La présente invention concerne une méthode optimisée pour la détection de la protéine prion PrPsc par Western-blot, ainsi que son application, notamment pour l'évaluation et/ou le contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou pour l'évaluation et/ou le contrôle in vitro d'une procédure de décontamination et/ou pour l'évaluation ou le screening de composés susceptibles d'être dotés d'une activité modulatrice de l'infectiosité à prion.

Etat de la technique :

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central

(SNC). La forme la plus fréquente chez l'homme est la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ), mais il existe également des EST chez de nombreux mammifères (notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine). L'agent étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). La signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans le système nerveux central. Cette forme anormale pathologique de la PrP, appelée PrPsc, est co-purifiée avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histologiques. Elle résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (Prusiner,

Biochemistry 1992 ; 31 : 12277-88 ).

Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans les dérivés sanguins (Brown et al, 2001, Semin Hematol.;38(4 Suppl 9):2-6).

Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation cliniquement silencieuse caractéristique de ces maladies, qui précède l'apparition des signes cliniques.

En outre, l'exceptionnelle résistance des ATNC empêche le recours à des procédés d'inactivation classiquement mis en œuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween- TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von

Willebrand, etc.). Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits biologiques, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, doit incorporer des étapes d'élimination/inactivation virales en vue d'un usage thérapeutique, l'industrie pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer le risque théorique de transmission du variant de la MCJ par les produits dérivés du sang.

Actuellement, la méthode de titrage de l'infectiosité liée aux ATNC classiquement mise en œuvre utilise une méthode de titrage in vivo chez l'animal, tel que le hamster doré, par injection intracérébrale de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en ATNC. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux et établir le facteur de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence non traitée. Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue (environ un an), coûteuse et peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle dont on veut connaître rapidement l'efficacité vis-à-vis de l'élimination du prion.

En outre, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de l'agent infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Toutes les procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST passent aujourd'hui par une purification de la PrPsc.

D'autres méthodes ont été proposées pour le titrage in vitro des agents infectieux des EST.

Les techniques de détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Médecine 2001 ; 11 , 3-14) ou par ELISA nécessitent généralement une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP).

Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7).

Le brevet US 6,150,583 décrit quant à lui la production d'animaux transgéniques exprimant une PrP marquée par un épitope hétérologue exposé ou non à la surface de la protéine prion, selon la conformation de cette dernière.

Le procédé appelé « PMCA » (Protein misfolding cyclic amplification), décrit dans le document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3) prévoit la mise en contact de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal contaminé avec une forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette dernière en une forme pathologique. La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi sensible que le bioessai. Néanmoins elle ne fournit aucune preuve sur l'infectiosité de la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices plasmatiques. En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine et des résultats faussement positifs.

Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée « TCIA » ("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au moyen de la mise en contact de cellules transgéniques supportant la réplication dudit ATNC avec le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs passages pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par réplication de l'ATNC.

Résumé de l'invention :

L'invention fournit maintenant une optimisation de la détection de la PrPsc par Western-blot et par voie de conséquence de la quantification de la PrPsc dans un échantillon par Western- blot.

Les inventeurs ont en effet mis en évidence qu'il est possible de concentrer la PrPsc dans un échantillon, avant et après l'étape de digestion par la protéinase K.

Plus généralement, l'invention concerne une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant une étape de concentration de l'échantillon avant et après digestion par une protéase.

Ainsi un objet de l'invention est une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant les étapes consistant à: i) concentrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité présent(e) dans l'échantillon, ii) soumettre l'échantillon concentré à une digestion par une protéase, de préférence la protéinase K. iii) concentrer le digestat obtenu à l'étape (ii), iv) détecter et/ou titrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité dans le digestat concentré obtenu à l'étape (iii).

De préférence la protéine de conformation pathologique, marqueur de l'ATNC, est la protéine prion PrPsc.

De manière avantageuse, l'étape de concentration (i) est réalisée par centrifugation, de préférence par ultracentrifugation. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de concentration (i) comprend une ultracentrifugation de 100 000 g à 140 000g, de préférence à 140 000 g, pendant 1 heure. De manière avantageuse, l'étape de concentration (iii) est réalisée par centrifugation. De préférence, l'étape (iv) est réalisée par immunochimie, plus particulièrement par un Western-Blot.

La méthode peut comprendre de préférence une étape intermédiaire de dilution après l'étape (iii) de concentration du digestat, et avant l'étape (iv) de détection ou titrage.

