本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用 于鸡胡须性状的分

背景技术

长期的进化和驯化选择， 丰富了农业动物遗传资源的多样性。 近 年来的研究发现，基因组结构变异是畜禽驯化 过程中多个重要性状的 遗传基础， 如鸡 20号染色体上发生的复杂结构重排， 会使 EDN3基 因的表达产生变化， 最终导致黑色素在真皮内的沉积； 位于鸡 1号染 色体的 SOX5基因内含子 1内 3.2 kb区域的复制，使得在发育的 6-12 天内 SOX5基因表达发生改变， 导致豆冠表型的产生。基因组结构变 异可以通过多种机制影响基因表达， 对结构变异进行研究， 有助于我 们解析相关性状形成的机制。

基因组结构变异包括缺失、 重复、 倒位、 易位四种类型。 目前针 对基因组结构变异的检测技术主要有基于高密 度 SNP 的基因分型芯 片、 比较基因组杂交芯片， 以及高通量测序技术等。 随着高通量测序 技术的不断发展， 成本的不断降低， 测序已经成为目前生物学研究的 重要手段。 通过对结构变异靶区域的重测序分析， 分离出结构变异造 成的断点和重排情况， 进而利用 PCR等常规分子生物学技术对结构 变异进行检测。 检测只需在结构变异产生的断点两侧设计扩增 引物， 利用简单的 PCR反应， 通过琼脂糖凝胶检测就可以检测结构变异的 存在。

鸡的胡须性状是家畜中最早进行研究的表型性 状之一， 经历了上 百年的历史，至今仍未见报道影响胡须性状的 确定染色体位置和检测 方法。 如果利用传统方法对鸡的胡须形状进行选育， 将耗费大量的人 力、 物力、 财力。 利用分子生物学的手段建立一种快速检测胡须 性状 的方法， 进行标记辅助选择， 将有助于提高育种效率。 发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别鸡胡须性状性状 的方法。

本发明以中国农业大学与广东省农业科学院畜 牧研究所合作建 立的以惠阳胡须鸡与岭南黄鸡 A03系为亲本的 F2杂交资源群体为研 究对象， 记录了 F0、 F1和 F2代个体的胡须性状，利用全基因组 SNP 进行连锁分析， 将影响鸡胡须性状的基因座定位于鸡 27号染色体； 对 F0样本的进行重测序分析， 分离得到了影响鸡胡须性状的结构变 异。 本发明发现， 胡须鸡 27号染色体存在三个 DNA片段的重复（拷 贝数变异， CNV ), 在鸡 ICGSC Gallus_gallus-4.0版本基因组中的物 理位置分别为 1702269-1721521bp ( CNV1 ) , 4470331-4503417bp ( CNV2 )、 3578409-3592890bp ( CNV3 ), 三个片段顺利连接并插入 到 CNV1原座位，其位置关系如图 1所示。本发明鉴别鸡胡须性状的 方法， 是针对不同 CNV片段间的连接设计引物进行 PCR检测， 根据 检测结果判定鸡是否存在胡须基因。

本发明首先提供一种用于检测鸡胡须性状的分 子标记组合，其为 CNV1、 CNV2和 CNV3, 这三个分子标记物理位置位于鸡 27号染色 体 1702269-1721521 bp、 4470331-4503417 bp、 3578409-3592890 bp 处， CNV1和 CNV2 连接的基因序列如 SEQ ID No.7所示， CNV2和 CNV3连接的基因序列如 SEQ ID No.8所示， CNV3和 CNV1连接的 基因序列如 SEQ ID No.9所示。

本发明提供了用于检测上述分子标记组合的引 物组合，是针对上 述不同 CNV片段间的连接设计引物， 其核苷酸序列为：

CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT

CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT

CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG

CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA

CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC

CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC 。

本发明提供了一种检测鸡胡须性状的试剂盒， 含有针对上述三个 本发明方法包括以下步骤：

( 1 )以待测鸡的基因组 DNA为模板，用三对引物分别进行 PCR 反应； 所述三对引物分别是：

CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT

CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT

CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG

CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA

CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC

CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC ；

( 2 )将三次 PCR反应的扩增产物用琼脂糖凝胶检测，若 CNV1、

CNV2、 CNV3引物的 PCR扩增反应的目的片段分别为 3200 bp、 501 bp、 411 bp , 则结果为阳性， 否则为阴性。

本发明方法中， 步骤（1 ) 中引物 CNV3-1F、 R和 CNV2-3F、 R 的 PCR扩增反应体系为：

总体系为 25 μ ΐ时， 基因组 DNA: 50 ng, 1 PCR Buffer, dNTP 4 mM, 上、 下游引物各 lO pmol, 康为 Taq DNA聚合酶 1.25 U, 加 水补至 25 μ ΐ反应体系;

