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Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR DETECTING SAMPLE GLYCOSYLATION AND TERMINAL MODIFICATION STATES DURING PROTEIN PURIFICATION PROCESS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/110874
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention provides a method for detecting immunoglobulin glycosylation and terminal modification states during an immunoglobulin purification process. With the method, immunoglobulin glycosylation, N-terminal pyroglutamic acidification, and C-terminal de-lysine can be detected simultaneously and rapidly. The method comprises the following steps: 1) separating immunoglobulin by using cation exchange resin, and collecting different components according to retention time; 2) denaturing the immunoglobulin components in Step 1) by using a denaturant, and reducing the immunoglobulin components by using a reducing agent, so that light chain and heavy chain are split; 3) separating the immunoglobulin light chain and heavy chain in Step 2) by using reversed-phase ultrahigh-pressure liquid chromatography; 4) detecting molecular weights of the light chain and the heavy chain obtained in Step 3) by using mass spectrometry; and 5) analyzing the chromatographic data in Step 3) and the mass spectral data in Step 4), to detect the glycosylation and terminal modification states of the immunoglobulin.

Inventors:
ZHU BAOGUO (CN)
PENG YUCAI (CN)
YANG JIAMING (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/074596
Publication Date:
July 24, 2014
Filing Date:
April 24, 2013
Export Citation:
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Assignee:
LIVZON MABPHRAM INC (CN)
International Classes:
G01N30/02
Domestic Patent References:
WO2011026640A12011-03-10
Foreign References:
CN102308216A2012-01-04
CN101177453B2010-09-29
CN102675460A2012-09-19
Other References:
YIN, SHENG ET AL.: "Characterization of Therapeutic Monoclonal Antibodies Reveals Differences Between In Vitro and In Vivo Time-Course Studies", PHARM RES., vol. 30, 6 September 2012 (2012-09-06), pages 167 - 178, XP035152041
CAI, YUN ET AL.: "Application of mass spectrometry in analysis of glycoprotein", LETTERS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 13, no. 5, September 2002 (2002-09-01), pages 404 - 407, XP008179731
See also references of EP 2947454A4
Attorney, Agent or Firm:
SBZL IP LAW OFFICE (CN)
北京商专永信知识产权代理事务所(普通合伙) (CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1、一种测定免疫球蛋白纯化工艺过程中样品的糖基化和末端修饰情况的方法,所述 方法包括以下步骤:

1 ) 使用阳离子交换层析法分离免疫球蛋白, 按保留时间收集不同组分;

2) 使步骤 1 ) 中免疫球蛋白组分经变性剂变性后, 使用还原剂还原, 从而拆分轻链 和重链;

3 ) 使用反相超高压液相色谱分离步骤 2) 中免疫球蛋白的轻链和重链;

4) 使用质谱测定步骤 3 ) 中获得的轻链和重链的分子量;

5 ) 分析步骤 3 ) 中的色谱数据和步骤 4) 中的质谱数据, 从而测定所述免疫球蛋白 的糖基化和末端修饰情况。

2、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 1 ) 采用常规强阳离子交换 层析柱的上样缓冲盐为 20 mM 磷酸钠缓冲盐,洗脱缓冲盐为 20mM磷酸钠和 1M氯化钠 缓冲盐 (pH=6.0), 紫外吸收 280nm监测流出组分。

3、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 2) 包括: 向一定量的免疫 球蛋白中加入 10-30 μ 的 1-6 M盐酸胍水溶液,混合均匀后加入 1-4 μ 二硫苏糖醇 (DTT) 水溶液, 使免疫球蛋白发生变性、还原反应,其中,反应溶液中 DTT终浓度为 25-100mM, 免疫球蛋白终浓度为 0.2-3μ§/μΙ^。

4、根据权利要求 3所述的方法,其特征在于,所述步骤 2)中 DTT终浓度为 50 mM。

5、 根据权利要求 3所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 2) 中免疫球蛋白发生变性、 还原反应温度为 50-65 °C, 反应时间为 45 min-120min。

6、 根据权利要求 5所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 2) 中免疫球蛋白发生变性、 还原反应温度为 65 °C, 反应时间为 45 min。

7、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 3 ) 包括: 采用 C4反向超 高压液相色谱分离步骤 2)中免疫球蛋白的轻链和重链, 以实现所述轻链和重链的基线分 离。

8、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 4) 包括: 采用电喷雾电离质谱测定步骤 3 ) 中获得的轻链和重链的分子量, 其中在 0-5min, 流路通往废液, 5-16min, 流路通往质谱, 然后采用正离子模式采集质谱数据。 质谱条件设定为: 锥孔气流为 50.0L/Hr, 脱溶剂气体为 800.0L/Hr, 脱溶剂温度为 500 °C, 锥孔电压为 20-40 V, 扫描范围为 400-2500Da, 扫描时间为 ls。

9、 根据权利要求 8所述的方法, 其特征在于, 所述锥孔电压为 25-30V。

10、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 5 ) 包括: 由步骤 3 )中获得的色谱峰面积计算得到所述免疫球蛋白的轻链的 N端焦谷氨酸化比例, 由步骤 4) 中获得的质谱数据计算得到所述免疫球蛋白的重链的糖型相对含量以及 N端 焦谷氨酸化和 C端脱赖氨酸比例。

11、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白。

12、根据权利要求 11所述的方法,其特征在于,所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白 IgGl 和 IgG2亚型。

