux et ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Une source d'ionisation de type électrospray (ESI pour ElectroSpray Ionisation) permet d'ioniser une molécule tout en la faisant passer d'un état liquide à un état gazeux. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules présentes à l'état liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine, une ionisation des peptides protéotypiques obtenus après fractionnement de la protéine cible, grâce à une source de type électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions polypeptidiques à l'état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus, et permet un passage d'un état liquide à un état gazeux [16]. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles ou peptides protéotypiques obtenus sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse. Néanmoins, le rendement d'ionisation des molécules présentes dans l'échantillon peut varier en fonction de la concentration et de la nature des différentes espèces en présence. Ce phénomène se traduit par un effet matrice bien connu de l'homme de l'art. Une source d'ionisation MALDI permettra d'ioniser des molécules, à partir d'un échantillon à l'état solide.

L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FT-ICR), l'orbitrappe.

La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en œuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS ² . Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS ³ et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS ⁿ .

Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d'une seule molécule cible, ou bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, sont des utilisations particulières de séparation MS ² . De même le mode MRM ³ est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS. On parle alors de spectrométrie de masse ciblée.

Dans le cas d'une détection en mode MS simple, c'est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter.

Dans le cas d'une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont : - une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions dit ions fragments de 1 ^ere génération, et

- une séparation des ions dit ions fragments de 1 ^ere génération en fonction de leur masse (m/z) ₂ , le rapport (m/z)i correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs.

C'est alors le rapport masse/charge des ions fragments de 1 ^ere génération ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment de première génération, on entend un ion issu de l'ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l'ion précurseur.

Les couples (m/z)i et (m/z) ₂ sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter.

Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué par l'homme du métier selon les méthodes standards. Leur sélection conduira avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité. Dans les méthodes développées pour la sélection de peptides protéotypiques (m/z)-i , et de fragment de première génération (m/z) ₂ , le choix est essentiellement basé sur l'intensité de la réponse. Pour plus de détails, on pourra se référer à V. Fusaro et al. [17]. Des logiciels commerciaux, tels que les logiciels MIDAS et MRM Pilote d'Applied Biosytems ou encore MRMaid [18] pourront être utilisés par l'homme de l'art pour lui permettre de prédire tous les couples de transitions possibles. Il pourra également être fait appel à une base de données nommée PeptideAtlas, construite par F. Desiere et al. [19] pour compiler l'ensemble des transitions MRM de peptides décrites par la communauté scientifique. Cette base PeptideAtlas est disponible en accès libre sur internet. Pour des molécules non protéiques, il est également possible d'utiliser des bases de données, telles que par exemple celle accessible au travers du logiciel Cliquid de la société Applied Biosytems (Etats Unis d'Amérique). Une approche alternative pour sélectionner les peptides protéotypiques, (m/z)i et (m/z)2, consiste à utiliser les spectres de fragmentation MS/MS obtenus à l'occasion d'autres travaux. Ces travaux peuvent être, par exemple, les phases de découverte et d'identification des biomarqueurs par analyse protéomique. Cette approche a été proposée par Thermo Scientific lors de réunions utilisateurs [18]. Elle permet de générer une liste de transitions candidates à partir des peptides identifiés expérimentalement par le logiciel SI EVE (Thermo Scientific). Certains critères ont été détaillés par J. Mead et al. [18] pour le choix des ions (m/z)i et (m/z) ₂ et sont détaillés ci-après :

- les peptides avec des sites de clivage interne, c'est-à-dire avec de la Lysine ou de l'Arginine interne, doivent être évités, sauf si la Lysine ou l'Arginine est suivie par de la Proline,

- les peptides avec de l'Asparagine ou de la Glutamine doivent être évités car ils peuvent se désaminer,

- les peptides avec de la Glutamine ou de l'Acide Glutamique en N- terminal doivent être évités car ils peuvent se cycliser spontanément,

- les peptides avec de la Méthionine doivent être évités car ils peuvent être oxydés,

- les peptides avec de la Cystéine doivent être évités car ils peuvent être modifiés de façon non reproductible lors d'une éventuelle étape de dénaturation, réduction et blocage des fonctions thiols,

- les peptides avec de la Proline peuvent être considérés comme favorables parce qu'ils produisent généralement des fragments intenses en MS/MS avec un seul pic très majoritaire. Cependant, un seul fragment très majoritaire ne permet pas de valider l'identité de la transition dans un mélange complexe. En effet, seule la présence simultanée de plusieurs fragments caractéristiques permet de vérifier que l'ion précurseur recherché est bien détecté,

- les peptides ayant une Proline adjacente au C-terminal (position n-1 ) ou en seconde position par rapport au C-terminal (position n-2) sont à éviter car, dans ce cas, la taille du peptide fragment de première génération est généralement considérée comme trop petite pour être suffisamment spécifique,

- la sélection de fragments ayant une masse supérieure au précurseur est à privilégier pour favoriser la spécificité. Pour cela, il faut sélectionner un ion précurseur dichargé et sélectionner l'ion fragment de première génération le plus intense ayant une masse supérieure au précurseur, c'est à dire un ion fragment de première génération monochargé.

La fragmentation des ions précurseurs sélectionnés est mise en œuvre dans une cellule de fragmentation telle que les modèles de type triple quadripôle [20], ou de type trappe ionique [21], ou encore de type temps de vol (TOF) [22], lesquels permettent également la séparation des ions. La ou les fragmentations seront classiquement réalisées par collision avec un gaz inerte tel que l'argon ou l'azote, au sein d'un champ électrique, par photo-excitation ou photodissociation à l'aide d'une source lumineuse intense, collision avec des électrons ou espèces radicalaires, par application d'une différence de potentiel, par exemple dans un tube de temps de vol, ou par tout autre mode d'activation. Les caractéristiques du champ électrique conditionnent l'intensité et la nature de la fragmentation. Ainsi, le champ électrique appliqué en présence d'un gaz inerte, par exemple dans un quadripôle, conditionne l'énergie de collision apportée aux ions. Cette énergie de collision sera optimisée, par l'homme du métier, pour accroître la sensibilité de la transition à doser. A titre d'exemple, il est possible de faire varier l'énergie de collision entre 5 et 180 e ^" V en q2 dans un spectromètre de masse AB SCI EX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems (Foster City, Etats Unis d'Amérique). De même, la durée de l'étape de collision et l'énergie d'excitation au sein, par exemple, d'une trappe ionique seront optimisées, par l'homme du métier, pour conduire au dosage le plus sensible. A titre d'exemple, il est possible de faire varier cette durée, baptisée temps d'excitation, entre 0,010 et 50 ms et l'énergie d'excitation entre 0 et 1 (unité arbitraire) en Q3 dans un spectromètre de masse AB SCI EX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems. Enfin, la détection des ions caractéristiques sélectionnés se fait de façon classique, notamment grâce à un détecteur et à un système de traitement. Le détecteur collecte les ions et produit un signal électrique dont l'intensité dépend de la quantité d'ions collectée. Le signal obtenu est ensuite amplifié pour qu'il puisse être traité informatiquement. Un ensemble informatique de traitement des données permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse.

Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôle à trappe ionique sont généralement utilisés.

Dans le cas d'un dispositif triple quadripôle (Q1 q2Q3) utilisé en mode MS ² , en vue du dosage ou de la détection d'une protéine cible, le premier quadripôle (Q1 ) permet de filtrer les ions moléculaires, correspondant aux peptides protéotypiques caractéristiques de la protéine à doser et obtenus lors d'une étape antérieure de digestion, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les peptides ayant le ratio masse/charge du peptide protéotypique recherché, ratio appelé (m/z)-i , sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d'ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L'analyseur q2 permet de fragmenter les peptides de ratio masse/charge (m/z)i en ions fragments de première génération. La fragmentation est généralement obtenue par collision des peptides précurseurs avec un gaz inerte, comme de l'azote ou de l'argon dans q2. Les ions fragments de première génération sont transmis dans un troisième quadripôle (Q3) qui filtre les ions fragments de première génération en fonction d'un ratio masse sur charge spécifique, ratio appelé (m/z) ₂ . Seuls les ions fragments de première génération ayant le ratio masse/charge d'un fragment caractéristique du peptide protéotypique recherché (m/z) ₂ sont transmis dans le détecteur pour être détectés, voire quantifiés.

Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l'ion précurseur d'une part et de la sélection de l'ion fragment de première génération d'autre part. La spectrométrie de masse en mode SRM ou MRM est donc avantageuse pour la quantification

Lorsque la spectrométrie de masse mise en œuvre dans le procédé de l'invention est une spectrométrie de masse en tandem (MS ² , MS ³ , MS ⁴ ou MS ⁵ ), plusieurs analyseurs de masse peuvent être couplés entre eux. Par exemple, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.

Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, le procédé de l'invention comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :

- la spectrométrie de masse, mise en œuvre pour les propriétés de résistance potentielle à au moins un antimicrobien, est une spectrométrie de type MS/MS, ce qui a pour avantage de générer un fragment spécifique de la molécule à détecter ou à quantifier, et ainsi d'apporter une grande spécificité à la méthode de dosage ;

- la spectrométrie MS/MS est de la MRM, ce qui a pour avantage d'utiliser un temps de cycle d'analyse dans le spectromètre de masse de quelques dizaines de millisecondes, ce qui permet de détecter ou de quantifier avec une grande sensibilité, et de façon multiplexée, un grand nombre de molécules différentes ;

- le cas échéant, la détermination des propriétés de typage, et du facteur de virulence est mise en œuvre dans le même appareil de spectrométrie de masse que la détermination des marqueurs de résistance à au moins un antimicrobien, de préférence simultanément, ce qui a pour avantage de réduire le temps d'analyse et le coût de l'instrument, cela facilite également le traitement et le rendu des résultats.

Outre la détermination de la résistance à un antibiotique, il convient d'identifier le ou les microorganismes présents dans l'échantillon à tester. Les procédés d'identification de microorganismes sont largement connus de l'homme du métier, comme décrit par exemple par Murray P. R. el al. dans Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9 ^eme édition, et en particulier dans le Vol. I, Section III, chapitres 15 et 16 pour les bactéries et levures, Vol. Il, Section VI, chapitre 82 pour les virus, et Vol. Il, Section X, chapitre 135 pour les protozoaires. A titre d'exemple de procédés classiques d'identification, on peut citer la détermination du profil biologique, en utilisant par exemple les cartes d'identification du Vitek 2 (bioMérieux™), ou bien encore en utilisant des techniques de biologie moléculaire avec des critères d'identification basés sur l'étude de la présence de certains gènes, sur l'étude de leur séquence.

L'identification peut être mise en œuvre directement à partir de l'échantillon dans lequel on effectue l'identification, ou bien les microorganismes contenus dans l'échantillon peuvent être cultivés par des méthodes bien connues de l'homme du métier avec des milieux de culture et des conditions de culture optimales adaptées en fonction des espèces de microorganismes à rechercher, comme décrit par Murray P.R. et al. dans Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9 ^ème édition, Vol. I, Section III, chapitre 14, et en particulier dans le Vol. I, Section IV, chapitre 21 pour les bactéries, Vol. Il, Section VI, chapitre 81 pour les virus, Vol. Il, Section VIII, chapitre 1 17 pour les levures, et Vol. Il, Section X, chapitre 134 pour les protozoaires.

Ainsi, de façon générale, dans le cas d'une identification par une méthode biochimique d'une bactérie dans un prélèvement, il faut d'abord l'obtenir en culture pure, par exemple après ensemencement sur gélose. La biologie moléculaire (PCR) peut dans certains cas s'appliquer directement à l'échantillon à analyser.

Au lieu de cultiver les microorganismes, ces derniers peuvent être concentrés par capture directement dans l'échantillon au moyen de surfaces actives. Un tel procédé a été décrit par W.-J. Chen et al. [10] qui ont capturé différentes espèces bactériennes à l'aide de billes magnétiques avec une surface activée au Fe ₃ 0 /Ti0 ₂ . Une capture par d'autres moyens est également possible, telle qu'une capture par des lectines [23], ou par des anticorps [24], ou encore par de la Vancomycine [25]. La capture permet de concentrer les microorganismes et ainsi de réduire ou même de supprimer l'étape de culture. Il s'en suit un gain de temps considérable.

L'identification peut également être mise en œuvre par spectrométrie de masse, selon les techniques décrites précédemment, de préférence par MS, par MS/MS, ou bien par MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS, ce qui constitue un mode de réalisation de l'invention. Dans ce cas également, l'échantillon peut être soumis préalablement à une étape de culture telle qu'un ensemencement sur gélose.

L'utilisation d'un procédé d'identification par MS est avantageux en ce qu'il peut être réalisé en quelques minutes et en ce qu'il nécessite un spectromètre de masse avec un seul analyseur, c'est à dire un instrument moins complexe qu'un spectromètre de masse en tandem utilisé en MS/MS.

L'utilisation d'un procédé d'identification par MS suivi d'une spectrométrie de type MS/MS est également avantageuse. Elle permet de s'assurer de l'identité des ions observée en MS, ce qui augmente la spécificité de l'analyse.

L'utilisation d'un procédé d'identification par MS/MS de type MRM présente l'avantage d'être plus sensible et plus simple que les approches MS puis MS/MS traditionnelle. Ce procédé ne nécessite ni logiciel performant, nécessaire pour traiter l'information entre l'acquisition du spectre MS et du spectre MS/MS, ni changement du réglage des paramètres machines, nécessaires pour enchaîner des spectres MS puis MS/MS.

