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Title:
METHOD FOR DETECTING COPPER COMPLEXES OF CHLOROPHYLL IN VEGETABLE OILS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/119162
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for detecting copper complexes of chlorophyll in vegetable oils and, more specifically, in olive oil. This method is of special interest for the food industry since it makes it possible to detect the presence, in the oil, of additives that are not permitted by legislation.

Inventors:
ROCA LOPEZ-CEPERO MARIA (ES)
GALLARDO GUERRERO LOURDES (ES)
MINGUEZ MOSQUERA MA ISABEL (ES)
GANDUL ROJAS BEATRIZ (ES)
Application Number:
PCT/ES2010/070235
Publication Date:
October 21, 2010
Filing Date:
April 19, 2010
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
ROCA LOPEZ-CEPERO MARIA (ES)
GALLARDO GUERRERO LOURDES (ES)
MINGUEZ MOSQUERA MA ISABEL (ES)
GANDUL ROJAS BEATRIZ (ES)
International Classes:
G01N33/03; A23D9/04; G01N30/02
Other References:
ROCA, M. ET AL.: "Control of Olive Adulteration with Copper-Chlorophyll Derivatives", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 58, 2010, pages 51 - 56
INOUE, H. ET AL.: "Determination of copper (II) chlorophyllin by reversed-phase high-performance liquid chromatography", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 679, 1994, pages 99 - 104
SCHWARTZ, S. J.: "High performance liquid chromatography of zinc and copper pheophytins", JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY, vol. 7, no. 8, 1984, pages 1673 - 1683
MINGUEZ-MOSQUERA, M. I. ET AL.: "Rapid Method of Quantification of Chlorophylls and Carotenoids in Virgin Olive Oil by High- Performance Liquid Chromatography", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 40, 1992, pages 60 - 63
DEL GIOVINE, L. ET AL.: "Copper chlorophyll in olive oils: identification and determination by LIF capillary electrophoresis", FOOD CONTROL, vol. 16, 2005, pages 267 - 272
SCOTTER, M. J. ET AL.: "Method development and HPLC analysis of retail foods and beverages for copper chlorophyll (E141[i] and chlorophyllin (E141[ii]) food colouring materials.", FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS, vol. 22, no. 12, 2005, pages 1163 - 1175
Attorney, Agent or Firm:
PONS ARIÑO, Ángel (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de detección de complejos cúpricos de clorofilas en aceites vegetales que comprende los siguiente pasos: d) extracción en fase líquida de los complejos cúpricos de clorofila, e) separación de los complejos extraídos en el paso a) mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y f) detección de los complejos separados en el paso b) por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS)

2. Procedimiento según Ia reivindicación 1 donde el complejo cúprico de clorofila se selecciona entre Cu-feoforbida a, Cu-feofitina b, Cu- feofitina b', Cu -132-OH-feofitina b, Cu-132-OH feofitina a, Cu-132-OH- feofitina a, Cu-151-OH-lactona-feofitina a, Cu-feofitina a, Cu-feofitina a', Cu-piro-feofitina b y Cu-piro-feofitina a o combinaciones de los mismos.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el aceite vegetal es aceite de oliva.

Description:
PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE COMPLEJOS CÚPRICOS DE CLOROFILAS EN ACEITES VEGETALES

La presente invención se refiere a un procedimiento para detección de complejos cúpricos de clorofilas en aceites, especialmente en aceite de oliva.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Debido al éxito comercial del aceite de oliva, éste se constituye en un producto susceptible, económicamente, de ser adulterado. Varios tipos de adulteraciones han sido descritas para el aceite de oliva en Ia literatura, para las cuales se han desarrollado métodos específicos de control (Dionisi, Prodolliet & Tagliaferri, Assesment of olive oil adulteration by reversed-phase high-performance liquid chromatography amperometric detection of tocopherols and tocotrienols. Journal of the American OiI Chemists Society, 1995; 72 (12), 1505-1511 ; Baeten, Meurens, Morales & Aparicio, Detection of Virgin Olive OiI Adulteration by Fourier Transform Raman Spectroscopy. Journal of the Agricultural Food Chemistry, 1996; 44 (8), 2225-2230).