13、 根据权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述免疫球蛋白的糖基化和末端修 饰情况包括免疫球蛋白的轻链 N端焦谷氨酸化, 以及重链的天冬酰胺糖基化和 N端焦谷 氨酸化、 C端脱赖氨酸。

14、 根据权利要求 1-13任一项所述的方法, 其特征在于, 所述方法在免疫球蛋白纯 化中测定蛋白糖基化和末端修饰情况试剂盒中的应用。

Description:
一种测定蛋白纯化工艺过程中样品的糖基化和 末端修饰情况的方法

技术领域 本发明涉及生物技术领域。 具体而言, 本发明提供了一种测定免疫球蛋白纯化工 艺过程中样品的糖基化和末端修饰情况的方法 。 同时本发明还涉及一种免疫球蛋白纯 化中测定蛋白糖基化和末端修饰情况的试剂盒 。

近十年来, 单克隆抗体在生物医药界、 乃至整个医药行业里取得重大的成功和巨大 的发展。 与传统小分子药物相比, 单克隆抗体具有特异性强, 疗效显著, 副作用小, 用 量少等优点。 就药物分子特性而言, 抗体具有更大的不均一性。 抗体的这一特性是由多 种因素引起的, 翻译后修饰是其中最重要的内在因素。 常见的抗体翻译后修饰包括糖基 化, N端焦谷氨酸化, C端脱赖氨酸, 脱酰胺, 氧化, 异构化等。 在抗体药物研发的多 个环节, 如分子鉴定、 工艺开发、 质量监控等, 均需要对翻译后修饰进行检测分析。 抗体 IgG糖基化发生在重链 Fc区的天冬酰胺, 属 N-糖基化, 是抗体的重要结构组 成。 IgG糖链的核心单元由两个 N-乙酰葡萄糖胺和三个甘露糖的双叉结构连接 成, 根 据末端半乳糖、 核心岩藻糖、 末端唾液酸等的差异, 可以组成多种不同的糖链结构。 IgG 的糖基化是不均一的, 表现为不同的糖型和含量。 糖基化差异可以影响抗体的生物学活 性和药代特征, 如 CDC、 ADCC、 体内清除半衰期等。 抗体 IgG 的 N 端氨基酸为谷氨酰胺时, 容易发生环化反应而生成焦谷氨酸 (pyroglutamic acid, pyroE 此反应可以自发进行, 也可以在酶催化条件下进行。在抗体 IgG分子的 C端, 则容易发生脱赖氨酸(-K)。 在大部分情况下, 两者对抗体的生物活性 没有影响, 但亦有报道指某些抗体的 Ν端焦谷氨酸化可能会影响其与抗原的结合力 此 外, Ν端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和 C端脱赖氨酸均会影响抗体的电荷分布, 而电荷特性 是抗体质量监控的重要指标之一。 因此, 建立快速检测抗体 IgG糖基化和末端修饰的分析方法在抗体研发中 具有重要 意义。 目前, 本领域一般对糖基化和末端修饰单独进行检测 。 酶解荧光标记法是 IgGl糖 基化测定的经典定量方法, 但样品处理过程相当复杂, 耗时长, 而且需要样品量大; 也 有使用质谱测定 IgG酶解片段进行糖基化分析, 如 papain酶和 IdeS酶等, 但这些方法都 存在一些不足, 如酶切位点选择性不强, 或成本过高, 或样品处理复杂等, 不适宜常规 或工艺开发样品的批量检测。 应用 LC-MS进行肽图分析理论上可以同时检测抗体的 基化和末端修饰, 但含糖多肽的分离、 测定和数据分析存在诸多技术难点, 不适用于糖 基化定量分析, 而且样品处理过程复杂, 耗时长, 酶切过程也可能对抗体原有末端修饰 产生影响。 在免疫球蛋白纯化过程中, 需要对蛋白的纯化情况进行随时检测, 检测需用 样品量大, 检测耗时长仍是目前最大的问题。 因此, 目前仍未有适用于抗体研发的对少 量 IgG的糖基化和末端修饰同时进行快速测定的报 道。 发明内容 为了解决上述技术问题, 本发明的目的是提供一种同时测定免疫球蛋白 (即抗体) 纯化工艺过程中样品的糖基化和末端修饰情况 的方法。 同时本发明还涉及一种免疫球 蛋白纯化中测定蛋白糖基化和末端修饰情况的 试剂盒。 本发明提供一种同时测定免疫球蛋白纯化工艺 过程中样品的糖基化和末端修饰情 况的方法, 所述方法包括以下步骤:

1 ) 使用阳离子交换层析法分离免疫球蛋白, 按保留时间收集不同组分;

2) 使步骤 1 ) 中免疫球蛋白组分经变性剂变性后, 使用还原剂还原, 从而拆分轻链 和重链;

3 ) 使用反相超高压液相色谱分离步骤 2) 中免疫球蛋白的轻链和重链;

4) 使用质谱测定步骤 3 ) 中获得的轻链和重链的分子量;