Le procédé d'identification par MS peut être mis en œuvre avec une source électrospray sur échantillon brut, comme décrit par S. Vaidyanathan et al. [26] ou encore par R. Everley et al. [27] après séparation chromatographique. Différentes gammes de m/z permettent alors d'identifier les microorganismes. S. Vaidyanathan et al. ont utilisé une fenêtre entre 200 et 2000 Th, et R. Everley et al. une fenêtre entre 620 et 2450 Th. Les spectres de masse peuvent également être déconvolués pour accéder à la masse des protéines indépendamment de leur état de charge. R. Everley et al. ont ainsi exploité les masses entre environ 5 000 et 50 000 Da. De façon alternative, le procédé d'identification par MS peut être également mis en œuvre à l'aide d'un MALDI-TOF, comme décrit par Claydon et al [3] et T. Krishnamurthy et P. Ross [4]. L'analyse associe l'acquisition d'un spectre de masse et l'interprétation d'un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes. Ce procédé d'identification se répand actuellement dans les laboratoires d'analyse médicale [5]

L'identification de bactéries par MS puis MS/MS via leurs protéines présentes dans l'échantillon, a été largement appliquée par de nombreuses équipes. A titre d'exemple, il est possible de citer les travaux récents de Mânes N. et al. [28] qui ont étudié le peptidome de Salmonella enterica, ou les travaux de R. Nandakumar et al. [29] ou de L. Hernychova et al. [30] qui ont étudié le protéome de bactéries après digestion des protéines avec de la trypsine. L'approche classique consiste à i) acquérir un spectre MS, ii) sélectionner successivement chaque ion précurseur observé sur le spectre MS avec un signal intense, iii) fragmenter successivement chaque ion précurseur et acquérir son spectre MS/MS, iv) interroger des bases de données protéiques telles que SWISS-PROT ou NCBI, au moyen de logiciels tels que Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) ou SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis d'Amérique), pour identifier le peptide ayant une forte probabilité de correspondre au spectre MS/MS observé. Cette méthode peut conduire à l'identification d'un microorganisme si une protéine ou un peptide caractéristique de l'espèce est identifié.

Un des avantages de l'utilisation de la spectrométrie de masse réside en ce qu'elle est particulièrement utile pour quantifier des molécules, dans le cas présent les marqueurs des mécanismes de résistance des bactéries aux glycopeptides. Pour ce faire, on utilise l'intensité de courant détectée, laquelle est proportionnelle à la quantité de molécule cible. L'intensité de courant ainsi mesurée pourra servir de mesure quantitative permettant de déterminer la quantité de molécule cible présente, laquelle est caractérisée par son expression en unités du Système International (SI) de type mol/m ³ ou kg/m ³ , ou par les multiples ou sous-multiples de ces unités, ou par les dérivées usuelles des unités SI, y compris leurs multiples ou sous-multiples. A titre d'exemple non limitatif, les unités telles que ng/ml ou fmol/l sont des unités caractérisant une mesure quantitative.

Une calibration est néanmoins nécessaire pour pouvoir corréler l'aire du pic mesurée, correspondant à l'intensité de courant induit par les ions détectés, à la quantité de molécule cible à doser. Pour cela, les calibrations classiquement utilisées en spectrométrie de masse pourront être mis en œuvre, dans le cadre de l'invention. Les dosages MRM sont classiquement calibrés à l'aide de standards externes ou, de préférence, à l'aide de standards internes tels que décrits par T. Fortin et al. [13]. Dans le cas où la molécule cible est un peptide protéotypique, permettant de doser une protéine d'intérêt, la corrélation entre la mesure quantitative et la quantité de peptide protéotypique cible, et par la suite de protéine d'intérêt, est obtenue en étalonnant le signal mesuré par rapport à un signal étalon pour lequel la quantité à doser est connue. L'étalonnage peut être réalisé au moyen d'une courbe d'étalonnage, par exemple obtenue par injections successives de peptide protéotypique étalon à différentes concentrations (étalonnage externe), ou de façon préférentielle, par étalonnage interne en utilisant un peptide lourd, comme standard interne, par exemple conformément aux méthodes AQUA, QconCAT ou PSAQ détaillées ci-après. Par « peptide lourd », on entend un peptide correspondant au peptide protéotypique, mais dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone 12 ( ¹² C) est (sont) remplacé(s) par du carbone 13 ( ¹³ C), et/ou un ou plusieurs atomes d'azote 14 ( ¹⁴ N) est (sont) remplacé(s) par de l'azote 15 ( ¹⁵ N).

L'utilisation de peptides lourds, comme standards internes (AQUA), a également été proposée dans la demande de brevet US 2004/0229283. Le principe est de synthétiser artificiellement des peptides protéotypiques avec des acides aminés comportant des isotopes plus lourds que les isotopes naturels usuels. De tels acides aminés sont obtenus, par exemple, en remplaçant certains des atomes de carbone 12 ( ¹² C) par du carbone 13 ( ¹³ C), ou en replaçant certains des atomes d'azote 14 ( ¹⁴ N) par de l'azote 15 ( ¹⁵ N). Le peptide artificiel (AQUA) ainsi synthétisé a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que le peptide naturel (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est généralement ajouté, à une concentration donnée, à l'échantillon, en amont du dosage par spectroscopie de masse, par exemple entre le traitement entraînant le clivage des protéines de l'échantillon d'intérêt et le fractionnement des peptides obtenus après l'étape de traitement. De ce fait, le peptide AQUA est co-purifié avec le peptide naturel à doser, lors du fractionnement des peptides. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour le dosage. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et AQUA, dont la concentration est connue, permet de calculer la concentration du peptide naturel et de remonter ainsi à la concentration de la protéine à doser. Une variante de la technique AQUA a été proposée par J.-M. Pratt et al. [31] sous le nom de QconCat. Cette variante est également décrite dans la demande de brevet WO 2006/128492. Elle consiste à concaténer différents peptides AQUA et à produire le polypeptide artificiel sous forme de protéine recombinante lourde. La protéine recombinante est synthétisée avec des acides aminés comportant des isotopes lourds. De cette façon, il est possible d'obtenir un standard pour calibrer le dosage simultané de plusieurs protéines à moindre coût. Le standard QconCAT est ajouté dès le début, en amont du traitement entraînant le clivage des protéines et avant les étapes de fractionnement des protéines, de dénaturation, de réduction puis de blocage des fonctions thiols des protéines, si celles-ci sont présentes. Le standard QconCAT subit donc le même cycle de traitement entraînant le clivage des protéines que la protéine naturelle, ce qui permet de tenir compte du rendement de l'étape de traitement entraînant le clivage des protéines. En effet, le traitement, notamment par digestion, de la protéine naturelle peut ne pas être complet. Dans ce cas l'utilisation d'un standard AQUA conduirait à sous-estimer la quantité de protéine naturelle. Pour un dosage absolu, il peut donc être important de tenir compte des rendements de traitement entraînant le clivage des protéines. Cependant, V. Brun et al. [33] ont montré que, parfois, les standards QconQAT ne reproduisaient pas exactement le rendement de traitement notamment par digestion de la protéine naturelle, sans doute du fait d'une conformation tridimensionnelle différente de la protéine QconCAT.

V. Brun et al. [32] ont alors proposé d'utiliser une méthode baptisée PSAQ et décrite dans la demande de brevet WO 2008/145763. Dans ce cas, le standard interne est une protéine recombinante, ayant la même séquence que la protéine naturelle mais synthétisée avec des acides aminés lourds. La synthèse est réalisée ex-vivo avec des acides aminés lourds. Ce standard a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que la protéine naturelle (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est ajouté dès le début, avant l'étape de fractionnement des protéines, lorsque cette dernière est présente. Il est donc co- purifié avec la protéine native, lors de l'étape de fractionnement des protéines. Il présente le même rendement de traitement, notamment par digestion, que la protéine native. Le peptide lourd obtenu après clivage est également co-purifié avec le peptide naturel, si une étape de fractionnement des peptides est réalisée. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour être dosé quantitativement. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et des peptides de référence dans la méthode PSAQ permet de calculer la concentration de la protéine à doser en tenant compte de la totalité des étapes du procédé de dosage.

L'ensemble de ces techniques, à savoir AQUA, QconCAT ou PSAQ ou toute autre technique de calibration, utilisée dans des dosages par spectrométrie de masse et en particulier dans les dosages MRM ou MS, pourront être mises en œuvre pour effectuer la calibration, dans le cadre de l'invention.

De façon préférentielle, la spectrométrie de masse utilisée dans le procédé de détection selon l'invention est de type MS/MS. Plus préférentiellement, la spectrométrie de masse est la MRM. Le procédé de l'invention permet la détection de résistances aux glycopeptides, caractérisée par la détection d'au moins un peptide en tant que marqueur de résistance.

De façon préférentielle, le procédé selon l'invention permet de détecter au moins un marqueur de résistance à la vancomycine.

Selon un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention permet de détecter directement la résistance à un glycopeptide, sans mise en contact du microorganisme potentiellement compris dans l'échantillon avec ledit glycopeptide, c'est-à-dire sans étape d'induction de ladite résistance.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire, préalable à l'étape de détection, et consistant en l'induction du mécanisme de résistance, par mise en contact dudit échantillon avec le(s)dit(s) glycopeptide(s).

De façon préférentielle, ledit marqueur de résistance est un peptide issu des protéines de type Van, telles que les variants respectifs de type Van A, Van B, Van C, Van D, Van E, Van G, Van L, Van M et Van N.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, lié à l'expression de la protéine VanA, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanA et à ses différents variants de séquences SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 4.

SEQ ID N°1 :

MKKPLKTVWILKGDRSMNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLY IGITKSGVWKMCEKPCAEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDV AFSALHGKSGEDGSIQGLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPA FWVINKDDRPVAATFTYPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSK ILIEQAVSGCEVGCAVLGNSAALVVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVIT VPADLSAEERGRIQETAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFT SYSRYPRMMAAAGIALPELIDRLIVLALKG SEQ ID N°2 :

MNRIKVAILFGGCSEEHDVSLKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPC AEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQ GLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFT YPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAV LGNSAALWGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQE TAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIA LPELIDRLIVLALKG SEQ ID N°3 :

MNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPC AEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQ GLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFT YPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAV LGNSAALAVGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQE TAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIA LPELIDRLIVLALKG SEQ ID N°4 :

MNRIKVAILFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINKEKYEPLYIGITKSGVWKMCEKPC AEWENDNCYSAVLSPDKKMHGLLVKKNHEYEINHVDVAFSALHGKSGEDGSIQ GLFELSGIPFVGCDIQSSAICMDKSLTYIVAKNAGIATPAFWVINKDDRPVAATFT YPVFVKPARSGSSFGVKKVNSADELDYAIESARQYDSKILIEQAVSGCEVGCAV LGNSAALWGEVDQIRLQYGIFRIHQEVEPEKGSENAVITVPADLSAEERGRIQE TAKKIYKALGCRGLARVDMFLQDNGRIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIA LPELIDRLIVLALKG lesdits peptides de type VanA étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16 tels que définis ci-après : Peptide Séquence d'acides Position du peptide dans la ou les SEQ ID N° aminés protéines VanA

243-251 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

IHQEVEPEK 4; 259-267 pour la protéine de séquence

N°5

SEQ ID N°l

336-342 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

LIVLAL 4; 352-358 pour la protéine de séquence

N°6

SEQ ID N°l

236-242 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

LQYGIFR 4; 252-258 pour la protéine de séquence

N°7

SEQ ID N°l

75-81 pour les protéines de SEQ N°2, 3, 4;

SEQ ID

MHGLLVK 91 -97 pour la protéine de séquence SEQ ID

N°8

N°l

321-335 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

MMAAAGIALPELIDR 4; 337-351 pour la protéine de séquence

N°9

SEQ ID N°l

142-155 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

NAGIATPAFWVINK 4; 158-171 pour la protéine de séquence

N°10

SEQ ID N°l

23-33 pour les protéines de SEQ N°2, 3, 4;

SEQ ID

SAIEIAANINK 39-49 pour la protéine de séquence SEQ ID N°ll

N°l

175-182 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

SGSSFGVK 4; 191-198 pour la protéine de séquence

N°12

SEQ ID N°l

134-141 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

SLTYIVAK 4; 150-157 pour la protéine de séquence

N°13

SEQ ID N°l

291-300 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

VDMFLQDNGR 4; 307-316 pour la protéine de séquence N°14

SEQ ID N°l

184-198 pour les protéines de SEQ N°2, 3,

SEQ ID

V SADELDYAIESAR 4; 200-214 pour la protéine de séquence

N°15

SEQ ID N°l

36-45 pour les protéines de SEQ N°2, 3, 4;

SEQ ID

YEPLYIGITK 52-61 pour la protéine de séquence SEQ ID

N°16

N°l Avantageusement, les marqueurs de type VanA choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 5 à SEQ ID N° 16 sont détectés après induction du mécanisme de résistance.

Avantageusement, les marqueurs de type VanA choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 1 1 , SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15 et SEQ ID N° 16 sont détectés sans étape d'induction.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, lié à l'expression de la protéine VanB, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanB et à ses différents variants de séquences SEQ ID N° 17 à SEQ ID N° 28.

