ГРАНОВСКИЙ Игорь Эдуардович (м-р «B», д. 35 кв. 11, Пущино, Московская обл, 0 Puschino, RU)
BELETSKY, Igor Petrovich (m-r "D", 12-38Puschin, Moskovskaya obl. 0, 14229, RU)
БЕЛЕЦКИЙ Игорь Петрович (м-р «Д», д. 12 кв. 38, Пущино, Московская обл, 0 Puschino, RU)
SHLYAPNIKOVA, Elena Andreevna (m-r "AB", 24-7Puschin, Moskovskaya obl. 0, 14229, RU)
ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО "MOЛEКУЛЯРНO-МЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ" (пр-т Науки, д. З Пущино, Московская обл, 0 Puschino, RU)
GRANOVSKY, Igor Eduardovich (m-r "V", 35-11Puschin, Moskovskaya obl. 0, 14229, RU)
ГРАНОВСКИЙ Игорь Эдуардович (м-р «B», д. 35 кв. 11, Пущино, Московская обл, 0 Puschino, RU)
BELETSKY, Igor Petrovich (m-r "D", 12-38Puschin, Moskovskaya obl. 0, 14229, RU)
БЕЛЕЦКИЙ Игорь Петрович (м-р «Д», д. 12 кв. 38, Пущино, Московская обл, 0 Puschino, RU)
формула изобретения
1. способ идентификации урогенитальной инфекции, включающий обеспечение образца исследуемой днк, прямых и обратных праймеров, специфичных к идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области, и биологического микрочипа, содержащего дифференцирующие олигонуклеотиды, проведение пцр в присутствии образца днк и праймеров с зондами, специфичных к идентификации инфекционных агентов, инкубацию пцр- продукта с биологическим микрочипом в условиях гибридизации, определение урогенитальной инфекции детекцией образованных гибридизационных комплексов на микрочипе, отличающийся тем, что биологический микрочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-58, в качестве пцр используют асимметричную пцр, причем в паре прямого и обратного праймеров, один праймер содержит метку, которую после гибридизации днк детектируют, регистрируют данные детекции и используют данные регистрации для идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области.
2. способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят детекцию образцов на наличие в них, по крайней мере одной днк, принадлежащей гену, входящему в группу, состоящую из: сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуliсит, Urеарlаsта раrvит, сапdidа аlbiсапs, мусорlаsта gепitаliит, мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерiососсиs аgаlасtiае, Strерtососсиs руоgепеs, нитап hеrреsvirиs 1, нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4, нитап hеrреsvirиs 5.
3. способ по п. 1, отличающийся тем, что образец исследуемой днк выделяют, по крайней мере, из одного образца биологического материала человека, входящего в группу, состоящую из крови, биопсийного материала, слюны, слезных выделений, мочи, бронхо-авеолярного лаважа, ликвора, или их комбинаций.
4. способ по п. 1, отличающийся тем, что биологический микрочип получают модификацией несущей поверхности микрочипа и иммобилизуют на нее дифференциальные олигонуклеотиды.
5. способ по п. 1, отличающийся тем, что модификация поверхности несущего элемента микрочипа осуществлена с применением раствора 3- аминопропилтриэтоксисилана.
6. способ по п. 1, отличающийся тем, что гибридизацию проводят при температуре от 35 до 5O 0 C в буфере, содержащем от 0,5 х до 5 х SSC; 0,1% SDS; до
25% формамида и\или до 10 мм эдта.
7. способ по п.l, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул. 8. способ по п.7, отличающийся тем, что каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин.
9. способ по п.7, отличающийся тем, что лигандная молекула выбрана из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол.
10. способ по п.7, отличающийся тем, что флуоресцентная молекула выбрана из группы, включающей FAM, TAMRA, суз, Cy5, Cy7, R6G, Rl 10, ROX или JOE.
11. способ по п.l, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию инфекционных агентов осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.
12. специфический олиrонуклеотид в качестве праймера пцр для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции по п. п. 1-1 1 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58. 13. дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции по п.п. 1-11 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87.
14. комбинация для идентификации инфекционного агента сhlатуdiа trасhотаtis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
15. комбинация для идентификации инфекционного агента Nеissеriа gопоrrhоеае, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84, либо SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
16. комбинация для идентификации инфекционного агента тriсhотопаs vаgiпаlis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, либо SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
17. комбинация для идентификации инфекционного агента Urеарlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, либо SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
18. комбинация для идентификации инфекционного агента сапdidа аlbiсапs, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, либо SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22.
19. комбинация для идентификации инфекционного агента мусорlаsта gепitаliит, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, либо SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, либо SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
20. комбинация для • идентификации инфекционного агента мусорlаsта hотiпis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 , либо SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
21. комбинация для идентификации инфекционного агента Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, либо SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, либо SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
22. комбинация для идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42. 23, комбинация для идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44. 24. комбинация для идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 1 и/или нитап hеrреsvirиs 2, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, либо SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
25. комбинация для идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 4, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50, либо SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, либо SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
26. комбинация для идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 5, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, либо SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58.
27. биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, входящих в группу, состоящую из: сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуtiсит, Urеарlаsта раrvит, сапdidа аlbiсапs, мусорlаsта gепitаliит, мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасdае, Strерlососсиs руоgепеs, нитап hеrреsvirиs 1, нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4, нитап hеrреsvirиs 5, представляющий собой несущий элемент, на котором иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с одной, или более последовательностями, выбранными из SEQ ID NO: 59-87.
28. микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов, входящих в группу, состоящую из: полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций. 29. микрочип по п.28, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из: полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.
30. микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полиметилметакрилат.
31. микрочип по п.29, отличающийся тем, что в качестве полимера используют поливинилхлорид. 32. микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок.
33. микрочип по п.27, отличающийся тем, что форма несущего элемента, выполненного в виде плоских платформ или пленки, представляет собой прямоугольник, квадрат, многоугольник или круг. 34. микрочип по п.33, отличающийся тем, что толщина несущего элемента составляет от 0,5 до 5,0 мм.
35. микрочип по п.27, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме индивидуального чипа или мультичипа.
36. микрочип по п.35, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен в форме мультичипа, состоящего из N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов.
37. микрочип по п.27, отличающийся тем, что дифференцирующие олигонуклеотиды иммобилизованы на несущей поверхности в форме кластеров.
38. микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет от 2 до
1000.
39. микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет 15.
40. микрочип по п.37, отличающийся тем, что состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей.
41. микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные контроли, выбирают в диапазоне от 1 :1 до 500:1. 42. микрочип по п.40, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1 :1 до 500:1. 43. микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50.
45. микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида в каждом кластере составляет 4 или 9. 46. микрочип по п.40, отличающийся тем, что объем капель каждого зонда составляет не менее 0,005 мкл.
47. микрочип по п.36, отличающийся тем, что отдельные микрочипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием. 48. набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, содержащий дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87. б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения пцр, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации. в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров пцр для видовой идентификации инфекционных агентов, входящих в группу, состоящую из: сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, тriсhотопаs vаgiпаlis, Urгарlаsта иrеаlуtiсит, Urеарlаsта раrvит, сапdidа άϊысапs, мусорlаsта gепitаliит, мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасtiае, Strерtососсиs руоgепеs, нитап hеrреsvirиs 1, нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4, нитап hеrреsvirиs 5, которые обладают нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO : 1 -: 58.
49. набор по п.48, отличающийся тем, что дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики. |
способ идентификации урогенитальной инфекции, олигонуклеотид, комбинация олигонуклеотидов, биочип и набор на его основе.
область техники
изобретение относится к области микробиологии, вирусологии, биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии, а именно, к видовой идентификации инфекционных патогенов (бактерий, вирусов, грибов и т.д.) в биологических образцах, включающей этапы амплификации днк и последующей гибридизации амплифицированной днк на биологическом микрочипе. изобретение также раскрывает состав высокоспецифичных днк- зондов и олигонуклеотидов, набор реактивов и способ регистрации и интерпретации результатов. уровень техники
в настоящее время для видовой идентификации инфекционных патогенов применяются методы иммуноферментного анализа - ифа [1,2], методы микробиологического анализа [3], методы вирусологического анализа [4], методы, основанные на пцр [5], в том числе с последующим анализом длины амплифицированного фрагмента [6] или с последующим определением нуклеотидной последовательности (секвенирование) [7].
эффективность ифа зависит от типа исследуемого материала и наличия высокоспецифичных моноклональных антител для каждого вида патогенов. вввиду близкого антигенного родства различных патогенов, результаты исследования инфекционных агентов не всегда достоверны.
методы микробиологического и вирусологического анализа являются культуральными методами и, соответственно, требуют специального оборудования и высококвалифицированного персонала. анализ занимает несколько дней и связан с особыми мерами предосторожности из-за повышенной биологической опасности.
серьезным недостатком метода традиционной пцр [6] является визуальный характер оценки результатов, что может приводить к их ложной интерпретации. в случае метода с определением нуклеотидной последовательности процедуры анализа довольно продолжительны и
дорогостоящи. кроме того, они также требуют наличия специального оборудования и высококвалифицированного персонала.
известно изобретение, в котором диагностику урогенитальных болезней осуществляют, исследуя в одном образце комплексы, содержащие грамм- положительные бактерии и другие микроорганизмы, такие как дрожжи, простейшие микроорганизмы, микоплазма и грамм-отрицательные бактерии [8].
известно изобретение, в котором рассматривается способ диагностики, в котором используются группы нуклеиновых кислот для формирования проб, гибридизующихся с областью 16S ррнк или 16S рднк Urеарlаsта иrеаlуtiсιιт [9].
известно изобретение, в котором одновременно детектируется множество микроорганизмов, выбираемых из группы Nеϊssеriа gопоrrhоеае, Nеissеriа тепiпgitidis, наеторhilιιs dιιсrеуi, вrапhатеllа саtаrrhаlis, воrdеtеllа реrtиssis, наеторhihιs iпflиепzае, Strерtососсиs рпеитопiае, Strерtососсиs аgаlасtiае, сатруlоbасtеr jеjιtпi, сатруlоъасtеr соli или их комбинаций. в этом изобретении нуклеиновые кислоты многих микроорганизмов приводят в контакт с мембраной, содержащей области, в которых нанесены образцы нуклеиновых кислот взятых из транскипционного участка гена между 16S и 23 S ррнк гена прокариотического микроорганизма и содержащего от 15 до 100 нуклеотидов [10].
в изобретении [11] приведены праймеры для амплификации участков 16S- 23 S ррнк и последующей гибридизации для обнаружения микроорганизмов, входящих в группу штаммов мусоbасtеήит, сhlатуdiа, ыstеriа, вrисеllа и Yеrsiпiа епtеrоlitiса. в изобретении [12] приведено техническое решение по применению пцр в реальном времени для диагностики любых эубактерий, используя высококонсервативную область 16S ррнк гена.
в изобретении [13] приведены олигонуклеотиды и амшшфикационные праймеры для определения наличия бактерий или грибов, входящих в группу епtеrососсгιs fаесiит, ыstеriа топосуtоgепеs, Nеissеrа тепiпgitidis, Strерtососсиs аgаlасtiае, сапdidа аlbiсапs, епtеrососсиs gепиs, Nеissеriа gепиs, Stарhуlососсиs gепиs, Strерtососсиs gепиs апd сапdidа gепиs. амплификацию осуществляют с помощью пцр и других систем: LCR, NASBA, 3SR, SDA, bDNа, (TMA), CPT, гнездовой пцр и мультиплексной пцр.
известны праймеры и наборы пцр для идентификации неrреs siтрlех virиs tуреs 1 апd 2 [23, 24] и неrреs siтрlех virиs tуреs 4 вируса эпштейна-барра
[25]. значительная часть известных технических решений относится к решению конкретных задач, связанных либо с поиском новых типов праймеров или технологий их применения для задач диагностики [26 - 37].
наиболее близким решением к данному изобретению относится изобретение [14]. в данном изобретении описывается способ определения положения множества образцов с разными генотипами на поверхности одного микрочипа. данный метод относится к применению мультипраймерной полимеразной цепной реакции (пцр) с использованием, флуоресцентно меченых праймеров для получения амплифицированных одноцепочечных днк. под мультипраймерной пцр принято понимать процесс совместной амплификации нескольких днк-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким инфекционным возбудителям.
однако данный способ неприменим без значительных доработок для создания относительно недорогого микрочипа или мультичипа, состоящего из нескольких чипов, для идентификации урогенитальных инфекций. общие принципы проведения мультипраймерных пцр содержат свои особенности, связанные с выбором температур проведения пцр, длиной праймеров и выбором последовательностей праймеров, не оказывающих влияния друг на друга в процессе амплификации. кроме того, эффективность диагностики во многом определяется выбором перечня патогенных организмов, с помощью которых осуществляют идентификацию смешанной урогенитальной инфекции. задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности диагностики и создании недорогого способа определения смешанной урогенитальной инфекции с помощью идентификации до 15 видов патогенов на биологических микрочипах.
другой задачей изобретения является разработка биологического микрочипа и мультичипа для проведения диагностики в лабораторных условиях без применения сложного диагностического оборудования.
