시안화물은 반응 속도가 가장 빠른 독극물 중의 하나로써 생물체나 환경에 유해한 물질이다. 일단 몸속으로 들어가면 거의 즉각적으로 신체의 산소 운반 기능을 마비시키고, 조직을 가사상태로 만들기 시작한다. 다량일 경우에는 심장 박동을 느리게 하고, 뇌에서 일어나는 전기적 활동을 멈추게 하기도 한다. 시안화 이온은 독성으로 인하여 동물에 특히 유해하며, 구토, 의식 불명을 초래하며 사망에 이르게 한다. 시안화물의 독성으로 사망을 초래하는 혈중 시안화물 농도는 약 23-26 μM 이다.

아이다호 주립대학의 Jeffrey J. Rosentreter 등은 해마다 전 세계적으로 14억 톤 가량에 달하는 시안화물이 비료와 플라스틱 제품에서부터 광산과 철강 생산에 이르기까지 다양한 산업 분야에서 중요하게 다루어지고 있다고 지적한 바 있다. 이와 같이, 다양한 산업 분야에 사용되는 시안화물은 인간의 신경 시스템에 유해하므로 음용수 관리와 조절이 이루어져야 한다. 폐수는 지속적인 관리가 필요하고 시안화물은 알칼리 염소처리법을 사용하여 제거된다. 이로 인하여 유럽의 시안화물 표준 제한 농도는 0.05 ㎎/L를 초과하지 않도록 규정하고 있다.

한편, 호흡기관계의 중요한 병원성 세균 중 하나인 녹농균( Pseudomonas aeruginosa )은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자의 폐에 기생하여 치명적인 증상을 유발하는데 있어서 세균으로부터 발생되는 시안화 이온이 중요한 역할을 수행함이 알려져 있다(B. Ryall, J. C. Davies, A. Shoemark and H. D. Williams, Eur. Respir. J. 2008, 32, 740). 시안화 이온의 검출은 환자의 타액을 채집하여 시안화 이온에 특수한 전극을 이용하는 방법이 사용되었다. 이러한 방법은 용액 내 시안화 이온 농도의 측정을 가능케 하지만, 동물 세포나 조직 등의 생체 내에서의 측정은 불가능하다. 특히, 녹농균의 폐로의 감염이 치명적인 질병을 수반하므로, 생체 내에서의 시안화 이온의 직접적인 검출 방법은 필수적이고, 질병의 연구와 극복에 많은 도움을 줄 것이다.

상기와 같은 이유로 시안화물의 검출 방법에 대한 많은 연구가 진행되어 오고 있고, 시안화물을 검출하기 위한 다양한 형광 및 색변화 센서들에 대한 연구가 최근 10년 동안 활발히 진행되고 있다. 가장 대표적인 예로 Zn(II)-porphyrin(Y.-H. Kim and J.-I. Hong, Chem. Commun . 2002, 512), Ru(II)-pyridine((a) P. Anzenbacher, Jr., D. S. Tyson, K. Jursikova and F. N. Castellano, J. Am. Chem. Soc . 2002, 124, 6232; (b) C.-F. Chow, M.H.W. Lan and W.-Y.Wong, Inorg. Chem . 2004, 43, 8387), 보론산 유도체((a) R.Badugu, J.R.Lakowicz and C.D.Geddes, J. Am. Chem. Soc . 2005, 127, 3635; (b) J. V. Ros-Lis, R. Martinez-Manez and J. Soto, Chem. Commun. 2005, 5260) 및 CdSe 양자점(CdSe quantum dot)(W. J. Jin, M. T. Fernandez-Arguelles, J. M. Costa-Fernandez, R. Pereito and A. Sanz-Medel, Chem. Commun. 2005, 883)들과 시안화물의 착화합물을 이용하는 것이다. 반면, 최근에는 플루오르화물 및 아세테이트와 같은 다른 음이온의 간섭을 최소화할 수 있는 다양한 기능기를 사용하는 시안화물의 친핵성 첨가법이 활용되고 있다. 옥사진(oxazine), 피릴륨(pyrylium), 스쿠알란(squarane), 트리플루오르아세토페논(trifluoroacetophenone), 아실트리아젠(acyltriazene), 아크리디늄(acridinium) 및 살리실알데하이드(salicylaldehyde)에 대한 시안화물의 친핵성 첨가법에 대한 연구가 최근 수년간 보고된 바 있다. 그러나, 수용액 상태에서 이용할 수 있는 시안화물에 대한 "OFF-ON" 타입의 센서에 대한 연구결과는 거의 알려진 바 없다. 여기서, "OFF-ON" 타입의 센서라 함은 형광의 세기(또는 강도)가 낮은 상태(OFF)에서 시안화 이온을 감지하면 형광의 세기(또는 강도)가 매우 커지는 사실(ON)을 센서화시킨 타입의 센서를 의미한다.