L'échantillon est choisi de préférence dans le groupe constitué par les produits sanguins et leurs dérivés, les aliments, et les produits cosmétiques.

Selon un mode de réalisation particulier, la concentration de la PrPsc avant l'étape de digestion est obtenue par ultracentrifugation de l'échantillon à titrer à de préférence à 140.000 xg pendant 1 heure à température ambiante, avec un volume d'échantillon d'environ 8.3ml introduit dans un tube préalablement traité pendant lheure à l'albumine sérique bovine à 0.1% et avec un rotor à angle libre (swinging rotor). Au terme de cette ultracentrifugation, le culot sédimenté est repris de préférence dans un volume d'eau ou autre tampon de préférence entre 20 et 60μl.

La suspension de culot est incubée en présence de protéinase K et aux conditions optimales pour la digestion. Au terme de l'étape de digestion, la concentration de la PrPsc est obtenue par nouvelle centrifugation, de préférence à 18 000 x g pendant 30 minutes du produit de la digestion.

L'invention vise également une méthode in vitro de détection et/ou titrage de l'immuno- réactivité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique, dans un échantillon.

Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues. L'invention vise également une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.

Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation d'un composé susceptible d'affecter l'immunoréactivité d'un produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.

Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) qui est une protéine de conformation pathologique , par la méthode telle que définie ci-dessus.

Description détaillée de l'invention :

Définitions

Une « protéine prion PrP » est généralement une sialoglycoprotéine ancrée à la membrane plasmique par un phosphatidyl glycolipide (GPI), présente à l'état naturel dans les cellules et impliquée dans leur fonctionnement normal. La forme normale de la protéine, c'est-à-dire non pathologique, est généralement appelée PrPc. Elle est impliquée dans le développement du système nerveux chez l'embryon. Chez l'adulte, elle est exprimée essentiellement dans le cerveau et la moelle épinière (neurones et glie). Elle est impliquée dans les processus de différenciation et d'adhésion des cellules. Elle aurait aussi un rôle protecteur antioxydant et vis-à-vis de la mort cellulaire programmée (apoptose). Cette protéine aurait également un rôle dans le repliement d'autres protéines. La forme « pathologique », PrPsc, de la PrP désigne généralement un isoforme de la protéine non pathologique. Elle représente le marqueur des maladies à prions. Cette structure tridimensionnelle modifiée confère des propriétés physico-chimiques atypiques à la protéine prion, qui se traduisent par une plus grande résistance aux moyens de désinfection et de stérilisation habituels (chaleur, produits chimiques, enzymes, etc). La protéine prion pathologique acquiert ainsi des capacités d'auto-agrégation et peut ainsi former des dépôts, notamment dans le cerveau, provoquant la mort neuronale. L'agent responsable de la réplication ou propagation de la protéine prion pathologique serait la protéine prion pathologique elle-même car capable de se « propager ou multiplier » de façon « exponentielle », en déformant les protéines prion saines en protéines prion pathologique. La forme dite « pathologique » de la PrP, est donc la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à l'apparition d'une EST chez l'animal humain ou non-humain infecté.

Le «titre», exprimé en unité Western-blot, est une grandeur arbitraire déterminée par la dilution limite de l'échantillon à partir de laquelle plus aucune immunoréactivité n'est observée par western-blot.

Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent transmissible non conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux responsables chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine, l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST expérimentalement adaptées à l'animal de laboratoire. Dans le contexte de l'invention, l'ATNC est également désigné par le terme «agent infectieux ».

Par « échantillon», on désigne toute source de matière susceptible d'être contaminée par un

ATNC. Une telle source de matière peut par exemple être un liquide, un produit alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie génétique, une molécule susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant pas limitative. De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide biologique ou un tissu ou extrait de tissu. Un tel tissu peut être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette liste n'étant pas limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une source humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits cellulaires, comme les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée par un ATNC. Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe, l'urine ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, l'échantillon est un produit sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de protéine plasmatique.

Concentration des protéines :

La concentration de la protéine PrPsc peut être réalisée par une première étape d'ultracentrifugation de préférence à 140.000xg pendant 1 heure à température ambiante. De manière avantageuse elle est obtenue en utilisant un tube préalablement traité à l'albumine sérique bovine à 0.1% pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à température de +4°C. Ce traitement consiste à neutraliser les forces électrostatiques du matériau (polymère) du tube susceptibles de fixer sur les parois du tube, la PrPsc présente dans l'échantillon à analyser. Ce traitement est obtenu en remplissant le tube d'ultracentrifugation avec la solution de BSA et en le laissant incuber comme décrit ci-dessus.

