REF 27658/002FR1

Méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant et dispositif pour la mise en œuvre de ladite méthode

ETAT DE L'ART

Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant et un dispositif pour la mise en oeuvre de ladite méthode. Elle s'applique notamment à la détection de signaux diffusés CARS.

Etat de l'art

Toutes les liaisons chimiques possèdent des fréquences de vibration qui leur sont propres. On appelle techniques optiques vibrationnelles des méthodes qui visent à utiliser l'interaction lumière/matière pour obtenir des informations sur ces vibrations moléculaires. La plus connue de ces techniques est la spectroscopie infrarouge (IR) qui observe les raies d'absorption spécifiques des liaisons chimiques présentes dans un échantillon. Découverte en 1928, la diffusion Raman (du nom du physicien Chandrasekhara Venkata Raman qui découvrit l'effet) permet d'utiliser la lumière visible pour accéder au spectre vibrationnel des molécules qui interagissent avec un faisceau lumineux. Dans un processus de diffusion Raman, une onde pompe de pulsation ω _ρ incidente sur une molécule est diffusée inélastiquement en une onde dite Stokes de pulsation ω _$

(Figure 1A) et une onde dite anti-Stokes de pulsation <D _as (Figure IB). L'écart en fréquence entre les ondes générées et l'onde pompe dépend de la transition Raman moléculaire (de pulsation Ω ) de telle sorte que ω -ω^ω^-ω =Q _R . Dans une vision photonique du processus, les ondes Stokes et anti-Stokes correspondent à une absorption à partir respectivement du niveau vibrationnel fondamental ou excité. Le processus générant l'onde anti-Stokes, partant du niveau vibrationnel excité (B), est beaucoup moins probable que le processus créant l'onde Stokes, qui est la seule observée dans la pratique en spectroscopie Raman spontanée. Une étude fine de la répartition spectrale des ondes Stokes renseigne sur les densités de liaisons chimiques présentes dans l'échantillon. Ce processus spontané de diffusion inélastique est très peu efficace comparé à la

-30 2

fluorescence (les sections efficaces Raman sont de l'ordre de 10 cm /molécule, à comparer

-16 2

avec la section efficace d'absorption à 1 photon d'un fluorophore qui atteint 10 cm /molécule).

La spectroscopie Raman stimulée CARS (pour Cohérent Anti-Stokes Raman Scattering) un processus de mélange à quatre ondes qui permet d'adresser les liaisons vibrationnelles

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) présentes dans un échantillon. Ce processus est par exemple décrit dans R.W. Boyd, Nonlinear Optics (Académie Press, Boston, 1992). Il s'agit d'envoyer deux impulsions lasers de pulsations ω _ρ et CÛ _s (ou fréquences et v _s ) dont la différence de pulsations est rendue égale à la pulsation Ω du niveau vibrationnel que l'on veut adresser. Dans cette configuration de résonance ω P -ω s = Ω, le niveau vibrationnel de pulsation Ω est peuplé de manière stimulée et va pouvoir diffuser inélastiquement le faisceau de pulsation ω p dans un faisceau de pulsation ω as = 2 ω p -ω s (Figure

2A). La présence de cette nouvelle radiation co^est la signature de la présence de la liaison vibrant à la pulsation Ω dans l'échantillon. Une première mise en oeuvre de CARS consiste à envoyer sur l'échantillon deux impulsions picoseconde fines spectralement dont la différence de pulsations n'adressera qu'une liaison vibrationnelle spécifique. Pour une identification optimale, on recherche l'ensemble des liaisons vibrationnelles présentes dans l'échantillon. Pour cela, on opère en mode dit « Multiplex CARS » (voir par exemple M.Muller et J.Schins, « Imaging the thermodynamic state of lipidic membranes with multiplex CARS spectroscopy », Physical Chemistry B 106, 3715-3723 (2002)) où l'on envoie sur l'échantillon une impulsion fine spectralement et une impulsion large spectralement (Figure 2B). On peut ainsi adresser l'ensemble des niveaux vibrationnels Ω. présents dans l'échantillon et obtenir un spectre du signal ω généré. Du point de vue technique, le spectre étroit est par exemple issu d'un laser picoseconde et le spectre large, par exemple d'un laser femtoseconde, ou d'une fibre à cristal photonique générant un supercontinuum (SC).

Sur la figure 3A, nous décrivons le processus de diffusion CARS résonant, exploité pour avoir accès à la signature des espèces moléculaires que l'on cherche à identifier. Il existe cependant une contribution CARS non résonante, représentée sur la figure 3B, qui provient d'une contribution électronique de l'échantillon. Cette contribution non résonante peut être importante lorsqu'on fait de la spectroscopie CARS sur un échantillon comportant une grande diversité de liaisons chimiques.