引物 CNV1-2F、R的 PCR扩增反应体系为：基因组 DNA: 50 ng, 1 X PCR Buffer, dNTP 4 mM,上、下游引物各 10 pmol, Long AmpTaq DNA聚合酶 NEB 1.25 U, 加水补至 25 μ ΐ反应体系。 。

本发明方法中，步骤（1 )中引物 CNV3-1F、 R及CNV2-3F、 R 的 PCR反应条件为： 94 °C预变性 5 min; 94 °C变性 30 sec, 60 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 20 sec, 共 35个循环； 72 °C终延伸 7 min; 12 °C 保存；

引物 CNV1-2F、 R 的 PCR反应条件为： 94 °C预变性 3 min; 94 °C变性 10 sec, 57 °C退火 30 sec, 65 °C延伸 4 sec, 共 35个循环； 65 °C终延伸 7 min; 12 °C保存。

本发明提供了上述方法、 分子标记组合在鸡育种中的应用。 本发明还提供了上述引物组合在检测鸡胡须性 状或制备检测鸡 胡须性状试剂盒中的应用。

本发明首次提供了用于鉴别胡须性状的 3个分子标记；利用该分 子标记设计特异性引物， 共 3对引物， 分别对待测鸡基因组 DNA进 行 PCR检测， 根据检测结果判断待测鸡只是否具有胡须性状 。 本发 明方法可以实现对鸡胡须性状个体的快速筛选 ，加快胡须性状鸡的选 育， 从而大大地提高育种和保种效率； 本发明的检测方法操作简单， 费用低廉， 准确度高。 附图说明

图 1为本发明提供的重测序胡须鸡与岭南黄鸡 A03测序深度比 值的对数值（Log2Ratio ), 横坐标为鸡 27 号染色体的物理图谱序列 位置。 具有胡须性状鸡的 27号染色上存在的三个 CNV, 其中 CNV1 的 区 间 为 chr27:1702269-1721521 bp ； CNV2 的 区 间 为 chr27:4470331-4503417 bp; CNV3 的区间为 chr27:3578409-3592890 bp。 CNV1、 CNV2、 CNV3在发生复制后插入 CNVl所在原始位置 的下游， 其连接方式如图所示。

图 2为本发明提供的引物 CNV1-2F、 R扩增后琼脂糖凝胶检测 的结果。 目的片段大小为 3.2 kb, marker为 1 kb的 marker。 其中泳道 13-24为北京油鸡 （有胡须）， 能够扩出条带； 泳道 1-12为岭南黄鸡 A03系 （无胡须）， 不能够扩出条带。

图 3为本发明提供的引物 CNV2-3F、 R扩增后琼脂糖凝胶检测 的结果。 目的片段大小为 501 bp, marker为 100 bp的 marker。 其中 泳道 13-24为北京油鸡 （有胡须）， 能够扩出条带； 泳道 1-12为岭南 黄鸡 A03系 （无胡须）， 不能够扩出条带。

图 4为本发明提供的引物 CNV3-1F、 R扩增后琼脂糖凝胶检测 的结果。 目的片段大小为 411 bp, marker为 100 bp的 marker。 其中 泳道 13-24为北京油鸡 （有胡须）， 能够扩出条带； 泳道 1-12为岭南 黄鸡 A03系 （无胡须）， 不能够扩出条带。

图 5为鸡胡须性状全基因组关联研究的曼哈顿图� � 图 5a显示仅 27 号染色体的标记达到基因组水平显著 （横坐标为不同的染色体编 号， 纵坐标为 P值的 10为底对数值）， 图 5b显示了 27号染色体上标 记的关联信号 （横坐标为 27号染色体的物理位置， 纵坐标为 P值的 10为底对数值）， 虛线为 bonferroni校正的 5%基因组水平显著。 具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述 实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中 所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到

