B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zum Nachweis von Leberzirrhose.

Die Diagnose von Lebererkrankungen ist schwierig, da die meisten Lebererkrankungen nur sehr unspezifische Symptome haben. Insbesondere bereitet die Abgrenzung - der einzelnen Lebererkrankungen wie Hepatitis, Leber¬ zirrhose und Lebercarzinom Schwierigkeiten. Verläßliche Befunde können häufig nur durch invasive Methoden er¬ halten werden, was für den Patienten belastend ist. Die Bestimmung von in der Leber gebildeten Enzymen wie Transaminasen, Cholinesterase sowie von Bilirubin gibt nur allgemeine Hinweise und ist für eine differenzierte Diagnose nicht brauchbar.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem Nachweisverfah¬ ren, mit dem eine Leberzirrhose eindeutig und in ein¬ facher Weise nachgewiesen werden kann, wobei andere Lebererkrankungen, wie insbesondere Hepatitis und Lebercarzinom, nicht erfaßt werden.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Leberzirrhose zur Verfügung zu stellen, das ohne den Patienten be¬ lastende Eingriffe einfach und schnell im Labor durch¬ geführt werden kann.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Leberzirrhose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe einer Körperflüssigkeit mit mindestens zwei Rezeptoren R. und R ₂ inkubiert, von denen R.. die Bindung an eine feste Phase vermittelt und R_ markiert ist, wobei entweder R, oder R- einen mono¬ klonalen Antikörper gegen Cytokeratin 5 bzw. 7 und der

andere der beiden Rezeptoren R„ oder R. einen monoklo¬ nalen Antikörper gegen CK 19 bzw. 18 enthält, oder beide Rezeptoren einen monoklonalen Antikörper gegen CK 8 enthalten, die feste von der flüssigen Phase trennt und die Markierung in einer der beiden Phasen mißt.

Cytokeratine (CK) sind als Intermediärfilament-Proteine Bestandteile des Cytoskelettes von Epithelzellen. Es - sind 19 Cytokeratine bekannt, von denen die Cytokeratine 1 bis 8 als basische und die Cytokeratine 9 bis 19 als saure Cytokeratine bezeichnet werden. Die Cytokeratine können sich in der Zelle zu Tetrameren- zusammenlagern. Ein Tetramer besteht dabei aus jeweils zwei basischen und zwei sauren Cytokeratinmolekülen. Durch lineare Aggregation von Tetrameren entstehen Filamente. Intakte Cytokeratinmoleküle sind als integrale Bestandteile der Intermediärfilamente epithelialer Zellen wasserunlös¬ lich. Die Komplexität und Zusammensetzung der Cytokera¬ tine ist unterschiedlich in den verschiedenen epithelia- len Geweben, d.h. Epithelzellen unterschiedlicher Gewebeherkunft haben eine unterschiedliche Cytokeratin- zusammensetzung. Überraschenderweise wurde nun festge¬ stellt, daß ein erhöhter Gehalt an löslichen Formen von Aggregaten der Cytokeratine CK 5 bzw. 7 in Verbindung mit CK 19 bzw. 18 oder von CK 8 in einer Körperflüssig- keit mit dem Auftreten von Leberzirrhose korreliert.

Erfindungsgemäß wird das Vorliegen einer Leberzirrhose nachgewiesen, indem man in einer Körperflüssigkeit be¬ stimmt, ob Bindungsstellen sowohl für Antikörper gegen Cytokeratin 5 bzw. 7 als auch für Antikörper gegen Cytokeratin 19 bzw. 18 oder mehrere Bindungsstellen für CK 8 vorhanden sind, bzw. ob die Anzahl der Bindungs¬ stellen gegenüber der Körperflüssigkeit von Gesunden

erhöht ist. Bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfah¬ ren ist es, daß entweder ein monoklonaler Antikörper gegen Cytokeratin 5 in Verbindung mit einem monoklona¬ len Antikörper gegen Cytokeratin 19, ein monoklonaler Antikörper gegen Cytokeratin 7 in Verbindung mit einem monoklonalen Antikörper gegen Cytokeratin 18 oder zwei monoklonale Antikörper gegen Cytokeratin 8 verwendet werden. Dazu inkubiert man die Probelösung, die eine Körperflüssigkeit wie Serum, Urin oder Lymphe sein kann und bevorzugt Serum ist, mit mindestens zwei Rezeptoren R.. und R-, von denen R.. die Bindung an eine feste Phase vermittelt und R~ markiert ist. Dabei enthält einer der beiden Rezeptoren R, oder R~ einen monoklonalen Antikör¬ per gegen Cytokeratin 5, 7 oder 8. Unter monoklonalem Antikörper werden dabei sowohl vollständige Antikörper als auch Antikörperfragmente, die die Antigen-Bindungs- stellen für die jeweiligen Cytokeratine aufweisen, verstanden.