El aceite de oliva por definición es mezcla de aceite de oliva virgen y aceite de oliva refinado. Éste último experimenta un proceso de refinación para eliminar defectos organolépticos, que incluye ente otras, una operación de decoloración. Si el aceite de oliva virgen con el que se va a mezclar procede de una variedad de aceituna de baja pigmentación o de frutos maduros, el aceite de oliva resultante tendrá una coloración muy débil. En general, el consumidor identifica aceite coloreado con aceite de oliva virgen, mientras que aceites de oliva poco pigmentados recuerdan a los aceites de semilla refinados. A esto hay que añadir que cada mercado tiene sus propias preferencias, por ejemplo, Japón demanda aceites muy coloreados. Todo ello ha conducido a que ciertos industriales refuercen Ia coloración de sus aceites vegetales, especialmente los de oliva, con aditivos colorantes verdes.

Según Ia normativa europea (94/35/CE) no está permitida Ia adición de colorantes a aceites y grasas de origen animal o vegetal. Sin embargo, para otros productos alimentarios existen dos colorantes naturales autorizados relacionados estructuralmente con las clorofilas, son los denominados E-140 y E-141. Por el hecho de ser naturales (pigmentos obtenidos de una materia prima animal o vegetal) y a pesar de estar sometidos a exámenes muy minuciosos, por norma no deben obligatoriamente responder a criterios de pureza específicos. El E-140 se corresponde con derivados clorofílicos tal cual, y se comercializa según su solubilidad, como el E-140Í, liposoluble, que se corresponde con las clorofilas y el E-140 ii, hidrosoluble compuesto por clorofilinas. El E-140 i se obtiene a partir de fuentes naturales, alfalfa, ortigas, y otras materias vegetales comestibles, mediante una extracción con solvente y durante este proceso, parte de las clorofilas pueden transformarse en sus derivados libres de magnesio: las feofitinas. Este hecho supone un cambio drástico en Ia coloración del colorante que pasa de verde a marrón. El producto final puede contener otros pigmentos (como carotenoides), aceites y ceras, por Io que el aspecto final del colorante es ceroso. El colorante E-140 ii (también conocido como clorofilinas sódicas o potásicas) se obtiene por saponificación de los productos extraídos por solventes a partir de material vegetal comestible. La saponificación rompe el enlace áster con el fitol e incluso puede llegar a romper el denominado anillo isocíclico. Tras Ia saponificación los ácidos son neutralizados para formar las sales de potasio y/o sodio. Este colorante se comercializa en polvo o solución acuosa a diferencia del E140i. El colorante E-141 se compone de complejos cúpricos de derivados clorofílicos, es decir, el correspondiente derivado cúprico del E-140. Paralelamente, existe en el mercado el E-141Í, liposoluble, llamado "clorofilas de cobre" y el E-141 Ü, hidrosoluble, conocido como "clorofilinas de cobre", resultantes ambas de adicionar sales de cobre a las respectivas soluciones de pigmentos.

Además existe un colorante verde artificial (E-142), autorizado en Europa, aunque no en Estados Unidos, que al ser artificial, debe pasar estrictos controles toxicológicos. La FDA, en materia de colorantes verdes en alimentos, sólo permite el uso del E-141 en bebidas basadas en cítricos, siempre y cuando no exceda el 2%.

En casos de adulteración del color en aceites de oliva el colorante generalmente utilizado es el E-141 i, es decir, Ia forma liposoluble del derivado cúprico de clorofilas, que facilita Ia disolución del mismo en el aceite. Los cupro-derivados son preferentemente utilizados porque son mucho más estables que Ia clorofila original, ya que Ia inserción del ion Cu +2 en el macrociclo de Ia clorofila, genera un complejo muy estable que mantiene su coloración verde a pesar del procesado y almacenamiento del alimento. A diferencia, el magnesio que de forma natural se encuentra quelado en el macrociclo (clorofila), durante el almacenamiento o procesamiento es sustituido fácilmente por hidrógeno generando otros derivados clorofílicos de coloración no verdosa (feofitinas).

La fracción clorofílica del aceite de oliva viene determinada principalmente por feofitinas (a y b). Durante el proceso de extracción del aceite de oliva, las clorofilas originales (presentes en Ia aceituna) se transforman en feofitinas cuando el ion magnesio del anillo de porfirina es sustituido por H+. Esta reacción está mediatizada por Ia liberación de ácidos que ocurre durante Ia molienda y batido de las pastas de aceitunas y es visualmente muy llamativa porque afecta directamente al grupo cromóforo de Ia clorofila, cambiando el color del verde brillante al marrón oliva. En algunos aceites pueden quedar trazas de las clorofilas originales. El contenido en feofitinas (a+b) supone más del 90% de Ia fracción clorofílica de un aceite de oliva. Incluso en un aceite de oliva virgen, a los 3-4 meses de almacenamiento todas las clorofilas se han transformado en feofitinas (Gallardo-Guerrero, Gandul-Rojas, Roca & Mínguez-Mosquera, 2005).