实施例 1 鸡 27号染色体三个拷贝数变异区间的确定

1、 胡须性状的 QTL定位

本发明以中国农业大学与广东省农业科学院畜 牧研究所合作建 立的以惠阳胡须鸡与岭南黄鸡 A03系为亲本的 F2杂交资源群体为研 究对象， 记录了 F0、 F1和 F2代个体的胡须性状， 利用 Illumina的鸡 60K SNP芯片进行基因分型， 通过数据质控（样本检出率 >90%, SNP 检出率 >90%,最小等位基因频率 >0.05,遗传错误率 <0.05 ) ,获得了 588 个个体的平均约 42K的全基因组 SNP标记信息， 利用 GenABEL软 件混合回归模型分析， bonferroni校正达到 5%基因组水平显著的 SNP ( P<1.19E-6 )全部位于鸡 27号染色体（如图 5a、 图 5b所示）， 但关 联信号的区间较大。

利用 CRI-MAP软件构建了 27号染色体的连锁图谱， 通过遗传 分离分析， 及区间内重组子的重测序分析， 确定了影响鸡胡须性状的 22 Kb的最小单倍型 ( 1.70~1.72Mb )。

2、 拷贝数变异与胡须性状

本发明以自定制了 Agilent 2X400K的比较基因组杂交（ CGH ) 芯片， 以德宏鸡基因组作为参照， 分析了 14个品种鸡 （仅胡须鸡有 胡须表型）的全基因组拷贝数变异信息，将包 含连续 5个探针的 CNV 确定为可信的 CNV区域， 由此检测到 3个胡须鸡品种特异 CNV区 域 （见表， CNVR1、 CNVR2和 CNVR4 )。 CNVR1与胡须性状的单

表 1 胡须鸡品种特异的 CNV信息

编号 染色体 起始位点 终止位点 大小 探针数 获得数

CNVR1 27 1,702,671 1,720,386 17,715 10 2

CNVR2 27 4,471,823 4,503,373 31,550 17 2

CNVR3 27 3,581,044 3,583,446 2,402 2 2

CNVR4 2 141,819,961 141,834,442 14,481 7 2 对资源家系的 F0样本进行全基因组 DNA重测序， 釆用测序深 度（read depth )分析方法研究基因组结构变异， 如图 1所示。 27号 染色体以胡须鸡与岭南黄鸡 A03 系测序深度的比值的 2 为底对数 ( log ₂ ratio )作图， 在 1.7、 3.5、 4.4Mb区间的 log ₂ ratio达到 1 , 说明 两者测序深度比值为 2, 均为多拷贝的结构变异， 即正常基因组为 2 个单倍型， 胡须鸡有 4个单倍型。 CNVR1和 CNVR2与 CGH结果吻 合， CNVR3由于片段较小， 所以没有在最初的统计中。

通过部分比对的 read信息 （ partially-mapped read ), 确定 3个结 构变异的断点 ( Breakpoint )分别为 1702269-1721521bp ( CNVR1 )、 4470331-4503417bp( CNVR2 )和 3578409-3592890bp( CNVR3 )。 CNVl 和 CNV2连接处基因序列、 CNV2和 CNV3连接处基因序列、 CNV3 和 CNV1连接处基因序列分别如 SEQ ID No.7-8、 9所示。 同时， 这 三个 CNV 的新拷贝片段并非独立， 而是顺序连接并插入到 CNVR1 原座位， 其位置关系如图 1所示。 实施例 2针对三个 CNV分子标记的引物的设计

本发明针对实施例 1 确定的不同 CNV 片段间的连接， 1702269-1721521bp ( CNVl ) 、 4470331-4503417bp ( CNV2 ) 、 3578409-3592890bp ( CNV3 ), 设计引物用于 PCR检测。 引物序列分 别见表 1。

三对引物的核苷酸序列

CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT

CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT

CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG

CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA

CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC

CNV3-1R

CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC 实施例 3检测鸡胡须性状方法的建立

1、 试验材料

用于检测的北京油鸡来自于中国农业科学院北 京畜牧兽医研究 所； 象洞鸡来自于福建省龙岩巿武平象洞鸡保种场 ； 惠阳胡须鸡与岭 南黄鸡 A03 系杂交资源群体来源于广东省农业科学院畜牧 研究所； 其他品种均来自中国农业科学院江苏省家禽研 究所。