SEQ ID N°17 :

MNKIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCT

EWEADSLPAIFSPDRKTHGLLVMKEREYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLF

ELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIEKGDKPEARTLTYP

VFVKPARSGSSFGVTKVNSTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG

NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMIIVPADIPVEERNRVQETAK

KVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMAAAAGITLPA

LIDSLITLAIER

SEQ ID N°18 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL

PALIDSLITLALKR

SEQ ID N°19 : MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYP

VFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG

NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETA

KKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITLP

ALIDSLITLALKR

SEQ ID N°20 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYP

VFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG

NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETA

KKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYTRMVAAAGITLP

ALIDSLITLALKR

SEQ ID N°21 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL

PALIDSLITLALKR

SEQ ID N°22 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL

PALIDSLITLALKR SEQ ID N°23 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITL

PALIDSLITLALKR

SEQ ID N°24 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGGGEDGAIQ GLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGAL TYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAV MGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQE TAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIT LPALIDSLITLALKR SEQ ID N°25 :

MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITL PALIDSLITLALKR

SEQ ID N°26 :

MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARAGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PALIDSLITLALKR

SEQ ID N°27 :

MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL

PAMIDSLITLALKR

SEQ ID N°28 :

MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC

TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL

FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY

PVFVKPARSGSSFGVTKVNGPEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM

GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET

AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITL

PALIDSLITLALKR lesdits marqueurs de type VanB étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°29 à SEQ ID N°35 tels que définis ci-après :

Peptide Séquence d'acides Position du peptide dans la ou les SEQ ID N° aminés protéines VanB

SEQ ID 36-45 pour les protéines de SEQ N°17, 18,

FDPHYIGITK

N°29 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28

SEQ ID 90-100 pour les protéines de SEQ N°17,

IDVAFPVLHGK

N°30 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28

242-250 pour les protéines de SEQ N°17,

SEQ ID

IHQENEPEK 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 26, 27, 28; 244-

N°31

252 pour la protéine de séquence SEQ ID N°24

235-241 pour les protéines de SEQ N°17,

SEQ ID 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 26, 27, 28; 237-

LSHGIFR

N°32 243 pour la protéine de séquence SEQ ID

N°24

133-140 pour les protéines de SEQ N°17,

SEQ ID 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 26, 27, 28; 135-

SLAYILTK

N°33 142 pour la protéine de séquence SEQ ID

N°24

SEQ ID 74-81 pour les protéines de SEQ N°17, 18,

THGLLVMK

N°34 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28

271 -276 pour les protéines de SEQ N°17,

SEQ ID 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 26, 27, 28; 273-

VQETAK

N°35 278 pour la protéine de séquence SEQ ID

N°24

Avantageusement, les marqueurs de type VanB choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32 et SEQ ID N° 33 sont détectés après induction du mécanisme de résistance.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, lié à l'expression de la protéine VanC, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanC et à ses différents variants de séquences SEQ ID N° 36 à SEQ ID N° 58. Notamment les variants VanC1 sont caractérisés par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanC1 et à ses différents variants de séquences SEQ ID n°36 à SEQ ID N°43, les variants VanC2 ou VanC3 sont caractérisés par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanC2 ou Van C3 et à ses différents variants de séquences SEQ ID N°46 à SEQ ID N°51 et SEQ ID N°53 à SEQ ID N°57, les variants VanC4 sont caractérisés par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanC4 et à ses différents variants de séquences SEQ ID n°44, SEQ ID n°45, SEQ ID n°52 et SEQ ID n°58 SEQ ID N°36 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYLYQGNLA

NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL

ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF

IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL

YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE

QLIALAEEDKR

SEQ ID N°37 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNL

ANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGL

LELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDR

FIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIG C

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL

YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE

QLIALAEEDKR

SEQ ID N°38 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNL

ANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGL

LELMNLPYVGCHVAATALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDR

FIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIG C

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL

YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE

QLIALAEEDKR

SEQ ID N°39 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA

NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL

ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF

IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR

SEQ ID N°40 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA

NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL

ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF

IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL

YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE

KLIALAEEDKR

SEQ ID N°41 :

MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAESVIQAINPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA

NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL

ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF

IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC

GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL

YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE

QLIALAEEDKR

SEQ ID N°42 :

MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGN

LANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQG

LLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATID

RFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEI G

CGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQL

LYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILV

EQLIALAEEDKR

SEQ ID N°43 :

MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGN LANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQG LLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATID RFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIG CGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQL LYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILV EQLIALAEEDKR

SEQ ID N°44 :

MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPDDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QDQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA IGLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°45 :

MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAEAIGVQSAPTILLTNQDNQ QRQIEAFIQTHDFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA IGLSYQELLQKLLVLAKEEGK SEQ ID N°46 :

MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSALEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°47 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE

LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED

GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°48 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTERGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°49 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°50 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLILAKEEVK SEQ ID N°51 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHTQKIKPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG SIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQ EQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNI AGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKV KEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVG LSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°52 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEGNGFWISEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG SIQGMFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QRQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA VGLSYQELLQKLLVLAKEEGK SEQ ID N°53 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNHANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°54 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLILAKEEVK SEQ ID N°55 : MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGMFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNHAN QQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQ KNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIE TKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMA AVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°56 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°57 :

MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDTISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK SEQ ID N°58 :

MKKIAIIFGGNSSEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE

LENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEENGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG

SIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQDNQQ

QQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQKNI

AGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKV

KEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAIG

LSYQELLQKLLVLAKEEGK lesdits marqueurs de type VanC étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°59 à SEQ ID N°71 tels que définis ci-après :

Peptide

Séquence d'acides

SEQ ID Position du peptide dans la ou les protéines VanC aminés

N°

279-286 pour les protéines de SEQ N°46, 47, 48, 49, 50, 51 , 53, 54, 55, 56, 57; 272-279 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 272-279 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 272-279 pour la protéine de

SEQ ID séquence SEQ ID N°38; 272-279 pour la protéine de

EQAQLLYR

N°59 séquence SEQ ID N°39; 272-279 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 272-279 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41; 273-280 pour la protéine de séquence SEQ ID N°42; 273-280 pour la protéine de séquence SEQ ID N°43

164-183 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 163-182 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 163-182 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 163-182

SEQ ID FIQDHGFPIFIKPN

pour la protéine de séquence SEQ ID N°38; 163-182

N°60 EAGSSK

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39; 163-182 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 163-182 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41

87-99 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 86-98 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 86-98 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 86-98 pour la

SEQ ID IVPDVLFPVLHG

protéine de séquence SEQ ID N°38; 86-98 pour la

N°61 K

protéine de séquence SEQ ID N°39; 86-98 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 86-98 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41

69-85 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 68-84 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 68-84 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 68-84 pour la

SEQ ID NCHQLTFSSQGFI

protéine de séquence SEQ ID N°38; 68-84 pour la

N°62 LGEK

protéine de séquence SEQ ID N°39; 68-84 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 68-84 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41 60-68 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 59-67 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 59-67 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 59-67 pour la

SEQ ID

NDTWLEDHK protéine de séquence SEQ ID N°38; 59-67 pour la

N°63

protéine de séquence SEQ ID N°39; 59-67 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 59-67 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41

281 -289 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 280-288 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 280-288 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 280-288

SEQ ID

NLGLTGLAR pour la protéine de séquence SEQ ID N°38; 280-288

N°64

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39; 280-288 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 280-288 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41

192-212 pour les protéines de SEQ N°42, 42 5; 191 -21 1 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36 191 -21 1 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37 191 -21 1

SEQ ID TALQSALTTAFA

pour la protéine de séquence SEQ ID N°38 191 -21 1

N°65 YGSTVLIQK

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39 191 -21 1 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40 191 -21 1 pour la protéine de séquence SEQ ID I ^°41

132-153 pour les protéines de SEQ N°42, 42 5; 131-152 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36 131 -152 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37 131 -152

SEQ ID WLLHQLADTMG

pour la protéine de séquence SEQ ID N°38 131 -152

N°66 IASAPTLLLSR

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39 131 -152 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40 131 - 152 pour la protéine de séquence SEQ ID î >T°41

154-163 pour les protéines de SEQ N°42, 42 S; 153-162 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36 153-162 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37 153- 162

SEQ ID

YENDPATIDR pour la protéine de séquence SEQ ID N°38 153- 162

N°67

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39 153-162 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40 153-162 pour la protéine de séquence SEQ ID î ^°41 250-272 pour les protéines de SEQ N°42, 43; 249-271 pour la protéine de séquence SEQ ID N°36; 249-271 pour la protéine de séquence SEQ ID N°37; 249-271

SEQ ID YQLISATITVPAP

pour la protéine de séquence SEQ ID N°38; 249-271

N°68 LPLALESQIK

pour la protéine de séquence SEQ ID N°39; 249-271 pour la protéine de séquence SEQ ID N°40; 249-271 pour la protéine de séquence SEQ ID N°41

SEQ ID UVPAPLPETIET 263-276 pour les protéines de SEQ N°44, 45, 46, 47,

N°69 K 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58

SEQ ID 62-70 pour les protéines de SEQ N°44, 45, 46, 47, 48,

QDTWLLDTK

N°70 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58

SEQ ID 256-262 pour les protéines de SEQ N°44, 45, 46, 47,

YQLISAK

N°71 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, lié à l'expression de la protéine VanD, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanD et à ses différents variants de séquences SEQ ID N° 72 à SEQ ID N° 79.

SEQ ID N°72 :

MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP CLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDWLPMIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDF VYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEEARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAI LGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIQ KTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFT LTEILDRLIELSLRR SEQ ID N°73 :

MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP

CLGWEQYAGDPWFSPDRSTHGLLIQKDTGYEIQPVDWFPMIHGKFGEDGSIQ

GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTWKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDLV

YPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIREARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAIL

GNENDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIRK TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL SEILDRLIEFSLRR

SEQ ID N°74 :

MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP

CLEWEQYAGDPWFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDVVFPMIHGKFGEDGSIQ

GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTVVKNAGITVPGFRILQEGDRLETEDFV

YPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEEARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAIL

GNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQIQE

TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL

SEILDRLIELSLRR

SEQ ID N°75 :

MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP

CLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDTGYEIQPVDVGLPMIHGKFGEDGSIQ

GLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDF

VYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEDARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAI

LGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVIERIQK

TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL

TEILDRLIELSLRR

SEQ ID N°76 :

MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTI QGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAE TLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVG CAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQI QETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAG FTLSEILDRLIGLSLRR SEQ ID N°77 :

MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTI QGLLELSGIPYVVCDIQSSVICMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAET LSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVG CAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQI QETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAG FTLSEILDRLIGLSLRR SEQ ID N°78 :

MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRTHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGT IQGLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLKA ETLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDCKILVEEAVSGSEV GCAILGNENALMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAVLPDEVR ERIQKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTA AGFTLTEILDRLIELSLRR SEQ ID N°79 :

MYRINVAVLFGGCSEEHTVSIKSAMELAANIDTEKYQPFYIGITKSGVWKLCEKP

CLDWEQYAKYPWFSPGRNTHGFLIQKEDRYEIQPVDVVFPIIHGKFGEDGSIQ

GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYTTVKNAGIEVPDFQIIQDGDSPKTECFS

FPLFVKPARSGSSFGVNKVDKAEDLCAAINEARQYDRKVLIEQAVSGSEVGCAV

LGTGTDLIVGEVDQISLKHGFFKIHQEAQPEKGSENATIEVPADLPAKVRERIQK

TAKKIYQVLGCRGLARIDLFLREDGHIVLNEVNTMPGFTSYSRYPCMMTAAGFT

LSELIDRLIELALRR lesdits peptides de type VanD étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°80 à SEQ ID N°83 tels que définis ci-après :

Peptide Séquence d'acides Position du peptide dans la ou les

SEQ ID N° aminés protéines VanD

SEQ ID 252-259 pour les protéines de SEQ N°72,

GSENAVIR

N°80 73, 74, 75, 76, 77, 78

SEQ ID 291 -296 pour les protéines de SEQ N°72,

IDLFLR

N°81 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 SEQ ID 243-251 pour les protéines de SEQ N°72,

IHQEAQPEK

N°82 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79

SEQ ID 175-183 pour les protéines de SEQ N°72,

SGSSFGVNK

N°83 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79

Avantageusement, les marqueurs de type VanD choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 et SEQ ID N° 83 sont détectés après induction du mécanisme de résistance.

Avantageusement, les marqueurs de type VanD choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 et SEQ ID N° 83 sont détectés sans étape d'induction.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, induit par l'expression de la protéine VanE, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanE de séquence SEQ ID N° 84.

SEQ ID N°84 :

MKTVAIIFGGVSSEYEVSLKSAVAIIKNMESIDYNVMKIGITEEGHWYLFEGTTDKI

KKDRWFLDESCEEIVVDFAKKSFVLKNSKKIIKPDILFPVLHGGYGENGAMQGVF

ELLDIPYVGCGIGAAAISMNKIMLHQFAEAIGVKSTPSMIIEKGQDLQKVDAFAKI

HGFPLYIKPNEAGSSKGISKVERKSDLYKAIDEASKYDSRILIQKEVKGVEIGCGIL

GNEQLWGECDQISLVDGFFDYEEKYNLVTAEILLPAKLSIDKKEDIQMKAKKLY

RLLGCKGLARIDFFLTDDGEILLNEINTMPGFTEHSRFPMMMNEIGMDYKEIIENL

LVLAVE N H EKKLSTI D lesdits marqueurs de type VanE étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°85 à SEQ ID N°91 tels que définis ci-après : Peptide Séquence d'acides Position du peptide dans la ou les

SEQ ID N° aminés protéines VanE

SEQ ID

AIDEASK 198-204 pour la protéine de SEQ N°84

N°85

SEQ ID

FPMMMNEIGMDYK 318-330 pour la protéine de SEQ N°84

N°86

SEQ ID

IMLHQFAEAIGVK 134-146 pour la protéine de SEQ N°84

N°87

SEQ ID

NMESIDY VMK 28-38 pour la protéine de SEQ N°84

N°88

SEQ ID

SAVAIIK 21-27 pour la protéine de SEQ N°84

N°89

SEQ ID

STPSMIIEK 147-155 pour la protéine de SEQ N°84

N°90

SEQ ID

Y LVTAEILLPAK 251-263 pour la protéine de SEQ N°84

N°91

Avantageusement, le marqueur de type VanE correspondant au peptide de séquence SEQ ID N° 89 est détecté après induction du mécanisme de résistance.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, lié à l'expression de la protéine VanG, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanG et à ses différents variants de séquences SEQ ID N° 92 à SEQ ID N° 94.

