Das Verfahren ist zum Nachweis von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar. Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter dienen beispielsweise in Kombination mit einem Luftkeimsammelgerät zur Sammlung von Bakterien, Sporen, Viren, Hefen und Pilzen (Mikroorganismen), um deren Konzentration in Räumen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmen zu können. Derartige Überwachungen sind Voraussetzung für die rechtzeitige Einleitung von Maßnahmen, um Personen und Produkte vor Schädigungen durch zu hohe Mikroorganismenkonzentrationen zum Beispiel in der Raumluft zu bewahren.

In bestimmten Räumen mit besonderen Anforderungen an die Beschaffenheit der Luft, wie in klimatisierten Räumen, Reinräumen und Isolatoren, wird die Luft regelmäßig auf ihren Keimgehalt hin untersucht. Da es sich in der Regel um gefilterte Luft handelt, die naturgemäß einen geringen Gehalt an Mikroorganismen aufweist, müssen gewöhnlich große Volumina untersucht werden, um ausreichend Keime für aussagefähige Ergebnisse zu sammeln. Dazu wird eine Luftprobe beispielsweise mittels eines

Luftkeimsammelgerätes, wie es von der Firma Sartorius AG unter der Bezeichnung "MD8 airscan"vertrieben wird, durch ein geeignetes Filter filtriert. Als Filter werden für diesen Zweck sterile Membranfilter mit Porengrößen im Mikrofiltrationsbereich vorwiegend auf der Basis von Gelatine eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE-PS 11 73 640 beschrieben sind.

Besonders geeignet sind Gelatinemembranfilter, auf denen die zurückgehaltenen Mikroorganismen feucht und vermehrungsfähig gehalten werden sollen.

Gelatinemembranen, auf denen die gesammelten Mikroorganismen aufgrund eines Zusatzes osmoprotektiver Substanzen eine besonders hohe Lebensfähigkeit aufweisen, sind in der DE-PS 197 50 215 beschrieben. Nach der Probenahme können die Gelatinemembranfilter entweder auf einem Agarnährboden bebrütet werden, wobei aus den einzelnen gesammelten Keimaggregaten Mikroorganismenkolonien heranwachsen (das Gelatinemembranfilter verflüssigt sich und verschwindet und die Mikroorganismenkolonien können direkt auf dem Agar gezählt werden), oder in einer sterilen Lösung, wie einer Pepton-Wasser-oder einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden, so daß Teilmengen auf verschiedenen Nährmedien bebrütet werden können. Allerdings stehen nach diesen Methoden die Analysenergebnisse erst relativ spät zur Verfügung, weil das Koloniewachstum in der Regel bis zu 7 Tagen in Anspruch nimmt.

Nach einem mit ChemScan bezeichneten schnellen mikrobiologischen Analyseverfahren (Schnelltestsystem fur den Nachweis von Mikroorganismen) stehen die Ergebnisse dagegen bereits nach 30 bis 90 Minuten zur Verfügung, weil bei diesem Verfahren der einzelne Mikroorganismus detektiert wird und die sonst übliche zeitaufwendige Mikroorganismen-Vervielfachung im Brutschrank entfällt. Dazu wird eine wässrige, die lebenden Mikroorganismen enthaltende Probe durch eine 0,22 um oder 0,45 llm Analysenmembran filtriert, um die in der Probe enthaltenden Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten. Die Analysenmembran wird fur 30 Minuten bei 30°C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die mit einer Markierungsflüssigkeit getränkt ist. Die Markierungsflüssigkeit besitzt die Fähigkeit mit dem Zellcytoplasma lebender Mikroorganismen über eine enzymgesteuerte Reaktion unter gelblicher Fluorescenz in Wechselwirkung zu treten. Schließlich kann unter einem Mikroskop, vorzugsweise mit