Dans l'article « Focused field symmetries for background-free cohérent anti-Stokes Raman spectroscopy », Physical Review A 77 (2008), au nom de D. Gachet et al, une méthode originale est présentée, permettant de s'affranchir de la contribution non résonante. Les figures 4 à 6 illustrent la méthode. La méthode consiste à effectuer une image différentielle CARS entre un objet et son symétrique par rapport à une interface transverse 43 entre un milieu résonant (référence 41 sur les figures 4A et 4B) et un milieu non résonant (référencé 42 sur les figures 4A, 4B). La susceptibilité non linéaire du 3 ^eme ordre est définie dans le milieu résonant 41 par un (3) (3)

terme résonant y et un terme non résonant y . Dans le milieu non résonant 42, elle est

^Λ 1R ^Λ INR '

(3)

définie par le terme non résonant χ _2nr . Sur les figures 4A et 4B, est représenté un volume actif

CARS 45 (lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes de pulsations (¾, et co _s respectivement), localisé sur l'interface transverse 43 entre le milieu résonant et le milieu non résonant. Deux situations sont envisagées: le cas a où les faisceaux pompe et Stokes sont incidents du côté du milieu non résonant et le cas β où les faisceaux pompe et Stokes sont incidents du côté du milieu résonant. Il est démontré dans cet article que la différence des signaux CARS obtenus dans les cas a et β ne contient que la contribution résonante du milieu résonant. La figure 5 illustre les résultats d'un calcul numérique prenant en compte la nature vectorielle des faisceaux pompe et Stokes focalisés sur une interface transverse comme illustré sur les figures 4 A et 4B. L'analyse consiste à étudier la différence AI _Fwd des signaux CARS émis dans les problèmes a (I _a (Fwd)) et β (Ip(Fwd)) en fonction du paramètre de décalage normalisé à la résonance Raman ζ=(ω _ρ -ω ₈ -Ωκ)/Γ (où Γ est la largeur spectrale de la raie vibrationnelle étudiée). Il est démontré que la différence AI _Fwd suit exactement la partie imaginaire de X ⁽³⁾ IR qui est connue pour être le spectre Raman du milieu 1. Une mise en œuvre expérimentale de la méthode est illustrée sur la figure 6B et des résultats expérimentaux sont présentés sur la figure 6A. La figure 6B représente un échantillon constitué d'une couche 61 de DMF (N,N- diméthylformamide) entre deux lames de verre 62, 63. La situation a correspond au cas où les faisceaux pompe et Stokes sont focalisés sur l'interface verre-DMF (interface entre 62 et 61), tandis que la situation β correspond au cas où les faisceaux d'excitation sont focalisés sur l'interface DMF-verre (interface entre 61 et 63). Sur la figure 6A, sont illustrés en fonction du décalage Raman respectivement par la courbe C l , l'intensité CARS du DMF seul (lorsque les faisceaux d'excitation sont focalisés dans le milieu résonant, par la courbe C2, l'intensité I _a (Fwd), par la courbe C3, l'intensité I (Fwd), par la courbe C4, la différence AI _Fwd et par la courbe C5 le spectre Raman. Il apparaît, comme cela avait été démontré théoriquement, que la méthode permet de s'affranchir de la composante non résonante qui entache le signal diffusé CARS représenté par la courbe Cl .

Cette méthode présente cependant un certain nombre d'inconvénients. Elle est notamment limitée à des échantillons symétriques, tels que celui représenté sur la figure 6B, ou réversibles, afin d'avoir accès aux interfaces résonant/non résonant d'une part et non résonant/résonant d'autre part. Cela présente une limitation dans le cas d'échantillons biologiques qui présentent rarement ces propriétés. Par ailleurs, si elle permet les applications en spectroscopie, cette méthode est limitée pour des applications en microscopie.

La présente invention propose un dispositif original de détection d'un signal optique non linéaire résonant, basé sur le principe de la détection aux interfaces transverses tel que décrit dans l'art antérieur, mais qui puisse s'appliquer à tout échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant, à la fois pour des applications de spectroscopie et de microscopie.

RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon de type comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, le dispositif comprenant : une source d'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation, dit faisceau pompe, à une première pulsation cop donnée adaptée à l'excitation du milieu résonant d'un échantillon du type donné, un premier module optique adapté à la détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction dudit faisceau pompe incident avec une interface axiale entre les milieux résonant et non résonant de l'échantillon, des moyens de réflexion dudit faisceau pompe, agencés de telle sorte à ce que ledit faisceau pompe ainsi réfléchi intercepte ladite interface transverse sensiblement à la même position que ledit faisceau pompe incident, un deuxième module optique adapté à la détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction dudit faisceau pompe réfléchi avec l'échantillon, un module de traitement des signaux optiques détectés par lesdits premier et second modules de détection, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, la source d'émission permet l'émission d'un faisceau pompe de pulsation cop et d'un faisceau Stokes de pulsation cos, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes est un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation coas = 2 cop - cos et la différence des signaux détectés par le premier et le second module de détection est caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant. Selon une autre variante, le dispositif selon l'invention comprend un objectif de focalisation des faisceaux d'excitation incidents en un volume de focalisation commun, permettant d'intercepter ladite interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant et un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation incidents avec l'échantillon, ledit objectif de collection étant identique à l'objectif de focalisation des faisceaux incidents et l'objectif de collection formant un objectif de focalisation des faisceaux d'excitation réfléchis et l'objectif de focalisation des faisceaux incidents formant un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon.