5 ) 分析步骤 3 ) 中的色谱数据和步骤 4) 中的质谱数据, 从而测定所述免疫球蛋白 的糖基化和末端修饰情况。 其中, 所述免疫球蛋白优选为人免疫球蛋白, 优选为人免疫球蛋白 IgG, 进一步优 选为人免疫球蛋白 IgGl和 IgG2亚型。 并且, 所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况优选 包括免疫球蛋白的轻链 N端焦 谷氨酸化, 以及重链的天冬酰胺糖基化和 N端焦谷氨酸化、 C端脱赖氨酸。 在本发明提供的测定方法中, 所述步骤 1 ) 包括: 采用常规强阳离子交换层析柱的上样缓冲盐为 20 mM磷酸钠缓冲盐,洗脱缓冲盐为 20 mM磷酸钠和 1M氯化钠缓冲盐 (pH=6.0), 紫外吸收 280nm监测流出组分。 具体地, 所述步骤 2) 包括: 向一定量的免疫球蛋白中加入 10-30 μ 的 1-6 M盐酸 胍水溶液, 混合均匀后加入 1-4 二硫苏糖醇 (DTT) 水溶液, 使免疫球蛋白发生变性、 还原反应,其中,反应溶液中 DTT终浓度为 25-100mM,免疫球蛋白终浓度为 0.2-3μ § /μΙ^。 优选地, 所述步骤 2) 中的 DTT终浓度为 50 mM。 优选地, 所述步骤 2) 免疫球蛋白发生变性、 还原反应温度为 50-65 °C, 反应时间为 45 min-120min。 更优选地, 所述步骤 2) 免疫球蛋白发生变性、 还原反应温度为 65 °C, 反应时间为 45 min。 具体地, 所述步骤 3 ) 具体包括: 采用反向超高压液相色谱分离步骤 2)中免疫球蛋白的轻链和重链, 以实现所述轻链 和重链的基线分离, 据本发明的具体实施方案, 采用的液相系统可以为 UPLC ( Waters, ACQUITY 色谱柱: Waters,ACQUITY UPLC column,BEH C4, 1.7μηι (粒径), 300Α (孔 径), 2.1 x50 mm。 流动相洗脱条件对轻链和重链的分离影响较大 , 优选地, 色谱条件设定为: 色谱柱温度设定为 55-65 °C, 进样量 0.2-3μ §; 流动相 X为 0.1 %甲酸水, 流动相 Υ为 0.1 %甲酸乙腈, 流速为 0.4mL/min; 梯度洗脱条件为: 流速

时间 (min) 流动相 X 流动相 Y

(mL/min)