Rezeptor R, vermittelt die Bindung an die feste Phase. Dazu kann Rezeptor R, entweder direkt an eine feste Phase gebunden sein oder aber immobilisierbar sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Rezeptor R-. ein Konjugat aus einem monoklonalen Antikörper und einer spezifisch bindefähigen Substanz. Der mit der spezi¬ fisch bindefähigen Substanz bindefähige Partner ist an eine Festphase gebunden. Als spezifisch bindefähige Paare können beispielsweise Antigen-Antikörper; Hap- ten-Antikörper; Biotin-Antibiotin-Antikörper; Bio- tin-Avidin; Biotin-Streptavidin; Protein A-Imπr -f -Glo- bulin genannt werden. Besonders bevorzugt wirc dieser Ausführungsform als R, ein Konjugat des monoklo¬ nalen Antikörpers mit Biotin und als Festphase eine Matrix verwendet, die an ihrer Oberfläche Streptavidin trägt. Durch Bindung des Biotins mit dem Streptavidin erfolgt dann die Immobilisierung des monoklonalen Antikörpers. Bevorzugt ist auch eine Ausführungsform,

bei der an der Oberfläche der festen Phase Antikörper gegen den Fc-Teil der verwendeten monoklonalen Anti¬ körper oder Protein-A-Moleküle gebunden werden, wobei dann durch Bindung der Fc-Teile der monoklonalen Anti¬ körper die Immobilisierung erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind an eine Matrix Biotinmoleküle gebunden und als Rezeptor R, wird ein Konjugat aus Biotin und dem monoklonalen Anti¬ körper verwendet. Die Immobilisierung kann dann nach Durchführung der immunologischen Reaktion durch Zugabe von Streptavidin erfolgen.

Als feste Phase sind die in immunologischen Verfahren üblicherweise verwendeten Materialien geeignet. Bei¬ spielsweise können Polymermaterialien oder auch cellu- losehaltige Materialien sowie Glas verwendet werden. Als besonders geeignet haben sich Polystyrol, Poly- methacrylat, Teflon, Polyamid, Copolymere aus Styrol und Acrylnitril, Glas- und Celluloseprodukte erwiesen. Die Matrix kann in beliebiger Form vorliegen, z.B. als Röhrchen, Mikrotiterplatte, Kugel, Film, Pulver, Körn¬ chen oder Faservlies. Geeignet sind beispielsweise nach einem in der DE-A 36 40 412 beschriebenen Verfahren erhaltene Festphasen.

Der Rezeptor R2 enthält jeweils den anderen monoklona¬ len Antikörper, der erfindungsgemäß notwendig ist, d.h. wenn für den Rezeptor R ₁ Anti-CK 5-Antikörper verwendet wird, enthält Rezeptor R_ einen monoklonalen Antikörper gegen CK 18 oder 19, vorzugsweise gegen CK 19 und umgekehrt. Dasselbe gilt für das Paar Cytokeratin 7/Cytokeratine 18 und 19. Hier ist die Kombination CK 7 mit CK 18 bevorzugt. Ebenso ist die Kombination CK 8 mit CK 8 bevorzugt. Die Markierung des Rezeptors R„ erfolgt nach bekannten Methoden. Als Markierung sind radioaktive Substanzen, Enzyme, fluoreszierende und

chemilumineszierende Substanzen geeignet. Der Nachweis der Markierung erfolgt dabei nach bekannten Methoden. Bevorzugt wird als Markierung ein Enzym eingesetzt. Als Enzyme geeignet sind insbesondere Peroxidase, alka¬ lische Phosphatase und ß-Galactosidase. Der Nachweis des Enzyms erfolgt durch Zugabe eines Substrats und Messung der gebildeten Farbe.