2、 基因组 DNA的提取

鸡翅静脉釆血， 抗凝处理后裂解， 经蛋白酶 K过夜消化后， 用酚 仿抽提， TE溶解 -20°C保存。

3 PCR扩增

用实施例 2的三对引物， 分别对样品基因组进 PCR反应。

引物 CNV3-1F、 R及 CNV2-3F、 R PCR扩增的反应体系为： 基因 组 DNA: 50 ng, IxPCR Buffer, dNTP 4 mM, 正向引物 10 pmol, 反向引物 10 pmol, 康为 Taq DNA聚合酶 1.25 U, 加水补至 25 ul反 应体系。 引物 CNV1-2F、 R PCR扩增的反应体系为： 基因组 DNA: 50 ng, IxPCR Buffer, dNTP 4 mM, 正向引物 10 pmol, 反向引物 10 pmol, Long AmpTaq DNA聚合酶 (NEB)1.25 U, 加水补至 25 ul反应 体系。

引物 CNV3-1F、 R及 CNV2-3F、 R PCR反应条件为： 94 °C预变 性 5 min; 35个循环过程条件为 94 °C变性 30 sec, 60 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 20 sec; 72 °C终延伸 7 min;12 °C保存。引物 CNV1-2F、R PCR 反应条件为： 94 °C预变性 3 min; 35个循环过程条件为 94 °C变性 10 sec, 57 °C退火 30 sec, 65 °C延伸 4 sec; 65 °C终延伸 7 min;12 °C保存。 对扩增产物用 2%琼脂糖凝胶进行检测。 扩增结果分别见图 2、 3、 4。

4、 结果分析

凡是具有胡须性状的个体， 用本发明的三对引物扩增都能够扩出 目的条带。 凡是没有胡须性状的个体都不能扩出目的条带 。 在所检测 的 524个个体中， 鉴定为胡须个体的有 248个， 鉴定为非胡须个体的 有 276个。 结果如表 3所示。

胡须性状检测结果

品种 个体数 胡须 非胡须 岭南黄鸡 A03系 18 - 18 惠阳胡须鸡 18 18 - 胡须、 A03家系 F1 36 36 - 胡须、 A03家系 F2 89 62 27 胡须、 A03家系 F5 189 95 94

文昌鸡 6 - 6 清远麻鸡 6 - 6 北京油鸡 23 11 12 象洞鸡 20 20 - 白耳黄鸡 6 - 6 瓦灰鸡 6 - 6 茶花鸡 6 - 6 河南斗鸡 6 - 6 崇仁麻鸡 6 - 6 狼山鸡 6 - 6 边鸡 6 - 6 鹿苑鸡 6 - 6 藏鸡 6 - 6 固始鸡 6 - 6 大骨鸡 6 - 6 尤溪麻鸡 6 - 6 安卡鸡 6 - 6 隐性白鸡 6 - 6 寿光鸡 6 - 6 石岐杂鸡 6 - 6 矮脚黄鸡 6 - 6 红色原鸡 6 - 6 瓢鸡鸡 5 - 5 共计 518 242 276 上述 524个个体的鉴定结果表明鸡胡须性状与 27号染色体上存 在的三个 CNV完全关联，因此可以通过判定 27号染色体上的结构变 异事件来确定胡须性状有无。这种确定胡须性 状的检测方法用于育种 实践， 克服了传统育种方法费时、 费力的问题， 可以加快选育具有胡 须表型的鸡种。

原则上，利用其中本发明三对引物中的任何一 对引物既可以做出 胡须性状的判断， 但保证不了这种结果的可靠性， 所以本发明要求以 三对引物分别进行扩增， 综合三次 PCR检测的结果来判断待测鸡种 是否具有胡须性状， 以保证判断结果的正确性。 上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽 的描述， 应当指 出， 对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理 的前提下， 还可以对相应的条件等做一些改进， 这些改进也应视为本 发明的保护范围。 工业实用性

本发明提供的 3个分子标记及检测其的 3对特异性引物，可分别 对待测鸡基因组 DNA进行 PCR检测，根据检测结果判断待测鸡只是 否具有胡须性状。 本发明方法可以实现对鸡胡须性状个体的快速 筛 选， 加快胡须性状鸡的选育， 从而大大地提高育种和保种效率， 该检 测方法操作简单， 费用低廉， 准确度高， 具有重要的经济价值和应用 前景。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种检测鸡胡须性状的方法

<130> KHP13312434. 1

<160> 9

<170> Patentln version 3. 5

<210>

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工.