이에, 본 발명자들은 시안화 이온을 수용액 상태에서 검출할 수 있는 "OFF-ON" 타입의 센서로서 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 사용하여, 실온에서 상기 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 시안화 이온을 반응시켜 520 ㎚ 파장 부근에서 발생되는 형광 강도 또는 색변화를 측정하여 시안화 이온을 정밀하게 검출할 수 있는 검출방법을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법을 제공하고 생체 내에서의 시안화 이온의 검출방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 "OFF-ON" 타입 센서로서 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 사용하여, 이를 시안화 이온과 반응시켜 발생되는 형광 강도 또는 색변화를 측정함으로써 시안화 이온을 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 실온에서 상기 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 시안화 이온과 반응시켜 520 ㎚ 파장 부근에서 발생되는 형광 강도 또는 색변화를 측정하여 광학적 방법으로 시안화 이온을 정량 및/또는 정성 분석하는데 유용하게 사용할 수 있다. 상기 화합물을 이용한 시안화 이온의 검출은 환경 오염에서 유래한 독성을 생체 내에서 직접적으로 형광 강도의 변화를 통해 관찰하여 시안화 이온의 유해성을 분석할 수 있다. 항생제로 치료하기 힘든 치명적인 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자들에 있어서 녹농균( P. aeruginosa ) 감염 영향의 정도를 정성적, 정량적으로 연구하여 검진 및 치료의 가능성을 제시한다.

도 1은 실온 상태인 CH ₃ CN-HEPES(9:1, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 음이온들을 첨가하여 플루오레세인 알데하이드(3 μM)와 반응시켜 발생된 형광 변화를 나타낸 그래프이고;

도 2는 실온 상태인 CH ₃ CN-HEPES(9:1, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 음이온들을 첨가하여 플루오레세인 다이알데하이드(3 μM)와 반응시켜 발생된 형광 변화를 나타낸 그래프이고;

도 3은 실온 상태인 CH ₃ CN-HEPES(1:2, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 음이온(100 eq.)들을 첨가하여 플루오레세인 다이알데하이드(3 μM)와 반응시켜 발생된 형광 변화를 나타낸 그래프이고;

도 4는 실온 상태인 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 농도의 시안화물과 플루오레세인 알데하이드(3 μM)를 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 그래프이고;

도 5는 실온 상태인 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 농도의 시안화물과 플루오레세인 다이알데하이드(3 μM)를 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 그래프이고;

도 6은 실온 상태인 CH ₃ CN-H ₂ O(1:2, v/v, 0.01 M, pH 7.4)에서 다양한 농도의 시안화물과 플루오레세인 다이알데하이드(3 μM)를 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 그래프이고;

도 7은 5개의 비이커에 30 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 알데하이드와 각기 다른 농도의 시안화물을 첨가하여 반응시킨 경우에 발생되는 각각의 비이커에서의 색변화를 나타내는 이미지이고;

도 8은 150 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드 및 100% CH ₃ CN, CH ₃ CN-H ₂ O, CH ₃ CN-HEPES와 같은 서로 다른 용매를 혼합한 용액에 20 eq 시안화 이온을 ^{첨가한 경우(2, 4, 6)와 첨가하지 않은 경우(1, 3, 5)로 나누어 각각의 용액에서 나타나는 색 변화를 캡처한 이미지이고;}