сущность изобретения
одним из объектов изобретения является способ идентификации урогенитальной инфекции, включающий обеспечение образца исследуемой днк, прямых и обратных праймеров, специфичных к идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области, и биологического микрочипа, содержащего дифференцирующие олигонуклеотиды, проведение пцр в присутствии образца днк и праймеров с зондами, специфичных к идентификации инфекционных агентов, инкубацию пцр-продукта с биологическим микрочипом в условиях гибридизации, определение урогенитальной инфекции детекцией образованных гибридизационных комплексов на микрочипе, причем биологический микрочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:59-87, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-58, в качестве пцр используют асимметричную пцр, причем в паре прямого и обратного праймеров один праймер содержит метку, которую после гибридизации днк детектируют, регистрируют данные детекции и используют данные регистрации для идентификации инфекционных агентов в урогенитальной области. другим объектом изобретения является специфический олигонуклеотид в качестве праймера пцр для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции с последовательностями, представленными от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58.
другим объектом изобретения является дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для видовой идентификации инфекционного агента в способе идентификации урогенитальной инфекции с последовательностями, представленными от SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента сhlаiпуdiа trасhотаtis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Nеissеriа gопоrrhоеае, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 61 и SEQ
ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84, либо SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента тriсhотопаs vаgiпаlis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 64 и SEQ
ID NO: и и SEQ ID NO: 12, либо SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO:
14.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Urеорlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, либо SEQ ID NO: 67 и
SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента сапdidа аlbiсапs, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 68 и SEQ
ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, либо SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO:
22.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента мусорlаsта gепitаliит, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 70 и SEQ
ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, либо SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO:
26, либо SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента мусорlаsта hотiпis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 73 и SEQ
ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO:
32 , либо SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 76 и SEQ
ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, либо SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO:
38, либо SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасliае , которая
включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: . 41 и SEQ ID NO: 42. -
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 1 и/или нитап hеrреsvirиs 2, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, либо SEQ ID NO: 82 и SEQ ID
NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 4, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50, либо SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO:
52, либо SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54.
другим объектом изобретения является комбинация олигонуклеотидов для видовой идентификации инфекционного агента нитап hеrреsvirиs 5, которая включает олигонуклеотиды с последовательностями либо SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, либо SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO:
58.
другим объектом изобретения является биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, представляющий собой несущий элемент, на котором иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в
SEQ ID NO:59 до SEQ ID NO:87.
другим объектом изобретения является набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, содержащий дифференцирующие олигонуклеотиды с одной или более последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 59 по SEQ ID NO: 87.
б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения пцр, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации. в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров пцр для видовой идентификации инфекционного агента с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 58.
другим объектом изобретения является набор, который, кроме биологического микрочипа или мультичипа, реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения пцр, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации и специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров пцр для видовой идентификации инфекционного агента, дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики.
перечень фигур фиг. 1. размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента: а) и б) - распределение зон на несущем элементе мультичипа; в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов; г) вариант мультичипа с выемками между чипами с размещением одного идентификатора.
фиг. 2. сечение несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок: а) треугольная выемка, б) сферическая выемка, в) прямоугольная выемка, г) многоугольная выемка, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента. фиг. 3. размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента с формированием общей зоны на несущем элементе: а) распределение зон на несущем элементе мультичипа; б) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов;
в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов.
фиг. 4. блок-схема системы для сбора, обработки и передачи данных, считанных с мультичипов, на индивидуальные компьютеры пользователей. фиг. 5. изображение точек при детекции экспериментального слайда для проверки эффективности выбора зондов и праймеров, а также положительных и отрицательных контролей для диагностирования урогенитальной инфекции.
фиг. 6. структурная схема медицинского чипа.
сокращения
ифа - иммуноферментный анализ
позиции 100 - относятся к конструктивным элементам мультичипа.
позиции 200 - относятся к системе для анализа результатов диагностики.
описание изобретения
в общем случае, способ видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, включает следующие стадии: выбор мишени, выбор праймеров и зондов, синтез зондов и праймеров, приготовление биологического микрочипа (например, модификация поверхности), нанесение зондов, выделение днк, амплификация днк при помощи пцр, гибридизация днк на микрочипе, детектирование и регистрация полученного результата, идентификация и интерпретация полученных результатов.
выбор мишени. в процессе изучения способов диагностики урогенитальных инфекций и известных диагностических микрочипов было обнаружено, что большинство известных решений, связанных с выбором перечня патогенных организмов для диагностики, не учитывает тот факт, что в последнее время идет быстрый рост заболеваний, связанных со смешанной урогенитальной инфекцией [38]. к неочевидному решению в рамках настоящего изобретения можно отнести выбор перечня патогенных организмов, с помощью которых осуществляют идентификацию смешанной урогенитальной инфекции. перечень, представленный в таблице N°l, составлен таким образом, что он устраняет недостатки известных изобретений. в перечень, в совокупности с бактериями,
дрожжами и грибами, широко встречающимися в урогенитальной диагностике, включены вирусы, а именно вирусы нитап hеrреsvirиs 1 и/или нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4 и нитап hеrреsvirиs 5. такая совокупность вирусов, бактерий, дрожжей и грибов позволяет реализовать техническую задачу изобретения, связанную с повышением эффективности диагностики одновременно, быстро и с минимальными затратами диагностировать в одном анализе от 1 до 15 патогенов, основанном на идентификации до 26 участков днк, специфичных для этих патогенных организмов.
таблица Ng 1. перечень патогенных организмов и мишеней.
5.
0 ,
5
0
выбор специфических и дифференцирующих олигонуклеотидов и их возможные 5 комбинации.
выбор специфических олигонуклеотидов для гщр.
праймеры выбраны с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам генов исследуемых патогенов, что позволяет избирательно амплифицировать фрагмент днк патогенного организма 0 непосредственно из выделенного биологического образца. при этом исходили из требований, стандартно применяемых к праймерам, в которые входят: отсутствие высокостабильных вторичных структур, малое расхождение температур плавления, не превышающее 2-3 °C, а также выбор длины праймеров в диапазоне от 15 до 55 н.о.
для составления праймеров выбирались последовательности, характерные для идентифицируемого патогенного организма и представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей Gепвапk (http://ncbi.nlm.nih.gov), в которых выбирались наиболее консервативные участки, не используемые ранее и неочевидные для составления специфических и дифференцирующих олигонуклеотидов для создания биологических чипов.