Selon une autre variante, chacun des modules de détection optique comprend un dispositif d'enregistrement d'images, le signal optique non linéaire étant collecté dans chacun des modules de détection optique respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés.

Selon une autre variante, un dispositif de balayage angulaire des faisceaux d'excitation permet aux faisceaux d'excitation d'intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. Selon une autre variante, la source d'émission émet au moins un faisceau d'excitation à longueur d'onde variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon, l'échantillon comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, la méthode comprenant : l'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation cop donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant l'échantillon à une position donnée d'une interface transverse entre le milieu résonant et non résonant, la détection d'un premier signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, la réflexion du ou desdits faisceaux d'excitation, le ou les faisceaux d'excitation ainsi réfléchis interceptant ladite interface transverse sensiblement à la même position que le ou les faisceaux d'excitation incidents, la détection d'un second signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon, le traitement des premier et second signaux optiques détectés, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, la méthode comprend l'émission d'un faisceau pompe de pulsation cop et d'un faisceau Stokes de pulsation cos, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes étant un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation coas = 2 cop - cos et la différence des premier et second signaux détectés étant caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant.

Selon une autre variante, les premier et deuxième signaux optiques non linéaires sont détectés respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés.

Selon une autre variante, les faisceaux d'excitation subissent un balayage angulaire pour intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant.

Selon une autre variante, l'un au moins des faisceaux d'excitation présente une longueur d'onde d'émission variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, illustrée par les figures suivantes :

Figures 1A et 1B (déjà décrites), principe de l'émission Stokes et anti-Stokes dans un processus de diffusion Raman;

Figure 2A et 2B (déjà décrites), principe de l'émission CARS dans deux modes différents ;

Figures 3A et 3B (déjà décrites), illustrations des processus CARS résonant et non résonant ;

Figures 4A et 4B (déjà décrites), illustrations des situations a et β pour la mise en œuvre de la méthode selon l'art antérieur ;

Figure 5 (déjà décrite), simulations numériques de résultats obtenus avec la méthode selon l'art antérieur ; Figures 6A et 6B (déjà décrites), résultats expérimentaux obtenus avec un échantillon symétrique, avec la méthode selon l'art antérieur ;

Figures 7A, 7B, illustrations des situations a et β pour la mise en œuvre de la méthode selon l'invention ; Figures 8A et 8B, exemple de montage expérimental pour la mise en œuvre de la méthode selon l'invention ;

Figure 9, résultats expérimentaux obtenus avec un échantillon du type de celui de la figure 8B ;

Figures 10A à 10D, images obtenues par simulation numérique avec une bille de polystyrène diamètre 3 μιη, immergée dans un liquide aqueux d'indice de réfraction n=1.33, avec la méthode selon l'invention ;

Figure 11, exemple de montage expérimental pour la mise en œuvre de la méthode selon l'invention selon une variante;

Figures 12A, 12B, illustrations des situations a et β pour la mise en œuvre de la méthode dans l'exemple de la figure 11 ;

Figure 13, schéma des conditions géométriques pour la mise en œuvre de la diffusion CARS à une interface axiale entre milieux résonant et non résonant ;

Figures 14A à 14E, illustration de la déviation du signal diffusé CARS en fonction de la position relative du lieu de focalisation des faisceaux d'excitation avec une interface axiale entre des milieux résonant et non résonant ;

Figures 15 A à 15C, courbes obtenues par simulation numérique, illustrant le décalage su signal diffusé CARS en fonction du paramètre ζ=(ω _ρ -ω ₈ -Ω _κ )/Γ (décalage normalisé à la résonance Raman) (figure 15 A), les intensités lumineuses calculées respectivement dans l'espace des (k _x >0) et (k _x <0) et la différence des intensités, en fonction du paramètre ζ (figure 15B) et de la position x du lieu de focalisation des faisceaux d'excitation par rapport à une interface axiale (figure 15C) ;

Figures 16A à 16C, schémas illustrant 3 modes possibles pour la mise en œuvre de la détection CARS selon l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE

Les figures 7A et 7B illustrent par deux schémas le principe de la méthode de détection selon l'invention dans le cas de la diffusion CARS. Selon la méthode, un faisceau pompe de pulsation et un faisceau stokes de pulsation ω^, co linéaires, interceptent une interface transverse 70, c'est-à-dire présentant une composante non nulle selon un plan perpendiculaire à l'axe des faisceaux incidents (axe optique), entre un milieu non résonant et un milieu résonant. En général, les deux faisceaux sont focalisés et on note 71 le volume de focalisation commun des faisceaux qui interceptent l'interface transverse 70. Selon l'invention, les faisceaux d'excitation traversent l'interface selon une première direction, dite situation a, puis sont réfléchis vers l'échantillon de telle sorte à intercepter la même interface sensiblement à la même position, mais dans la direction opposée (situation β). Dans l'exemple de la figure 7, les faisceaux d'excitation traversent d'abord l'interface dans le sens milieu non résonant/milieu résonant (figure 7A, situation a), puis dans le sens milieu résonant/milieu non résonant (figure 7B, situation β). Les intensités des signaux CARS diffusés I _a (Fwd) et I (Fwd) sont mesurées respectivement dans les deux situations a et β, et leur différence AI _Fw d est calculée, après calibrage, pour donner un signal dont la déposante a

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montré qu'il est proportionnel à la partie imaginaire Im[% ] de la susceptibilité non

1R

linéaire d'ordre 3 du milieu résonant. Selon l'invention, une seule impulsion du faisceau pompe et du faisceau stokes est utilisée pour exciter l'échantillon dans les situations a et β, permettant d'augmenter le rapport signal à bruit par rapport à la méthode selon l'art antérieur tel que décrite dans les figures 4 à 6.