Au terme de l'ultracentrifugation, le surnageant est évacué et le culot repris par un volume de préférence de 50μl d'eau ou de tout autre tampon.

Elimination de la protéine prion non pathologique (forme PrPc):

L'élimination de la forme non pathologique (PrPc) dans l'échantillon peut être réalisée sur la base de propriétés biochimiques de la PrPsc qui permettent de la distinguer des protéines non pathologiques, en particulier le fait que la PrPsc est relativement plus résistante aux traitements à base de protéases et est moins soluble voire insoluble même en présence de détergents. Ainsi, on utilise par exemple un traitement par protéase, par exemple la protéinase K, pour éliminer les formes sensibles (PrPc) des formes moins sensibles à la digestion (PrPsc). Dans un mode de réalisation particulier, on conduit une digestion à la protéinase K qui conduit à la digestion principalement la PrPc et pas ou peu de la PrPsc. C'est en effet une propriété de la PrPsc que d'être davantage résistante à la PK comparativement à la PrPc. L'étape de détection ultérieure ne détecte donc plus la forme non pathologique de la protéine car celle-ci a été digérée par la protéase.

Concentration de la forme PrPsc digérée :

La protéine Prion pathologique dite « résistante » au traitement par la protéinase, peut être concentrée par centrifugation de préférence à 18.000 xg pendant 30 minutes à température ambiante. Au terme de l'étape de centrifugation de l'échantillon digéré par la protéinase K, le surnageant est évacué et le culot repris dans un volume de tampon de charge correspondant au volume maximum d'un puits de peigne pour le dépôt sur gel d'électrophorèse (typiquement 10 à 15μl) ou 25 μl si une gamme de dilution en tampon de charge et de préférence au pas de 3 est prévue.

La nature du tampon de charge est déterminée par la méthode de détection de la PrPsc utilisée par la suite (voir paragraphe suivant). Ainsi pour une détection de la PrPsc par Western-blot le tampon de charge est préférentiellement du tampon de Laemmli (typiquement : Tris-HCl 0.15M pH = 6,8, SDS 2 à 10%, DTT 0.06M, bleu de bromophénol à 0.3%, glycérol 11.5%).

Détection des protéines de I 'ATNC :

L'étape de détection de la PrPsc dans l'échantillon digéré et concentré comme décrit précédemment peut être effectuée à l'aide des méthodes suivantes : immunochimiques comme le Western-blot ou l'ELISA, l'immunoblot, ou le test de radioactivité, la microscopie électronique, le test de turbidimétrie pour détecter les agrégats, ainsi que des tests structurels incluant la RMN (résonance magnétique nucléaire), le dichroïsme circulaire, la spectroscopie de Raman, l'absorption UV, cette liste n'étant pas limitative.

Titrage des A TNC : La détection de la forme pathologique de la PrP peut être associée à une détermination de la quantité de PrPsc présent dans l'échantillon.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la suspension d'échantillon digéré et concentré est diluée dans du tampon de charge selon une progression géométrique dit aussi pas de dilution. Ce dernier est de préférence de 3. Chaque point de dilution est alors soumis à un test de détection des protéines de l'ATNC comme décrit ci-dessus.

De manière arbitraire, l'unité Western-blot de PrPsc se définit comme l'inverse de la première dilution négative ne présentant pas de signal spécifique de la PrPsc (signal d'extinction de la PrPsc) dans le volume d'échantillon non dilué et utilisé pour le test de détection.

La méthode de l'invention permet de quantifier l'immunoréactivité liée aux ATNC sur une gamme théoriquement infinie. Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode a permis de quantifier l'immunoréactivité liée à la souche de scrapie sur une gamme d'environ 7,5 logio, c'est-à-dire d'environ 31.000.000 unités western-blot. Ceci peut, par exemple, permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC.

Applications de la méthode de détection ou titrage de l'immuno-réactivité liée aux ATNC :

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on applique au produit biologique, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'invention, telle que décrite précédemment, et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction de l'ATNC.