0 90 10 0.4

5 90 10 0.4 5.1 75 25 0.4

15 65 35 0.4

15.1 10 90 0.4

18 10 90 0.4

18.1 90 10 0.4

21 90 10 0.4

具体地, 所述步骤 4) 具体包括: 采用电喷雾电离质谱测定步骤 3 ) 中获得的轻链和重链的分子量, 其中在 0-5min, 流路通往废液, 5-16min, 流路通往质谱, 然后采用正离子模式采集质谱数据; 优选地, 质谱条件设定为: 锥孔气流为 50.0L/Hr, 脱溶剂气体为 500-800.0L/Hr, 脱溶剂温度为 350-500 °C, 扫 描范围为 400-2500Da, 扫描时间为 0.5-2s。 采样锥孔电压对质谱信号影响较大, 设定为 20-40 V, 优选地, 设定为 20-30V。 具体地, 所述步骤 5 ) 具体包括: 由步骤 3 ) 中获得的色谱峰面积计算得到所述免疫球蛋白 的轻链的 N端焦谷氨酸化 比例, 由步骤 4)中获得的质谱数据通过去卷积化计算, 得到所述免疫球蛋白的重链的糖 型相对含量以及 N端焦谷氨酸和 C端脱赖氨酸比例。 具体地, 所述方法在免疫球蛋白纯化中测定蛋白糖基化 和末端修饰情况试剂盒中的 应用。 在免疫球蛋白还原反应中, 蛋白的二硫键在 DTT的作用下发生断裂, 生成两条一 样的轻链和两条一样的重链。 使用 C4反相 -超高压液相色谱分离轻重链混合物, 含或 不含 N端焦谷氨酸的轻链与重链 (含不同糖型和末端修饰) 能实现基线分离, 然后采 用 ESI-MS在线测定其分子量。 由于含不同糖型或末端修饰的重链有不同的分 子量, 而且各种重链的比例与其分子量峰的强度成正 比, 因此糖型相对含量和重链 N端焦谷 氨酸化、 C端脱赖氨酸比例均可以由重链质谱数据计算 得。 此外, 轻链 N端焦谷氨 酸化比例由色谱峰面积计算获得。 目前本领域已有一些技术来测定蛋白质的分子 量或其修饰情况, 但与本发明的方 法相比, 都存在缺陷或不足之处。 例如质谱仪 (MS), 如 MALDI-MS, 常用于测定抗体 完整蛋白水平的分子量。 质谱方法虽然对样品兼容性好, 操作方便, 但测得分子量结 果分辨率较低; 作为抗体 IgG糖基化的经典定量方法一一酶解荧光标记法 采用 N糖酐 酶 PNGaseF酶切 IgG获得糖链, 经纯化后再进行荧光标记、 高效液相色谱或毛细管电 泳分析; 该方法选择性强, 准确度高, 但样品处理过程复杂, 耗时长(通常需要 2天), 而且需要样品量较大 (一般至少为 100μ § ) ; 也有使用 ESI-MS测定 IgG酶解片段进行 糖基化分析, 但 papain酶切位点的选择性低, 会增加副产物而影响数据分析; 免疫球 蛋白 G降解酶 S ( IdeS ) 选择性很强, 但 IdeS的成本高, 不适宜常规或工艺开发样品 的批量检测; 应用 LC-MS 进行胰酶肽图分析理论上可以同时检测抗体的 糖基化和末 端修饰, 但含糖多肽的分离、 测定和数据分析存在诸多技术难点, 而且其检测灵敏度低, 不适于低含量糖基的检测, 此外样品处理过程复杂, 耗时长, 酶切过程可能对抗体原有 末端修饰产生影响。 相比之下, 本方法采用 ESI-MS测定抗体多电荷离子, 然后进行去卷积化计算, 大大提高了分辨率和检测结果的准确度 (<30ppm)。 此外, 本发明样品处理简单, 只需 还原剂进行反应(45min),样品用量少(5 g),而且样品的 UPLC-MS检测只需在 16min 内完成, 便可同时得到抗体糖基化、 N端焦谷氨酸化和 C端脱赖氨酸的数据。 本发明 尤其适用于样品量少的实验, 如克隆筛选, 以及工艺开发过程的批量快速检测; 同时, 本发明也适用于常规用量 (100μ § ) 的样品检测。 采用本发明的方法,可以检测不同抗 体如 IgGl、 IgG2 的糖基化和末端修饰, 而且该方法可用于抗体工艺开发过程中样品 的检测。 此外, 结合羧肽酶 B和阳离子交换色谱(CEX-HPLC ), 应用本方法还可以对 抗体电荷异构体的结构进行表征和鉴定。 免疫球蛋白可以分为 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE五类,其中 IgG可分为 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4等亚型, 目前市场上销售的单克隆抗体药物 70%-80%属于 IgGl类蛋白。 根据抗体 IgGl 中人源氨基酸序列的组成, 又可划分为嵌合型抗体 IgGl、 人源化抗体 IgGl 等多种蛋白。 本发明提供了一种测定免疫球蛋白纯化工艺过 程中样品的糖基化和 末端修饰情况的方法, 尤其提供了一种免疫球蛋白 IgGl、 IgG2的糖基化和末端修饰情 况的方法。 该方法能够同时、 快速地对蛋白纯化过程中免疫球蛋白的糖基化 、 N端焦 谷氨酸化和 C端脱赖氨酸进行测定。 具体而言, 本发明通过在蛋白纯化过程中对少量 蛋白进行还原, 可以使其轻链和重链正确拆分开, 且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化 和末端修饰情况。 经还原的人免疫球蛋白 (即抗体) 进行超高压液相色谱 -质谱联用分 析, 可以同时、 快速地对少量的免疫球蛋白 (特别是人免疫球蛋白) 糖基化、 N端焦 谷氨酸环化和 C端脱赖氨酸进行测定。 附图说明 以下, 结合附图来详细说明本发明的实施方案, 其中: 图 1A-1D显示了实施例 1中不同 DTT用量对抗体 A轻重链分离情况的比较结果。 图 2A-2C显示了实施例 1中不同 DTT还原反应温度和时间对抗体 A轻重链分离和 末端修饰情况的影响。 图 3A-3D分别显示了实施例 1 中洗脱梯度 1、 2、 3、 4对轻重链色谱分离情况的影 响比较。 图 4A-4D显示了实施例 1中不同锥孔电压 (20V, 25V, 30V, 40V) 对重链去卷积 化分子量质谱峰强度的影响。 图 5A显示了实施例 2中抗体 A经还原后测定的色谱图; 图 5B-1至图 5B-3分别显 示了抗体 A经还原后测定的轻链,焦谷氨酸化轻链和重 质谱图。图 5C显示了实施例 2 中抗体 B经还原后测定的色谱图;图 5D-1至图 5D-2分别显示了抗体 B经还原后测定的 轻链和重链质谱图。 pyroE为 N端焦谷氨酸, -K为 C端脱赖氨酸, -H 2 0为脱水。 图 6A显示了实施例 3中抗体 A阳离子交换树脂组分 1和组分 5经还原后测定的色 谱图; 图 6B显示了抗体 A组分 1和组分 5经还原后测定的重链质谱图。 pyroE为 N端 焦谷氨酸, -K为 C端脱赖氨酸, -¾0为脱水。 图 7显示了实施例 4中抗体 C (IgG2) 经还原后测定的色谱图。 pyroE为 N端焦谷 氨酸, -K为 C端脱赖氨酸, -¾0为脱水。 具体实施方式 以下参照具体的实施例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解, 这些实施例仅用 于说明本发明, 其不以任何方式限制本发明的范围。 下述实施例中的抗体 A 为嵌合型抗体 IgGl, (具体制备方法如中国专利: CN 101177453B说明书 10-13页实施例 1-6所示,其中说明书 13页实施例 6筛选出的 C2-11-12 嵌合抗体即为本发明的抗体 A); 抗体 B为人源化抗体 IgGl, (由珠海丽珠单抗生物技术 有限公司生产, 具体制备方法如中国专利: CN 102675460A说明书 12-18页实施例 1-7 所示, 其中说明书 17-18页实施例 7筛选出的 AT-132抗体即为本发明的抗体 B); 抗体 C 为全人源抗体 IgG2, 由 Amgen Canada Inc.生产。 下述实施例中的实验方法, 如无特殊说明, 均为常规方法。 下述实施例中所用的 药材原料、 试剂材料等, 如无特殊说明, 均为市售购买产品。 实施例 1 免疫球蛋白还原方法的条件筛选