도 9는 150 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드 및 100% CH ₃ CN, CH ₃ CN-H ₂ O, CH ₃ CN-HEPES와 같은 서로 다른 용매를 혼합한 용액에 20 eq 시안화 이온을 ^{첨가한 경우(2, 4, 6)와 첨가하지 않은 경우(1, 3, 5)로 나누어 각각의 용액에서 나타나는 형광 변화를 캡처한 이미지이고;}

도 10의 (a)는 녹농균과 반응하지 않고 100μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 선충의 형광 이미지이고, (c)는 이의 DIC 이미지이고, (b)는 녹농균 및 100μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 선충의 형광 이미지이고, (d)는 이의 DIC 이미지이고, 이미지 상의 막대들은 각각 50μm 길이를 의미하고;

도 11의 (a)는 녹농균을 주입하지 않고 2μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 쥐의 폐 조직 절편의 형광 이미지이고, (b)는 녹농균 및 2μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 쥐의 폐 조직 절편의 형광 이미지이고, 이미지 상의 막대는 100μm 길이를 의미하고;

도 12의 (a)는 본 발명에 따른 시안화 이온의 검출방법에 사용되는 미세유체채널의 광학 이미지이고, (b)는 상기 미세유체채널의 유입부(1 및 2)에 노란색과 파란색의 식품 착색제 용액을 각각 주입하여 상기 혼합부를 통과시키는 경우 혼합에 의해 녹색의 채도가 점차적으로 증가된 것을 나타내는 광학 이미지이고;

도 13은 미세유체채널의 유입부(1 및 2)에 10 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 1 eq., 5 eq., 10 eq., 20 eq. 및 50 eq.의 시안화물을 각각 10 μl의 유동률로 주입하여 혼합한 후 발생되는 형광 강도를 측정한 그래프이고;

도 14는 미세유체채널의 유입부(1 및 2)에 10 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 1 eq., 5 eq., 10 eq., 20 eq. 및 50 eq.의 시안화물을 각각 10 μl의 유동률로 주입하여 혼합한 후 발생되는 형광을 캡처한 형광 이미지이고;

도 15의 (a), (b) 및 (c)은 각각 사람의 각질 세포주, HaCaT 세포를 20 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 37℃에서 한 시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고, 20 μM의 테트라부틸암모늄 시안화물로 처리한 경우의 HaCaT 세포의 형광 이미지, DIC 이미지(Differential Interference Contrast Image) 및 통합 이미지(merged image)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 유도체를 이용한 시안화 이온의 검출방법을 제공한다.

화학식 1

상기 식에서 R은 수소 또는 -CHO이다.

상기 화학식 1은 하기 화학식 2의 플루오레세인 알데하이드 또는 하기 화학식 3의 플루오레세인 다이알데하이드이다.

화학식 2

화학식 3

상기 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드는 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다(W. Wang et al., J. Am. Chem. Soc . 2005, 127, 15949).

예를 들면, 본 발명에서 사용되는 화학식 3의 플루오레세인 다이알데하이드는 100 ml 플라스크에 플루오레세인(4 g, 12 mmol), 10 ㎖ 클로로폼, 6 ㎖ 메탄올 및 0.06 g의 15-crown-5를 넣는다. 플라스크의 온도를 50 ℃로 유지하면서 20 g의 50% 수산화나트륨용액을 조심스럽게 넣는다. 이 혼합물을 50 ℃의 온도에서 5 시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 냉각시킨 후, 10 M의 H ₂ SO ₄ 로 용액을 산성화시킨다. 침전물을 모아서 진공상태에서 건조시킨다. 실리카겔을 이용한 크로마토그래피를 수행한 결과(5:95 = EtOAc:DCM) 142 ㎎의 흰색 입자인 플루오레세인 다이알데하이드를 얻을 수 있다(수득률 3.0%).

본 발명에 따른 시안화 이온의 검출방법을 반응식 1 및 반응식 2를 통하여 구체적으로 설명한다.