En algunos aceites de oliva, se han detectado trazas de derivados clorofílicos oxidados en el carbono-13 (OH-feofitinas y lactona-feofitinas), cuya presencia puede ser debida a Ia actividad de enzimas oxidativas del fruto y a las condiciones inherentes al proceso de extracción (Roca & Mínguez-Mosquera, 2003). En aceites de frutos con alta actividad clorofilasa, como en el caso de Ia variedad Arbequina, también se encuentran clorofilidas y feoforbidas. Estos compuestos son productos de Ia reacción de desesterificación del alcohol fitol de las moléculas de clorofilas y feofitina, respectivamente (Roca & Mínguez-Mosquera, 2003). Si el aceite de oliva lleva un tiempo almacenado se puede formar también pirofeofitina a. Este compuesto se forma por Ia demetoxicarbonilación de C-13 2 . La aparición de este compuesto en alimentos ha estado siempre relacionada con tratamientos térmicos fuertes como Ia esterilización. Sin embargo, Gallardo-Guerrero, Gandul-Rojas, Roca & Mínguez-Mosquera (2005) han demostrado Ia formación de dicho compuesto durante el almacenamiento del aceite de oliva virgen a 15 0 C durante un año, aunque nunca más de 3%. Consecuentemente, el aceite de oliva debe contener sólo los pigmentos presentes en el fruto más los derivados asociados al proceso de extracción y almacenamiento: específicamente, feofitinas (a y 6), trazas de clorofilas y feofitinas oxidadas y pirofeofitina a, y, en ciertos casos, derivados clorofílicos desesterificados. Por tanto, sería de gran interés para el control de calidad de Ia industria alimentaria poder disponer de un procedimiento de detección de pigmentos que hayan sido añadidos fraudulentamente al aceite de oliva.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de Ia presente invención han desarrollado un procedimiento de detección de complejos cúpricos de clorofilas en aceite, especialmente indicado para controlar Ia adición fraudulenta en aceite de oliva de colorantes que contienen estos complejos.

Así, en un primer aspecto, Ia presente invención se refiere a un procedimiento de detección de complejos cúpricos de clorofila en aceites vegetales que comprende los siguientes pasos: a) extracción en fase líquida de los complejos cúpricos, b) separación de los complejos extraídos en el paso a) mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y c) detección de los complejos separados en el paso b) por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS)

En Ia presente invención el término "complejo de clorofila" se refiere a un compuesto coloreado con estructura química de clorofila, es decir, formado por un anillo porfirínico sustituido y una cadena terpénica denominada fitol. La estructura básica es el anillo de porfina que esta formado por cuatro anillos de pirrol enlazados por puentes metínicos que forman un nuevo sistema aromático planar muy estable.que es Ia porfina. En el caso de Ia clorofila, en el centro del anillo porfirínico se encuentra un átomo de Mg 2+ unido a los nitrógenos de los grupos pirrol, pero este átomo de Mg 2+ puede sustituirse por Zn 2+ , Cu 2+ o 2H + para formar otros pigmentos químicamente estables. En Ia presente invención el término "aceite vegetal" se refiere a un lípido que es líquido a temperatura ambiente y que se obtiene de las plantas, principalmente de sus semillas. Ejemplos de aceites vegetales, sin limitarse a, son aceite de oliva, de palma, de girasol, de colza, de coco, de lino, de sésamo, de pepitas de uva o de almendra.

En una realización preferida, el complejo cúprico de clorofila se selecciona entre Cu-feoforbida a, Cu-feofitina b, Cu- feofitina b ' , Cu -13 2 -OH-feofitina b, Cu-13 2 -OH feofitina a, Cu-13 2 -OH-feofitina a ' , Cu-15 1 -OH-lactona- feofitina a, Cu-feofitina a, Cu-feofitina a ' , Cu-piro-feofitina b y Cu-piro- feofitina a o combinaciones de los mismos.

Los mencionados complejos clorofílicos con cobre, junto con otros derivados clorofílicos no cúpricos, están presentes en el colorante E141 i y tienen Ia siguiente fórmula general:

donde las características estructurales específicas se recogen en Ia tabla 1.

En otra realización preferida, el aceite vegetal es aceite de oliva.