Für die Durchführung des erfindungsgemäß vorgesehenen- immunologischen Bestimmungsverfahrens sind sehr viele Varianten bekannt, die alle hier geeignet sind. So können zwei oder drei oder auch mehr Rezeptoren verwen¬ det werden und die Inkubation mit den einzelnen Rezep¬ toren kann in verschiedener Reihenfolge in homogener oder heterogener Phase erfolgen. Diese Verfahrensvarian¬ ten sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung. Bevorzugt erfolgt die erfindungs¬ gemäße Bestimmung als Sandwich-Immunoassay. Dazu wird Rezeptor R. immobilisiert oder immobilisierbar gemacht und mit der Probelösung umgesetzt. Anschließend wird Rezeptor R ₂ zugegeben. Es bilden sich Komplexe aus dem immobilisierten Rezeptor R., der nachzuweisenden Sub¬ stanz sowie Rezeptor R ₂ . Nur Komplexe, die an die Fest¬ phase gebunden sind und eine Markierung tragen, gehen in die Auswertung ein.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Vorhanden¬ sein von Bindungsstellen für Antikörper gegen CK 5 und CK 18/CK 19, Antikörper gegen CK 7 und CK 18/CK 19 oder Antikörper gegen CK 8 und CK 8 schnell, einfach und reproduzierbar nachgewiesen werden. Eine erhöhte Kon¬ zentration dieser Cytokeratine bzw. von Substanzen, die antigene Determinanten aufweisen, die zu einer Bindung mit den entsprechenden monoklonalen Antikörpern führen, ist im wesentlichen nur nachweisbar bei Vorliegen einer Leberzirrhose. Es konnte gezeigt werden, daß bei ande-

ren Lebererkrankungen wie Hepatitis oder Fettleber oder anderen Erkrankungen, die mit Lebererkrankungen in Ver¬ bindung stehen wie Pankreatitis oder primäre biliäre Zirrhose eine derartige Erhöhung in der Regel nicht auftritt, so daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein spezifischer Nachweis möglich ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zum Nachweis von Leberzirrhose, das dadurch gekenn¬ zeichnet ist, daß es mindestens zwei Rezeptoren R.. und R ₂ enthält, von denen R ₁ die Bindung an eine feste Phase vermittelt und „ markiert ist, wobei entweder R. oder R ₂ einen monoklonalen Antikörper gegen CK 5 bzw. CK 7 und der andere der beiden Rezeptoren R ₂ oder R.. einen monoklonalen Antikörper gegen CK 19 bzw. CK 18 enthält, oder beide Rezeptoren einen monoklonalen Anti¬ körper gegen CK 8 enthalten.

Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Reagenz einen an eine Festphase gebundenen oder immobilisierbaren mono¬ klonalen Antikörper gegen Cytokeratin 5 und einen mar¬ kierten monoklonalen Antikörper gegen Cytokeratin 19.

Ebenso bevorzugt sind die Kombinationen CK 7 mit CK 18 und CK 8 mit CK 8.

Gegenstand der Erfindung sind auch die bei der European Collection of Ani al ell C_ultures, Porton Down (GB) , hinterlegten Zellkulturen ECACC 89030306 und ECACC 89030305 (CK 5) , ECACC 89030301 (CK 7) , ECACC 89030303 (CK 18), ECACC 89030304 (CK 19) und ECACC 89030302 (CK 8) , die Antikörper gegen die entsprechenden Cytokeratine produzieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele er¬ läutert.

B e i s p i e l 1

Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Cytokera¬ tine

Balb/c-Mäuse werden mit gereinigtem Cytokeratin oder Cytokeratinfragmenten in komplettem Freundschen Adjuvans erstimmunisiert. Nach weiteren Immunisierungen im inkompletten Freundschen Adjuvans werden nach 3 bis 4 - Monaten die B-Lymphozyten der immunisierten Tiere mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert. Die hierbei gewonnenen Hybridomzellinien werden mit den dazu übli¬ chen Hilfsmitteln kloniert (z.B. fluorescence activated cell sorter) und mit Hilfe geeigneter Methoden selek- tioniert (z.B. ELISA) . Auf diese Weise können monoklo- nale Antikörper gewonnen werden, die spezifisch gegen bestimmte Cytokeratine gerichtet sind.