먼저, 화학식 2의 플루오레세인 알데하이드를 이용하는 경우를 살펴보면 다음과 같다.

하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 2의 플루오레세인 알데하이드는 시안화 이온과 반응하여 화학식 4의 화합물을 거쳐 양성자 이동의 결과 녹색 형광을 발광시키는 화학식 5의 화합물을 생성한다. 상기 플루오레세인 알데하이드의 시안화 이온에 대한 선택성은 수용액에서의 시안화물의 친핵성에 기인한 것으로 판단된다.

<반응식 1>

다음으로, 화학식 3의 플루오레세인 다이알데하이드를 이용하는 경우를 살펴보면 다음과 같다.

하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 화학식 3의 플루오레세인 다이알데하이드는 시안화 이온과 반응하여 화학식 6의 화합물을 거쳐 양성자 이동의 결과 녹색 형광을 발광시키는 화학식 7의 화합물을 생성한다. 상기 플루오레세인 다이알데하이드의 시안화 이온에 대한 선택성은 수용액에서의 시안화물의 친핵성에 기인한 것으로 판단된다.

<반응식 2>

본 발명에 따른 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드의 형광 변화에 대한 실시예 1 및 도 1, 2 및 3을 참조하면, 시안화 이온을 포함한 다양한 음이온들에 대해 3 μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 첨가한 경우, NO ₃ ^- 등의 음이온들은 비교적 작은 형광 변화를 나타내거나 거의 나타내지 않으나, 시안화 이온은 큰 폭의 형광 변화를 나타내는 것을 알 수 있다. 시안화 이온의 첨가에 따른 전체 형광 변화는 200배 이상으로 나타났다. 이로부터, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드는 시안화 이온과 선택적으로 반응함으로써 시안화 이온을 검출하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드는 시안화 이온과 반응시 큰 폭의 형광 변화를 나타내어 시안화 이온을 정밀하게 검출할 수 있게 한다.

상기 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 시안화 이온이 반응하여 발생되는 형광 강도는 시안화 이온의 농도가 증가할수록 증가된다. 본 발명의 시안화 이온의 농도에 따른 형광 강도를 측정한 실시예 2 및 도 4, 5 및 6을 참조하면, 일정량의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응하는 시안화 이온의 농도에 비례하여 형광 강도가 증가하는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 시안화 이온을 반응시켜 발생되는 색변화를 측정하여 수행될 수 있다. 시안화 이온의 농도에 따른 색변화를 측정한 실시예 3 및 도 7을 참조하면, 일정량의 플루오레세인 알데하이드와 반응하는 시안화 이온의 농도가 증가할수록 색의 채도가 증가되는 것을 알 수 있다. 또한, 용매의 종류에 따른 색변화 및 형광 변화를 측정한 실시예 4 및 도 8를 참조하면, 용매의 종류에 상관없이 다양한 용매에서도 색 변화가 뚜렷하게 관찰됨을 확인할 수 있다. 나아가 도 9를 참조하면, 색 변화뿐만 아니라 형광 변화도 뚜렷이 관찰됨을 알 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 세균에 감염된 예쁜 꼬마 선충을 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드에서 배양한 후 발생되는 형광을 측정하여 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예 5 및 도 10을 참조하면, 녹농균에 감염된 예쁜 꼬마 선충은 형광 변화가 뚜렷이 관찰된다.

또한, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 세균에 감염된 실험용 쥐의 폐 조직을 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드에서 배양한 후 발생되는 형광을 측정하여 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예 6 및 도 11을 참조하면, 녹농균에 감염된 실험용 쥐의 폐 조직은 형광 변화가 뚜렷이 관찰된다.

나아가, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 생체 외에서 사람의 각질 세포주를 플루오레세인 알데하이에서 배양한 후 발생되는 형광을 측정하여 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예 8 및 도 15(a), 15(b) 및 15(c)를 참조하면, 살아있는 세포 내에서 형광 변화가 뚜렷이 관찰된다.