1.1 考察还原剂 DTT的用量 考察了 4个不同用量的 DTT对轻、重链分离的影响。取 5μ § 抗体 A蛋白 4份, 分别 加入到 ΙΟμΙ^ 6 Μ盐酸胍溶液中,再分别加入 0.1M DTT溶液 2 L禾卩 5 L,以及 0.5M DTT 溶液 2 L和 4 L,最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度分别为 10mM,25mM,50mM 和 lOOmM, 使其与所述 IgGl蛋白在 65°C下反应 45 min。 采用 C4反向超高压液相色谱分离反应所得的轻链和 链,使用的液相系统为 UPLC ( Waters, ACQUITY 色谱柱: Waters, ACQUITY UPLC column, BEH C4, 1.7μηι (粒径), 300Α (孔径), 2.1x50 mm。 色谱条件设定为: 色谱柱温度设定为 60°C, 进样量 1μ §; 流 动相 X为 0.1%甲酸水, 流动相 Υ为 0.1%甲酸乙腈, 流速为 0.4mL/min ; 梯度洗脱条件

流速

时间 (min) 流动相 X 流动相 Y

(mL/min)

0 90 10 0.4

5 90 10 0.4

5.1 75 25 0.4

15 65 35 0.4

15.1 10 90 0.4 18 10 90 0.4

18.1 90 10 0.4

21 90 10 0.4 采用电喷雾电离质谱测定经色谱分离获得的轻 链和重链的分子量, 其中在 0-5min, 流路通往废液, 5-16min, 流路通往质谱, 然后采用正离子模式采集质谱数据; 质谱条件 设定为: 锥孔气流为 50.0L/Hr, 脱溶剂气体为 800.0L/Hr, 脱溶剂温度为 500°C, 扫描范 围为 400-2500Da, 扫描时间为 ls, 采样锥孔电压设定为 25V。 结果如图 1A-1D所示, DTT终浓度为 10mM时, 抗体 A轻重链未能完全拆分; 当 DTT浓度为 25M时, 轻重链大部分情况下可以拆分完全, 但有极个别样品色谱分离不理 想; 当 DTT浓度为 50-100mM时, 所有抗体样品轻重链完全拆分。 为保证抗体轻重链拆 分和色谱分离, 确定使用 25-100mM DTT作为 0.2-3 μ§ /μΙ^抗体蛋白的合适还原剂用量, 50mM为优选用量。

1.2 考察还原反应的温度和时间 取 5 g抗体 A若干份分别加入到 ΙΟμΙ^ 6Μ盐酸胍溶液中,再加入 0.5Μ DTT溶液 2μ∑, 最后加适量 6 Μ盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 考察了 37°C、 50°C、 65 °C这三个反 应温度以及 20 min到 120 min的反应时间对抗体 IgGl轻、重链分离和末端修饰结果的影 响。 色谱和质谱条件与实施例 1.1一致。 实验数据使用 Waters公司的 BiopharmaLynx 1.3软件进行处理。 选择" Intact Protein" 模式进行去卷积化 (Deconvolution)处理, 方法参数如下: Lock Mass (Da): 556.2771; TIC Threshold: 300-500; Deconvolution m/z Range:轻链为 850-2000, 重链为 950-1500; Protein MW Range: 轻链为 20000-30000 Da, 重链为 42000-60000 Da。 抗体 IgG各糖型的比例根 据重链质谱图中各糖型分子量峰的强度进行归 一化计算得到。 含 N端焦谷氨酸的轻链与 不含焦谷氨酸的轻链可实现基线分离, 因此对色谱峰面积进行积分, 可计算出轻链 N端 焦谷氨酸化的比例。重链 N端焦谷氨酸化和 C端脱赖氨酸是通过对 G0F重链的分子量分 析获得的。 具体结果如图 2和表 1所示。 其中, 由图 2A-1至图 2A-3可见, 当还原温度为 37°C 时, 抗体轻重链未完全分开, 说明该温度下还原反应不彻底。 由图 2B-1至图 2B-3以及 图 2C-1至图 2C-3可见, 当还原温度升高为 50°C及 65 °C (反应时间≥45min)时, 抗体轻 重链分离情况比较理想, 说明 DTT还原在 50°C以上的高温下反应比较彻底。此外, 从下 表 1 中可以看出, 在相同的还原温度下, 随着反应时间的延长, 样品轻重链末端的修饰 比例均呈上升趋势; 同样, 在相同的反应时间里, 随着反应温度的升高, 样品轻重链末 端修饰比例也均逐渐增加。 并且, 考虑到高温条件下可能促进 N端焦谷氨酸化和 C端脱 赖氨酸反应, 须考察样品制备过程对末端修饰的影响。 如表 1所示, 当 45!^!1≤反应时间

<120min, 末端修饰数据的变化幅度均不大, 因此, 所用样品制备条件对抗体末端修饰的 影响较小。

表 1 不同 DTT还原温度和时间条件下抗体 IgGl末端修饰情况比较

DTT还原条件 修饰比例 (%) 时间 焦谷氨酸化 焦谷氨酸化 脱赖氨酸 温度

(min) (轻链) (重链) (重链)