каждая пара олигонуклеотидов для пцр, специфичных к какой-либо мишени патогенов, состоит из одного немеченого (не содержащего одну или несколько меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида из перечисленных в списке последовательностей с любым нечетным номером с SEQ ID NO: 1- по SEQ ID
NO: 57 и меченого (содержащего одну или несколько меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида из перечисленных в списке последовательностей с любым четным номером с SEQ ID NO: 2 по SEQ ID NO: 58, следующим сразу за первым специфическим олигонуклеотидом пары.
выбор дифференцирующих олигонуклеотидов.
дифференцирующие олигонуклеотиды выбирали с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам генов исследуемых патогенов, что позволяет проводить избирательную гибридизацию фрагментов днк, амплифицируемых со специфическими олигонуклеотидами при помощи пцр непосредственно из биологических образцов, а также исходя из отсутствия высокостабильных вторичных структур и имеющие длину от 15 до 55 н.о.
дифференцирующие олигонуклеотиды характеризуются видовой специфичностью к патогенам, преимущественно урогенитальной области.
допустимо использование олигонуклеотидов, гомологичных указанным в перечне последовательностей олигонуклеотидам, не менее, чем на 80% , предпочтительно, не менее чем на 90%, наиболее предпочтительно, не менее чем на 95% . допустимо использование олигонуклеотидов, имеющих делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов.
комбинации олигонуклеотидов
1. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида сhlатуdiа trасhотаtis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один
и
дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 59 и два специфических SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 60 и два специфических SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 олигонуклеотида.
2. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Nеissеriа gопоrrhоеае используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 61 и два специфических SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 62 и два специфических SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 84 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 63 и два специфических SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 олигонуклеотида.
3. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида тriсhотопаs vаgiпаlis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 64 и два специфических SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 65 и два специфических SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 олигонуклеотида.
4. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Urеарlаsта иrеаlуtiсит и/или Urеарlаsта раrvит используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 66 и два специфических SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, в другую комбинацию входят
дифференцирующий SEQ ID NO: 67 и два специфических SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 олигонуклеотида.
5. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления грибов вида сапdidа аlbiсапs используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 68 и два специфических SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 69 и два специфических SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 олигонуклеотида.
6. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида
мусорlаsта gепitάliит используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий ,,SEQ ID NO: 70 и два специфических SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 71 и два специфических SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 олигонуклеотида и в третью комбинацию входит дифференцирующий SEQ ID NO: 72 и два специфических SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 олигонуклеотида.
7. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида мусорlаsта hотiпis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 73 и два специфических SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 74 и два специфических SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий
SEQ ID NO: 75 и два специфических SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 3 4 олигонуклеотида.
8. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Gаrdпеrгllа vаgiпаlis используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 76 и два специфических SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 77 и два специфических SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 олигонуклеотида и в третью комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 78 и два специфических SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40 олигонуклеотида.
9. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида Strерtососсиs аgаlасtiае используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 79 и два специфических SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 олигонуклеотида.
10. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления бактерий вида
Strерtососсиs аgаlасtiае и/или Strерtососсиs руоgепеs используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 80 и два специфических SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 олигонуклеотида.
11. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления вирусов нитап hеrреsvirιιs 1 и/или нитап hеrреsvirиs 2 используют любую из двух комбинаций,
в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 81 и два специфических SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 82 и два специфических SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48 олигонуклеотида.
12. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, и специфического выявления вирусов нитап hеrреsvirиs 4 используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 83 и два специфических SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 84 и два специфических SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 олигонуклеотида и в третью группу входят дифференцирующий SEQ ID NO: 85 и два специфических SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 олигонуклеотида.
13. для видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области,- и специфического выявления вирусов нитап hеrреsvirиs 5 используют любую из двух комбинаций, в которую входят один дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда и два специфических олигонуклеотида, используемых в качестве праймеров пцр. в одну из комбинаций входят дифференцирующий SEQ ID NO: 86 и два специфических SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 олигонуклеотида, в другую комбинацию входят дифференцирующий SEQ ID NO: 87 и два специфических SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58 олигонуклеотида.
таблица 1-1. специфические олигонуклеотиды (часть 1).
таблица 1-2. специфические олигонуклеотиды (часть 2).
таблица 1-3. специфические олигонуклеотиды (часть 3).
таблица 2-1. дифференциирующие олигонуклеотиды (часть 1).
таблица 2-2. дифференциирующие олигонуклеотиды (часть 2).
синтез зондов и праймеров
олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (например, модель "Gепе аssеmblеr" фирмы рhаrmасiа стандартным амидофосфитным методом. для иммобилизации на поверхности чипа дифференцирующие олигонуклеотиды модифицируют по 5'- или 3' -концу, например, 5'- концевую фосфатную группу вводят в процессе синтеза. один из пары специфических олигонуклеотидов для проведения пцр модифицируют по 5'-кoнцy меткой, которую выбирают из группы, состоящей из: каталитической, лигандной, флуоресцентной и радиоактивной, которую вводят химическими методами или энзиматически .
приготовление биологического микрочипа (модификация поверхности) матрицу, имеющую поверхностные аминогруппы, изготовляют с помощью раствора 3-aминoпpoпилтpиэтoкcиcилaнa (аптэс) в различных растворителях в зависимости от типа подложек. например, стеклянные подложки инкубируют в растворе 3-aминoпpoпилтpиэтoкcиcилaнa в ацетоне или в этаноле. концентрацию аптэс варьируют от 0,1 до 10% по объему. если реакцию проводят в ацетоне, стекла трижды промывают ацетоном по 5 минут, затем этанолом 2 раза по 3 минуты и прокаливают при температуре 120-130 0 C в течение 20 минут.
нанесение зондов .
реакционную смесь, содержащую 1 мкм олигонуклеотида и 60 мм гидрохлорида l-этил-3-(3-димeтилaминoпpoпил)-кapбoди имидa в 0.1 M 1- метилимидазоле, рн 7.0, наносят на поверхность матрицы роботом (хрrеss Lапе, сша). объем капель каждого зонда составляет не менее 0.005 мкл. матрицы с нанесенными олигонуклеотидами помещают в герметичную емкость, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной атмосфере и промывают на шейкере 1 M раствором NaCI в течение 10 минут, затем дистиллированной водой. биочип высушивают и хранят при комнатной температуре. концентрация олигонуклеотида в объеме капель каждого зонда составляет от 0.5 до 100 мкм.
выделение днк и подготовка материала для амплификации.
выделение днк из биологического образца (кровь, биопсийный материал, слюна, слезные выделения, моча, бронхо-авеолярный лаваж, ликвор, спинномозговая жидкость и др.) проводят с использованием общепринятых методик, основанных, например, на щелочном лизисе, применении детергентов, протеиназы к, экстракции фенолом, хлороформом и/или смесью фенол/хлороформ, либо очистку на диатомовой земле или диоксида кремния. перед выделением днк к образцу добавляют днк положительного контроля.