본 발명에 따른 검출방법은 미세유체채널을 이용하여 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.

미세유체채널의 시료용액 유입부(1)에 시안화 이온을 포함하는 시료용액을 주입하는 단계(단계 1);

미세유체채널의 센서함유용액 유입부(2)에 상기 플루오레세인 알데하이드를 함유하는 센서함유용액을 주입하는 단계(단계 2);

미세유체채널의 혼합부(3)에서 상기 단계 1 및 2의 용액이 혼합되어 상기 반응식 1의 반응이 수행되는 단계(단계 3); 및

검출부(4)에서 상기 단계 3의 반응결과 생성되는 형광 강도를 측정하는 단계(단계 4).

이하, 상기 검출방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 시안화 이온의 검출방법에서 사용되는 미세유체채널은 시료용액 유입부(1), 센서함유용액 유입부(2), 혼합부(3) 및 검출부(4)로 순차적으로 구성된다(도 12의 (a) 참조).

상기 미세유체채널의 시료용액 유입부(1)는 시료 용액을 주입하는데 사용된다. 상기 센서함유용액 유입부(2)는 시안화 이온과 반응을 일으켜 형광을 발생시키는 화학식 1의 플루오레세인 알데하이드가 포함된 용액을 주입하는데 사용된다. 상기 유입부(1 및 2)는 주입되는 용액의 유동률을 제어할 수 있는 시린지 펌프(syringe pump)와 결합되는 것이 바람직하다.

상기 미세유체채널의 혼합부(3)는 상기 미세유체채널의 유입부(1 및 2)를 통하여 주입된 용액들이 혼합되는 구간이다. 상기 혼합부(3)는 용액들이 용이하게 혼합될 수 있도록 지그재그 형태(zigzag design)로 형성되는 것이 바람직하다. 도 12의 (b)는 각각의 미세유체채널의 유입부(1 및 2)에 노란색과 파란색의 식품 착색제 용액을 각각 주입하여 지그재그 형태로 구성된 상기 혼합부(3)를 통과하는 경우 혼합에 의해 녹색의 채도가 점차적으로 증가되는 것을 나타내는 광학 이미지이다. 도 12의 (b)에 나타난 녹색 순도의 균일성(evenness in the green colour purity)은 미세유체채널 내의 혼합 정도를 직접적으로 나타낸다.

상기 미세유체채널의 검출부(4)에서는 상기 혼합부(3)를 통과하면서 혼합된 용액 내에서 시안화 이온과 화학식 1의 플루오레세인 알데하이드가 반응한 결과 발생된 형광 강도 또는 색변화를 측정하여 검출한다. 상기 검출부(4)는 용이한 형광 측정을 위해서 평면벽 미세유체채널(flat-wall microchannel)로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 미세유체채널의 검출부(4)에서는 형광 화학 정량계 이용하여 500-540 nm의 파장에서 발생되는 형광 강도를 측정함으로써 시안화 이온의 존재를 검출한다. 또한, 형광 현미경을 이용하여 형광 이미지를 캡쳐함으로써 시안화 이온의 존재를 검출할 수 있다. 더욱 구체적으로, 형광 강도의 측정은 형광계(fluorescent spectrometer) 등의 형광 측정 기기를 사용하여 시안화 이온이 없는 시료와 시안화 이온이 존재하는 시료의 상대적인 강도(intensity)를 측정함으로써 이루어진다. 이러한 형광 강도는 측정 기기에 따라 절대값이 달라질 수 있으나, 시안화 이온이 존재할 때 형광 강도가 증가한다는 사실은 변함이 없다.

또한, 본 발명에 따른 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 살아있는 세포 내의 시안화 이온을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 살아 있는 세포와 상기 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 실온에서 배양하고, 이를 PBS로 세척하고, 테트라부틸암모늄 시안화물로 처리하여 색변화를 관찰하여 시안화 이온을 검출할 수 있다. 상기와 같이 시안화물로 처리한 세포 배양액에서는 뚜렷한 녹색 형광색이 발광되나, 시안화물로 처리하지 않는 세포 배양액에서는 아무런 색 변화가 일어나지 않는다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 이용한 시안화 이온의 검출방법은 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 시안화 이온과 반응시켜 발생되는 형광 강도 또는 색 변화를 측정하여 정량 및/또는 정성 분석하는데 유용하게 사용될 수 있고, 실온에서 수용액 상태로 검출할 수 있다는 장점을 가진다.