30 一 81.22 85.42

45 70.47 80.59 85.04

37 °C 60 70.55 81.68 84.32

90 75.53 81.89 85.12

120 77.66 80.33 86.71

30 71.38 81.87 84.39

45 77.13 83.10 86.60

50 °C 60 78.75 82.31 87.13

90 80.62 81.39 87.45

120 80.67 79.78 88.45

65 °C 20 79.51 83.96 87.17 30 80.56 81.20 87.17

45 81.12 82.62 87.41

60 81.11 82.13 88.45

90 81.58 81.81 88.05

120 81.12 81.24 89.30 综上, 确定还原反应条件为: 在 50-65°C下反应, 反应时间为: 451^!1≤反应时间 ≤120min。

1.3 方法精密度和重现性 在优化后的实验条件下 (取 5μ § 抗体 A若干份分别加入到 10μΙ^ 6Μ盐酸胍溶液中, 再加入 0.5Μ DTT溶液 2 L, 最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 65 °C 反应 45min),评价本方法测定抗体 A的糖基化、 N端焦谷氨酸环化和 C端脱赖氨酸的精 密度和重现性。 色谱和质谱条件与实施例 1.1一致。 数据处理方法与实施例 1.2—致。 连续测定五次, 结果如表 2所示。 IgGl各糖型比例、 N端焦谷氨酸环化和 C端脱赖 氨酸修饰比例的测定结果 RSD%均小于 0.5%, 糖型含量测定结果的 RSD%小于 7%。 测定五个平行处理的样品, 结果如表 3所示。 N端焦谷氨酸环化和 C端脱赖氨酸修 饰比例的测定结果 RSD%均小于 1%, 糖型含量测定结果的 RSD%小于 6%。 表 2 方法精密度测定 末端修饰 百分比 (%) RSD

平均值 或糖型 1 2 3 4 5 (%) 轻链焦谷氨酸 83.51 83.55 83.49 83.59 83.58 83.54 0.05

G0F重链焦谷氨酸 90.10 89.58 90.04 90.04 89.81 89.91 0.24

G0F重链脱赖氨酸 87.95 88.17 88.15 88.43 87.99 88.14 0.22

G0F 74.40 74.03 73.22 73.80 74.25 73.94 0.62 GIF 12.64 12.79 12.76 13.01 13.13 12.87 1.55

Man5 4.61 4.75 5.35 5.10 4.79 4.92 6.09

GOF-GN 4.10 4.15 4.40 3.98 3.85 4.10 5.02

GO 4.24 4.28 4.27 4.12 3.98 4.18 3.06

表 3 方法重现性测定

综上, 该方法的精密度和重现性良好。

1.4 流动相优化 基于反相超高压液相色谱, 考察了流动相洗脱梯度对轻重链色谱分离的影 响。 样品 使用 5 g抗体 A加入到 ΙΟμΙ^ 6Μ盐酸胍溶液中, 再加入 0.5Μ DTT溶液 2μ 最后加适 量 6 Μ盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 65°C反应 45min。 反应产品采用不同流动相 梯度进行分离, 其他色谱条件和质谱条件与实施例 1.1一致。 流动相 X为 0.1%甲酸水, 流动相 Y为 0.1%甲酸乙腈, 流速为 0.4mL/min, 考察了四种洗脱梯度, 具体如下: 梯度 1 : 0-5min, 10%Y; 5-5.1min, 10%-18%Y; 5.1-15min, 18%-28%Y; 15-15. lmin, 28%-90%Y; 15.1-19.0min, 90%Y; 19.0- 19. lmin, 90%-10%Y, 19.1-22.0min, 10%Y。 梯度 2: 0-5min, 10%Y; 5-5. lmin, 10%-25%Υ; 5.1-8min, 25%-27%Υ; 8-18min, 27%-30%Υ; 18-18. lmin, 30%-90%Υ; 18.1-21.0min, 90%Υ; 21.0-21. lmin, 90%-10%Υ, 21.1-24.0min, 10%Υ。 梯度 3: 0-5min, 10%Y; 5-5. lmin, 10%-25%Y; 5.1-8min, 25%-26%Y; 8-18min, 26%-28%Y; 18-18. lmin, 28%-90%Y; 18.1-21.0min, 90%Y; 21.0-21. lmin, 90%-10%Y, 21.1-24.0min, 10%Y。 梯度 4: 0-5min, 10%Y; 5-5. lmin, 10%-25%Υ; 5.1-6min, 25%-26%Υ; 6-10min, 26%-27%Υ; 10-15min, 27%-32%Υ; 15-15. lmin, 32%-90%Υ; 15.1-18.0min, 90%Υ; 18.0-18. lmin, 90%-10%Υ, 18.1-21.0min, 10%Υ。 轻链和重链的色谱分离结果如图 3所示。 综上, 实现轻重链基线分离的最佳流动相 洗脱梯度为梯度 4: 0-5min, 10%Y; 5-5. lmin, 10%-25%Y; 5.1-6min, 25%-26%Υ; 6-10min, 26%-27%Υ; 10-15min, 27%-32%Υ; 15-15. lmin, 32%-90%Υ; 15.1-18.0min, 90%Υ;

18.0- 18. lmin, 90%-10%Υ, 18.1-21.0min, 10%Υ。

1.5 质谱条件优化 基于优化后的流动相洗脱梯度 ( 0-5min, 10%Y; 5-5. lmin, 10%-25%Y; 5.1-6min, 25%-26%Υ; 6-10min, 26%-27%Υ; 10-15min, 27%-32%Υ; 15-15. lmin, 32%-90%Υ;