положительные и отрицательные контроли. в рамках данного изобретения положительные контроли используютея в диагностическом наборе для подтверждения соблюдения оптимальных условий проведения процедур, необходимых для идентификации заявленных патогенных организмов, а именно, выделения днк из биологического материала, проведения пцр и гибридизации. в качестве положительного контроля 1 служит днк с известной нуклеотидной последовательностью. такой днк может быть как природная днк какого-либо организма, либо искусственная последовательность, например, рекомбинантная днк, либо фрагмент такой днк, полученный при помощи пцр или другим способом. днк положительного контроля 1 амплифицируют при помощи асимметричной пцр с использованием специфических олигонуклеотидов так же, как исследуемые образцы. специфические олигонуклеотиды для амплификации днк положительного контроля 1 подбирают таким образом, чтобы ее амплификацию можно было проводить при помощи пцр в тех же условиях, что и для определяемых патогенных организмов. для идентификации днк положительного контроля 1 на чип иммобилизуют дифференцирующий олигонуклеотид, комплементарный последовательности днк положительного контроля, нарабатываемой в одноцепочечной форме. в качестве положительного контроля 2 на чип иммобилизуют олигонуклеотид или несколько олигонуклеотидов, комплементарных специфическим олигонуклеотидам для пцр, которые модифицированы по 5 '-концу меткой из группы, приведенной в п. «Cинтeз зондов и пpaймepoв».
отрицательные контроли в рамках данного изобретения используют для подтверждения соблюдения оптимальных условий гибридизации. в качестве отрицательного контроля на чип иммобилизуют олигонуклеотид, частично
комплементарный последовательности днк положительного контроля, нарабатываемой в одноцепочечной форме, или олигуноклеотиды, частично комплементарные специфическим олигонуклеотидам для пцр, которые модифицированы по 5 '-концу меткой из группы, приведенной в п. «Cинтeз зондов и пpaймepoв». в последовательности дифференцирующего олигонуклеотида, служащего в качестве отрицательного контроля, количество и положение нуклеотидов, несоответствующих последовательности днк положительного контроля или специфическим олигонуклеотидам для пцр, подбирают таким образом, чтобы этот дифференцирующий олигонуклеотид был способен образовывать и сохранять несовершенный дуплекс с одноцепочечной днк положительного контроля или специфического олигонуклеотида для пцр при несоблюдении условий гибридизации и отмывки, а именно, при проведении гибридизации и отмывки в условиях, более мягких по сравнению с оптимальными. в качестве примера, который включает, но не ограничивает объем изобретения, в перечне последовательности приведены специфические олигонуклеотиды ID SEQ No: 88 и 89, которые используют для амплификации днк плазмиды pUC18 при помощи асимметричной пцр, а также дифференцирующие олигонуклеотиды ID SEQ No: 90 и 91, которые иммобилизуют на поверхности чипа и используют в качестве, соответственно, положительного и отрицательного контролей.
выбор метки
известно большое число патентов, в которых рассматриваются разные типы меток для построения биологических чипов. известна классификация меток на группы, состоящие из: каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул [21,22]. указанные патенты приведены в качестве ссылок. каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин. лигандную молекулу выбирают из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол. флуоресцентную молекулу выбирают из группы, включающей FAM, TAMRA, суз, Cy5, Cy7, R6G, RI lO, ROX или JOE.
амплификация днк при помощи гщр
однонитевые фрагменты днк типичных последовательностей инфекционных агентов, приведенных в таблице 1, получают в реакции асимметричной пцр с использованием высокоспецифичных праймеров.
условия пIJр.
в состав пцр-смеси входит lх-кратный реакционный буфер, например, от 10 до 80 мм трис-нсl pH8,8, до 50 мм KCl и\или до 25 mм (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,1% тритон X-IOO, или 0,1% тwееп 20, или 0,8% Nопidеt P40, от 1 мм до 5 мм, оптимально от 1,5 мм до 2,5 мм, MgCl 2 или MgSO 4 , от 10 мкг до 300 мкг, оптимально от 50 мкг до 200 мкг, днк анализируемого образца и не менее одной пары специфических олигонуклеотидных праймеров для каждой мишени. общее количество пар специфических олигонуклеотидов может варьировать от 1 до 29 в сочетаниях для идентификации, по меньшей мере, одного инфекционного агента в форме патогенных микроорганизмов и/или грибов и/или вирусов. в состав пцр-смеси входит от 1 ед. до 20 ед., оптимально от 6 ед. до 14 ед., наиболее оптимально от 8 ед. до 12 ед. активности таq-полимеразы. в состав пцр смеси могут входить реагенты, повышающие специфичность и эффективность пцр, например, такие как бетаин, эктаин и его производные, а также трегалоза, диметилсульфоксид, глицерин.
концентрация немеченого специфического олигонуклеотида в пцр может составлять от 0,025 мкм до 0,2 мкм, оптимально от 0,05 мкм до 0,1 мкм, и концентрация меченого специфического олигонуклеотида в пцр составляет от 0,125 мкм до 1 мкм, оптимально от 0,25 мкм до 0,5 мкм. соотношение немеченого олигонуклеотида к меченому составляет от 1/2 до 1/50, оптимально от 1/5 до 1/10. объем реакционной смеси может составлять от 5 мкл до 200 мкл, оптимально от 20 мкл до 50 мкл. реакцию можно проводить под минеральным маслом или без него, в зависимости от конструкции днк-амплификатора. пцр проводят с использованием днк амплификатора (например терцик, днк- технология, россия или маstеrсусlеr, еррепdоrf, германия), в условиях, приведенных в таблице 2.
таблица 2. условия проведения пцр.
проведение гибридизации.
меченые продукты пцр гибридизуются с днк-зондами (дифференцирующими олигонуклеотидами), иммобилизованными на биочипе, в специально подобранном буфере.
условия гибридизации:
гибридизацию проводят в буфере, 'содержащем 0,5 х — 5 х SSC, 0,1% SDS, до 25% формамида и\или до 10 мм эдта в течение 1 часа при 35 — 5O 0 C. затем чип промывают при комнатной температуре на орбитальном шейкере от 5 до 10 раз растворами 0,5 х — 5 х SSC, 0,1% SDS. в случае использования ферментов для проявления результатов гибридизации последние 3 промывки проводят раствором SSC, не содержащим SDS.
проведение пероксидазной реакции
в случае, если продукты пцр мечены биотином, то для дальнейшей идентификации проводят реакцию с коньюгатом стрептавидин- пероксидаза или стрептавидин - фосфатаза.