이하, 본 발명을 실시예 및 도면을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드의 시안화 음이온에 대한 선택성 측정

CN ^- , AcO ^- , F ^- , Cl ^- , Br ^- , I ^- , H ₂ PO ₄ ^- , ClO ₄ ^- , NO ₃ ^- , HSO ₄ ^- , CH ₃ COO ^- 와 같은 다양한 음이온들을 아세토니트릴-HEPES(9:1, v/v, 0.01 M pH 7.4 HEPES) 내에서 3 μM 플루오레세인 알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 변화를 측정하여 도 1에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 및 발광 슬릿 폭: 5 nm). 또한 아세토니트릴-HEPES(9:1, v/v, 0.01 M, pH 7.4 HEPES) 내에서 3 μM 플루오레세인 다이알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 변화를 측정하여 도 2에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 및 발광 슬릿 폭: 3 nm). 나아가 아세토니트릴-HEPES(1:2, v/v, 0.01 M, pH 7.4 HEPES) 내에서 3 μM 플루오레세인 다이알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 변화를 측정하여 도 3에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 및 발광 슬릿 폭: 1.5 nm).도 1, 2 및 3에 나타난 바와 같이, 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 음이온들 중 시안화 이온만이 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응하여 큰 폭의 형광 변화를 나타냄을 알 수 있다.

<실시예 2> 시안화 이온의 농도에 따른 형광 강도의 측정

실온에서 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, v/v) 수용액 내에서 다양한 양의 시안화물과 3 μM의 플루오레세인 알데하이드를 반응시켜 발생되는 형광 강도를 형광 화학 정량계를 사용하여 측정하여 도 4에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 & 발광 슬릿: 1.5 nm). 도 4의 (a)는 시안화물을 첨가하지 않고 플루오레세인 알데하이드를 단독으로 첨가한 후 형광 강도를 측정한 것이고, (b) 내지 (j)는 시안화물을 각각 1eq., 2eq., 3eq., 5eq., 10eq., 20eq., 30eq., 50eq., 70eq. 첨가하여 플루오레세인 알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 것이다. 또한 3 μM의 플루오레세인 다이알데하이드를 반응시켜 발생되는 형광 강도를 형광 화학 정량계를 사용하여 측정하여 도 5에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 & 발광 슬릿: 1.5 nm). 도 5의 (a)는 시안화물을 첨가하지 않고 플루오레세인 다이알데하이드를 단독으로 첨가한 후 형광 강도를 측정한 것이고, (b) 내지 (i)는 시안화물을 각각 1eq., 2eq., 5eq., 10eq., 20eq., 50eq., 100eq., 200eq. 첨가하여 플루오레세인 다이알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 것이다. 또한 CH ₃ CN-H ₂ O(1:2, v/v, 0.01 M, pH 7.4)를 사용하여 발생되는 형광 강도를 측정하여 도 6에 나타내었다(여기 파장: 485 nm, 여기 & 발광 슬릿: 1.5 nm). 도 6의 (a)는 시안화물을 첨가하지 않고 플루오레세인 다이알데하이드를 단독으로 첨가한 후 형광 강도를 측정한 것이고, (b) 내지 (l)는 시안화물을 각각 1eq., 2eq., 4eq., 10eq., 20eq., 40eq., 100eq., 200eq., 400eq., 700eq., 1000eq. 첨가하여 플루오레세인 다이알데하이드와 반응시켜 발생되는 형광 강도를 측정한 것이다. 도 4, 5 및 6에 나타난 바와 같이, 형광 강도는 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응하는 시안화 이온의 농도가 증가할수록 증가하는 것을 알 수 있었고, 520 nm 파장 부근에서 포화지점을 나타내었다.