Faisant la différence des signaux CARS générés par un objet et son symétrique par rapport à un plan perpendiculaire à l'axe optique, la méthode selon l'invention est nommée Dz-CARS dans la suite de la description (pour Differential imaging in Z symmetry).

La figure 8A illustre un exemple de dispositif pour la mise en œuvre de la méthode de détection selon l'invention. Le dispositif de détection 800 comprend généralement un système laser 801 permettant l'émission d'un premier faisceau d'excitation de pulsation co _p (faisceau pompe) et d'un second faisceau d'excitation de pulsation co _s (faisceau Stokes), colinéaires, les deux faisceaux d'excitation étant symbolisés par la flèche 802. Le dispositif

800 comprend en outre un élément optique, par exemple une lame réfléchissante 804, permettant d'envoyer les deux faisceaux d'excitation dans un premier module de détection optique du dispositif généralement référencé 803, selon une direction principale Z.

Le système laser 801 comprend par exemple, dans une application dite deux couleurs, deux sources laser 808 fines spectralement, accordables, par exemple de type Titane - Saphir, émettant entre 690 et 1000 nm, pompés par un laser de pompe 809, type

Nd :YV04 émettant à 532 nm. Les lasers accordables émettent par exemple des impulsions picoseconde, typiquement de l'ordre de 3 ps, pour former les faisceaux d'excitation pompe de pulsation C0p (de longueur d'onde typique 730 nm) et Stokes de pulsation co _s . Un sélecteur d'impulsion 810 (ou « puise picker ») peut être utilisé pour réduire la cadence des lasers d'excitation pompe et sonde sans réduire la puissance crête des impulsions. L'utilisation d'un faisceau Stokes ou d'un faisceau pompe accordable permet notamment de balayer le spectre d'émission anti-Stokes pour des applications en spectroscopie visant à déterminer le spectre Raman du milieu résonant. D'autres sources laser accordables peuvent être utilisées, par exemple de type oscillateur paramétrique optique (OPO), amplificateur paramétrique optique (OPA), oscillateurs picoseconde de type Nd : verre, lasers fîbrés dopés Ytterbium ou Erbium, etc. Les sources peuvent également être des sources lasers nanoseconde ou femtoseconde, en fonction de la largeur spectrale des raies Raman que l'on veut observer. Cependant, les impulsions nanosecondes, si elles sont très bonnes d'un point de vue spectral, ont une puissance crête moins élevée que les impulsions ps. Par ailleurs, les effets thermiques associés aux impulsions ns sont plus à même d'endommager les échantillons biologiques.

Les impulsions femtosecondes brutes sont généralement trop larges spectralement. En phase condensée (solide ou liquide), les largeurs de raie sont autour de 10-20 cm ^"1 , ce qui correspond à l'emploi d'impulsions ps.