SEQ ID N°92 :

MIKKRIAIIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTKKFDIVPIGITRNGDWYHYTGKKE KIANNTWFEDNENLYSVAVSQNRSVKGFIEFKEEKFYIIKVDLIFPVLHGKNGED GTLQGLFELAGIPVVGCDTLSSALCMDKDKAHKLVSLAGISVPKSVTFKFSGKK AALKKIEKELSYPLFVKPVRAGSSFGITKVTKQQELENAIQLAFEHDAEVIVEETIN GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI QETAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG LSFAQMLDKLIGLYVE SEQ ID N°93 : MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEK EKILNNTWFEDSKNLCPVWSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGE DGTLQGIFELAGIPWGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEE AAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETIN GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI QEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG LSFSQMLDKLIGLYVE SEQ ID N°94 :

MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEK

EKILNNTWFEDSKNLCPWVSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGE

NGTLQGIFELAGIPWGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEE

AAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETIN

GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI

QEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG

LSFSQMLDKLIGLYVE lesdits marqueurs de type VanG étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°95 à SEQ ID N°102 tels que définis ci-après :

Peptide

Séquence d'acides Position du peptide dans la ou les

SEQ ID

aminés protéines VanG

N°

SEQ ID 187-195 pour les protéines de SEQ

AGSSFGITK

N°95 N°92, 93, 94

SEQ ID 289-297 pour les protéines de SEQ

ALGCSGFSR

N°96 N°92, 93, 94

SEQ ID 271 -277 pour les protéines de SEQ

IDAEAEK

N°97 N°92, 93, 94 SEQ ID 265-270 pour les protéines de SEQ

IYMPAR

N°98 N°92, 93, 94

SEQ ID 343-349 pour les protéines de SEQ

LIGLYVE

N°99 N°92, 93, 94

SEQ ID 146-156 pour les protéines de SEQ

LVSLAGISVPK

N°100 N°92, 93, 94

SEQ ID 242-257 pour les protéines de SEQ

VDEIELSSGFFDYTEK

N°101 N°92, 93, 94

SEQ ID 325-330 pour les protéines de SEQ

YPNMMK

N°102 N°92, 93, 94

Avantageusement, les marqueurs de type VanG choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96, SEQ ID N° 97, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 100 et SEQ ID N° 102 sont détectés après induction du mécanisme de résistance.

Avantageusement, les marqueurs de type VanG choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 97 et SEQ ID N° 100 sont détectés sans étape d'induction.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, induit par l'expression de la protéine VanL, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanL de séquence SEQ ID N° 103.

SEQ ID N°103 :

MMKLKKIAIIFGGQSSEYEVSLKSTVSVLETLSTCNFEIIKIGIDLGGKWYLTTSNN KDIEYDVWQTDPSLQEIIPCFNNRGFYNKTTNKYFRPDVLFPILHGGTGEDGTL QGVFELMNIPYVGCGVTPSAICMDKYLLHEFAQSVGVKSAPTLIIRTRNCKDEID

KFIEKNDFPIFVKPNEAGSSKGINKVNEPDKLEDALTEAFKYSKSVIIQKAIIGREI

GCAVLGNEKLLVGECDEVSLNSDFFDYTEKYQMISAKVNIPASISVEFSNEMKK

QAQLLYRLLGCSGLARIDFFLSDNNEILLNEINTLPGFTEHSRYPKMMEAVGVTY

KEIITKLINLAEEKYYG lesdits peptides de type VanL étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°104 à SEQ ID N°120 tels que définis ci-après :

Peptide

Position du peptide dans la ou les SEQ ID Séquence d'acides aminés

protéines VanL

N°

SEQ ID 59-81 pour la protéine de SEQ

DIEYDVWQTDPSLQEIIPCF R

N°104 N°103

SEQ ID 222-232 pour la protéine de SEQ

EIGCAVLGNEK

N°105 N°103

SEQ ID

IAIIFGGQSSEYEVSLK 7-23 pour la protéine de SEQ N°103 N°106

SEQ ID 42-49 pour la protéine de SEQ

IGIDLGGK

N°107 N°103

SEQ ID 198-207 pour la protéine de SEQ

LEDALTEAFK

N°108 N°103

SEQ ID 339-346 pour la protéine de SEQ

LINLAEEK

N°109 N°103

SEQ ID 285-293 pour la protéine de SEQ

LLGCSGLAR

N°110 N°103

SEQ ID 233-253 pour la protéine de SEQ

LLVGECDEVSLNSDFFDYTEK

N°lll N°103

SEQ ID 324-333 pour la protéine de SEQ

MMEAVGVTYK

N°112 N°103

SEQ ID 172-187 pour la protéine de SEQ

NDFPIFVKPNEAGSSK

N°113 N°103

SEQ ID 278-284 pour la protéine de SEQ

QAQLLYR

N°114 N°103

SEQ ID 150-157 pour la protéine de SEQ

SAPTLIIR

N°115 N°103

SEQ ID 24-41 pour la protéine de SEQ

STVSVLETLSTCNFEIIK

N°116 N°103 SEQ ID 261 -276 pour la protéine de SEQ

V IPASISVEFSNEMK

N°117 N°103

SEQ ID 50-58 pour la protéine de SEQ

WYLTTSNNK

N°118 N°103

SEQ ID 137-149 pour la protéine de SEQ

YLLHEFAQSVGVK

N°119 N°103

SEQ ID 254-260 pour la protéine de SEQ

YQMISAK

N°120 N°103

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, induit par l'expression de la protéine VanM, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanM de séquence SEQ ID N° 121.

SEQ ID N°121 :

MNRLKIAILFGGCSEEHNVSVKSAAEIANNIDIGKYEPIYIGITQSGVWKTCEKPCI

DWDNEHCRSAVLSPDKKMHGLLIMQDKGYQIQRIDWFSVLHGKSGEDGAIQG

LFELSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYIIAKNAGIATPEFQVIYKDDKPAADSFTY

PVFVKPARSGSSYGVNKVNSADELDSAIDLARQYDSKILIEQGVLGYEVGCAVL

GNSFDLIVGEVDQIRLQHGIFRIHQEAEPEKGSENATITVPAELSAEERERIKEAA

KNIYKALGCRGLSRVDMFLQDNGRIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMVSAGITIP

ELIDHLIVLAVKE lesdits peptides de type VanM étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°122 à SEQ ID N°139 tels que définis ci-après :

Position du peptide dans la ou

Séquence d'acides aminés

les protéines VanM SEQ ID 156-174 pour la protéine de SEQ

DDKPAADSFTYPVFVKPAR

N°122 N°121

SEQ ID 252-269 pour la protéine de SEQ

GSENATITVPAELSAEER

N°123 N°121

SEQ ID 6-22 pour la protéine de SEQ

IAILFGGCSEEHNVSVK

N°124 N°121

SEQ ID 91-101 pour la protéine de SEQ

IDWFSVLHGK

N°125 N°121

SEQ ID 243-251 pour la protéine de SEQ

IHQEAEPEK

N°126 N°121

SEQ ID 301 -317 pour la protéine de SEQ

IVLNEV TMPGFTSYSR

N°127 N°121

SEQ ID 236-242 pour la protéine de SEQ

LQHGIFR

N°128 N°121

SEQ ID 75-84 pour la protéine de SEQ

MHGLLIMQDK

N°129 N°121

SEQ ID 321 -342 pour la protéine de SEQ

MMVSAGITIPELIDHLIVLAVK

N°130 N°121

SEQ ID 142-155 pour la protéine de SEQ

NAGIATPEFQVIYK

N°131 N°121

SEQ ID 23-35 pour la protéine de SEQ

SAAEIA IDIGK

N°132 N°121

SEQ ID 66-73 pour la protéine de SEQ

SAVLSPDK

N°133 N°121

SEQ ID 175-183 pour la protéine de SEQ

SGSSYGV K

N°134 N°121

SEQ ID 134-141 pour la protéine de SEQ

SLAYIIAK

N°135 N°121

SEQ ID 51 -65 pour la protéine de SEQ

TCEKPCIDWDNEHCR

N°136 N°121

SEQ ID 291 -300 pour la protéine de SEQ

VDMFLQDNGR

N°137 N°121

SEQ ID 184-198 pour la protéine de SEQ

V SADELDSAIDLAR

N°138 N°121 SEQ ID 36-50 pour la protéine de SEQ

YEPIYIGUQSGVWK

N°139 N°121

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la détection d'un mécanisme de résistance aux glycopeptides, induit par l'expression de la protéine VanN, est caractérisée par la détection d'au moins un peptide appartenant à la protéine VanN de séquence SEQ ID N° 140.

SEQ ID N°140 :

MKKIALIFGGTSAEYEVSLKSAASVLSVLENLNVEIYRIGIASNGKWYLTFSDNETI

ANDLWLQDKKLNEITPSFDGRGFYDQAEKVYFKPDVLFPMLHGGTGENGTLQG

VFECMQIPYVGCGVASSAICMNKYLLHQFAKSVGVMSTPTQLISSTDEQQVIKN

FTELYGFPIFIKPNEAGSSKGISKVHTEAELTKALTEAFQFSQTVILQKAVSGVEI

GCAILGNDQLLVGECDEVSLATDFFDYTEKYQMTTAKLTVPAKIPVATSREIKRQ

AQLLYQLLGCQGLARIDFFLTEAGEILLNEINTMPGFTNHSRFPAMMAATGITYQ

ELISTLITLAEDK

lesdits peptides de type VanN étant choisis, de préférence, parmi les peptides de séquence SEQ ID N°141 à SEQ ID N°154 tels que définis ci-après :

Peptide

Position du peptide dans la

SEQ ID Séquence d'acides aminés

protéine VanN

N°

SEQ ID 198-213 pour la protéine de SEQ

ALTEAFQFSQTVILQK

N°141 N°140

SEQ ID 79-86 pour la protéine de SEQ

GFYDQAEK

N°142 N°140

SEQ ID 4-20 pour la protéine de SEQ

IALIFGGT SAEYEVSLK

N°143 N°140

SEQ ID 39-46 pour la protéine de SEQ

IGIASNGK

N°144 N°140

SEQ ID 264-270 pour la protéine de SEQ

IPVATSR

N°145 N°140

SEQ ID 68-78 pour la protéine de SEQ

LNEUPSFDGR

N°146 N°140 SEQ ID 164-184 pour la protéine de SEQ

NFTELYGFPIFIKPNEAGSSK

N°147 N°140

SEQ ID 275-290 pour la protéine de SEQ

QAQLLYQLLGCQGLAR

N°148 N°140

SEQ ID 21 -38 pour la protéine de SEQ

SAASVLSVLENLNVEIYR

N°149 N°140

SEQ ID 142-163 pour la protéine de SEQ

SVGVMSTPTQLISSTDEQQVIK

N°150 N°140

SEQ ID 189-197 pour la protéine de SEQ

VHTEAELTK

N°151 N°140

SEQ ID 47-66 pour la protéine de SEQ

WYLTF S DNETI ANDLWLQDK

N°152 N°140

SEQ ID 134-141 pour la protéine de SEQ

YLLHQFAK

N°153 N°140

SEQ ID 251 -257 pour la protéine de SEQ

YQMTTAK

N°154 N°140

Le procédé de l'invention et ses avantages ressortiront de la suite de la présente description qui présente plusieurs exemples, non limitatifs, de mise en œuvre dudit procédé.

Exemple 1 : Préparation d'un échantillon primaire urinaire par enrichissement en microorganismes:

Le protocole suivant est mis en œuvre en 16 étapes (les étapes 5 à 12 sont optionnelles et pourraient être omises si l'échantillon enrichi est ultérieurement traité selon les exemples 6 et suivants) :

1. Centrifugation de 5 mL d'urine contaminée, à 2000g pendant 30 secondes

2. Récupération du surnageant

3. Centrifugation à 15000g pendant 5 minutes

4. Elimination du surnageant

5. Lavage du culot avec 3 mL d'eau distillée par remise en suspension

6. Centrifugation à 15000g pendant 5 minutes

7. Elimination du surnageant 8. Mettre le culot en présence de solvant (8 volumes acétone pour 1 volume de méthanol) en dilution au 1/10

9. Laisser 1 heure à -20°C

10. Centrifugation à 15000g pendant 5 minutes

1 1 . Elimination du surnageant

12. Mettre le culot en présence de solvant (8 volumes acétone pour 1 volume de méthanol) en dilution au 1/10

13. Laisser 1 heure à -20°C

14. Centrifugation à 15000g pendant 5 minutes

15. Elimination du surnageant

Le culot constitue l'échantillon enrichi en microorganisme

Exemple 2 : Mise en culture de l'échantillon sur milieu de culture en absence d'antibiotique :

Les milieux de culture optimaux et les conditions de culture optimales sont différents selon les espèces de microorganisme. Par défaut l'échantillon est ensemencé sur différents milieux :

o gélose Columbia au sang de mouton (référence bioMérieux 43041 ) pendant 18 à 24 h à 35°C, en atmosphère aérobie ou anaérobie ; o gélose TSA (référence bioMérieux 4301 1 ) pendant 18 à 24 h à 37°C.