структура биочипа
биологический микрочип для видовой идентификации инфекционных агентов, предпочтительно урогенитальной области, может представлять собой как индивидуальный чип, так и мультичип, выполненный на поверхности общего несущего элемента содержащего N индивидуальных чипов. в рабочей зоне индивидуальный чипа иммобилизованы в форме кластеров дифференцирующие олигонуклеотиды-зонды с одной или более последовательностями,
представленными в SEQ ID NO:59-87. несущий элемент микрочипа может быть выполнен в виде плоских платформ или пленок.
известно выполнение мультичипа в форме прямоугольных платформ [15], прямоугольных листов [16] или в форме плоского диска [17] . предпочтительной формой мультичипа является плоский лист разной толщины. в рамках настоящего изобретения форму мультичипа выбирают на основании предварительной информации о типе материала для мультичипа, о предполагаемом способе модификации поверхности, информации о предполагаемом способе обработки данных анализа и выборе оборудования для съема и обработки информации. форма мультичипа может представлять собой прямоугольник, квадрат, диск, многоугольник. толщина несущего элемента может составлять от 0,5 до 5мм.
на фиг.1 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента без формирования общей зоны. на фиг.l(a) - (г) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа для разных вариантов. в общем случае, мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N отделяемых от несущего элемента индивидуальных чипов в секторах 102, количество N индивидуальных чипов в мультичипе выбирают не менее 2. на поверхности каждого сектора 102, принадлежащего индивидуальному чипу, формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. в группу типов зондов, которые выбирают для размещения на рабочей поверхности чипа, кроме зондов, относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, а также группа зондов, выполненных в форме меток, например, меток, идентифицирующих положение чипа. дополнительно каждый сектор контактирует с зоной 107, контактируемой с границами, по крайней мере, двух индивидуальных чипов, прилегающих к внешнему контуру каждого сектора. в зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. сквозные отверстия могут быть выполнены в виде перфораций, прорезей, промежутков или интервалов между боковыми границами чипов. ( на фиг.l(в) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий в
между чипами с размещением двух идентификаторов. на фиг.l(г) приведен вариант мультичипа с одним идентификатором. выемки и/или сквозные отверстия между чипами упрощают отделение индивидуальных чипов 110 от несущего элемента 100 или друг от друга. возможность простого отделения индивидуальных чипов от мультичипа позволяет проведение последовательного скрининга с использованием одного мультичипа, в котором все индивидуальные чипы изготовлены в одинаковых условиях, что позволяет сравнивать отдельные чипы в процессе проведения последовательных диагностик, например, при лечении пациента. при этом при проведении последовательного скрининга проб от группы индивидуальных чипов в процессе диагностирования последовательно отделяют, по крайней мере, один индивидуальный чип, который используют для гибридизации с продуктами пцр в индивидуальной камере.
на фиг.l(a) приведен вариант мультичипа с формированием на поверхности мультичипа одних выемок без сквозных отверстий между чипами и с размещением двух идентификаторов. такое решение предпочтительно при проведении массовых скринингов, когда все чипы мультичипа должны проходить параллельную обработку и после проведения диагностики могут быть одновременно отделены от мультичипа.
в предлагаемом изобретении проблема кросс-контаминации устраняется за счет комбинации выемок и сквозных отверстий, выполненных в виде перфораций, прорезей, промежутков или интервалов между боковыми границами чипов. в этом случае излишки гибридизационной смеси будут стекать в выемки или сквозные отверстия. при отливке или штамповке несущего элемента мультичипа возможно формировать дополнительные углубления на поверхности рабочей части каждого индивидуального чипа глубиной от 0,1 до 5мм для размещения в них зондов индивидуальных чипов и введения в рабочую зону гибридизационной смеси, что позволяет свободно отделять от тела мультичипа отдельные чипы или группу чипов для проведения сканирования в выбранном сканере, либо сканировать мультичип целиком на планшетном сканере с одновременным считыванием данных всех идентификаторов.
на фиг.2 приведены примеры форм сечений несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок: а) треугольная выемка 120, б) сферическая выемка 121, в) прямоугольная выемка 122, г) многоугольная выемка 123, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента 124. причем выемки,
предпочтительно при штамповке или отливке, могут быть организованы как с одной, так и с двух сторон мультичипа. толщину несущего элемента выбирают от 0,5 до 5мм. при этом соотношение толщины слоя несущего элемента к глубине выемки мультичипа выбирается исходя из механических и физических параметров выбранного материала (твердость, хрупкость) для мультичипа и может составлять отношение от 2:1 до 100:1. если используют комбинацию выемок и сквозных отверстий в зоне 107, то соотношение между длинами выемок и сквозных отверстий между чипами выбирают в пределах от 1 :10 до 10:1. соотношение ширины выемки к ширине сквозных отверстий можно выбирать в пределах от 1:10 до 10:1. ширину выемки выбирают в пределах от 0,1мм до 5мм.
на фиг. 3 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента, на котором формируется общая зона 111. общая зона 111 несущего элемента мультичипа 100 может быть расположена сбоку, сверху, снизу или в центре массива чипов. она может представлять форму прямоугольника или иметь, например, крестообразную форму. общая зона выполняет две функции. первая связана с ее использованием для формирования на ней установочных и крепежных отверстий 112, которые способствуют креплению заготовок мультичипов при модификации поверхности, многочисленных промывках и очистках поверхности перед нанесением зондов. второй функцией общей зоны является размещение на ее поверхности третьего идентификатора 113, на котором может быть размещена информация, полезная для последующего анализа данных диагностики при проведении параллельного или последовательного скрининга биополимеров. на фиг. 3(a) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа. в общем случае мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N чипов, размещенных в секторах 102, на поверхности каждого сектора формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. в состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей. количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, может составлять от 2 до 1000. для недорогих чипов количество кластеров,
размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, может составлять 15.
количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50. для дешевых чипов предпочтительно, если количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет 4 или 9.
в группу зондов, размещаемых на поверхности рабочей зоны, кроме зондов относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, может быть размещена группа зондов, выполненных в форме меток, например меток, идентифицирующих положение чипа. соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные или отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1. каждый сектор 102 контактирует с зоной 107, контактируемой с границами, по крайней мере, двух индивидуальных чипов прилегающих к внешнему контуру каждого сектора и границей общей зоны мультичипа. в зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. на фиг.3(6) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов. выемки и/или сквозные отверстия промежутки между чипами обеспечивают отделение чипов 110 от несущего элемента 100 или друг относительно друга. на фиг.з(в) приведен вариант мультичипа с выемками между чипами и с размещением двух идентификаторов. отдельные микрочипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием.