einem Laser-Scan-System, jeder einzelne Mirkoorganismus auf der Analysenmembran erkannt werden. Man sollte erwarten, daß zur Anwendung dieses schnellen mikrobiologischen Analyseverfahrens fur den Nachweis von Mikroorgansismen in Gasen die Gelatinemembranfilter, auf denen die Mikroorganismen aus der Luft gesammelt wurden, lediglich durch Auflösen der Gelatinemembranfilter in einer wässrigen Lösung, wie zum Beispiel einer Pepton-Wasser-Lösung, in eine Probe zu überfuhren ist und diese Probe wie vorstehend beschrieben zu analysieren ist. Es hat sich aber gezeigt, daß man keine auswertbaren gelblich fluorescierenden Signale auf der Analysenmembran erkennt und die Analysenmembran durchgehend rot gefärbt ist.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen und fur dieses Verfahren geeignete Gelatinemembranfilter zur Sammlung dieser Mikroorganismen aus Gasen vorzuschlagen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mikroorganismen in Gasen gelöst, bei dem a) das Gas zur Sammlung der Mikroorgansimen durch ein von Partikeln mit einem Durchmesser größer 0,45 um, vorzugsweise 0,1 um freies Gelatinemembranfilter geströmt wird, b) der Gelatinemembranfilter mit den gesammelten Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung, die ein mit den Mikroorganismen Fluorescenz hervorrufendes enzymatisches Markierungsmittel enthält, aufgelöst wird, c) die erhaltene Lösung mit den Mikroorganismen durch eine Analysenmembran einer Porengröße im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,45 um filtriert wird und d) die auf der Analysenmembran verbleibenden fluorescierenden Mikroorganismen ausgezählt werden.

Es wurde gefunden, daß Gelatinemembranfilter zur Durchfiihrung des Verfahrens geeignet sind, die frei von Partikeln mit Größen sind, die durch Mikrofiltrationsmembranen mit einem Porendurchmesser von höchstens 0,45 um, vorzugsweise von höchstens 0,2 um zurückgehalten werden. Das heißt, das derartige

Gelatinemembranfilter frei von Mikroorganismen, einschließlich von toten Mikroorganismen sind. Um die Lebensfähigkeit der auf den Gelatinemembranfiltern gesammelten lebenden Mikroorganismen deutlich zu erhöhen, enthalten die Gelatinemembranfilter in einer bevorzugten Ausfiihrungsform osmoprotektive Substanzen, beispielsweise Trimethylammonioacetat (Betain).

Überraschenderweise wurde gefunden, daß es bereits ausreicht, eine von derartiken Partikeln befreite Gelatine als Ausgangsstoff für die Herstellung der Gelatinemembranfilter zu verwenden. Vorteilhafterweise filtriert man dazu eine Lösung handelsüblicher Gelatine durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von bis zu ungefähr 0,45 m, vorzugsweise von bis zu ungefähr 0,2 Rm und besonders vorzugsweise von bis zu 0,1 Rm. Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die bereits formulierte Membranziehlösung unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran der genannten Porengröße zu filtrieren. Damit wird sichergestellt, daß in einem Arbeitsschritt aus jeder Komponente, aus der die Membranziehlösung hergestellt wurde, alle Partikel entfernt werden, die eine Größe besitzen, daß sie von Mikrofiltrationsmembranen der genannten Porengröße zurückgehalten werden. Die Druckfiltration ist deshalb zu bevorzugen, weil dabei im Vergleich zur Vakuumfiltration flüchtige Lösungsmittel nicht abdampfen können und die quantitative Zusammensetzung der Membranziehlösung nicht verändert wird. Als zur Filtration besonders geeignet hat sich eine hydrophile, vernetzte 0,2 m Cellulosehydratmembran erwiesen, die unter dem Namen Hydrosart von der Sartorius AG, Göttingen auf dem Markt vertrieben wird (DE-PS 44 18 831).