15.1- 18.0min, 90%Υ; 18.0-18. lmin, 90%-10%Υ, 18.l-21.0min, 10%Υ), 考察了质谱参数对 基线分离后的轻链和重链质谱信号的影响。 锥孔气流, 脱溶剂气体和脱溶剂温度等对质 谱信号影响不大, 基本采用仪器供应商建议参数。 本发明方法对采样锥孔电压进行了优 化。 样品使用 5 g抗体 A加入到 ΙΟμΙ^ 6Μ盐酸胍溶液中, 再加入 0.5Μ DTT溶液 2 L, 最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 65 °C反应 45min。 反应产品采用实 施例 1.1中的色谱条件进行分离,质谱采样锥孔电压 分别设定为 20V, 25V, 30V和 40V, 其他质谱条件与实施例 1.1一致。 随着电压的升高, 轻重链的总离子流(峰面积)都有所 增加; 而如图 4A至图 4D所示, 重链的去卷积化分子量质谱信号在 20-25V之间时有较 明显增加, 在 25-30V之间没有明显差别, 在 40V时则有显著降低。 综上, 确定该方法 的质谱采样锥孔电压为 25-30V。 实施例 2 采用本发明的 UPLC-MS方法测定抗体 A和抗体 B ( IgGl )的糖基化和末 端修饰情况 采用优化后的还原条件(5 μ § 抗体 A加入到 10 μ 6M盐酸胍溶液中,再加入 0.5 M DTT溶液 2 L, 最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 65 °C反应 45 min), UPLC分离 (与实施例 1.1一致), ESI-MS检测 (与实施例 1.1一致) 和归一化数据处理 (与实施例 1.2—致)分析抗体 A和抗体 B的糖基化和末端修饰。 抗体 A轻链和重链的 N端首个氨基酸均为谷氨酰胺 (Gln), 易发生焦谷氨酸环化; 抗体 B轻链 N端首个氨基 酸为谷氨酸(Glu), 不易发生焦谷氨酸环化, 而重链为易发生环化的谷氨酰胺。 图 5A为 抗体 A经过还原后采用本发明的 UPLC-MS方法测得的色谱图,图 5B为该抗体测得的质 谱图, 其中图 5B-1是图 5A中保留时间为 8.19min色谱峰即无修饰的轻链 (LC)的去卷 积化质谱图, 分子量为 23056 Da。 图 5B-2是图 5A中保留时间为 9.67min色谱峰即 N 端焦谷氨酸化的轻链的去卷积化质谱图, 分子量为 23039 Da。 图 5B-3是图 5A中保留 时间为 11.27min色谱峰即重链 (HC)的去卷积化质谱图, 图 5B-3中不同质量数的质谱 峰分别代表含不同糖型和末端修饰的 IgGl分子量,其测定分子量和理论分子量如表 4 所示。 该方法测得抗体 A的轻重链分子量与其理论值非常一致, 准确度高; 而且能区分 质量差为 17Da的质谱峰, 如 50542Da ( GOF, 焦谷氨酸,脱赖氨酸)和 50559Da ( GOF, 脱 赖氨酸), 表明分辨率高。 图 5C为抗体 B经过还原后采用本发明的 UPLC-MS方法测得 的色谱图, 图 5D为该抗体测得的质谱图, 其中图 5D-1是图 5C中保留时间为 11.57min 色谱峰即轻链 (LC)的去卷积化质谱图, 无焦谷氨酸化分子量为 23056 Da。 图 5D-2是 图 5C中保留时间为 13.26min色谱峰即重链 (HC)的去卷积化质谱图, 图 5D-2中不同 质量数的质谱峰分别代表含不同糖型和末端修 饰的 IgGl分子量。与抗体 A—样,抗体 B轻重链分子量的测定值与理论值十分一致。 通过归一化计算, 抗体 B重链 N端焦谷氨 酸化和 C 端脱赖氨酸分别为 70.6%和 97.8% ; G0F,G1F,G2F 和 GO 的含量分别为 65.7%,26.5%,4.6%禾卩 3.2%。 表 4抗体 A含不同糖型和末端修饰的重链分子量理论值 测定值 糖基化和末端修饰 理论分子量 (Da) 实测分子量 (Da)