Exemple 3 : Mise en culture de l'échantillon sur milieu de culture en présence d'antibiotique :

L'échantillon est ensemencé sur milieu :

o gélose VRE (référence bioMérieux 43002) pendant 18 à 24 h à 35°C, en atmosphère aérobie ou anaérobie. Ce milieu contient de la vancomycine. Exemple 4 : Identification de microorganismes par profil biochimique :

L'identification est mise en œuvre comme suit :

1. Sélection de colonies isolées obtenues selon l'exemple 2 ou l'exemple 3, ou par enrichissement de microorganismes présents dans un échantillon primaire selon l'exemple 1.

2. En respectant les conditions d'asepsie, transfert de 3,0 ml_ de solution saline stérile aqueuse (à 0,45-0,50 % de NaCI, de pH 4,5 à 7,0) dans un tube à essai en plastique transparent (polystyrène)

3. A l'aide d'un bâtonnet ou d'un écouvillon stérile, transfert d'un nombre suffisant de colonies identiques dans le tube de solution saline préparé à l'étape 2 et ajustement de la suspension bactérienne entre 0,50 et 0,63 McFarland avec un DENSICHEK étalonné du VITEK®

4. Positionnement du tube de suspension bactérienne et d'une carte d'identification VITEK® sur une cassette VITEK®

5. Chargement de la cassette dans l'instrument VITEK®

6. Les opérations de remplissage, scellage, incubation et lecture sont automatiques

7. Acquisition d'un profil biochimique

Identification avec le système VITEK® réalisée par comparaison à des profils biochimiques de souches connues

Exemple 5 : Identification de microorqanismes à partir d'un échantillon par MALDI-TOF

L'identification est mise en œuvre comme suit :

1. Transfert, à l'aide d'une oese de 1 μΙ, d'une portion de colonie de microorganisme obtenue selon l'exemple 2 ou 3, ou d'un échantillon enrichi selon l'exemple 1 , et dépôt uniforme sur une plaque pour spectrométrie de masse par MALDI-TOF 2. Recouvrement du dépôt avec 1 μΙ de matrice. La matrice utilisée est une solution saturée d'HCCA (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) en solvant organique (50% d'acétonitrile et 2,5% d'acide trifluoroacétique)

3. Séchage à température ambiante

4. Introduction de la plaque dans le spectromètre de masse

5. Acquisition d'un spectre de masse

6. Comparaison du spectre obtenu avec les spectres contenus dans une base de connaissance

7. Identification du microorganisme par comparaison des pics obtenus à ceux de la base de connaissance

Exemple 6 : Identification de microorqanismes à partir d'un échantillon par ESI-MS

L'identification est mise en œuvre comme suit :

1. Prélèvement d'une colonie de microorganisme, obtenue selon l'exemple 2 ou 3, ou d'un échantillon enrichi selon l'exemple 1 , et mise en suspension dans 10ΟμΙ d'eau déminéralisée.

2. Centrifugation à 3000g pendant 5 minutes.

3. Elimination du surnageant.

4. Remise en suspension dans 100μΙ d'eau déminéralisée.

5. Centrifugation à 3000g pendant 5 minutes.

6. Elimination du surnageant.

7. Remise en suspension dans 100μΙ d'un mélange Acétonitrile, eau déminéralisée, acide formique (50/50/0.1 %).

8. Filtration avec un filtre de porosité 0.45 μηη.

9. Injection dans un spectromètre de masse en mode MS simple.

10. Acquisition d'un spectre de masse.

1 1 . Comparaison du spectre obtenu avec les spectres contenus dans une base de connaissance. 12. Identification du microorganisme par référence à des spectres de référence.

Exemple 7 : Obtention de protéines digérées à partir de microorganismes

Le protocole suivant est mis en œuvre en 17 étapes :

1. Prélèvement d'une colonie de microorganisme, obtenue selon l'exemple 2 ou 3, ou d'un échantillon enrichi selon l'exemple 1 , et mise en suspension dans 10 à 10ΟμΙ d'une solution d'hydrochlorure de guanidine 6M, 50 mM Tris-HCI, pH=8,0.

2. Ajout de dithiothréitol (DTT) pour obtenir une concentration finale de 5mM.

3. Réduction pendant 20 minutes à 95°C dans un bain-marie.

4. Refroidissement des tubes à température ambiante.

5. Ajout d'iodoacétamide pour obtenir une concentration finale de 12.5 mM.

6. Alkylation pendant 40 minutes à température ambiante et à l'obscurité.

7. Dilution d'un facteur 6 avec une solution de NH ₄ HCO ₃ 50 mM, pH=8.0 pour obtenir une concentration finale en hydrochlorure de guanidine de 1 M.

8. Ajout de 1 μg de trypsine.

9. Digestion à 37°C pendant 6 heures jusqu'à une nuit.

10. Ajout d'acide formique jusqu'à un pH inférieur à 4 pour stopper la réaction.

1 1 . Le volume d'échantillon est complété à 1 mL avec eau/acide formique 0,5% (v/v)

12. Equilibrage des colonnes HLB Oasis Waters avec 1 ml de méthanol puis 1 ml H ₂ O/acide formique 0,1 % (v/v)

13. Dépôt de l'échantillon qui s'écoule par gravité

14. Lavage avec 1 ml H ₂ O/acide formique 0,1 % (v/v)

15. Elution avec 1 ml d'un mélange 80% de méthanol et 20% d'eau/acide formique 0,1 % (v/v) 16. L'éluat est évaporé avec un évaporateur de type SpeedVac® SPD2010 (Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique), durant 2 heures, afin d'obtenir un volume d'environ 10ΟμΙ.

L'éluat est ensuite repris dans une solution eau/acide formique 0,5% (v/v) quantité suffisante pour (QSP) 200μΙ

Exemple 8 : Identification de résistance aux glycopeptides, sans induction, de type VanA, VanB, VanC1 , VanD, VanE et VanG:

Les échantillons Ech1 à Ech13 sont identifiés selon l'une des méthodes décrites dans les exemples 1 à 6. L'identification des espèces est reportée dans le

TABLEAU 1.

TABLEAU1

Les échantillons Ech1 à Ech1 1 correspondent à une espèce pouvant comporter un mécanisme de résistance de type Van. La méthode suivante est alors mise en œuvre pour rechercher un tel mécanisme.

La colonie de microorganisme est obtenue selon l'exemple 2, traitée selon l'exemple 7, puis un volume de 50μΙ de protéines digérées est injecté et analysé selon les conditions suivantes : • Chaîne chromatographique Dionex Ultimate 3000 de la société Dionex Corporation (Sunnyvale, Etats Unis d'Amérique).

• Colonne Waters BEH130 C18, 2,1 mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,5μηη (Waters, Saint-Quentin en Yvelines, France).

• Solvant A : H ₂ 0 + 0, 1 % acide formique.

• Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique.

Gradient HPLC défini dans le TABLEAU 2 ci-après.

TABLEAU 2 :

• L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation du spectromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems (Foster City, Etats Unis d'Amérique).

• Les peptides, issus de la digestion des protéines du microorganisme, sont analysés par le spectromètre de masse en mode MRM. Seuls les peptides indiqués dans le TABLEAU 3 sont détectés. Pour cela, le ou les fragments indiqués dans le TABLEAU 3 sont détectés.