Eine nach dem ChemScan@-Verfahren durchgefuhrte Analyse handelsüblicher Gelatine und Gelatinemembranfilter, die daraus direkt ohne den erfindungsgemäßen Filtrationsschritt gefertigt und sterilisiert wurden, zeigte, daß ein Gramm derartiger Produkte zwischen ungefähr 10.000 und mehr als 1.000.000 toter Mikroorganismen enthalten kann. Diese Menge an Mikroorganismen ist offensichtlich daflir verantwortlich, daß Gelatinemembranfilter selbst nach ihrer Sterilisierung in Schnelltestverfahren, bei denen Fluorescenz hervorrufende Markierungsmittel eingesetzt werden, wie in dem ChemScan-Verfahren, nicht verwendet werden können. Die bereits im Rohstoff vorhandenen, insbesondere toten Mikroorganismen verursachen offensichtlich eine

Verfärbung der Analysenmembran und verhindern dadurch das Erkennen der Flurescenz von lebenden Mikroorganismen.

In den erfindungsgemäß hergestellten Gelatinemembranfiltern konnte dagegen eine so weitgehende Reduktion der Mikroorganismen festgestellt werden, daß sie sich zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen und zum Nachweis der gesammelten Mikroorganismen als geeignet erwiesen.

Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter sind insbesondere für schnelle mikrobiologische Analyseverfahren zur direkten Bestimmung einzelner Mikroorganismen, insbesondere lebender Mikroorganismen geeignet, die mit Markierungsmitteln Fluorescenz-Signale zeigen. Dazu wird das Gelatinemembranfilter, auf dem die Mikroorganismen aus Gasen gesammelt wurden, zur Auflösung in eine wässrige Lösung gebracht, durch eine Analysenmembran mit Porengrößen im Bereich von etwa 0,2 bis höchstens 0,45 m filtriert, um die auf dem Gelatinemembranfilter gesammelten Mikroorganismen auf der Analysenmembran zurückzuhalten. Hierbei ist die Verwendung von Mikrosieb-Membranentypen, wie sie beispielsweise in der WO 95/13860 A1 beschrieben werden, insbesondere Kernspurmembranen mit Porengrößen von etwa 0,2 um bevorzugt. Die Verwendung derartiger Analysenmembranen ist deshalb von Vorteil, weil sie sich durch eine enge Porengrößenverteilung und aufgrund des geraden Porenverlaufs quer zur Membranfläche durch eine hohe Filtrationsgeschwindigkeit auszeichnen und weil Mikroorganismen vollständig auf der Oberfläche dieser Membranen zurückbleiben und nicht wie bei herkömmlichen Mikrofiltrationsmembranen in die Porenstruktur eindringen können. Die Analysenmembran wird für 30 Minuten bei 30° C auf eine Absorptionsunterlage aufgelegt, die für Mikroorganismen mit einer Fluorescenz hervorrufernden Markierungsflüssigkeit getränkt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierungsflüssigkeit direkt der zur Auflösung des Gelatinemembranfilters dienenden wässrigen Lösung zugesetzt und nach einer auszutestenden Markierungszeit werden die markierten Mikroorganismen auf der Analysenmembran gesammelt. Schließlich werden unter einem Mikroskop oder vorzugsweise mit einem Laser-Scan-System, die einzelnen auf der Analysenmembran fluorescierenden Mirkoorganismus quantitativ erfaßt.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter wird im Einzelnen wie folgt durchgeführt. Es wird zunächst eine wässrige homogene Membranziehlösung mindestens bestehend aus Gelatine mit einem Anteil von 4,5 bis 5,6 % an der gesamten Membranziehlösung, aus Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46 % an der gesamten Membranziehlösung und wahlweise aus einem Bindemittel mit einem Gehalt von 0,02 bis 0,1 % an der gesamten Membranziehlösung hergestellt. Als Bindemittel kann beispielsweise Polyvinylalkohol eingesetzt werden. Die Membranziehlösung wird unter Druck durch eine Mikrofiltrationsmembran mit einer Porengröße von maximal 0,45 u, vorzugsweise bis 0,2 um filtriert. Dann wird ein dünner Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet, und der dünne Film wird zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt. Die gelierte Phase wird sodann zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht, welches aus Methylacetat besteht.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Membranziehlösung zusätzlich wenigstens eine osmoprotektive Substanz mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75 % bezogen auf den Gehalt an Gelatine. Als osmoprotektive Substanz kann beispielsweise Trimethylammonioacetat verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes Verfestigungsbad Methylacetat mit einem Alkohol, insbesondere Methanol, mit einem Anteil von 10 bis 20 % am gesamten ersten Verfestigungsbad verwendet. Die Membran verbleibt in diesem ersten Verfestigungsbad über eine Zeitdauer von ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur bevor sie in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat überführt wird. Trocknung und Sterilisierung, vorzugsweise mit Gammastrahlen, schließen sich an.