известно [16], что в качестве основы для создания мультичипов можно использовать нитроцеллюлозу, стекло, пластики, тефлон, металл и их комбинации. однако, как уже указывалось, не все материалы, перечисленные в группе, обладают способностью ковалентно иммобилизовать олигонуклеотидные зонды. в качестве материала несущего элемента для создания мультичипа предлагается использовать полимеры, стекло, керамику или их композиции.
для такого материала как стекло разработано большое число способов модификации поверхности для последующей иммобилизации зондов. однако массовое применение стеклянных мультичипов ограничивается хрупкостью этого
материала, затрудняющего их производство и транспортировку. выполнение двухсторонних выемок - или выемок и сквозных отверстий между чипами позволяет отделять стеклянные слайды друг от друга без нарушения основы чипа.
полимеры не обладают хрупкостью и могут быть изготовлены с помощью разных технологий, включающих, но не ограничивающих, способы штамповки, отливки, механической обработки. группа используемых полимеров включает, но не ограничивает, полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, сополимеры метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. более предпочтительно использовать полиметилметакрилат, который имеет меньший уровень автофлуоресценции, прозрачен и может составлять основу композитных несущих поверхностей. поливинилхлорид позволяет эффективно проводить модификацию поверхности и являться основой для изготовления индивидуальных н мультичипов. в варианте, когда форма мультичипа представляет собой форму прямоугольника, предпочтительно, чтобы соотношения между шириной и длиной мультичипа лежали в пределах от 1:1 до 1:50. в некоторых вариантах предпочтительно выбирать размеры мультичипа в пределах размеров стандартных листов бумаги, например, размер A4, на которые рассчитаны сканеры. учитывая высокие характеристики разрешения современных сканеров и совершенство способов .нанесения зондов на поверхность чипов, более предпочтительно использовать не только стандартные размеры индивидуальных чипов 25мм х 75мм, но и другие размеры. например, для сокращения расходов на подготовку индивидуальных чипов в составе мультичипа, возможно использовать чипы, габариты которых составляют значение 12,5мм х 75 мм, либо мини-чипы размером 25мм х 37,5м, либо 12,5мм х 37,5мм.
в качестве варианта реализации данного изобретения индивидуальный биологический микрочип, который может входить в набор для диагностики либо как индивидуальный чип, либо как элемент, входящий в состав мультичипа, содержит 15 групп (кластеров) днк-зондов, каждая из которых представлена одним из 15 иммобилизованных олигонуклеотидов (фиг.6 и таблица 1). чип содержит 15 кластеров индивидуальных дифференцирующих олигонуклеотидов, нанесенных в 4-х или 9 повторах, из них 12 кластеров олигонуклеотидов для одного или двух из 15 инфекционных агентов, представленных в таблице 1, 2
кластера положительного контроля и 1 кластер отрицательного контроля. получаемая гибридизационная картина опытного образца сравнивается с положительными и отрицательными контролями, что позволяет проводить достоверную видовую идентификацию.
идентификация данных мультичипа
существует много примеров применения идентификаторов для идентификации биочипов. например, известно изобретение [18], в котором чип имеет два штрих-кода для идентификации двух рабочих зон. известно изобретение [16], в котором каждая индивидуальная зона с принадлежащей ей кодированной информацией в виде одного идентификатора может быть отделена от мультичипа и использована индивидуально. известно изобретение [19], в котором рассматриваются вопросы применения идентификаторов совместно с компьютером для контроля качества изготовления чипов. отличие предлагаемого изобретения от известных вариантов состоит в том, что индивидуальный чип и мультичип имеет, в зависимости от типа медицинской диагностики, по крайней мере, двух- или трехуровневую идентификацию данных о многофункциональном мультичипе, в который входит N индивидуальных чипов. с этой целью на каждом из индивидуальных чипов размещают, по крайней мере, один, первый идентификатор, относящийся к идентификации данных о биологическом - объекте исследования и необязательно второй идентификатор с данными производителя о дате изготовления, типе и параметрах зондов, причем многофункциональный мультичип на зоне крепежа всех чипов дополнительно содержит третий идентификатор, который может быть идентичен второму идентификатору. причем первый идентификатор связан с первым кодом, второй идентификатор связан со вторым кодом, отличным от первого кода. указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип. идентификатор может быть выполнен в виде цифровых и/или буквенных обозначений, которые выполняют функцию кода или в виде штрих-кодов или их комбинаций.
в качестве примера, включающего, но не ограничивающего объема данного изобретения, ниже приведены параметры, которые могут быть введены в параметры первого идентификатора при определении или диагностики заболеваний млекопитающих.
первый идентификатор отдельного чипа может включать в себя следующие данные, входящие в группу, состоящую из: а) кода болезни, б) кода, характеризующего объект, из которого взята проба (кровь, лимфа, соскоб, слюна и т.д.),' в) код пациента или код данных, идентифицирующий пациента (фио, возраст), г) код медицинского учреждения и/или страховой компании, д) дата диагностики. в свою очередь, параметры второго и третьего идентификатора, идентифицирующие мультичип, могут содержать: а) код номера партии и/или даты изготовления, б) код фирмы изготовителя, в) код, идентифицирующий способ модификации поверхности, г) код типа скрининга (последовательный, параллельный), д) код количества индивидуальных чипов, е) код количества кластеров.
такая информация может быть полезна для выяснения качественных характеристик не только мультичипа, но и его составных компонентов. причем сочетание первого и второго кода или первого, второго и третьего кода должна обеспечить уникальный код, соответствующий только одному мультичипу. обращение к такому уникальному коду обеспечит быстрый поиск информации в базах данных о всех образцах при параллельном скрининге, либо к информации о последовательных измерениях.
аппаратные и программные средства идентификации данных диагностики
для реализации возможностей мультичипа по проведению параллельных и последовательных скринингов биологических объектов необходим комплекс аппаратных и программных средств для обработки полученных данных, их идентификации и занесения в базу данных. на фиг.4 показана блок-схема установки для проведения параллельных и последовательных скринингов биологических объектов. в ее состав входят: компьютер 201, к которому могут быть подключены устройства, входящие в группу, состоящую из дисплея 202, принтера 203 и устройства для сканирования мультичипов или индивидуальных чипов, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из: планшетного сканера 210, цифровой пзс-камеры 211, сканера 212, индивидуальных чипов 110, сканера 213 мультичипа, размещенного на диске 140, ручного сканера 214. данные, полученные посредством сканирования с прямоугольных 130 или дисковых 140 мультичипов, а также с индивидуальных чипов 110, обрабатываются в компьютере 201 и обработанные
данные выдаются либо в форме, записанной на твердых носителях, например, на сд диске 204 , либо посредством связи через интернет или по локальной сети на компьютер 205, на основе которого формируется база данных множества диагностик, которые хранятся, например, на жестких дисках 206. этой информацией с помощью локальной сети или через интернет могут пользоваться несколько пользователей с помощью своих компьютеров 207, например, карманных.