<실시예 3> 시안화 이온의 농도에 따른 색변화 측정

5개의 비이커의 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, v/v) 용액에 대하여 30 μM의 화학식 1의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 각기 다른 농도의 시안화물을 첨가하여 반응시킨 경우 각각의 비이커에서의 색변화를 나타내는 이미지를 캡처하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 비이커 1은 30 μM의 화학식 1의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드만 존재하는 경우, 비이커 2는 1 eq.의 시안화물을 첨가한 경우, 비이커 3은 5 eq.의 시안화물을 첨가한 경우, 비이커 4는 10 eq.의 시안화물을 첨가한 경우, 비이커 5는 50 eq.의 시안화물을 첨가한 경우를 나타낸 것이며, 이로부터 농도가 높은 시안화물이 첨가된 비이커일수록 높은 색의 채도를 나타내는 것을 알 수 있다.

<실시예 4> 용매의 종류에 따른 색 변화 측정 및 형광 측정

150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 100% CH ₃ CN, CH ₃ CN-H ₂ O, CH ₃ CN-HEPES와 같이 서로 다른 용매를 혼합한 용액에 20 eq 시안화 이온을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 나누어 각각의 용액에서 나타나는 색 변화와 형광 변화를 나타내는 이미지를 각각 도 8 및 도 9에 나타내었다. 도 8 및 도 9에서, 1은 100% CH ₃ CN 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드만 첨가한 경우; 2는 100% CH ₃ CN 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 20 eq CN ^- 를 첨가한 경우; 3은 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, V/V) 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드만 첨가한 경우; 4는 CH ₃ CN-H ₂ O(9:1, V/V) 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 20 eq CN ^- 를 첨가한 경우; 5는 CH ₃ CN-HEPES(9:1, V/V, 0.01 M, pH 7.4) 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드만 첨가한 경우; 6은 CH ₃ CN-HEPES(9:1, V/V, 0.01 M, pH 7.4) 내에 150 μM 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 20 eq CN ^- 를 첨가한 경우를 나타낸다.

이로부터 다양한 용매에서도 색 변화와 형광 변화가 뚜렷하게 관찰됨을 알 수 있었다.

<실시예 5> 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 사용한 세균 감염으로 인한 예쁜 꼬마 선충 내 시안화 이온 검출

예쁜 꼬마 선충( C. elegans )은 병원성이 제거된 대장균( Escherichia coli OP50)이 도포된 NGM 고체 배지(NaCl 0.3%, Peptone 0.25%, 5 ㎎/㎖ cholesterol, 1M potassium phosphate buffer, 2.5% agar) 위에서 25 ℃로 배양되었다(S. Brenner, Genetics. 1974, 77, 71). 예쁜 꼬마 선충의 감염을 위해서 선충의 성충은 녹농균( P. aeruginosa PAO1)이 도포된 NGM 고체 배지위로 옮겨져 4시간 배양 후에 NGM 용액(NaCl 0.3%, Peptone 0.25%, 5 ㎎/㎖ cholesterol, 1M potassium phosphate buffer)을 이용하여 감염된 선충을 1.5 ㎖ 실험실용 반응 용기에 포집한다. 이렇게 포집된 선충은 NGM 용액 내에서 100 μM의 화학식 2 또는 화학식 3의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 25 ℃에서 20분 동안 배양한 후, 남아있는 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드를 제거하기 위해 선충을 NGM 용액으로 3회 세척한 후 선충의 형광 이미지 및 DIC 이미지(Differential Interference Contrast Image)를 캡처하여 도 10에 나타내었다. 도 10의 (a)는 녹농균과 반응하지 않고 100μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 선충의 형광 이미지이고, (c)는 이의 DIC 이미지이고, (b)는 녹농균 및 100μM의 플루오레세인 알데하이드 또는 플루오레세인 다이알데하이드와 반응한 선충의 형광 이미지이고, (d)는 이의 DIC 이미지이고, 이미지 상의 막대들은 각각 50 ㎛ 길이를 의미한다.