Die Erfindung wird anhand des nachstehenden Ausführungsbeispiels erläutert.

Beispiel Zur Herstellung eines Gelatinemembranfilters werden 200 g handelsübliches Gelatinepulver und 2 g Polyvinylalkohol als Bindemittel (Mowiol Typ 18-88, Hoechst AG) unter einstündigem Rühren bei 60° C in 2000 g Wasser gelöst und anschließend mit

1645 g Ethanol und 0,02 g Trimethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz gelöst in 10 g Wasser versetzt. Diese Membranziehlösung wird im Dead-End-Modus bei einer Druckdifferenz von 3 bar und einer Temperatur von etwa 40° C durch eine vernetzte Cellulosehydrat-Membran mit einer Porengröße von 0,2 um filtriert. Die filtrierte und auf 21° C temperierte Membranziehlösung wird zu einem Film der Stärke 350 um auf eine Unterlage ausgebreitet und Luft mit einer relativen Feuchte von etwa 45 % bei Raumtemperatur ungefähr 5 Minuten ausgesetzt. Der gelierte Film wird zusammen mit der Unterlage in ein erstes Verfestigungsbad, daß aus Methylacetat mit einem Anteil von 14 % Methanol besteht, fur die Dauer von 3 Stunden und danach in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat für die Dauer von 3 Stunden eingebracht. Der Gelatinemembranfilter wird von der Unterlage abgezogen, getrocknet und mit Gamma- Strahlen sterilisiert.

Der so erhaltene Gelatinemembranfilter weist einen Luftdurchfluß von 140 l/min cm2 bar auf.

Ein nach diesem Beispiel hergestellter Gelatinemembranfilter, der 150 mg Gelatine enthält, wurde in 50 ml Peptone-Wasser gelöst und mit 100 tl Delvolase Enzym und Fluoreszenzfarbstoffversetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei 37° C wurde die Lösung über eine 0,4 um Analysenmembran aus Cellulosenitrat filtriert und die Analysenmembran unter dem Mikroskop ausgewertet. Es konnten keine Mikroorganismen gefunden werden.

In einem Vergleichsversuch, der analog dem vorstehenden Beispiel durchgeführt wurde, allerdings mit dem Unterschied, daß auf die Filtration der Membranziehlösung verzichtet wurde, zeigte nach Behandlung mit dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Enzym eine durchgehend rot gefärbte Analysenmembran, was auf die Anwesenheit einer Vielzahl toter Mikroorganismen hindeutet.

Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter zur Luftkeimsammlung stellen zusammen mit einem Schnelltestsystem zum Nachweis von Mikroorganismen, wie dem ChemScan-System eine extrem genaue Nachweismethode für sehr niedrige Keimzahlen dar, wodurch sie sich besonders für Qualitätskontrollfragen in der pharmazeutischen Industrie und Biotechnologie eignen. Durch Erhalt der mikrobiologischen

Analysenresultate in wenigen Minuten wird eine Just-in-time Produktion unterstützt. Es treten praktisch keine Wartezeiten bei der Freigabe von Produktionräumen auf, da mikrobiologische Verunreinigungen in sehr kurzer Zeit nachweisbar sind und nicht mehr wie bei herkömmlichen Methoden bis zu einer Woche Inkubationszeiten benötigt werden, um zum mikrobiologischen Befund zu gelangen. Dadurch wird die Produktionssicherheit entscheidend erhöht.