G0F, 焦谷氨酸,脱赖氨酸 50542 50542

G0F, 焦谷氨酸,脱赖氨酸, 脱水 50524 50523

G0F, 脱赖氨酸 50559 50559 GOF, 焦谷氨酸 50670 50670

GIF, 焦谷氨酸,脱赖氨酸 50704 50704

Man5, 焦谷氨酸,脱赖氨酸 50314 50315

G0F-GN, 焦谷氨酸,脱赖氨酸 50338 50339

GO, 焦谷氨酸,脱赖氨酸 50395 50395

实施例 3 采用本发明的 UPLC-MS方法测定抗体 A经纯化后各组分的糖基化和末 端修饰情况 在抗体 A纯化工艺中, 采用常规强阳离子交换层析柱, 上样缓冲盐为 20mM 磷酸 钠缓冲盐,洗脱缓冲盐为 20mM磷酸钠和 1M氯化钠缓冲盐(pH=6.0),流速 200-400cm/h 进行洗脱, 紫外吸收 280nm监测流出组分, 按保留时间先后收集抗体 A组分: 组分 1 (4000-4300分钟),组分 2(4300-4500分钟),组分 3 (4500-4650分钟),组分 4(4650-4800 分钟), 组分 5 (4800-5100分钟)。采用优化后的还原条件(5μ § 抗体 A加入到 10μΙ^ 6Μ 盐酸胍溶液中, 再加入 0.5Μ DTT溶液 2 L, 最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度 为 50mM, 65 °C反应 45min), UPLC分离 (与实施例 1.1一致), ESI-MS检测 (与实施 例 1.1一致) 和归一化数据处理 (与实施例 1.2—致) 分析该 IgGl各组分的糖基化和末 端修饰。 结果如表 5以及图 6A-1至图 6A-2和图 6B-1至图 6B-2所示。 表 5 阳离子交换树脂收集的 IgGl各纯化组分的糖基化和末端修饰检测结果 末端修饰 百分比 (%) 或糖型 组分 1 组分 2 组分 3 组分 4 组分 5 轻链焦谷氨酸 95.36 75.88 57.89 59.14 48.16

G0F重链焦谷氨酸 86.49 88.05 86.31 75.48 65.53

G0F重链脱赖氨酸 95.63 93.85 90.88 91.81 92.30

G0F 66.45 66.95 59.98 59.14 62.33 GIF 14.39 12.82 11.83 10.47 8.27

Man5 5.53 7.24 10.55 11.61 9.16

GOF-GN 6.90 6.88 10.09 11.49 14.11

GO 6.72 6.11 7.55 7.28 6.12 图 6A-1至图 6A-2为组分 1和组分 5经还原后测得的色谱图, 图 6B-1至图 6B-2为 组分 1和组分 5重链的质谱图。 测定结果显示, 由组分 1到组分 5, 轻链 N端焦谷氨酸化 (由 95.36%到 48.16%) 和重链焦谷氨酸化 (由 86.49%到 65.53%) 依次减少; 糖基化部分, GIF由 14.39% (组 分 1 ) 减少至 8.27% (组分 5), Man5和 G0F-GN则分别由 5.53%和 6.72%增加至 9.16% 和 14.11。 因此, 本方明方法可用于监测抗体纯化工艺过程中样 品的糖基化和末端修饰的 差异。 实施例 4 采用本发明的 UPLC-MS方法测定抗体 C (IgG2)的糖基化和末端修饰情 况 采用本发明中优化后的还原条件 (5μ § 抗体 A加入到 10μΙ^ 6Μ盐酸胍溶液中, 再加 入 0.5M DTT溶液 2 L, 最后加适量 6 M盐酸胍溶液使 DTT终浓度为 50mM, 65°C反应 45min), 经 UPLC分离(与实施例 1.1一致), ESI-MS检测 (与实施例 1.1一致)和归一 化数据处理 (与实施例 1.2—致) 分析抗体 C的糖基化和末端修饰。 图 Ί为抗体 C经过 还原后采用本发明的 UPLC-MS方法测得的色谱图, 轻链 (LC) 的保留时间为 6.6min, 重链 (HC)的保留时间为 13.7min。抗体 C轻链和重链的 N端首个氨基酸均为谷氨酸 ( Glu), 不易环化形成焦谷氨酸, 因此未检测到焦谷氨酸化的轻链或重链; 重链大部分发生了 C 端脱赖氨酸。 抗体 C的糖型主要包括 G0F, GIF, Man5, GO和 G2F, 对应的含脱赖氨 酸重链的分子量为 50206Da, 50367Da, 49978Da, 50059Da和 50531Da, 与理论值一致; 其含量分别为 58.0%, 19.5%, 13.7%, 6.6%, 2.2%。 因此, 本发明方法同样适用于免疫 球蛋白 IgG2糖基化和末端修饰的检测。 实施例 5 采用本发明测定抗体 A的糖基化和末端修饰情况的试剂盒方法 试剂盒由试剂 A和试剂 B构成, 其中试剂 A为 6M盐酸胍溶液; 试剂 B为 0.5 M DTT溶液。 使用试剂盒检测抗体 A的糖基化和末端修饰情况的方法具体如下: 取 20μ § 抗体 A (蛋白浓度应大于 ΙμΒ/μΙ^若小于 1μ § /μί,可用截留分子量为 lOkDa 的超滤离心管进行浓缩), 加入一定量试剂 A至溶液总体积为 36 L, 再加入 4 试剂 B, 在 65°C下反应 45 min。 反应产品采用 UPLC分离 (与实施例 1.1一致), ESI-MS检 测 (与实施例 1.1一致)和归一化数据处理(与实施例 1.2—致)分析抗体 A的糖基化和 末端修饰。 连续 5天进行重复实验 (重新配置样品和测定)。 结果显示, 抗体 A的轻链和重链有效拆分, 并在色谱上实现基线分离。如表 6所示, 连续测定 5天, 轻链 N端焦谷氨酸化, 重链 N端焦谷氨酸化和 C端脱赖氨酸测定值的相 对标准偏差 RSD%小于 2%;糖链 G0F,G1F和 GO相对含量测定值的相对标准偏差 RSD% 小于 5%, Man5和 G0F-GN小于 10%。 综上, 本方法可实现标准化操作, 且重现性良好, 可用于建立测定免疫球蛋白糖基化和末端修饰 的试剂盒方法。 表 6 应用本方法测定抗体 A末端修饰情况的重现性

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制 本发明, 本领域技术人员可以根据本发 明作出各种改变或变形, 只要不脱离本发明的精神, 均应属于本发明所附权利要求的范 围。