Es werden 5 monoklonale Antikörper mit verschiedenen Spezifitäten beschrieben (siehe Tabelle 1) . An einem repräsentativen Beispiel werden die Immunisierung, die Klonierung und die Spezifitätsbestim ung detailliert beschrieben. Die anderen vier monoklonalen Antikörper werden analog hergestellt.

B e i s p i e l 2

Monoklonaler Antikörper gegen CK 5

Isolierun des Antigens CK 5

Das mehrfach geschichtete, nicht verhornende Platten¬ epithel der menschlichen Gaumenmandel wird durch einen Hitzeschritt (5 min/60 °C) von der bindegewebigen Unter¬ lage (Basalmembran) abgetrennt und nach mehreren Wa¬ schungen homogenisiert.

Der 1 % Triton K-100/Kochsalz-resistente Rückstand aus dem homogenisierten Plattenepithel wird in 8 mol/1 Harnstoff/20 mmol/1 Tris HCl, pH 7,5/30 mmol/1 KCl/0,2 % (v/v) Mercaptoethanol lysiert und der Überstand auf eine Chromatographie-Säule (DEAE-Sepharose ^y ~~ ^/ fastflow) gegeben. Die Säule (15x16cm) wird bei Raumtemperatur und einer Flußrate von 18 ml/Stunde mit einem von 30 bis 170 mmol/1 ansteigenden KCl-Gradienten entwickelt über 14 Stunden. Der Proteingehalt jeder Fraktion wird durch Elektrophorese geprüft. Die CK 5 enthaltende Fraktion wird über das Molekulargewicht (ca. 58000) bzw. den isoelektrischen Punkt (ca. pH 7,5) identifi¬ ziert. Die lyophilisierte CK 5 haltige Fraktion wird in 9,5 mol/1 Harnstoff/0,2 % (v/v) Mercaptoethanol/20 mmol/1 Tris HC1/1 mmol/1 KC1 aufgenommen und in einer Chromatographiesäule (DEAE-Sepharose*^ fastflow; 15,5x1,6cm) durch Anwendung eines 1 bis 180 mmol/1 linear ansteigenden KCl-Gradienten weitergereinigt. Die Identifikation von CK 5 erfolgt über das Molekularge¬ wicht bzw. den isoelektrischen Punkt.

Immunisierung

Balb/c-Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, werden mit 100 μg CK 5-Antigen in komplettem Freundschen Adjuvans intra- peritoneal immunisiert. In vierwöchigem Rhythmus werden zwei weitere Immunisierungen mit jeweils 50 μg Antigen in inkomplettem Freundschen Adjuvans durchgeführt.

Fusion und Klonierung

Milzzellen einer immunisierten Maus werden mit Ag8.653

Myelomzellen (ATCC-CRL 8375) im Verhältnis 1:1 nach dem

Standardverfahren gemäß J. of Immunol. Meth., Vol. 39,

285-308 fusioniert. Die Fusionsprodukte werden auf 24er

4 Kulturschalen gemeinsam mit 5 x 10 Peritoneal-Exudat-

Zellen als Futterzellen angesät. Positive Primärkul¬ turen werden 2 bis 3 Wochen nach Fusion mit Hilfe eines Fluorescence activated cell sorters kloniert. Die Zellen werden einzeln in 96-well-Zellkulturplatten abgelegt und mit HECS gefüttert. Als Kulturmedium wird handelsübliches RPMI 1640 Medium mit 10 % fötalem Kälberserum verwendet (nach J.A.M.A. 199, 519 (1957) .

Induktion von Ascites

2 bis 5 x 10 Hybridzellen werden intraperitoneal in mit Pristan vorbehandelte Mäuse gespritzt. Nach 10 bis 15 Tagen kann Ascites mit einer Antikörperkonzentration von 5 bis 10 mg/ml gewonnen werden.