En Ia presente invención el término cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) se refiere a una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y Ia columna cromatográfica, Ia cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por Ia absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en el caso de Ia HPLC es un líquido o mezcla de varios líquidos que se introduce en Ia columna por bombeo a alta presión. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Dependiendo de Ia relación carga/tamaño unos constituyentes de Ia mezcla serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, Io que provocará su separación. Las sustancias que permanecen libres más tiempo en Ia fase móvil, avanzan más rápidamente con el fluir de Ia misma y las que quedan más unidas a Ia fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir.

En Ia presente invención el término "espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis)" se refiere a una técnica instrumental basada en el análisis espectral que permite detectar Ia absorción o emisión de radiación electromagnética a ciertas longitudes de onda, y relacionar éstas con los niveles de energía implicados en una transición cuántica. En el caso de Ia espectroscopia UV-Vis se utiliza radiación electromagnética de las regiones visible, ultravioleta cercana e infrarroja cercana. La radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Espectros de los derivados clorofílicos presentes en el colorante E 141 i. (a) feofitina b (línea continua) y Cu-feofitina b (línea discontinua), (b) feofitina a (línea continua) y Cu-feofitina a (línea discontinua), (c) 15- ácido glioxílico feofitina b, (d) Cu-15 1 -OH lactona feofitina a. Picos como en tablas 2 y 3.

Figura 2: Cromatogramas (430 nm) de aceite de oliva (a, b) y mezcla de aceite de oliva y colorante 141 i (c). Ampliación del cromatograma del recuadro de Ia figura 2a para aceite de oliva (b) y mezcla de aceite de oliva y colorante 141 i (c). Picos como en tablas 2 y 3.

Figura 3: Cromatogramas a 430 nm de cuatro muestras diferentes de colorantes naturales E-141 i, obtenidos tal y como se describe en materiales y métodos. Picos como tabla 2 y 3.

Figura 4: Espectro directo de una solución de hexano del colorante E 141 i (línea continua), aceite de oliva (línea punteada) y muestra adulterada (línea discontinua).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad del procedimiento descrito en Ia presente invención.

Materia prima. La muestra de aceite de oliva fue comprada en un supermercado, y las muestras de colorantes fueron suministradas por diferentes empresas dedicadas a Ia producción y comercialización de colorantes alimentarios. El aceite problema (adulterado) se obtuvo mezclando el aceite de oliva con uno de estos colorantes E-141 i.

Extracción de pigmentos. Muestras de 15g de aceite de oliva se disuelven con N, N-dimetilformamida (DMF) saturado con MgCÜ3. Los extractos se combinan en un embudo de decantación y son repetidamente tratados con hexano (5 x 50 mi). Clorofilas, derivados clorofílicos y xantofilas se retienen en Ia fase DMF. La fase de hexano contiene lípidos y carotenos. La fase DMF es tratada con 40OmL de una solución 10 % (p/v) NaCI a O 0 C y las clorofilas y xantofilas se transfieren a 100 mi de una mezcla de éter dietílico/hexano (1 :1 v/v). La fase acuosa se lava con éter dietítico y es finalmente descartada, eliminando polifenoles y otros compuestos hidrosolubles. Las fases orgánicas combinadas se filtran a través de IN^SO 4 anhidro y evaporado a sequedad bajo vacío con temperatura inferior a 3O 0 C. El residuo seco se disuelve en 1.5 mi de acetona previo a HPLC. Para los colorantes (E-141 i), diferentes alícuotas se disuelven en acetona. Los análisis se realizan inmediatamente o tras el almacenamiento a -20 0 C durante no más de 18 h. Los datos son media de un análisis por triplicado.

Patrones de pigmentos para HPLC. Clorofila a y b se compraron a Sigma. Se obtuvo clorofilida mediante una desesterificación enzimática con clorofilasa. La mezcla de reacción contiene: tampón 100 mM Tris-HCI (pH 8.5) que lleva 0.24 % (w/v) Tritón X-100, clorofila a disuelta en acetona y el extracto enzimático crudo de hojas de Ailanthus altissima (Mili.), en una proporción 5:1 :5. Los epímeros en C-13 de clorofila a y b se prepararon con un tratamiento con cloroformo. La 13 2 -OH-clorofla a y b se obtuvo mediante una oxidación con dióxido de selenio (37mg, 0.34 mmol) a partir de clorofila a con reflujo y calor durante 4 h, en una solución con piridina (5 mi) bajo argón. 15 1 -OH-lactona clorofilas a y b se obtuvieron mediante una oxidación alcalina en medio acuoso. Para ello, clorofila (a o b) sólida y cromatográficamente pura se disolvió en acetona y se mezcló con 0.5% NaOH y se expuso a oxigeno atmosférico a temperatura ambiente durante 10 min. Los productos de oxidación resultantes fueron transferidos a éter dietílico adicionando agua saturada con NaCI, y 15 1 - OH-lactona clorofilas se aislaron por NP-TLC y HPLC semi-preparativa. Pirofeofitina a y b se obtuvieron de sus respectivas feofitinas disueltas en colidina mediante calentamiento a 100 0 C y reflujo. Todos los derivados libre de magnesio se obtuvieron de los correspondientes precursores clorofílicos disueltos en éter dietílico mediante una acidificación con 2-3 gotas de 5 M HCI.. La 15-ácido glioxílico feofitina b se obtuvo por tratamiento alcalino en medio acuoso (0.5% NaOH). Los complejos de cobre se prepararon disolviendo los pigmentos en acetona para Ia reacción de quelación con iones cobre (II) y con ácido ascórbico para minimizar los cambios oxidativos.

Análisis de pigmentos clorofílicos por HPLC. La separación y cuantificación de pigmentos se llevaron a cabo por HPLC utilizando un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard HP 1100 equipado con un inyector automático de HPLC HP1100. Se utilizó una columna de acero inoxidable (20 x 0.46 cm i.d.), empaquetada con 3μm Cíe Mediterránea Sea (Teknokroma, Barcelona, Spain). La columna se protege con una precolumna (1 x 0.4 cm d.i.) empaquetada con el mismo material. La separación se lleva a cabo utilizando un gradiente de elución (flujo 1.250 ml_ min "1 ) con las fases móviles: agua/par iónico/metanol (1/1/8, v/v/v) y metanol/acetona (1/1 , v/v). El par iónico es tetrabutilamonio 0.05 M y acetato de amonio 1 M en agua. La columna se guarda en metanol/agua (1/1 , v/v). El gradiente es inicialmente 75%A y 25%B, luego cambia a 25%A en 8 minutos, ¡socrático 2 min., cambio a 10%A en 8 min., luego a 100%B en 5 minutos, ¡socrático 15 minutos, y vuelta a las condiciones iniciales en 5 min. Se lleva a cabo una detección secuencial con un detector de fotodiodo a 430 nm. Los datos se procesan con un LC HP ChemStation (Rev.A.05.04). Los pigmentos son identificados por co- cromatografia con muestras auténticas y por sus características espectroscópicas. El espectro UV-Vis on-line se registra desde 350 a 800 nm con el detector de fotodiodo.

Espectro directo. Las muestras (aceites y colorante) se disolvieron en 25 mL de hexano y se realizó el espectro de absorción electrónica con un espectrofotómetro de diodo HP 8452A.

La tabla 2 y Ia figura 1 (a-b) muestran las principales características espectroscópicas de los derivados clorofílicos presentes en el aceite de oliva. En Ia figura 2a se representa un cromatograma típico a 430 nm de aceite de oliva. A esta longitud de onda, el pico de mayor área se corresponde con luteína, carotenoide mayoritario del aceite de oliva, Io que dificulta Ia visualización de Ia zona cromatográfica objeto de interés (tiempos de retención superiores a 22 minutos). Si esta zona se amplia (figura 2b), se observan con más claridad los derivados clorofílicos mayoritarios en un aceite de oliva. La presencia de otros derivados clorofílicos distintos de los descritos (feofitinas (a y b), trazas de clorofilas y feofitinas oxidadas y pirofeofitina a, y, en ciertos casos, derivados clorofílicos desesterificados), indica que el aceite de oliva ha sido adulterado con Ia adición de un compuesto o mezcla colorante. En Ia figura 3 se muestra el perfil de cuatro ejemplos reales de colorantes E-141 i que se comercializan bajo diferentes marcas, como colorantes alimentarios autorizados (para otro tipo de alimentos). La composición clorofílica y carotenoide varía entre muestras dependiendo de Ia materia prima de partida y del proceso de obtención, ya que Ia norma no recoge un protocolo uniforme. Dentro de Ia fracción carotenoide, predomina luteína y β-caroteno, acompañados de otras xantofilas minoritarias. En Ia tabla 3 se recogen las propiedades cromatográficas y espectroscópicas de todos los derivados clorofílicos presentes en las cuatro muestras de colorantes E- 141 i analizadas. La inserción del ion cobre en el macrociclo clorofílico induce un desplazamiento batocrómico de Ia banda Soret (entre 3 y 15 nm, dependiendo del pigmento) y un desplazamiento hipsocrómico de Ia banda Vl (entre 12 y 30 nm, dependiendo del pigmento), como puede verse en Ia tabla 3. A diferencia, las modificaciones de Ia molécula de clorofila que no afectan al sistema de doble enlaces conjugados del macrociclo, no modifican el espectro de absorción. En este sentido, Ia hidroxilación del C13 (13 2 -OH), Ia pérdida de Ia cadena de fitol, los epímeros, y Ia demetoxicarbonilación que conduce a Ia formación de los piroderivados, no modifican el espectro de absorción del pigmento precursor correspondiente, aunque sí Ia polaridad y, consecuentemente, los tiempos de retención (tabla 3 y figura 3).

De Ia fracción clorofílica, Io más llamativo es que el 99.59±0.52 % de los pigmentos clorofílicos presentes en las diferentes muestras del colorante E141 i, no son propios de un aceite de oliva. Por tanto, Ia simple detección de uno de estos compuestos en un aceite de oliva desconocido permite detectar Ia adulteración. Las tres primeras muestras de colorantes E-141 i son bastantes parecidas entre sí, tan sólo Ia cuarta (figura 3d) presenta un cromatograma más complejo. Pero en cualquier caso, en todas ellas el derivado clorofílico mayoritario es Cu-pirofeofitina a (pico 14) que supone, dependiendo de Ia muestra, entre el 39-91 % de Ia fracción clorofílica. Por otro lado, entre el 76-100% de los derivados clorofílicos son complejos cúpricos de clorofilas. Como se ha visto anteriormente (figura 2a-b), en los aceites de oliva están ausentes los derivados cupro-clorofílicos, por Io que Ia detección de Ia adulteración es relativamente fácil, entre otras cosas porque Ia inserción de Ia molécula de cobre en un complejo clorofílico modifica su polaridad, permitiendo así una elución cromatográfica separada del complejo original entre 1-2 min. La identificación también se ve facilitada por el hecho de que los espectros de absorción de los derivados cupro-clorofílicos se diferencian sustancialmente del derivado clorofílico del que proceden, tal y como se ha comentado anteriormente. Este hecho permite incluso a veces detectar Ia adulteración directamente a partir de un espectro de absorción del aceite disuelto en hexano, observando Ia zona entre 600-700 nm. A modo de ejemplo, se muestra en Ia figura 4 el espectro de un aceite de oliva, donde el máximo de absorción se encuentra a 666 nm por ser el propio de Ia feofitina a, derivado clorofílico mayoritario del aceite de oliva. El espectro del colorante E-141 i exhibe su máximo a 654 nm, propio del Cu-piro-feofitina a (pico 14), al ser el mayoritario en el colorante. Cuando se realiza el espectro directo a Ia muestra problema (aceite de oliva puro más colorante E-141 i) se produce una modificación de los máximos de absorción. Específicamente, en Ia zona 600-700 nm se produce un plateau, suma de los máximos de absorción del aceite de oliva (666 nm) y del colorante (654 nm). Por tanto, si Ia absorbancia del aceite a 654 nm es mayor que a 666 nm, nos indica una adulteración del aceite de oliva.

En Ia figura 2c se muestra el perfil cromatográfico del extracto de complejos obtenido de una muestra de aceite de oliva adulterado con colorante E-141 i. Se ha ampliado el cromatograma en Ia zona más apolar donde se concentran los derivados cupro-clorofílicos. Se observa claramente cómo el método cromatográfico propuesto permite separar los complejos inherentes al aceite de oliva (picos 1-3, figura 2c) de los derivados clorofílicos procedentes del colorante (picos 9, 11 , 13 y 14). Como se comentó anteriormente, Ia presencia de complejos cúpricos de clorofilas en Ia muestra problema implica que el aceite de oliva ha sido adulterado. Así pues, teniendo en cuenta Ia separación cromatográfica y las características espectroscópicas (tabla 3 y figura 2) se puede garantizar el control de Ia adulteración del aceite de oliva con aditivos colorantes tipo "complejo cúprico de clorofila" (E-141 i). En el sistema cromatográfico se recomienda, además de Ia detección general a 430 nm, Ia detección simultánea a las longitudes de onda específicas de los complejos cúpricos mayoritarios, 654 nm para Cu-pirofeofitina a y 633 nm para Cu-pirofeofitina b.