TABLEAU 3 : Etat de Ion fragment de

Transition

Protéine Peptide charge du première numéro

précurseur génération

1 VanA IHQEVEPEK 2 y5 monochargé

2 VanA IHQEVEPEK 2 y6 monochargé

3 VanA IHQEVEPEK 2 y7 monochargé

4 VanA LIVLALK 2 y4 monochargé

5 VanA LIVLALK 2 y5 monochargé

6 VanA LIVLALK 2 y6 monochargé

7 VanA LQYGIFR 2 y4 monochargé

8 VanA LQYGIFR 2 y5 monochargé

9 VanA LQYGIFR 2 y6 monochargé

10 VanA MHGLLVK 2 b5 monochargé

11 VanA MHGLLVK 2 y5 monochargé

12 VanA MHGLLVK 2 y6 monochargé

13 VanA MMAAAGIALPELIDR 2 y6 monochargé

14 VanA MMAAAGIALPELIDR 2 y7 monochargé

15 VanA MMAAAGIALPELIDR 2 y8 monochargé

16 VanA N AG I AT PAFWVIN K 2 y10 monochargé

17 VanA N AG I AT PAFWVIN K 2 y8 monochargé

18 VanA NAG I AT PAFWVIN K 2 y9 monochargé

19 VanA SAIEIAANINK 2 y6 monochargé

20 VanA SAIEIAANINK 2 y7 monochargé

21 VanA SAIEIAANINK 2 y8 monochargé

22 VanA SGSSFGVK 2 y5 monochargé

23 VanA SGSSFGVK 2 y6 monochargé

24 VanA SGSSFGVK 2 y7 monochargé

25 VanA SLTYIVAK 2 y4 monochargé

26 VanA SLTYIVAK 2 y5 monochargé

27 VanA SLTYIVAK 2 y6 monochargé

28 VanA VDMFLQDNGR 2 y6 monochargé

29 VanA VDMFLQDNGR 2 y7 monochargé

30 VanA VDMFLQDNGR 2 y8 monochargé

31 VanA VNSADELDYAIESAR 2 y6 monochargé

32 VanA VNSADELDYAIESAR 2 y7 monochargé

33 VanA VNSADELDYAIESAR 2 y8 monochargé

34 VanA YEPLYIGITK 2 y7 monochargé

35 VanA YEPLYIGITK 2 y8 monochargé

36 VanA YEPLYIGITK 2 y8 dichargé

37 VanB FDPHYIGITK 2 y6 monochargé

38 VanB FDPHYIGITK 2 y7 dichargé

39 VanB FDPHYIGITK 2 y8 dichargé

40 VanB IDVAFPVLHGK 2 y6 monochargé

41 VanB IDVAFPVLHGK 2 y7 monochargé

42 VanB IDVAFPVLHGK 2 y8 monochargé

43 VanB IHQENEPEK 2 y5 monochargé

44 VanB IHQENEPEK 2 y6 monochargé VanB IHQENEPEK 2 y7 monochargé

VanB LSHGIFR 2 y4 monochargé

VanB LSHGIFR 2 y5 monochargé

VanB LSHGIFR 2 y6 monochargé

VanB SLAYILTK 2 y5 monochargé

VanB SLAYILTK 2 y6 monochargé

VanB SLAYILTK 2 y7 monochargé

VanB THGLLVMK 2 b5 monochargé

VanB THGLLVMK 2 b6 monochargé

VanB THGLLVMK 2 y6 monochargé

VanB VQETAK 2 y3 monochargé

VanB VQETAK 2 y4 monochargé

VanB VQETAK 2 y5 monochargé

VanC1 EQAQLLYR 2 y3 monochargé

VanC1 EQAQLLYR 2 y4 monochargé

VanC1 EQAQLLYR 2 y6 monochargé

VanC1 FIQDHGFPIFIKPNEAGSSK 3 b7 monochargé

VanC1 FIQDHGFPIFIKPNEAGSSK 3 y8 monochargé

VanC1 FIQDHGFPIFIKPNEAGSSK 3 y9 monochargé

VanC1 IVPDVLFPVLHGK 2 y1 1 dichargé

VanC1 IVPDVLFPVLHGK 3 y1 1 dichargé

VanC1 IVPDVLFPVLHGK 3 y1 1 trichargé

VanC1 NC[CAM]HQLTFSSQGFILGEK 3 y5 monochargé

VanC1 NC[CAM]HQLTFSSQGFILGEK 3 y7 monochargé

VanC1 NC[CAM]HQLTFSSQGFILGEK 3 y8 monochargé

VanC1 NDTWLEDHK 2 y5 monochargé

VanC1 NDTWLEDHK 2 y6 monochargé

VanC1 NDTWLEDHK 2 y7 monochargé

VanC1 NLGLTGLAR 2 y4 monochargé

VanC1 NLGLTGLAR 2 y5 monochargé

VanC1 NLGLTGLAR 2 y7 monochargé

VanC1 TALQSALTTAFAYGSTVLIQK 3 y7 monochargé

VanC1 TALQSALTTAFAYGSTVLIQK 3 y8 monochargé

VanC1 TALQSALTTAFAYGSTVLIQK 3 y9 monochargé

VanC1 WLLHQLADTMGIASAPTLLLSR 3 y10 monochargé

VanC1 WLLHQLADTMGIASAPTLLLSR 3 y7 monochargé

VanC1 WLLHQLADTMGIASAPTLLLSR 3 y9 monochargé

VanC1 YENDPATIDR 2 b4 monochargé

VanC1 YENDPATIDR 2 y6 monochargé

VanC1 YENDPATIDR 2 y8 monochargé

VanC1 YQLISATITVPAPLPLALESQIK 3 y1 1 dichargé

VanC1 YQLISATITVPAPLPLALESQIK 3 y13 dichargé

VanC1 YQLISATITVPAPLPLALESQIK 3 y9 monochargé

VanC2 ITVPAPLPETIETK 2 y1 1 dichargé

VanC2 ITVPAPLPETIETK 2 y7 monochargé

VanC2 ITVPAPLPETIETK 2 y9 monochargé

VanC2 QDTWLLDTK 2 y4 monochargé

VanC2 QDTWLLDTK 2 y5 monochargé VanC2 QDTWLLDTK 2 y6 monochargé

VanC2 YQLISAK 2 y3 monochargé

VanC2 YQLISAK 2 y5 monochargé

VanC2 YQLISAK 2 y6 monochargé

VanD GSENAVIR 2 y4 monochargé

VanD GSENAVIR 2 y5 monochargé

VanD GSENAVIR 2 y6 monochargé

VanD IDLFLR 2 y3 monochargé

VanD IDLFLR 2 y4 monochargé

VanD IDLFLR 2 y5 monochargé

VanD IHQEAQPEK 2 y3 monochargé

VanD IHQEAQPEK 2 y7 monochargé

VanD IHQEAQPEK 2 y8 dichargé

VanD SGSSFGVNK 2 y5 monochargé

VanD SGSSFGVNK 2 y6 monochargé

VanD SGSSFGVNK 2 y7 monochargé

VanE AIDEASK 2 y4 monochargé

VanE AIDEASK 2 y5 monochargé

VanE AIDEASK 2 y6 monochargé

VanE FPMMMNEIGMDYK 2 y9 monochargé

VanE FPMMMNEIGMDYK 2 y12 dichargé

VanE FPMMMNEIGMDYK 2 y5 monochargé

VanE IMLHQFAEAIGVK 2 y10 dichargé

VanE IMLHQFAEAIGVK 2 y8 monochargé

VanE IMLHQFAEAIGVK 2 y9 monochargé

VanE NMESIDYNVMK 2 y6 monochargé

VanE NMESIDYNVMK 2 y7 monochargé

VanE NMESIDYNVMK 2 y8 monochargé

VanE SAVAIIK 2 y4 monochargé

VanE SAVAIIK 2 y5 monochargé

VanE SAVAIIK 2 y6 monochargé

VanE STPSMIIEK 2 y6 monochargé

VanE STPSMIIEK 2 y7 monochargé

VanE STPSMIIEK 2 y7 dichargé

VanE YNLVTAEILLPAK 2 y4 monochargé

VanE YNLVTAEILLPAK 2 y8 monochargé

VanE YNLVTAEILLPAK 2 y9 monochargé

VanG AGSSFGITK 2 y5 monochargé

VanG AGSSFGITK 2 y7 monochargé

VanG AGSSFGITK 2 y8 monochargé

VanG ALGC[CAM]SGFSR 2 y5 monochargé

VanG ALGC[CAM]SGFSR 2 y6 monochargé

VanG ALGC[CAM]SGFSR 2 y7 monochargé

VanG IDAEAEK 2 y4 monochargé

VanG IDAEAEK 2 y5 monochargé

VanG IDAEAEK 2 y6 monochargé

VanG IYMPAR 2 y3 monochargé

VanG IYMPAR 2 y4 monochargé 141 VanG IYMPAR 2 y5 monochargé

142 VanG LIGLYVE 2 b4 monochargé

143 VanG LIGLYVE 2 b5 monochargé

144 VanG LIGLYVE 2 b6 monochargé

145 VanG LVSLAGISVPK 2 y6 monochargé

146 VanG LVSLAGISVPK 2 y 7 monochargé

147 VanG LVSLAGISVPK 2 y9 monochargé

148 VanG VDEIELSSGFFDYTEK 2 y10 monochargé

149 VanG VDEIELSSGFFDYTEK 2 y4 monochargé

150 VanG VDEIELSSGFFDYTEK 2 y6 monochargé

151 VanG YPNMMK 2 y3 monochargé

152 VanG YPNMMK 2 y4 monochargé

153 VanG YPNMMK 2 y5 monochargé

Les transitions mentionnées dans le TABLEAU 3 sont détectées en utilisant les paramètres figurant dans les TABLEAU 4 et 5.

TABLEAU 4 :

Energie

Temps (m/z) (m/z)

Transition de

de filtré en filtré en

numéro collision

rétention Q1 Q3

(eV)

1 8,75 554,79 601 ,32 29

2 8,75 554,79 730,36 29

3 8,75 554,79 858,42 29

4 19,71 385,28 444,32 22

5 19,71 385,28 543,39 22

6 19,71 385,28 656,47 22

7 17,91 448,75 492,29 25

8 17,91 448,75 655,36 25

9 17,91 448,75 783,41 25

10 13,32 399,24 552,3 23

11 13,32 399,24 529,37 23

12 13,32 399,24 666,43 23

13 23,29 786,42 742,41 32

14 23,29 786,42 855,49 31

15 23,29 786,42 926,53 34

16 22,44 751 ,41 1 146,63 38

17 22,44 751 ,41 974,55 38

18 22,44 751 ,41 1075,59 38

19 15,89 572,32 630,36 25

20 15,89 572,32 743,44 26

21 15,89 572,32 872,48 25

22 10,67 384,7 537,3 20,5 10,67 384,7 624,34 18,5

10,67 384,7 681 ,36 19,5

15,29 447,77 430,3 25

15,29 447,77 593,37 25

15,29 447,77 694,41 25

16,64 597,78 702,35 29

16,64 597,78 849,42 29

16,64 597,78 980,46 27

18,52 826,89 646,35 41

18,52 826,89 809,42 41

18,52 826,89 924,44 41

19,2 598,83 807,5 31

19,2 598,83 904,55 22

19,2 598,83 452,78 25

15,89 595,81 694,41 33

15,89 595,81 416,24 35

15,89 595,81 464,77 28

19,1 598,35 650,4 29

19,1 598,35 797,47 28

19,1 598,35 868,5 28

4,97 562,27 616,29 30

4,97 562,27 745,34 30

4,97 562,27 873,39 30

12,85 415,24 492,29 23

12,85 415,24 629,35 23

12,85 415,24 716,38 23

17,9 454,78 637,39 25

17,9 454,78 708,43 25

17,9 454,78 821 ,51 25

14,32 449,76 522,3 25

14,32 449,76 621 ,37 25

14,32 449,76 660,41 25

1 ,53 338,19 319,2 20

1 ,53 338,19 448,24 20

1 ,53 338,19 576,3 20

14,16 510,78 451 ,27 24

14,16 510,78 564,35 25

14,16 510,78 763,45 27

19,45 744,72 845,39 43

19,45 744,72 789,37 41

19,45 744,72 917,47 40

22,56 717,43 611 ,35 30

22,56 478,62 611 ,35 16

22,56 478,62 407,9 19

19,53 655,98 559,34 34

19,53 655,98 763,43 27

19,53 655,98 891 ,49 25

12,98 579,26 641 ,33 31 12,98 579,26 827,4 29

12,98 579,26 928,45 27

16,92 457,77 416,26 22

16,92 457,77 517,31 21

16,92 457,77 687,41 22

27,6 728,74 788,89 29

27,6 728,74 845,51 31

27,6 728,74 1008,57 31

26,39 803,1 1 1028,61 35

26,39 803,1 1 799,5 30

26,39 803,1 1 957,57 35

11 ,46 597,28 522,18 26

11 ,46 597,28 672,37 33

11 ,46 597,28 901 ,44 26

26,58 822,81 604,87 30

26,58 822,81 688,91 26

26,58 822,81 998,59 39

19,29 754,93 598,33 30

19,29 754,93 817,43 45

19,29 754,93 1027,57 38

18,18 560,29 476,27 30

18,18 560,29 589,36 30

18,18 560,29 775,43 30

13,88 41 1 ,74 305,18 23

13,88 41 1 ,74 531 ,35 23

13,88 41 1 ,74 659,41 23

9,97 423,23 458,31 25

9,97 423,23 572,35 23

9,97 423,23 701 ,39 21

19,92 388,74 435,27 19

19,92 388,74 548,36 17

19,92 388,74 663,38 19

5,57 540,28 373,21 35

5,57 540,28 829,41 26

5,57 540,28 483,74 29

10,45 441 ,72 564,31 23

10,45 441 ,72 651 ,35 22

10,45 441 ,72 738,38 21

4,52 367,19 434,22 21

4,52 367,19 549,25 17

4,52 367,19 662,34 18

21 ,88 803,84 1 100,48 41

21 ,88 803,84 730,31 38

21 ,88 803,84 613,27 46

20,03 728,9 550,3 39

20,03 728,9 834,47 41

20,03 728,9 962,53 39

16,81 672,3 769,35 26 1 19 16,81 672,3 882,44 26

120 16,81 672,3 969,47 26

121 13,59 351 ,23 444,32 18

122 13,59 351 ,23 543,39 16

123 13,59 351 ,23 614,42 17

124 14,51 503,27 720,4 28

125 14,51 503,27 817,45 19

126 14,51 503,27 409,23 20

127 22,39 722,92 428,29 37

128 22,39 722,92 854,53 37

129 22,39 722,92 955,58 37

130 12,77 434,23 565,33 24

131 12,77 434,23 739,4 21

132 12,77 434,23 796,42 22

133 12,41 477,73 553,27 27

134 12,41 477,73 713,3 26

135 12,41 477,73 770,33 24

136 7,63 388,2 476,24 22

137 7,63 388,2 547,27 19

138 7,63 388,2 662,3 19

139 12,85 375,7 343,21 22

140 12,85 375,7 474,25 22

141 12,85 375,7 637,31 22

142 20,72 403,74 397,28 23

143 20,72 403,74 560,34 23

144 20,72 403,74 659,41 23

145 19,66 542,34 600,37 23

146 19,66 542,34 671 ,41 25

147 19,66 542,34 871 ,52 23

148 22,14 939,94 1 180,52 46

149 22,14 939,94 540,27 46

150 22,14 939,94 802,36 46

151 12,66 392,18 409,19 22

152 12,66 392,18 523,24 22

153 12,66 392,18 620,29 22

TABLEAU 5 : potentiel Potentiel en

Transition Potentiel Seuil de d'entrée sortie de cellule numéro d'orifice positivité avant Q0 de collision

1 80 10 35 2000

2 80 10 35 2000

3 80 10 35 2000 80 10 35 1400

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 1500

80 10 35 4000

80 10 35 4000

80 10 35 4000

120 10 18 2000

120 10 18 2000

120 10 18 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

90 10 15 2000

90 10 15 2000

90 10 15 2000

85 10 24 2000

85 10 24 2000

85 10 24 2000

80 10 35 2000

80 10 35 1500

80 10 35 2000

100 10 17 2000

100 10 17 2000

100 10 17 2000

80 10 35 1000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

105 10 20 1400

105 10 20 2000

105 10 20 2000

100 10 1 1 2000

100 10 16 2000

100 10 1 1 2000

90 10 16 2000

90 10 18 2000

90 10 22 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000 80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

75 12 1 1 2000

75 12 14 2000

75 12 18 2000

140 10 35 2000

140 10 35 2000

140 10 35 2000

120 10 35 2000

70 10 35 2000

70 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

80 12 15 2000

80 12 19 2000

80 12 22 2000

70 12 10 4000

70 12 13 4000

70 12 16 4000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

85 12 13 2000

85 12 16 2000

85 12 21 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

75 10 1 1 2000

75 10 14 2000

75 10 16 1800 140 6 10 1300

140 6 14 2000

140 6 16 2000

1 10 12 10 2000

1 10 12 20 2000

1 10 12 6 2000

75 12 14 2000

75 12 16 2000

75 12 18 2000

65 12 18 2000

65 12 23 2000

65 12 15 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

140 9 14 2000

140 9 34 2000

140 9 24 2000

125 9 18 2000

125 9 21 2000

125 9 41 2000

70 12 10 2000

70 12 23 2000

70 12 14 2000

70 12 17 8000

70 12 20 2000

70 12 10 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

70 12 14 2000

70 12 18 2000

70 12 19 2000

80 12 14 2000

80 12 18 2000

80 12 18 2000

70 12 12 1600

70 12 13 2000

70 12 16 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 12 16 2000

80 12 14 2000

80 12 21 2000 148 80 10 35 2000

149 80 10 35 2000

150 80 10 35 2000

151 80 10 35 3000

152 80 10 35 2000

153 80 10 35 2000

Les autres paramètres machine utilisés sont les suivants :

Type de balayage: MRM

MRM planifié : oui

Polarité: Positive

Source d'ionisation: Turbo V™ (Applied BioSystems) Réglage Q1 : Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Pause inter-scan: 5.00 msec

Vitesse de balayage: 10 Da/s

Gaz rideau: 50,00 psi

Tension de cône: 5500,00 V

Température de source: 550,00 °C

Gaz de nébulisation: 50,00 psi

Gaz chauffant: 40,00 psi

Gaz de collision induisant dissociation : 9,00 psi

Remplissage dynamique: inactivé

Temps de cycle total: 1.2 sec

Fenêtre de détection : 90 sec

Les aires obtenues pour chacune des transitions et pour chacun des microorganismes étudiés ont été mesurées. Lorsque l'aire d'une transition est supérieure ou égale au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 5, la détection de la transition est considérée comme positive et est notée « 1 » dans le TABLEAU 6. Lorsque l'aire d'une transition est inférieure au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 5, la détection de la transition est considérée comme négative et est notée « 0 » dans le TABLEAU 6. Lorsque les 3 transitions d'un même peptide sont notées « 1 », la détection du peptide est considérée comme positive. Un cas particulier fait exception à cette règle. Le peptide correspondant aux transitions numéros 49, 50 et 51 a une transition de très faible intensité. Dans ce cas précis, lorsque les transitions 49 et 50 sont notées « 1 », la détection de ce peptide sera considérée comme positive.