Bestimmung der Spezifität

1. ELISA: Um die Anwesenheit und Spezifität von Anti¬ körpern zu erkennen, wird ein Enzyme-linked i muno- sorbent assay (ELISA) angewandt. Dazu werden auf ELISA-Platten pro well 80 μl Cytokeratinantigen in Carbonatpuffer vorgelegt. Anschließend wird mit

80 μl Hybridomakulturüberstand inkubiert. Danach wird eine Stunde mit gegen Mausimmunglobulin ge¬ richteten Antikörpern, die aus Schaf stammen und mit POD (Peroxidase) markiert sind, inkubiert. Zum Nachweis von gebundenem Enzym wird ABTS (2,2'- Azino-di-2 ^" 3-ethyl-benzthiazolin-sulfonsäure(G)_7- di-ammoniumsalz) als Substrat zugegeben. Nach 20 Minuten werden die Extinktionen in einem Photometer bei 405 nm bestimmt.

2. Immunoblot ("Western-Blot") : Aus humanem nicht . verhornendem Plattenepithel (enthält die CK 4, 5, 6, 13, 14) sowie aus humaner Epidermis (enthält

die CK 1, 5, 10, 14) werden Cytoskelettpräpara- tionen hergestellt und auf SDS-Polyacrylamid-Gel- elektrophorese aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf Nitrocellulose werden durch Inkubation mit den einzelnen Antikörpern die Reaktivitäten derselben untersucht.

3. Immunhistochemie/Immuncytochemie: Gefrierschnitte der Gewebe Leber (CK 8, 18), Darm (CK 8, 18, 19) - und Endόmetrium (CK 7, 8, 18, 19) sowie methanol¬ fixierte Zellen der Linien MCF-7 (ATCC HTB22) (CK 8, 18, 19), Heia (ATCC CCL2) (CK 7, 8, 18, 19), A-431 (ATCC CRL1555) (CK 5,-8, 13, 15, 17, 18) und RT-112 (CK 7, 8, 13, 17, 18, 19) werden mit Hybridomakulturüberständen inkubiert und die gebundenen Antikörper mit Schafantikörpern gegen Maus-Immunglobulin, die mit FITC (Fluorescein- isothiocyanat) markiert sind, sichtbar gemacht.

a b e l l e

MAK üππunogen Spezifität Subklasse Referenz

ECACC Cytoskelett CK 7 IgG 1 1), 3) 89030301 von RT 112- Zellen

ECACC CK 18 (45 kD) CK 18 IgG 1 2), 3), 4), 5) 89030303 aus MCF-7- Zellen

ECACC CK 5 aus hu CK 5 IgG 1 1), 3), 6), 7) 89030306 Mundschleim- 89030305 haut

ECACC Cytoskelett CK 19 IgG lk 2), 3) 89030304 von MCF-7- Zellen

ECACC Cytoskelett CK 8 IgG 1 2), 3) 89030302 von MCF-7 Zellen

1) Eur. J. Cell Biol. 38 (1985) 234-244

2) Lab. Invest. 55 (1986) 497-504

3) Dissertation T. Achtstatter, Universität Heidelberg 1988 121

6) Intermediate Filaments, Vol. 455, E. Wang, D. Fischman, R.K.H. Liem, T.-T. Sun (eds.) The New York Academy of Science (1985) S. 282-306

7) TIG , Vol . 4 (1988 ) 277-281

B e i s p i e l 3

Es wurden Seren von Patienten mit unterschiedlichen, sowohl malignen als auch benignen epithelialen Krank¬ heiten untersucht. Tabelle 2 stellt die Ergebnisse dar.

12

T a b e l l e

Wie die Tabelle zeigt, gelingt der Nachweis der Kombi¬ nation Cytokeratin 5/19, 7/18 oder 8/8 nur bei Patienten, bei. denen eine Leberzirrhose vorliegt. Die positive Reaktion des Patienten mit Niereninsuffizienz ist da¬ rauf zurückzuführen, daß der Patient zusätzlich eine beginnende oder ausgebildete Leberzirrhose hatte. Auch bei dem Patienten mit Leberkarzinom, bei dem ein posi¬ tiver Befund festgestellt wurde, ist dies darauf zu¬ rückzuführen, daß die Leber zirrhoseartig verändert war.

~ 12a -

Die hinterlegten Zellinien ECACC 89030301, 89030302, 89030303, 89030304 und 89030306 wurden alle am 3. März 1989 bei PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilts. SP4 OJG, U.K., unter der jeweiligen oben angegebenen Nummer hinterlegt. Die Zellinie ATCC CCL 77 wurde am 12. Oktober 1983 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt.