本发明属于生物技术领域， 更具体涉及一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白 表达系统 用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的快速检测 方法。 可用于临床结核分枝杆菌吡嗪酰胺 耐药性的快速检测。 技术背景

结核病是对人类威胁最大的传染病之一， 尽管牛型结核分枝杆菌疫苗 (BCG)和各种 抗结核药物在全球范围内得到了广泛应用，但 近年来， 随着人口流动及人口密度的增高， 结核杆菌多重耐药菌株及同人体免疫缺陷病毒 (HIV)双重感染的出现，结核病已在发达国 家和发展中国家呈再度肆虐态势。 据报道， 2005年全球大约有 880万新发结核病人，每 年约有 160万人死于结核病。 由于结核病的历史悠久， 结核病的耐药状况十分严重， 多 重耐药和超级耐药株的出现， 已成为结核病治疗中的一个难题。结核杆菌的 耐药性检测， 对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有 非常重要的作用。 由于结核分枝杆菌的生 长十分缓慢， 传统的药敏试验需要长达 1〜2个月时间， 不能及时指导临床用药， 可能使 感染耐药结核的病人在该期间得不到正确的治 疗。 因此， 快速， 灵敏， 特异检测结核杆 菌耐药性的方法对结核病的早期诊断、 有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。

在目前使用的用于治疗结核病的临床药物中， 吡嗪酰胺是一线抗结核药物之一。 目 前临床上检测吡嗪酰胺的耐药性方法主要可以 分为表型检测 （细菌培养） 和基因检测两 类， 并以前者为主。 由于结核菌生长缓慢， 不仅需要长达 1〜2个月时间， 而且对吡嗪酰 胺的耐药性检测需要在酸性培养基中进行， 对培养基的 pH值控制要求高， 往往导致即 使是同一实验室不同时间测定的结果也不一致 。 而基因检测的方法主要是测定与吡嗪酰 胺耐药性产生密切相关的吡嗪酰胺酶基因 （/ ) 的位点突变。 已报道的方法有基因芯 片、 基因测序列等方法。 所有基因检测方法只能根据已经报道的与耐药 性产生有相关性 的突变位点来判断是否耐药。 但是由于 基因的很多位点突变， 都会导致吡嗪酰胺 耐药性的产生， 而且新的突变位点也在不断报道， 因此， 各种基因检测的结果容易产生 假阴性， 只能作为参考， 还需要传统药敏实验进行验证。 一系列的研究表明， 吡嗪酰胺 耐药性产生与结核 p _nC A基因表达的吡嗪酰胺酶的活性丧失有 90%以上的相关性， 因此 也有人报道通过直接测定结核分枝杆菌的吡嗪 酰胺酶活性来测定结核杆菌的吡嗪酰胺耐 药性。 但由于结核杆菌中吡嗪酰胺酶的含量少， 该方法同样需要对结核杆菌进行培养放 大后才能进行， 需要的时间与传统的药敏时间差不多。 基于以上的原因， 目前国际上还 没有标准的测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性 的方法。

体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源 DNA为模板，利用细胞抽提物中的蛋白合 成机器、 蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基 酸、 T7聚合酶和能量物质等来实 现蛋白质体外快速表达的系统。 经常使用的有兔网织红血球 （rabbit reticulocyte )、 小麦 胚芽 （wheat germ)、 大肠杆菌 (E. O^)的细胞裂解液。 使用兔网织红血球表达系统， 日本 科学家于 2001年报道过一种测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺� �药性的方法。由于兔网织红血 球表达系统中， 溶液为深红色， 与吡嗪酰胺酶活性测定的反应产物颜色接近， 需要对溶 液进行脱色处理， 增加了检测时间和成本， 脱色不完全也会带来新的误差。 该报道中， 也采用了小麦胚芽表达系统， 但效果不明显， 检测灵敏度度比兔网织红血球差很多倍。 此外， 该报道中采用的 PCR引物， 由于部分与 / 基因序列重合， PCR引物覆盖了部 分的 / 基因突变位点， 导致需要采用至少两对引物， 才能对一个结核分枝杆菌吡嗪 酰胺耐药性进行完全检测， 增加了检测的复杂性和成本。 发明内容

本发明的目的是在于提供了一种基于小麦胚芽 无细胞体外蛋白表达系统用于结核分 枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂的快速检测方法 （PCR引物设计方法和引物序列）， 本发明 能快速 （ 24 小时）， 灵敏， 特异检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性， 具有操作简便， 成本低， 无需细菌培养等特点。其主要技术特征在于使 用一对引物就能测定结核分枝杆 菌因 pncA基因突变导致的耐药性。

一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法， 其步骤是：

A、 裂解结核分枝杆菌用于 PCR反应的模板； 裂解结核分枝杆菌的方法包括加热煮 沸法、 超声破碎法、 压力法等， 主要目的在于将结核分枝杆菌的菌壁破碎， 释放结核分 枝杆菌基因组.

B、 设计 PCR引物， 扩增全长的吡嗪酰胺酶 （/ c^U基因； 其特征之一在于 PCR 引物序列根据结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺 酶基因的上下游序列来设计， 引物序列不 与吡嗪酰胺酶基因序列重叠， 能完整反应全长 / 基因。 其特征之二在于 PCR引物序 列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的 启动子， 或者同时带有启动子和增强表达 子。

C、 浓縮扩增的 / 基因片段并定量； 浓縮方法包括乙醇沉淀法、 吸附提取法等； 定量方法包括紫外吸收法、 荧光定量法等。 主要目的在于控制用于表达吡嗪酰胺酶的基 因模板量。

D、 采用小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶 ； 表达时间可以根据需要调节， 一般 1-24小时。

F、 测定表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸 的活性， 并与同样表达的结核分 枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性 比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。 测定吡嗪酰胺酶活性的方法一般采用硫酸亚铁 胺法， 通过吡嗪酸能与亚铁离子反应生成 棕红色物质显色。 也可以采用其它如分光光度计、 高效液相色谱法等来测定吡嗪酰胺酶 转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性。

所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为 T7启动子， 增强表达子为 5'端非编码 区增强子和 /或 3'端非编码区增强子。

本发明所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全 长 pncA基因又适合小麦胚芽无细胞 表达系统表达吡嗪酰胺酶的含 T7启动子的引物对序列。 引物对 P1 : 上游引物序列 5*-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3*(SEQ NO.1)， 下游 引物序列： 5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'(SEQ N0.2)。 所述的即能从结核杆菌 基因组上扩增全长 pncA基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表� �吡嗪酰胺酶的含 T7 启动子和 5'端非编码区增强子的引物对序列： 引物对 P2: 列举三套包含不同 5'端非编码 区增强子的上游引物序列：

N0.3); 或 Q NO.5);

下游引物序列： 5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'(SEQ N0.6)。

通过采用本发明提供的以上方法和 PCR引物， 就可以在 24小时内实现对结核杆菌 吡嗪酰胺耐药性检测。

本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果：

与传统的表型检测相比， 本发明耗时短， 仅一天就可以得出检测结果； 与基因检测相比， 本发明可同时检测多位点突变或者潜在的耐药 位点突变， 步骤简单， 成本低， 不会出现 假阴性结果，具有很高的灵敏度和特异性。 与现有报道的无细胞表达方法比较， 本发明具 有以下优点： 1. 只使用一对引物就可对结核杆菌吡嗪酰胺酶全 基因检测。本发明在设计 PCR扩增结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物时， 选择了在吡嗪酰胺酶基因上下游的结核杆菌 基因组上的临近序列。 这样， 引物序列不会与吡嗪酰胺酶基因序列重复， 扩增产物能够 包括全长的吡嗪酰胺酶基因， 对吡嗪酰胺酶基因中任何位点的突变都能进行 检测。 如图 2所示。 2. 操作简单， 无需构建质粒载体。 由于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统一般 需要将要表达蛋白的基因构建到一个质粒载体 上， 如: pIVEX1.3 WG 和 pIVEX1.4 WG. 该步骤比较复杂， 不适合快速检测。本发明通过在吡嗪酰胺酶基 因 PCR引物上加上启动 子， 如 T7启动子， 使得小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统能对 PCR扩增的蛋白基因进 行表达， 不需要构建到质粒载体上。 如图 3所示。 3. 本发明可以进一步在启动子， 如 T7启动子后， 引入合适的提高蛋白合成效率的序列， 例如 5'非编码区的增强子。 也可以 在下游引物序列中引入提高蛋白合成效率的序 列， 如 3'非编码区的增强子， 来达到在 短时间内， 更多表达蛋白的目的， 从而縮短蛋白表达时间， 实现快速检测。 如图 4 (A) (B) (C) 所示。 附图说明