TABLEAU 6 :

Transition

Ech1 Ech2 Ech3 Ech4 Ech5 Ech6 Ech7 Ech8 Ech9 Ech10 Ech1 1 numéro

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

20 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

21 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

22 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

23 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

24 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0

1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 129 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

130 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

131 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

132 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

134 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

136 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

137 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

138 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

139 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

140 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

141 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

142 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

143 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

145 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

146 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

147 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

148 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

149 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

150 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

151 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

152 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

153 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Les échantillons Ech1 , Ech2, Ech4, Ech5, Ech7 et Ech9 ne présentent aucun peptide caractéristique de résistance de type Van. Les bactéries présentes dans les échantillons Ech1 , Ech2, Ech4, Ech5, Ech7 et Ech9 peuvent être sensibles aux glycopeptides de type Vancomycine ou Teicoplanine.

Les échantillons Ech3, Ech10 et Ech1 1 comportent au moins un peptide caractéristique de VanA. Les bactéries présentes dans les échantillons Ech3, Ech10 et Ech1 1 expriment donc la ligase VanA qui leur confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

L'échantillon Ech6 comporte au moins un peptide caractéristique de VanG. La bactérie présente dans l'échantillon Ech6 exprime donc la ligase VanG qui lui confère une résistance à la Vancomycine. L'échantillon Ech8 comporte au moins un peptide caractéristique de VanD. La bactérie présente dans l'échantillon Ech8 exprime donc la ligase VanD qui lui confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

Ainsi, de façon avantageuse plusieurs mécanismes de résistance aux glycopeptides sont recherchés simultanément. De façon particulièrement avantageuse, un mécanisme de résistance inductible, tel que le mécanisme de résistance lié à l'expression de VanA, est détecté sans phase d'induction lors de la culture du microorganisme. Ce procédé permet donc de rechercher les mécanismes de résistance aux glycopeptides sans a priori sur leur éventuel existence.

Exemple 9 : Identification de résistance aux glycopeptides, avec induction, de type VanA, VanB, VanD, VanE et VanG:

Les échantillons Ech1 à Ech1 1 sont identifiés selon l'une des méthodes décrites dans les exemples 1 à 6. L'identification des espèces est reportée dans le

TABLEAU 7.

TABLEAU7 :

Les échantillons Ech12 à Ech20 correspondent à une espèce pouvant comporter un mécanisme de résistance de type Van. La méthode suivante est alors mise en œuvre pour rechercher un tel mécanisme. La colonie de microorganisme est obtenue selon l'exemple 3 puis traité selon l'exemple 7 et analysé selon l'exemple 8.

Les aires obtenues pour chacune des transitions et pour chacun des microorganismes étudiés ont été mesurées. Lorsque l'aire d'une transition est supérieure ou égale au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 5, la détection de la transition est considérée comme positive et est notée « 1 » dans le TABLEAU 8. Lorsque l'aire d'une transition est inférieure au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 5, la détection de la transition est considérée comme négative et est notée « 0 » dans le TABLEAU 8. Lorsque les 3 transitions d'un même peptide sont notées « 1 », la détection du peptide est considérée comme positive. Un cas particulier fait exception à cette règle. Le peptide correspondant aux transitions numéros 49, 50 et 51 a une transition de très faible intensité. Dans ce cas précis, lorsque les transitions 49 et 50 sont notées « 1 », la détection de ce peptide sera considérée comme positive.

TABLEAU 8 :

Transition

Ech12 Ech13 Ech14 Ech15 Ech16 Ech17 Ech18 Ech19 Ech20

numéro

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0 0 1 0

4 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0 1

6 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0 0 1 1

8 0 0 0 0 0 0 0 1 1

9 0 0 0 0 0 0 0 1 1

10 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 0 0 0 0 0 0 0 1 1

12 0 0 0 0 0 0 0 1 1

13 0 0 0 0 0 0 0 1 1

14 0 0 0 0 0 0 0 1 1

15 0 0 0 0 0 0 0 1 1

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 0 0 0 0 0 0 0 1 1

20 0 0 0 0 0 0 0 1 1

21 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 1 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 0 0 1 0 0

0 1 1 0 0 0 1 0 0

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 0 1 1 0 0

0 1 1 0 0 0 1 0 0

0 1 1 0 0 0 1 0 0

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

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0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

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0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0

120 0 0 0 0 0 0 0 0 0

121 0 0 0 0 1 0 0 0 0

122 0 0 0 0 1 0 0 0 0

123 0 0 0 0 1 0 0 0 0

124 0 0 0 0 0 0 0 0 0

125 0 0 1 0 1 0 0 0 0

126 0 0 1 0 1 0 0 0 0

127 0 0 0 0 0 1 0 0 0

128 0 0 0 0 0 1 0 0 0

129 0 0 0 0 0 0 0 0 0

130 0 0 0 1 0 0 0 0 0

131 0 0 0 1 0 0 0 0 0

132 0 0 0 1 0 0 0 0 0

133 0 0 0 1 0 0 0 0 0

134 0 0 0 1 0 0 0 0 0

135 0 0 0 1 0 0 0 0 0

136 0 0 0 1 0 0 0 0 0

137 0 0 0 1 0 0 0 0 0

138 0 0 0 1 0 0 0 0 0

139 0 0 0 1 0 0 0 0 0

140 0 0 0 1 0 0 0 0 0

141 0 0 0 1 0 0 0 0 0

142 0 0 0 0 0 0 0 0 0

143 0 0 0 0 0 0 0 0 0

144 0 0 0 0 0 0 0 0 0

145 0 0 0 1 0 0 0 0 0

146 0 0 0 1 0 0 0 0 0

147 0 0 0 1 0 0 0 0 0

148 0 0 0 0 0 0 0 0 0

149 0 0 0 0 0 0 0 0 0

150 0 0 0 0 0 0 0 0 0

151 0 0 0 1 0 0 0 0 0

152 0 0 0 1 0 0 0 0 0

153 0 0 0 1 0 0 0 0 0

L'échantillon Ech12 ne présente aucun peptide caractéristique de résistance de type Van. La bactérie présente dans l'échantillon Ech12 peut être sensible aux glycopeptides de type Vancomycine ou Teicoplanine.

Les échantillons Ech19 et Ech20 comportent au moins un peptide caractéristique de VanA. Les bactéries présentes dans les échantillons Ech19 et Ech20 expriment donc la ligase VanA qui leur confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

Les échantillons Ech13, Ech14 et Ech18 comportent au moins un peptide caractéristique de VanB. Les bactéries présentes dans les échantillons Ech13, Ech14 et Ech18 expriment donc la ligase VanB qui leur confère une résistance à la Vancomycine.

L'échantillon Ech15 comporte au moins un peptide caractéristique de VanG. La bactérie présente dans l'échantillon Ech15 exprime la ligase VanG qui lui confère une résistance à la Vancomycine.

L'échantillon Ech16 comporte au moins un peptide caractéristique de VanE. La bactérie présente dans l'échantillon Ech16 exprime la ligase VanE qui lui confère une résistance à la Vancomycine.

L'échantillon Ech17 comporte au moins un peptide caractéristique de VanD. La bactérie présente dans l'échantillon Ech17 exprime la ligase VanD qui lui confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

Ainsi, de façon avantageuse plusieurs mécanismes de résistance aux glycopeptides peuvent être recherchés simultanément.

Exemple 10 : Obtention de protéines digérées à partir de microorganismes

Le protocole suivant est mis en œuvre en 16 étapes :

1. Prélèvement d'une colonie de microorganisme, obtenue selon l'exemple 8 et mise en suspension dans 10ΟμΙ d'une solution de bicarbonate d'ammonium, 50 mM, pH=8,0 dans un tube contenant des billes de verre de 0.05mm à 2mm de diamètre

2. Ajout de dithiothréitol (DTT) pour obtenir une concentration finale de 5mM.

3. Réduction pendant 5 minutes à 95°C sur une sonde Hielscher (réglage instrument : amplitude :100, cycle :1 ) 4. Refroidissement des tubes à température ambiante.

5. Ajout d'iodoacétamide pour obtenir une concentration finale de 12.5 mM.

6. Alkylation pendant 5 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière.

7. Ajout de 1 μ9 de trypsine.

8. Digestion à 50°C pendant 15 minutes

9. Ajout d'acide formique jusqu'à un pH inférieur à 4 pour stopper la réaction.

10. Centrifugat.ion pendant 5 minutes à 15 000g, le surnageant est récupérer et complété à 1 ml_ avec eau/acide formique 0,5% (v/v)

1 1 . Equilibrage des colonnes HLB Oasis Waters avec 1 ml de méthanol puis 1 ml H ₂ O/acide formique 0,1 % (v/v)

12. Dépôt de l'échantillon qui s'écoule par gravité

13. Lavage avec 1 ml H ₂ O/acide formique 0,1 % (v/v)

14. Elution avec 1 ml d'un mélange 80% de méthanol et 20% d'eau/acide formique 0,1 % (v/v)

15. L'éluat est évaporé avec un évaporateur de type SpeedVac® SPD2010 (Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique), durant 2 heures, afin d'obtenir un volume d'environ 10ΟμΙ.

16. L'éluat est ensuite repris dans une solution eau/acide formique 0,5% (v/v) quantité suffisante pour (QSP) 150μΙ

Exemple 11 : Identification de résistance aux glycopeptides, sans induction, de type VanA:

Les échantillons Ech21 et Ech22 sont identifiés selon l'une des méthodes décrites dans les exemples 1 à 6. L'identification des espèces est reportée dans le TABLEAU 9. TABLEAU 9 :

Les échantillons Ech21 et Ech22 correspondent à l'espèce, Enterococcus faecalis, pouvant comporter un mécanisme de résistance de type Van. La méthode suivante est alors mise en œuvre pour rechercher un tel mécanisme.

Chaque échantillon est traité selon l'exemple 10 et analysé selon l'exemple 8 hormis les éléments mentionnés ci-après.

Les transitions mentionnées dans le TABLEAU 3 sont détectées en utilisant les paramètres figurant dans les TABLEAUX 10 et 11.

TABLEAU 10 :

Energie

Temps (m/z) (m/z)

Transition de

de filtré en filtré en

numéro collision

rétention Q1 Q3

(eV)