Dans l'exemple de la figure 8A, le premier module de détection optique 803 comprend un objectif de focalisation 807 visant à focaliser les faisceaux pompe et Stokes en un volume de focalisation commun pour l'analyse de l'échantillon 805, représenté sur la figure 8B. L'utilisation d'un objectif de focalisation est particulièrement appropriée dans les applications type microscopie. Cependant, il n'est pas indispensable pour l'émission du signal CARS de travailler en faisceaux focalisés, et notamment dans le cas de l'étude d'échantillons minces. Dans cet exemple, l'échantillon est formé, comme dans l'exemple de la figure 6B, d'une couche 61 de DMF (Ν,Ν-diméthylformamide) entre deux lames de verre 62, 63. Le premier module de détection optique 803 comprend également un objectif de collection 811 permettant de collecter le signal optique non linéaire émis, dans cet exemple le signal diffusé CARS, et un détecteur 816, par exemple un détecteur ponctuel de type photodiode à avalanche (APD), photodiode rapide (PIN), ou photomultiplicateur (PMT), précédé d'une lentille de collection 818 et d'un filtre 812 pour couper les faisceaux d'excitation résiduels. Dans cet exemple, Le passage du problème a au problème β pour un échantillon donné s'effectue en retournant les faisceaux pompe et Stokes comme indiqué sur la figure 8 A au moyen d'un miroir 813, dont le coefficient de réflexion est adapté aux longueurs d'onde des faisceaux d'excitation d'une part, et du signal diffusé CARS d'autre part, de telle sorte à réfléchir les faisceaux pompes et Stokes et transmettre le signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation avec l'échantillon. Dans cette situation, lors du premier passage des impulsions incidentes, un premier signal CARS est émis vers l'avant et collecté par le détecteur 816 ; il s'agit alors de la situation a et le signal collecté est I _a (Fwd). Les impulsions pompes et Stokes sont alors réfléchies par le miroir pour être renvoyées sur l'échantillon, qui apparaît alors dans la situation β, dans un deuxième module de détection optique généralement référencé 806 sur la figure 8 A. Le deuxième module de détection optique 806 comprend en commun avec le premier module de détection optique, les objectifs 811 et 807, mais l'objectif 81 1 sert d'objectif de focalisation pour les faisceaux d'excitation renvoyés par le miroir 813 et l'objectif 807 sert d'objectif de collection pour le signal optique non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon 805. Le deuxième module optique 806 comprend par ailleurs un détecteur 817, par exemple un détecteur ponctuel du même type que le détecteur 816, précédé d'une lentille de collection 819 et d'un filtre 820 pour couper les faisceaux d'excitation résiduels. Le signal collecté vers l'arrière par le détecteur 817 est alors I (Fwd). On opère en temps réel la différence des signaux I _a (Fwd) - I (Fwd), dont la déposante a montré qu'elle était proportionnelle au spectre Raman du milieu résonant, au moyen d'une unité de traitement notée 830 sur la figure 8A. Avantageusement, la lame réfléchissante 804 est une lame dichroïque, permettant de réfléchir les faisceaux d'excitation émis par la source laser 801 vers l'échantillon 805 (situation a) tout en transmettant le signal diffusé CARS dans la situation β. Avantageusement, les objectifs de focalisation 807 et de collection 811 sont identiques permettant d'obtenir un montage symétrique dans les situations a et β. En pratique, une calibration des détecteurs 816, 817, est effectuée préalablement à la mesure. Par exemple, cette calibration est effectuée sur un échantillon ne comprenant que du solvant. Comme cela apparaît sur la figure 8B, le dispositif selon l'invention permet aux même impulsions pompe et Stokes d'intercepter l'échantillon à la même position de l'interface transverse, respectivement dans les situations a et β. La méthode peut ainsi être utilisée avec n'importe quel type d'échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant, et non plus seulement un échantillon symétrique ou réversible.

Selon un exemple, le dispositif 800 comprend également un dispositif de balayage des faisceaux d'excitation dans le plan XY de l'échantillon (non représenté). Ce dispositif de balayage peut être utile à la fois dans une application en spectroscopie, pour ajuster le lieu de focalisation des faisceaux d'excitation sur une interface transverse des milieux résonant et non résonant formant l'échantillon, soit dans une application d'imagerie. Il peut s'agir d'un dispositif permettant le déplacement de l'échantillon, ou de manière préférée, d'un dispositif de balayage des faisceaux d'excitation. Avantageusement, on pourra utiliser un miroir de renvoi des faisceaux d'excitation 813 sphérique, de telle sorte à renvoyer les faisceaux d'excitation dans une direction parallèle opposée, ce qui permettra aux faisceaux d'excitation réfléchis (situation β) d'intercepter l'échantillon à la même position que celle des faisceaux incidents (situation a).

La figure 9 illustre des résultats expérimentaux obtenus avec le dispositif de la figure 8A et un échantillon du type de celui de la figure 8B, dans lequel une fine couche de DMF (N,N- dimethylformamide) fait office de milieu résonant entre deux lamelles de verre (qui font office ici de milieu non résonant). La longueur d'onde du faisceau de pompe est 730 nm, celui du faisceau d'excitation Stokes autour de 814 nm. L'ouverture numérique des objectifs 807, 81 1 de 0.6 dans l'air. Sur la figure 9, sont illustrés en fonction du décalage Raman respectivement par la courbe Dl, le signal diffusé CARS mesuré dans le DMF, par la courbe D2, l'intensité I _a (Fwd) mesurée dans la situation a (figure 6B), par la courbe D3, l'intensité I (Fwd) mesurée dans la situation β, par la courbe D4, la différence AI _Fw d, par la courbe D5 (en pointillés) le spectre Raman, et par la courbe D6 le signal diffusé CARS mesuré dans le verre. La courbe Dl fait clairement apparaître l'effet de distorsion dû à la contribution non résonante du milieu résonant, tandis que la différence AI _Fw d se superpose exactement au spectre Raman du DMF (en pointillés). On peut ainsi apprécier la capacité de Dz-CARS à extraire le spectre Raman du milieu résonant sans aucune distorsion due à la partie non résonante du milieu résonant.