En particulier, la méthode de titrage selon l'invention a la capacité d'être aisément applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits biologiques, en particulier de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguins, utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration. Ainsi, la mise en œuvre de la méthode de l'invention permet d'évaluer et/ou de contrôler l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de traitement, voire de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par un ATNC, dans l'élimination de cet ATNC, grâce à un titrage utilisant la méthode de titrage selon l'invention. On mesure les quantités d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on veut apprécier l'efficacité à l'égard de l'ATNC. Par comparaison des deux mesures, on détermine le degré d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en œuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la procédure de décontamination sont comparées pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromato graphie, ou encore être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé permettant de réduire le titre du matériel infectieux. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact de l'échantillon avec le composé à tester sont comparées. L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC, en présence puis en absence du composé à évaluer, au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. Les modalités de la mise en présence du composé sont déterminées selon que l'action du composé prévient l'initiation d'un cycle infectieux ou bloque un cycle infectieux déjà initié. Dans tous les cas, on détermine le titre du produit biologique avec et sans traitement avec le produit à tester. Les deux mesures de titre effectuées sont comparées pour évaluer l'activité modulatrice de l'infectiosité d'un ATNC du composé.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'identification d'un composé permettant de moduler la transformation de la forme non-pathologique en la forme pathologique de l'ATNC, par exemple la transformation de PrP en PrP ^sc . Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on applique la méthode de titrage de l'invention afin de déterminer à nouveau le titre du produit biologique. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact avec le composé sont comparées pour évaluer l'efficacité du composé à tester.

La méthode de l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui ne limite pas la portée de l'invention.

EXEMPLES :

Matériels et Méthodes

Stock de broyats de cerveaux de hamster infectés

Le lot LN-6246 était constitué de fraction microsomale à 10% en PBS préparée à partir d'un cerveau de hamster infecté par la souche 263K. 3 Aliquotes dénommées LN-6246-1, LN- 6246-2 et LN-6246-3 étaient constitués à partir du lot LN-6246. Les lots LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C provenaient d'une dilution de l'échantillon LN-6246. Cette dilution était réalisée en diluant 10 fois un aliquote de LN-6246 dans du PBS. Les caractéristiques des stocks de broyats de cerveaux de hamsters infectés par la souche 263K utilisés lors de l'étude sont résumées dans le tableau I ci-dessous.

Tableau I : Caractéristiques des stocks d'homogénats de cerveaux infectés par la souche 263K

Dosage de la PrPsc des échantillons LN-6246 par Western-blot « Standard »

(I) Etape de digestion à la Protéinase K :

20μl de chacun des échantillons (LN-6246-1 , LN-6246-2 et LN-6246-3) étaient mis en présence d'un mix constitué de 2μl de tampon de digestion et 2μl d'enzyme protéinase K. La suspension obtenue était incubée à 48 ⁰ C pendant 40 minutes.

Au terme de cette incubation étaient apportés pour chaque échantillon successivement 2μl d'un tampon bloquant pour stopper l'action de la protéinase K puis 20μl de tampon de charge

(Tampon de Laemmli). Le volume réactionnel total, appelé « digestat » était alors de : 46μl.

(II) Etape de la Gamme de dilution : Pour chaque échantillon, une gamme de dilution au pas de 3 dans du tampon de charge était préparée par dilution en cascade avec au départ lOμl de digestat additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu était dit dilué au l/3 ^eme . Cette dilution était reproduite avec le digestat dilué au l/3 ^eme additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu correspondait alors à la dilution l/9 ^eme . Cette opération de dilution était reproduite en cascade jusqu'à la dilution du digestat au l/177181 ^eme .

(III) Etape du Western-blot :

Pour chacun des points de gamme de dilution de chacun des digestats obtenus, une étape de dénaturation à 96°C pendant 5 minutes était réalisée. Les échantillons dénaturés étaient alors déposés à raison de lOμl sur un gel d'électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Dans les lOμl de digestat non dilué déposé sur la piste du gel, il y avait l'équivalent de :

(20μl / 46μl ) x lOμl = 4,35μl de l'échantillon. Ce volume était appelé « Volume Equivalent initial » (VEq)

Les protéines ayant migrées dans le gel étaient transférées sur une membrane PVDF par électro-transfert. La PrPsc présente sur les membranes était détectée par incubation avec l'anticorps 3F4 puis un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (anticorps de chèvre « anti-anticorps de souris »).

Les membranes marquées étaient révélées par chemi-luminescence. Un échantillon était considéré comme positif si le profil électrophorétique avec les trois formes de PrPsc glycosylée était visible sur les autoradiogrammes. Néanmoins en cas de charges très faibles, seule la bande majoritaire correspondant à la forme diglycosylée d'un poids moléculaire d'environ 29kDa était observée.

Le titre des échantillons LN-6246-1, LN-6246-2 et LN-6246-3 était calculé comme suit : T = (1/DL) x (1000/VEq) Avec :

DL : la dilution limite, c'est-à-dire la première dilution ne présentant plus de signal spécifique de la PrPsc sur l' autoradiogramme.