1 8,75 554,79 601 ,32 29

2 8,75 554,79 730,36 29

3 8,75 554,79 858,42 29

4 19,71 385,28 444,32 22

5 19,71 385,28 543,39 22

6 19,71 385,28 656,47 22

7 17,91 448,75 492,29 25

8 17,91 448,75 655,36 25

9 17,91 448,75 783,41 25

10 13,32 399,24 552,3 23

11 13,32 399,24 529,37 23

12 13,32 399,24 666,43 23

13 23,29 786,42 742,41 32

14 23,29 786,42 855,49 31

15 23,29 786,42 926,53 34

16 22,44 751 ,41 1 146,63 38

17 22,44 751 ,41 974,55 38

18 22,44 751 ,41 1075,59 38

19 15,89 572,32 630,36 25

20 15,89 572,32 743,44 26

21 15,89 572,32 872,48 25

22 10,67 384,7 537,3 20,5 10,67 384,7 624,34 18,5

10,67 384,7 681 ,36 19,5

15,29 447,77 430,3 25

15,29 447,77 593,37 25

15,29 447,77 694,41 25

16,64 597,78 702,35 29

16,64 597,78 849,42 29

16,64 597,78 980,46 27

18,52 826,89 646,35 41

18,52 826,89 809,42 41

18,52 826,89 924,44 41

19,2 598,83 807,5 31

19,2 598,83 904,55 22

19,2 598,83 452,78 25

15,89 595,81 694,41 33

15,89 595,81 416,24 35

15,89 595,81 464,77 28

19,1 598,35 650,4 29

19,1 598,35 797,47 28

19,1 598,35 868,5 28

4,97 562,27 616,29 30

4,97 562,27 745,34 30

4,97 562,27 873,39 30

12,85 415,24 492,29 23

12,85 415,24 629,35 23

12,85 415,24 716,38 23

17,9 454,78 637,39 25

17,9 454,78 708,43 25

17,9 454,78 821 ,51 25

14,32 449,76 522,3 25

14,32 449,76 621 ,37 25

14,32 449,76 660,41 25

1 ,53 338,19 319,2 20

1 ,53 338,19 448,24 20

1 ,53 338,19 576,3 20

14,16 510,78 451 ,27 24

14,16 510,78 564,35 25

14,16 510,78 763,45 27

19,45 744,72 845,39 43

19,45 744,72 789,37 41

19,45 744,72 917,47 40

22,56 717,43 611 ,35 30

22,56 478,62 611 ,35 16

22,56 478,62 407,9 19

19,53 655,98 559,34 34

19,53 655,98 763,43 27

19,53 655,98 891 ,49 25

12,98 579,26 641 ,33 31 71 12,98 579,26 827,4 29

72 12,98 579,26 928,45 27

73 16,92 457,77 416,26 22

74 16,92 457,77 517,31 21

75 16,92 457,77 687,41 22

76 27,6 728,74 788,89 29

77 27,6 728,74 845,51 31

78 27,6 728,74 1008,57 31

79 26,39 803,1 1 1028,61 35

80 26,39 803,1 1 799,5 30

81 26,39 803,1 1 957,57 35

82 11 ,46 597,28 522,18 26

83 11 ,46 597,28 672,37 33

84 11 ,46 597,28 901 ,44 26

85 26,58 822,81 604,87 30

86 26,58 822,81 688,91 26

87 26,58 822,81 998,59 39

88 19,29 754,93 598,33 30

89 19,29 754,93 817,43 45

90 19,29 754,93 1027,57 38

91 18,18 560,29 476,27 30

92 18,18 560,29 589,36 30

93 18,18 560,29 775,43 30

94 13,88 41 1 ,74 305,18 23

95 13,88 41 1 ,74 531 ,35 23

96 13,88 41 1 ,74 659,41 23

97 9,97 423,23 458,31 25

98 9,97 423,23 572,35 23

99 9,97 423,23 701 ,39 21

100 19,92 388,74 435,27 19

101 19,92 388,74 548,36 17

102 19,92 388,74 663,38 19

103 5,57 540,28 373,21 35

104 5,57 540,28 829,41 26

105 5,57 540,28 483,74 29

106 10,45 441 ,72 564,31 23

107 10,45 441 ,72 651 ,35 22

108 10,45 441 ,72 738,38 21

109 4,52 367,19 434,22 21

1 10 4,52 367,19 549,25 17

1 1 1 4,52 367,19 662,34 18

1 12 21 ,88 803,84 1 100,48 41

1 13 21 ,88 803,84 730,31 38

1 14 21 ,88 803,84 613,27 46

1 15 20,03 728,9 550,3 39

1 16 20,03 728,9 834,47 41

1 17 20,03 728,9 962,53 39

1 18 16,81 672,3 769,35 26 1 19 16,81 672,3 882,44 26

120 16,81 672,3 969,47 26

121 13,59 351 ,23 444,32 18

122 13,59 351 ,23 543,39 16

123 13,59 351 ,23 614,42 17

124 14,51 503,27 720,4 28

125 14,51 503,27 817,45 19

126 14,51 503,27 409,23 20

127 22,39 722,92 428,29 37

128 22,39 722,92 854,53 37

129 22,39 722,92 955,58 37

130 12,77 434,23 565,33 24

131 12,77 434,23 739,4 21

132 12,77 434,23 796,42 22

133 12,41 477,73 553,27 27

134 12,41 477,73 713,3 26

135 12,41 477,73 770,33 24

136 7,63 388,2 476,24 22

137 7,63 388,2 547,27 19

138 7,63 388,2 662,3 19

139 12,85 375,7 343,21 22

140 12,85 375,7 474,25 22

141 12,85 375,7 637,31 22

142 20,72 403,74 397,28 23

143 20,72 403,74 560,34 23

144 20,72 403,74 659,41 23

145 19,66 542,34 600,37 23

146 19,66 542,34 671 ,41 25

147 19,66 542,34 871 ,52 23

148 22,14 939,94 1 180,52 46

149 22,14 939,94 540,27 46

150 22,14 939,94 802,36 46

151 12,66 392,18 409,19 22

152 12,66 392,18 523,24 22

153 12,66 392,18 620,29 22

TABLEAU 11 : potentiel Potentiel en

Transition Potentiel Seuil de d'entrée sortie de cellule numéro d'orifice positivité avant Q0 de collision

1 80 10 35 2000

2 80 10 35 2000

3 80 10 35 2000

4 80 10 35 600

5 80 10 35 2000

6 80 10 35 1000 80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

120 10 18 2000

120 10 18 2000

120 10 18 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

90 10 15 2000

90 10 15 2000

90 10 15 2000

85 10 24 2000

85 10 24 2000

85 10 24 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

100 10 17 2000

100 10 17 2000

100 10 17 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

105 10 20 2000

105 10 20 2000

105 10 20 2000

100 10 1 1 2000

100 10 16 2000

100 10 1 1 2000

90 10 16 2000

90 10 18 2000

90 10 22 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000 80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

75 12 1 1 2000

75 12 14 2000

75 12 18 2000

140 10 35 2000

140 10 35 2000

140 10 35 2000

120 10 35 2000

70 10 35 2000

70 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

80 12 15 3500

80 12 19 2500

80 12 22 4500

70 12 10 2000

70 12 13 2000

70 12 16 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

120 10 35 2000

85 12 13 2000

85 12 16 2000

85 12 21 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 2000

100 10 35 4000

100 10 35 2000

80 10 35 4000

80 10 35 3500

80 10 35 6000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

80 10 35 2000

75 10 1 1 2000

75 10 14 2000

75 10 16 2000

140 6 10 2000

140 6 14 2000

140 6 16 2000 103 1 10 12 10 2000

104 1 10 12 20 2000

105 1 10 12 6 2000

106 75 12 14 2000

107 75 12 16 2000

108 75 12 18 2000

109 65 12 18 2000

1 10 65 12 23 2000

1 1 1 65 12 15 2000

1 12 100 10 35 2000

1 13 100 10 35 2000

1 14 100 10 35 2000

1 15 140 9 14 2000

1 16 140 9 34 2000

1 17 140 9 24 2000

1 18 125 9 18 2000

1 19 125 9 21 2000

120 125 9 41 2000

121 70 12 10 2000

122 70 12 23 2000

123 70 12 14 2000

124 70 12 17 2500

125 70 12 20 2500

126 70 12 10 2500

127 80 10 35 2000

128 80 10 35 2000

129 80 10 35 2000

130 70 12 14 2000

131 70 12 18 2000

132 70 12 19 2000

133 80 12 14 2000

134 80 12 18 2000

135 80 12 18 2000

136 70 12 12 2000

137 70 12 13 2000

138 70 12 16 2000

139 80 10 35 2000

140 80 10 35 2000

141 80 10 35 2000

142 80 10 35 2000

143 80 10 35 2000

144 80 10 35 2000

145 80 12 16 2000

146 80 12 14 2000

147 80 12 21 2000

148 80 10 35 2000

149 80 10 35 2000

150 80 10 35 2000 151 80 10 35 2800

152 80 10 35 2000

153 80 10 35 2000

Les autres paramètres machine utilisés sont les suivants :

Type de balayage: MRM

MRM planifié : oui

Polarité: Positive

Source d'ionisation: Turbo V™ (Applied BioSystems) Réglage Q1 : Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Pause inter-scan: 5.00 msec

Vitesse de balayage: 10 Da/s

Gaz rideau: 50,00 psi

Tension de cône: 5500,00 V

Température de source: 550,00 °C

Gaz de nébulisation: 50,00 psi

Gaz chauffant: 40,00 psi

Gaz de collision induisant dissociation : 9,00 psi

Remplissage dynamique: inactivé

Temps de cycle total: 1.2 sec

Fenêtre de détection : 90 sec

Les aires obtenues pour chacune des transitions et pour chacun des microorganismes étudiés ont été mesurées. Lorsque l'aire d'une transition est supérieure ou égale au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 11 , la détection de la transition est considérée comme positive et est notée « 1 » dans le TABLEAU 12. Lorsque l'aire d'une transition est inférieure au seuil de positivité décrit dans le TABLEAU 11 , la détection de la transition est considérée comme négative et est notée « 0 » dans le TABLEAU 12. Lorsque les 3 transitions d'un même peptide sont notées « 1 », la détection du peptide est considérée comme positive. Un cas particulier fait exception à cette règle. Le peptide correspondant aux transitions numéros 49, 50 et 51 a une transition de très faible intensité. Dans ce cas précis, lorsque les transitions 49 et 50 sont notées « 1 », la détection de ce peptide sera considérée comme positive.

TABLEAU 12 :

Transition

Ech21 Ech22

numéro

1 0 1

2 0 1

3 0 1

4 1 1

5 1 1

6 1 1

7 1 1

8 1 1

9 1 1

10 1 1

1 1 1 1

12 1 1

13 0 1

14 0 1

15 0 1

16 0 1

17 0 1

18 0 1

19 1 1

20 1 1

21 1 1

22 1 1

23 1 1

24 1 1

25 0 1

26 0 1

27 0 1

28 0 1

29 0 1

30 0 1

31 0 1

32 0 1

33 0 1

34 1 1

35 1 1

36 1 1

37 0 0

38 0 0

39 0 0 0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0 88 0 0

89 0 0

90 0 0

91 0 0

92 0 0

93 0 0

94 0 0

95 0 0

96 0 0

97 0 0

98 0 0

99 0 0

100 0 0

101 0 0

102 0 0

103 0 0

104 0 0

105 0 0

106 0 0

107 0 0

108 0 0

109 0 0

110 0 0

11 1 0 0

112 0 0

113 0 0

114 0 0

115 0 0

116 0 0

117 0 0

118 0 0

119 0 0

120 0 0

121 0 0

122 0 0

123 0 0

124 0 0

125 0 0

126 0 0

127 0 0

128 0 0

129 0 0

130 0 0

131 0 0

132 0 0

133 0 0

134 0 0

135 0 0 136 0 0

137 0 0

138 0 0

139 0 0

140 0 0

141 0 0

142 0 0

143 0 0

144 0 0

145 0 0

146 0 0

147 0 0

148 0 0

149 0 0

150 0 0

151 0 0

152 0 0

153 0 0

Les échantillons Ech21 et Ech22 comportent au moins un peptide caractéristique de VanA. Les bactéries présentes dans les échantillons Ech21 et Ech22 expriment la ligase VanA qui leur confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

Ainsi, de façon particulièrement avantageuse, un mécanisme de résistance inductible, tel que le mécanisme de résistance lié à l'expression de VanA, est détecté sans phase d'induction lors de la culture du microorganisme, après une phase de préparation d'échantillon réalisée en moins de 3 heures. Ce procédé permet donc de rechercher rapidement les mécanismes de résistance aux glycopeptides sans a priori sur leur éventuel existence.

Exemple 12 : Identification de résistance aux glycopeptides, sans

Induction :

Les échantillons Ech23 et Ech24 sont identifiés selon l'une des méthodes décrites dans les exemples 1 à 6. L'identification des espèces est reportée dans le TABLEAU 13. TABLEAU 13 :

Les échantillons Ech23, Ech24 et Ech25 correspondent à l'espèce, Enterococcus Faecalis ou Enterococcus faecium, pouvant comporter un mécanisme de résistance de type Van.

La méthode suivante est alors mise en œuvre pour rechercher un tel mécanisme. Chaque échantillon est traité selon l'exemple 10 avec les modifications suivantes :

• Etape 1 : une ligne de colonie de 3 cm est prélevée avec une oese de 10μΙ (contre une colonie précédemment).

• Etape 7 : ajout de 2 μ9 de trypsine.

Chaque échantillon est analysé selon l'exemple 8 hormis les éléments mentionnés ci-après.

Les transitions mentionnées dans le TABLEAU 3 sont détectées en utilisant les paramètres figurant dans les TABLEAUX 4 et 11.

Comme dans l'exemple 8 les aires positives sont notées « 1 » dans le TABLEAU 14. Les peptides positifs sont détectés selon les règles de l'exemple 8.

TABLEAU 14 :

Transition

Ech23 Ech24 Ech25

numéro

1 0 0 1

2 0 0 1

3 0 0 1

4 0 0 1 0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

0 0 1

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0 1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

1 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0 83 0 0 0

84 0 0 0

85 0 0 0

86 0 0 0

87 0 0 0

88 0 0 0

89 0 0 0

90 0 0 0

91 1 0 1

92 1 0 1

93 0 0 0

94 0 0 0

95 0 0 0

96 0 0 0

97 0 0 0

98 0 0 0

99 0 0 0

100 0 0 0

101 0 0 0

102 0 0 0

103 0 0 0

104 0 0 0

105 0 0 0

106 0 0 0

107 0 0 0

108 0 0 0

109 0 0 0

110 0 0 0

111 0 0 0

112 0 0 0

113 0 0 0

114 0 0 0

115 0 0 0

116 0 0 0

117 0 0 0

118 0 0 0

119 0 0 0

120 0 0 0

121 0 0 0 122 0 0 0

123 0 0 0

124 0 0 0

125 0 0 0

126 0 0 0

127 0 0 0

128 0 0 0

129 0 0 0

130 0 0 0

131 0 0 0

132 0 0 0

133 0 0 0

134 0 0 0

135 0 0 0

136 0 0 0

137 0 0 0

138 0 0 0

139 0 0 0

140 0 0 0

141 0 0 0

142 0 0 0

143 0 0 0

144 0 0 0

145 0 0 0

146 0 0 0

147 0 0 0

148 0 0 0

149 0 0 0

150 0 0 0

151 0 0 0

152 0 0 0

153 0 0 0

L'échantillon Ech23 comporte au moins un peptide caractéristique de VanB. La bactérie présente dans l'échantillon Ech23 exprime la ligase VanB qui lui confère une résistance à la Vancomycine. L'échantillon Ech25 comporte au moins un peptide caractéristique de VanA. La bactérie présente dans l'échantillon Ech25 exprime la ligase VanA qui lui confère une résistance à la Vancomycine et à la Teicoplanine.

A l'inverse l'échantillon Ech24 ne présente aucun peptide caractéristique de résistance de type Van. La bactérie présente dans l'échantillon Ech24 peut être sensible aux glycopeptides de type Vancomycine ou Teicoplanine.

Ainsi, de façon particulièrement avantageuse, un mécanisme de résistance inductible, tel que le mécanisme de résistance lié à l'expression de VanB, est détecté sans phase d'induction lors de la culture du microorganisme, après une phase de préparation d'échantillon réalisée en moins de 3 heures. De façon également très avantageuse, tous les mécanismes de résistance aux glycopeptides peuvent être recherchés et détectés simultanément. Ainsi 2 mécanismes de résistance, VanB et VanA sont détectés respectivement dans les échantillons Ech23 et Ech25 en utilisant la même méthode.

Ce procédé permet donc de rechercher rapidement les mécanismes de résistance aux glycopeptides sans a priori sur leur éventuel existence.

Références bibliographiques

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