Ces résultats expérimentaux démontrent la pertinence de l'approche Dz-CARS pour une spectroscopie CARS sans bruit non résonant, et avec une précision nettement améliorée en comparaison de l'art antérieur, tel qu'illustré sur la figure 6A. Par ailleurs, la méthode selon l'invention permet de repérer parfaitement la position de l'interface sur laquelle on travaille, et de venir focaliser des impulsions d'excitation identiques, à la même position de l'interface dans les problèmes a et β, permettant notamment des applications en microscopie. Les figures 10A à 10D présentent des simulations numériques obtenues avec la méthode selon l'invention, sur un autre type d'échantillon. Les images sont calculées en prenant pour échantillon une bille de 3 μιη de diamètre dans un solvant de type aqueux (longueur d'onde pompe 730 nm, longueur d'onde Stokes 814 nm, ouverture numérique de l'objectif d'excitation 1.2 dans l'eau, ouverture numérique de l'objectif de collection 1.2 dans l'eau). L'image est calculée dans chacun des cas dans un plan XZ de la bille correspondant à un plan longitudinal contenant la direction d'incidence des faisceaux d'excitation. Les figures 10A et 10B représentent une image de la bille en détection classique, c'est-à-dire que seul le signal diffusé CARS en situation a est représenté. A la résonance (Figure 10A), le signal est plus intense qu'hors résonance (Figure 10B), mais la différence des contrastes est faible du fait des contributions non résonantes de la bille et de son environnement. Les figures 10C et 10D représentent des images de la bille à la résonance et hors résonance, mais calculées avec la méthode Dz-CARS selon l'invention, c'est-à-dire en soustrayant les signaux CARS diffusés dans les situations a et β, avec un montage du type de celui de la figure 8 A. Hors résonance (Figure 10D), le contraste est nul, car la différence des signaux qui ne contiennent qu'une contribution non résonante s'annule. Au contraire, dans la figure 10C, calculée à la résonance, le contraste aux interfaces transverses est maximal. Ces résultats établissent la faisabilité de Dz-CARS dans une configuration de microscopie.

La figure 11 illustre un exemple de montage expérimental pour la mise en œuvre de la détection selon l'invention selon une variante. Le montage est sensiblement identique à celui de la figure 8 A, mais les détecteurs ponctuels 816, 817 sont remplacés par des détecteurs matriciels 901, 902, par exemple de type CCD, ou CMOS. Selon cette variante, on ne mesure plus, comme précédemment, la différence des signaux diffusés CARS intégrés respectivement pour les situations a et β, dans tout l'espace des vecteurs d'onde k contenu dans l'ouverture numérique des objectifs de détection, mais on mesure la différence des signaux diffusés CARS dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents sur l'échantillon, les signaux étant détectés pour le premier dans la situation a, pour le second dans la situation β. Ainsi, comme cela apparaît sur la figure 12A, dans la situation a, on mesure le signal diffusé CARS dans une direction représentée par le vecteur d'onde k , de coordonnées k _x , k _y dans le plan de projection XY perpendiculaire à l'axe principal z, et dans la situation β, on mesure le signal diffusé CARS dans une direction représentée par le vecteur d'onde k " de coordonnées -k _x , -k _y dans le plan de projection XY. Ici, comme précédemment, la situation a correspond à la génération d'un signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation incidents avec l'échantillon, alors que la situation β correspond à la génération d'un signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon. La déposante a en effet démontré, à la fois théoriquement et expérimentalement, que cette méthode permettait outre la détection aux interfaces transverses de l'échantillon, une détection aux interfaces axiales de l'échantillon, c'est-à-dire présentant une composante non nulle selon l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents. Dans la suite de la demande, la méthode est nommée D-CARS. Les figures 13 à 15 illustrent pour la meilleure compréhension de D-CARS l'approche ci-dessous nommée Dk-CARS de détection aux interfaces axiales (pour Differential imaging in K-space).

La figure 13 représente un échantillon comprenant le milieu résonant 131, par exemple un milieu contenant le milieu à analyser, c'est-à-dire le milieu d'intérêt biologique, et le milieu non résonant 132, typiquement un milieu contenant le solvant. La susceptibilité non linéaire du

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3 ^eme ordre est définie dans le milieu résonant 131 par un terme résonant χ et un terme non

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résonant y . Dans le milieu non résonant 132, elle est définie par le terme non résonant

^Λ INR ' ¹

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χ _2NR . Selon cet aspect de la méthode selon l'invention, les faisceaux d'excitation pompe de pulsation C0p et sonde de pulsation co _s , colinéaires, sont incidents sur l'échantillon dans un volume de focalisation 135, interceptant une interface axiale 133 de l'échantillon. Selon cet aspect de la méthode, comme cela est expliqué en détail par la suite, il est procédé à l'analyse de l'intensité lumineuse du faisceau optique non linéaire dans l'espace des vecteurs d'onde k , c'est-à-dire dans l'espace des directions d'émission du signal émis par processus CARS, de part et d'autre de l'interface, cette intensité étant notée sur la figure 13 I ^Fwd ( k ) et I ^Fwd ( k ') de part et d'autre de l'interface respectivement, l'abréviation « Fwd » représentant le signal CARS diffusé vers l'avant, par opposition au signal dit « Epi », diffusé vers l'arrière.