VEq : Le Volume Equivalent initial, soit 4,35μl Dosage de la PrPsc des échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C par Western- blot « optimisé » selon l'invention :

3 tubes pour ultracentrifugation (Beckman ref : 361623 ) étaient remplis d'une solution de d'albumine bovine sérique à 0.1% et incubés à +4°C pendant une nuit (environ 16heures). Au terme de l'incubation, ces tubes étaient vidés et remplis par 8,3 ml de l'échantillon LN-6246- A, LN-6246-B et LN-6246-C. Ces 3 tubes étaient ultracentrifugés avec un rotor libre (swinging rotor Beckman ref SW41) à 140.000 xg pendant 1 heure à température ambiante. Au terme de l 'ultracentrifugation le surnageant était évacué et les culots étaient repris individuellement dans 50μl d'eau. Les suspensions étaient dénommées respectivement LN- 6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C pour les culots repris des tubes respectivement LN-6246- A, -B et -C. Le facteur de concentration maximum théorique était donc de 8300 / 50 soit 166 fois.

50μl de chacune des suspensions LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C étaient mises en présence d'un mix constitué de 5μl de tampon de digestion et 5μl d'enzyme protéinase K. La suspension obtenue était incubée à 48°C pendant 40 min. Au terme de cette incubation était apporté successivement 5μl d'un tampon bloquant pour stopper l'action de la protéinase K. Le volume final du « digestat » était alors de : 65 μl.

Pour chacun des digestats obtenus une concentration était réalisée par centrifugation à 18.000 xg pendant 30 minutes à température ambiante. Au terme de la centrifugation le surnageant était retiré et le culot repris dans 25μl de tampon de charge (tampon de Laemmli).

Une gamme de dilution au pas de 3 dans du tampon de charge était préparée par dilution en cascade avec au départ lOμl de digestat additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu était dit dilué au l/3 ^ème .

Cette dilution était reproduite avec le digestat dilué au l/3 ^eme additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu correspondait alors à la dilution l/9 ^eme . Cette opération de dilution était reproduite en cascade jusqu'à la dilution du digestat au l/729 ^eme . Pour chacun des points de gamme de dilution du digestat obtenus, une étape de dénaturation à

96°C pendant 5 minutes était réalisée. Les échantillons dénaturés étaient alors déposés à raison de 15μl sur un gel d'électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes

(SDS-PAGE).

Dans ces conditions opératoire, le volume Equivalent initial était de :

(8300/50) x (50μl / 65μl ) x ( 65μl / 25μl) x 15μl = 4980 μl pour chacun des échantillons LN-

6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C.

Comparativement à la méthode de titrage par Western-blot « standard », la méthode optimisée permettait d'augmenter le volume Equivalent initial de : 4980/4,32 soit d'un rapport de 1152 fois, soit 3,061ogio.

Les protéines étaient séparées par électrophorèse et analysées comme décrit précédemment à l'étape III.

Résultats

Les résultats des titrages des échantillons sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous.

Légende : NT : Non testé, ND : Non détectable, NA : Non Applicable, LoD : Limite de détection.

Ces données montraient que le titre de l'échantillon LN-6246-1, LN-6246-2 et LN-6246-3 pouvait être déterminé avec la méthode standard, ce titre était respectivement de : 7,61, 7,13 et 7,131ogio uWB/ml. Le titre moyen était de 7,29 logio uWB/ml. Le titre des échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C ne pouvait pas être déterminé avec la méthode standard. Leur titre était inférieur à la limite de détection de cette méthode (Limite de détection théorique de 2.8 log ₁₀ uWB/ml).

Par contre, avec la méthode optimisée, le titre de ces échantillons pouvait être déterminé. Il était de 1 ,21 , 0,73 et 1 ,21 logio uWB/ml dans les échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN- 6246-C respectivement. Le titre moyen de ces échantillons était 1 ,05 logio uWB/ml. L'absence de détection de la PrPsc dans les échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246- C avec la méthode standard était confirmée par le titre de ces échantillons qui était inférieure à la limite de détection de la méthode standard. Ce niveau de titre ne pouvait être déterminé qu'avec la méthode optimisée selon l'invention.

Conclusions

La méthode de dosage par Western-blot optimisé, selon l'invention, permet d'abaisser signifîcativement la limite de détection de la méthode Western-blot. Les étapes de concentration de la PrPsc mises en œuvre dans la méthode optimisée induisent en effet un volume équivalent initial très supérieur à celui mesuré avec la méthode standard.