图 1为一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方� �示意图

图 2为一种吡嗪酰胺酶基因上下游序列与 PCR引物设计示意图

图 3为一种 PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子 示意图

图 4为 PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子 和增强子示意图。 A、 含有 启动子和 5'非编码区增强子的引物示意图。 B、含有启动子和 3'非编码区增强子的引物 示意图。 C同时含有启动子， 5'非编码区增强子和 3'非编码区增强子的引物示意图。 图 5 为采用只带启动子的 PCR引物扩增结核基因组上吡嗪酰胺酶基因的基 因扩增 电泳图 （A) 和小麦胚芽无细胞体外表达系统表达后检测效 果图 （B)。 上游引物序列： 5*-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3*, 下游弓 |物序列： 5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'。 吡嗪酰胺酶活性检测采用硫酸亚铁胺显色法。

图 6 为采用带启动子和 5'非编码区增强子的 PCR引物扩增结核基因组上吡嗪酰胺 酶基因的基因扩增电泳图（A)和小麦胚芽无细� ��体外表达系统表达后检测效果图 （B)。 上游引物序列：

5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'。 吡嗪酰胺酶活性检测采用硫酸亚铁胺显色法。 具体实施方式

一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用 于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂 的快速检测方法， 下面结合图 1对本发明作进一步详细描述。

实施例 1 :

采用含 T7启动子 PCR扩增全长结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物 -小麦胚芽无细胞体外蛋白 表达测定结核吡嗪酰胺敏感株（H37RA)和吡嗪酰 胺耐药株（BCG)的吡嗪酰胺耐药性。

1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于 PCR反应的模板：

取结核菌液 lml，4000rpm，离心 lmin， 去除上清， 收集菌体后， 加入 lOOul双蒸水煮沸 lOmin，然后 5000rpm，离心 5min，小心吸取上清作为扩增吡嗪酰胺酶基因� �/ j的模板。

2. PCR扩增 pi cA基因的引物设计。 上游引物序列 P1 :

5*-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3*, 下游弓 |物序列： 5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'。

PCR扩增条件：

采用 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (购自美国 NEB公司） 作为 PCR反应 中的 DNA聚合酶。 98°C预变性 30s， 变性 98°C 10s，退火 60°C lmin 延伸 72 °C 30s共 35 个循环。

采用以上引物对结核吡嗪酰胺敏感株 （H37Rv ) (购自美国菌种保藏中心， ATCC25177 ) 和吡嗪酰胺耐药株 （BCG) (购自美国菌种保藏中心， ATCC19015 ) 的吡 嗪酰胺酶基因（/ )的扩增， 经凝胶电泳， 典型结果如图 5A， 可见得到了很好的扩增。

3. 浓縮扩增的 / 基因片段：

(1) 制备一定浓度的 DNA溶液；

(2) 加入 1/10 体积的 3 M CH ₃ COONa (pH=5.2) 溶液， 均匀混合；

(3) 加入 4 μΐ 的 DNAmate溶液， 均匀混合；

(4) 加入 2.5 倍体积的 -20°C预冷无水乙醇， 充分混匀；

(5) 12，000 rpm 4°C离心 15 分钟；

(6) 弃溶液， 留白色沉淀；

(7) 加入 -20°C预冷的 70% (V/V， 以下相同)乙醇 l ml， 轻轻上下颠倒洗涤沉淀。

(8) 12,000 rpm 4°C离心 5分钟后小心弃去乙醇。

(9) 再加入 -20°C预冷的 70%(V/V)乙醇 l ml， 轻轻上下颠倒洗涤沉淀。

(10) 12,000 rpm 4°C离心 5分钟后小心弃去乙醇， 真空干燥。

4. 采用 BioTek公司 Take3 Multi-Volume Plate精确定量浓縮的 pitcA基因片段浓度。 适合的 pi cA基因片段浓度一般为 0.1- 100微克 /ml。

5. 采用美国 5 PRIMER公司生产的 RTS 100 Wheat Germ CECF Kit试剂盒体外无细 胞 24°C反应 1 - 20小时。 表达目的蛋白： 吡嗪酰胺酶。

6. 酶活的测定：

体外表达完成后， 取体系中的 20ul加入 100ul l0mg/ml浓度的吡嗪酰胺（PZA) (购 自 Sigma公司）， 37°C孵育 1小时。 然后加入 10ul浓度为 10% (W/V) 硫酸亚铁按， 立 即显色。 由于吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后， 吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质， 从 而作为检测的指标。

对结核吡嗪酰胺敏感株 （H37Ra) 和吡嗪酰胺耐药株 （BCG) 的吡嗪酰胺酶活性检 测结果如图 5B所示， 可见 H37RA的酶活性高， 产生肉眼明确可见的红棕色， 而耐药的 BCG的吡嗪酰胺酶活性几乎没有， 活性低。更精确的定量可以采用分光光度计在 450nm 测定酶反应后溶液的吸收值。

实施例 2:

采用含 T7启动子和增强子 PCR扩增全长结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物 -小麦胚芽无 细胞体外蛋白表达测定结核吡嗪酰胺敏感株 （H37RA)和吡嗪酰胺耐药株 （BCG) 的吡 嗪酰胺耐药性。

1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于 PCR反应的模板：

取菌液 lml，4000rpm，离心 lmin， 去除上清， 收集菌体后， 加入 lOOul双蒸水

煮沸 lOmin，然后 5000rpm，离心 5min， 小心吸取上清作为扩增吡嗪酰胺酶基因 （/ j的 模板。

2. PCR扩增得到 pncA基因的片段。 上游引物序列 P2:

下游引物序歹 ij： 5*-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3*

PCR扩增条件：

采用 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (购自美国 NEB公司） 作为 PCR反应 中的 DNA聚合酶。 98°C预变性 30s， 变性 98°C 10s，退火 60 °C lmin延伸 72 °C 30s共 35 个循环。

采用以上引物对结核吡嗪酰胺敏感株 （H37Ra ) (购自美国菌种保藏中心， ATCC25177 ) 和吡嗪酰胺耐药株 （BCG) (购自美国菌种保藏中心， ATCC19015 ) 的吡 嗪酰胺酶基因（/ )的扩增， 经凝胶电泳， 典型结果如图 6A， 可见得到了很好的扩增。

3. 浓縮扩增的 / 基因片段：

(1) 制备一定浓度的 DNA溶液；

(2) 加入 1/10 体积的 3 M CH ₃ COONa (pH=5.2) 溶液， 均匀混合；

(3) 加入 4 μΐ 的 DNAmate溶液， 均匀混合；

(4) 加入 2.5 倍体积的 -20°C预冷无水乙醇， 充分混匀；

(5) 12，000 rpm 4°C离心 15 分钟；

(6) 弃溶液， 留白色沉淀； (7) 加入 -20°C预冷的 70% (V/V)乙醇 l ml， 轻轻上下颠倒洗涤沉淀；

(8) 12,000 rpm 4°C离心 5分钟后小心弃去乙醇；

(9) 再加入 -20°C预冷的 70%(V/V)乙醇 1 ml， 轻轻上下颠倒洗涤沉淀；

(10) 12,000 rpm 4°C离心 5分钟后小心弃去乙醇， 真空干燥；

4. 采用 BioTek公司 Take3 Multi-Volume Plate精确定量浓縮的 pitcA基因片段浓度。 适合的 pi cA基因片段浓度一般为 0.1- 100微克 /ml。

5. 采用 5 PRIMER公司生产的 RTS 100 Wheat Germ CECF Kit试剂盒体外无细胞 24°C反应 1 - 20小时。 表达目的蛋白： 吡嗪酰胺酶。

6. 酶活的测定：

体外表达完成后， 取体系中的 20ul加入 100ul l0mg/ml浓度的吡嗪酰胺（PZA) (购 自 Sigma公司）， 37°C孵育 1小时。 然后加入 10ul浓度为 10% (W/V) 硫酸亚铁按， 立 即显色。 由于吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后， 吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质， 从 而作为检测的指标对结核吡嗪酰胺敏感株 （H37Rv) 和吡嗪酰胺耐药株 （BCG) 的吡嗪 酰胺酶活性检测。 结果如图 6B所示， 可见 H37RA的酶活性高， 产生肉眼明确可见的红 棕色， 而耐药的 BCG的吡嗪酰胺酶活性几乎没有， 活性低。 与采用没有增强子引物序 列进行扩增的实施例一比较， H37RA溶液的颜色更深， 这显然是由于表达产生了更多的 吡嗪酰胺酶。 同样的， 更精确的定量可以采用分光光度计在 450nm测定酶反应后溶液的 吸收值。