En effet, la déposante a démontré expérimentalement et théoriquement qu'à une interface axiale, le signal émis par processus CARS est dévié à la résonance. Les figures 14A à 14E représentent par une série de schémas la déviation du signal diffusé CARS en fonction de la position relative des faisceaux pompe et Stokes incidents avec l'interface. Sur les figues 14A à 14E est représenté le volume actif CARS 135 (lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes) qui est déplacé à travers un objet CARS 140 (chaque vignette correspond à une position différente du volume actif dans l'objet). L'objet CARS est considéré comme résonant alors que le milieu entourant l'objet est considéré comme non résonant (il sera appelé dans la suite de la description « le solvant »). Il apparaît qu'aux interfaces entre l'objet CARS et le solvant, le signal diffusé CARS est affecté d'une déviation (ou tilt). La déposante a démontré que cette déviation relève d'un processus purement interférentiel entre l'objet CARS et le solvant et n'est en aucun cas imputable aux effets réfractifs. Sur les deux vignettes 1 (figures 14A et 14E), le volume CARS est focalisé dans le solvant et le signal diffusé CARS est émis dans la direction normale (parallèle à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes, symbolisé par la flèche 141); sur la vignette 2 (figure 14B), le volume CARS est focalisé sur l'interface entre l'objet CARS et le solvant, le signal diffusé CARS est alors émis avec un angle a positif (par rapport à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes), déviant ainsi le faisceau dans une direction définie par (k _x >0) dans l'espace des vecteurs d'onde k . Sur la vignette 3 (figure 14C), le volume CARS est centré dans l'objet CARS, le signal CARS est alors intense et est dirigé dans la direction normale (parallèle à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes). On retrouve ensuite une situation similaire sur les vignettes suivantes (vignette 4, figure 14D et vignette 1 , figure 14E); il est cependant important de noter que sur la vignette 4, a est négatif et correspond à une déviation dans une direction définie par (k _x <0). La déposante a démontré à la fois théoriquement et expérimentalement, que l'évolution de l'angle a en fonction du paramètre normalisé ζ=(ω^-ω -

Ω )/Γ (où Γ est la largeur spectrale de la raie vibrationnelle étudiée), suit la phase du tenseur χ ⁽³ \

R

= X ⁽³⁾ IR + X ⁽³⁾ INR décrivant le milieu 1. La déposante a également démontré qu'il est possible en analysant dans des directions de diffusion symétriques le signal CARS de déterminer le spectre Raman. La figure 15A présente les résultats d'un calcul numérique rigoureux prenant en compte la nature vectorielle des faisceaux pompe et Stokes focalisés sur une interface axiale entre un milieu 1 résonant et un milieu 2 non résonant (figure 13). L'analyse consiste à étudier dans l'espace des vecteurs d'onde k la déviation du signal diffusé CARS émis en fonction du paramètre de décalage normalisé à la résonance Raman ζ=(ω _ρ -ω ₈ -Ω _κ )/Γ. Hors résonance

(ζ=-10), le faisceau est centré tandis qu'à la résonance (ζ=0), il apparaît clairement un décalage angulaire.

Les figures 15B et 15C représentent des simulations numériques dans lesquelles le signal diffusé CARS est intégré respectivement dans les demi-espaces (k _x >0) et (k _x <0) puis la différence des signaux ainsi intégrés est effectuée. Sur la figure 15B sont représentés les spectres CARS intégrés sur les demi-espaces (k _x >0) et (k _x <0) lorsque les faisceaux pompe et Stokes sont focalisés sur l'interface (x=0), ainsi que leur différence ΔΙ. Cette différence suit exactement le

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spectre Raman donné par Ιιη[χ ]. Ceci démontre la pertinence de l'approche Dk-CARS pour une spectroscopie CARS sans bruit non résonant. Il est ainsi par exemple possible, en faisant varier la fréquence du faisceau Stokes, de déterminer le spectre Raman du milieu résonant. Sur la figure 15CB, sont représentés les signaux CARS intégrés sur les demi-espaces (k _x >0) et (k _x <0) en fonction du lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes par rapport à l'interface. Leur différence est non nulle uniquement au voisinage de l'interface (x = 0). Une imagerie CARS sans bruit de fond non résonant peut ainsi être obtenue au voisinage de l'interface. Les figures 16A à 16C présentent ainsi 3 modes de détection possibles pour la microscopie D-CARS associant l'approche Dz-CARS et l'approche Dk-CARS. Pour chaque mode de détection une simulation numérique représente l'image obtenue pour une bille de 3 μιη de diamètre dans un solvant de type aqueux (longueur d'onde pompe 730 nm, longueur d'onde Stokes 814 nm, ouverture numérique de l'objectif d'excitation 1.2 dans l'eau, ouverture numérique de l'objectif de collection 1.2 dans l'eau). La figure 16A représente le mode de détection XZ permettant une détection aux interfaces perpendiculaires à l'axe X et aux interfaces perpendiculaires à l'axe Z. Pour cela, on calcule la différence des signaux diffusés CARS respectivement dans les situations a et β en intégrant le signal CARS dans l'espace (k _x >0) (problème a, Figure 7A) et dans l'espace (k _x <0) (problème β, Figure 7B), le référentiel choisi étant celui de la direction des faisceaux d'excitation. Ainsi par exemple, en modifiant la position relative du lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes, on obtient l'image de la Figure 16A dans un plan équatorial de la bille. La figure 16B représente le mode de détection YZ permettant une détection aux interfaces perpendiculaires à l'axe Y et aux interfaces perpendiculaires à l'axe Z. Dans cet exemple, on calcule pour différentes positions la différence des intensités lumineuses intégrées dans l'espace (k _y >0) (problème a, Figure 7 A) et dans l'espace (k _y <0) (problème β, Figure 7B). La figure 16C représente le mode de détection XYZ. L'image est calculée en faisant la différence deux à deux des intensités lumineuses I _a (k _x , k _y ) et I (-k _x ,-k _y ) mesurées dans deux directions k (k _x ,k _y ,k _z ) et k" (-k _x ,-k _y ,k _z ) opposées, respectivement dans les situations a et β, les directions étant contenues dans le cône angulaire dont l'angle d'ouverture est défini par l'ouverture numérique de collection du signal diffusé CARS (par exemple 1.2 dans l'eau). Là encore, les coordonnées des vecteurs d'onde k et k " sont exprimées dans les référentiels des faisceaux d'excitation propres respectivement aux situations a et β.