<400>

tttgttgtct ccttgcatca tt

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatgtcagc acagtaacga tt

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgttggttg tgtgccaagt ag

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttcccctcg tctgctttat ta

<210> 5

<211> 22

<212> DNA <213> 人工序列

<400> 5

acaagtcaga gaggcaatcg ac

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatacagcc tcaggtaagg ac

<210> 7

<211> 3140

<212> DNA

<213> CNV1、 CNV2连接处胡须鸡基因序列

<400> 7

tttgttgtct ccttgcatca ttgctcggtg gttgtgggct ttcaggttgg ctctggagcc 60 tccacccctg tgagaagggt ttctgatggg ctcaggatgg gtcgtgctgc ctggagcctg 120 ggaatggtcc ccctctgtgc ctcccatccc cgtgggttgg ggggcaaagg ctgctggata 180 ccgcaggacg gagcagggac atgcttccag cactcctcag tcaacgtgct ctgagagcat 240 cagcttaagg tgctgcttgg tgctgagcac cccgggtaca gagatgggaa cttcagtggc 300 aaggtccctt gcttggccct caacatcctt tccagcccca tcccaggcac tgagctgccc 360 tacggtgctc catcaccacc tgccttccca gacactcggt attcaatgag attaaatctg 420 tcttcctgtg tggttttctc ccttcatggg acggcactgc tgggggtgct gatatcaaca 480 cagaccctcc tcctctcttc cattgaaggg acctggcagc atcgacccct 540 ccatatacct gttgtgtttg ggcacaagag ggcactggaa caccgctgtg atgggatgct 600 ttgtggctgc aagcagagct gctgcggccg caaagtccct ctgcaccttt ccccagcgag 660 cagacatcca taggacgacc tgcactctgc tgcaccccct tccatttaaa tcacactgct 720 ctgggagtcg gcagttcctc ctgcatgatc acagctgcct tccctgccgc ttcctataga 780 ctggatcgat gggccaaggt taatggcatg agtttcaata gggccaagtg tcgggtcctg 840 cattttggtc acaacaaccc caggcagccc tacaggcttg gggaggagtg tctggaaagc 900 tgcctgatgg aaagggacct tggtgtactg ttggacagtg ggctgaatat gagccagcag 960 tgtgcccagg tggccaagaa ggtcaatggc atcctggctt ggatcaggaa tggtgtggtg 1020 agcagcactg gggaagtcat cctgccctgt acttggcact ggtgaggcct cacctcgagt 1080 gctgtgttca gttttgggct cctcggtaca gaaaggacat ggaggtgctg gagaaggtcc 1140 agagaagggc aacaaggctg gggaagggct tggagaatat ggcctacgag gagagactga 1200 aggaactggg gctgtttggt ctggggaaga ggaggctgag gggagacctt attgctctct 1260 tcaaatccct aacaggtgat tgcagtgaga ttggggtggt ctcttctcac tgctgacagg 1320 09 BOOBOBOBSB yiS-eS-eooyi ^^B^S^SBS^ ^S^SBO^^^B

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<213> CNV3 CNVl连接处胡须鸡基因序列

<400> 9

ggcacgatgg gctatttgta gctaacagat aagcaaacgc tgtctctctc tccctatata 60 ttttgcttat accacagaaa tggacgtcaa aaggtaagga gtttctctta 120 atttatttat ttttctttga gaaaatgcat ttgttaagct gctttttttt ctgttccatt 180 ccccatctcc ctctcctccc ctacccaagg gggggaaata gacagaaaag ggtggagtga 240 tgaaaaaggg agaaatcacg gctcaggttg gacagctcat agtgaatgag aaaagccaga 300 acctgcggcg tttgcaagct cagagaaatg agttgaacgc taaaggtaaa gctcagttcc 360 tctcaccgtc cttacctggg cctgtatgga 390