Avantageusement, dans l'exemple de la figure 11 , on pourra prévoir des moyens de balayage angulaire des faisceaux d'excitation, notamment pour les applications en microscopie. Avantageusement, comme dans l'exemple du dispositif de la figure 8 A, on pourra choisir un miroir de renvoi des faisceaux d'excitation 813 sphérique. Par ailleurs, il est avantageux de positionner les caméras 901, 902 dans les pupilles de sortie respectivement des objectifs 811, 807, afin de garder la direction d'incidence des faisceaux d'excitation centrée sur la caméra dans chacune des situations a et β. Une calibration des caméras en solution est également possible pour repérer, dans chacune des situations a et β, et pour chaque angle de balayage, la direction des faisceaux d'excitation par rapport à laquelle sera mesurée la déviation du signal diffusé CARS.

La détection Dz-CARS ou D-CARS a été décrite au travers des exemples de mise en œuvre des figures 8A et 1 1 dans une application deux couleurs, utilisant deux sources laser fines spectralement. Dans une application dite multiplexe, on pourra choisir une source d'émission du faisceau Stokes large spectralement, générée par exemple par une impulsion femtoseconde ou par un supercontinuum généré par une fibre optique ou un autre milieu dispersif. Le signal pompe reste lui fin spectralement. Dans cette application, il sera possible d'acquérir un spectre Raman en une seule impulsion, par exemple en utilisant deux spectromètres à fente ou un spectromètre unique équipé d'une caméra CCD dans lequel on injecte les deux signaux détectés dans les deux situations a et β. Dans cette application, il s'agit d'acquérir les spectres dans chacune des situations (a ou β) et de faire leur différence.

Dans une application dite trois couleurs, on utilise trois longueurs d'ondes de pulsations associées ω , ω ₂ et ω ₃ pour générer un signal CARS à la pulsation ω -ω +ω . Le signal CARS peut être rendu sans bruit non résonant en détectant les signaux à la pulsation ω _ι -ω ₂ +ω ₃ dans les situations (a ou β) et en faisant leur différence.

Bien que la méthode de détection ait été décrite dans le cas de la diffusion CARS, elle s'applique aussi bien à d'autres processus non linéaires, du 2 ^eme ou du 3 ^eme ordre, à la fois pour des applications de spectroscopie ou pour des applications de microscopie par détection aux interfaces axiales, permettant ainsi de révéler des interfaces entre milieu résonant et non résonant. Dans chaque cas, on procède à une analyse du signal optique non linéaire résultant de l'interaction d'un ou plusieurs faisceaux d'excitation avec un échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant. Cette analyse spatiale permet soit de révéler l'interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant, soit de caractériser un spectre du milieu résonant.

Selon un exemple, on peut utiliser un processus de génération de troisième harmonique résonant dans lequel la résonance est une résonance électronique, en excitant avec un faisceau d'excitation pompe unique, de pulsation C0p, un échantillon comprenant une interface entre un milieu résonant et un milieu non-résonant. Par exemple on utilise une source laser picoseconde ou femtoseconde de type oscillateurs Ti : Saphir, Nd :verre, lasers fïbrés dopés Ytterbium ou Erbium.

Selon un autre exemple, on peut utiliser un processus de mélange à quatre ondes résonant dans lequel la résonance est une résonance électronique, en excitant avec un faisceau d'excitation pompe unique, de pulsation C0p, un échantillon comprenant une interface entre un milieu résonant et un milieu non-résonant. Par exemple on utilise une source laser picoseconde ou femtoseconde de type oscillateurs Ti : Saphir, Nd :verre, lasers fïbrés dopés Ytterbium ou Erbium.

Les deux exemples décrits précédemment traitent de résonances électroniques. On les trouve dans des atomes, de molécules, des cristaux semi-conducteurs, etc.

Selon un autre exemple, on pourra exciter la seconde harmonique résonante avec un faisceau pompe unique, ou on pourra faire de la somme de fréquence avec un faisceau pompe et un faisceau sonde (effet non linéaire du 2 ^eme ordre).

Bien que décrits à travers un certain nombre d'exemples de réalisation détaillés, le dispositif de détection et la méthode selon l'invention comprennent différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention, telle que définie par les revendications qui suivent.