предпочтительно использовать для съема данных диагностики сканирующие устройства, которые могут реализовать, по крайней мере, один из трех известных способов: измерение пропускания, измерение отражения, измерение флуоресценции.
детекция флуоресцентного сигнала производится с использованием детектирующего устройства, например, экспериментальной установки, состоящей из флуоресцентного микроскопа, пзс-камеры и компьютера либо темнопольной установки с подключенной пзс-камерой [20], приведенной в данном описании в качестве ссылки, в которой используется возбуждающий свет лазерных свето диодов. колориметрическая детекция, например, биотинилированной днк, осуществляется также после отмывки микрочипа с использованием сканирующих устройств, например, экспериментальной установки, состоящей из сканера и компьютера, как средства для интерпретации и хранения результатов диагностики и специального программного обеспечения.
предпочтительно, чтобы комплекс аппаратных средств содержал устройства, входящие в группу, состоящую из: ручных сканеров штрих-кода и изображений, автоматических сканеров планшетного типа, сканеров, обеспечивающих съем информации с отдельных индивидуальных чипов и других сканеров.
сканер преобразует изображения рабочей зоны чипа, входящего в состав мультичипа или конкретных кластеров, расположенных в рабочей зоне чипа, в сигналы, полученные с помощью измерения флуоресценции, измерения пропускания, колориметрического измерения, сигналов отражения, в цифровые данные, которые поступают на компьютер для последующей обработки по разным алгоритмам. описание подобных аппаратных и программных систем хорошо известно из литературы.
интерпретация полученных результатов
в случае медицинских чипов, структурная схема одного из вариантов, который включает, но не ограничивает объем изобретения, приведена на фиг. 6. дифференцирующие олигонуклеотиды разделены на 12 (двенадцать) групп в зависимости от вида патогена. интенсивность сигнала образующихся совершенных или несовершенных дуплексов внутри каждой группы существенно выше интенсивности сигнала отрицательных контролей, что позволяет проводить надежную видовую идентификацию инфекционных патогенов. интерпретацию результатов проводят исходя из гибридизационной картины, которую получают, используя экспериментальную установку, включающую, например, сканер, компьютер и специальное программное обеспечение. для цифровой обработки изображений применяют программу «Meдcкaн-l».
интерпретацию результатов проводят следующим образом. интенсивности флуоресцентных или колорометрических сигналов в каждой группе днк-зондов, в которой содержатся олигонуклеотиды, видоспецифичные для одного из 12 инфекционных агентов, с помощью специального программного обеспечения сравнивают с группами зондов положительного (максимальная интенсивность сигнала) и отрицательного (минимальная интенсивность сигнала) контроля. в результате образуется гибридизационная картина, различная для групп положительного контроля, отрицательного контроля и 12 видов инфекционных агентов, что позволяет однозначно интерпретировать полученные данные.
особенности аппаратной и программной систем, разработанных в рамках настоящего изобретения, относятся к использованию мультичипов в качестве объекта диагностики. каждый мультичип характеризуется множеством параметров, которые входят в группу, состоящую из: а) значения интенсивности сигналов в каждом конкретном кластере рабочей зоны для каждого индивидуального чипа, б) количестве кластеров в рабочей зоне каждого индивидуального чипа и их распределение по объектам исследования, в) количество и расположение положительных и/или отрицательных контролей в рабочей зоне каждого из чипов, г) способа съема данных об интенсивности сигналов, д) изображение рабочей зоны чипа в виде графического изображения. данные параметры формируются по определенным алгоритмам в компьютерный файл, который передается в базу данных, например, в общий компьютер клиники. в дополнение к данным параметрам в состав файла входит уникальный
идентификационный код, состоящий из комбинации первого идентификационного кода каждого отдельного чипа и/или второго и третьего идентификационных кодов, характеризующих параметры мультичипа.
компьютерная программа идентифицирует уникальный код мультичипа в автоматическом или диалоговом режиме и производит обработку параметров, занесенных в компьютерный файл при сканировании мультичипа или его индивидуальных компонентов. данные обработки заносятся в файл и, в зависимости от структуры хранения информации в каждом конкретном лечебном заведении, хранятся либо на дисках в картотеке вместе с картой больного, либо хранятся в компьютерной форме на жестких дисках центрального компьютера больницы. к этим данным может обращаться врач. причем поиск файлов осуществляется при введении кода пациента и/или сканировании штрих-кодов с карты больного. после получения результатов диагностики отдельные чипы могут храниться в карте больного и при сканировании штрих-кода чипа и введении запроса в центральный компьютер, последний выдает полную информацию по файлу, характеризующему все параметры и коды диагностики. врач может сравнивать данные, полученные на разных этапах лечения болезни по результатам независимых диагностик, и корректировать лечение или прием тех или иных лекарств в соответствии с данными диагностики. таким образом, уникальный код мультичипа и его компонентов позволяет упростить программы поиска необходимых файлов и сохранять данные о диагностике в разных формах, начиная от компьютерных файлов, кончая хранением индивидуальных чипов в период лечения больного.
набор для диагностики
другим объектом защиты, предлагаемым настоящим изобретением, является набор для видовой идентификации инфекционных агентов, включающий: а) по меньшей мере, один биологический индивидуальный микрочип для проведения разовой диагностики или биологический мультичип для проведения параллельного или последовательного скрининга, охарактеризованный в п.27; б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения пцр, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации.
в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров пцр для видовой идентификации инфекционного агента, с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO : 1 по SEQ ID NO: 58.
49. набор по п.48, отличающийся тем, что дополнительно содержит устройство для проведения гибридизации и/или устройство для сканирования и интерпретации результатов анализа, причем для сканирования используют устройство, входящее в группу, состоящую из: ручного сканера, сканера индивидуальных чипов, планшетного сканера мультичипов, сканера дисковых мультичипов и компьютера.
примеры
ниже приведены примеры, которые включают, но не ограничивают объем изобретения.
пример 1. пришивка олигонуклеотидных зондов к поверхности амино- модифицированного стекла.
в качестве зондов использовали олигонуклеотиды, модифицированные фосфатной группой (р) по 5'-пoлoжeнию ID SEQ No: 59, 68, 90 и 91. олигонуклеотиды наносили кластерами по 4 точки. реакционную смесь, содержащую 4 мкм олигонуклеотида и 60 мм гидрохлорида 3- диметиламинопропилэтилкарбодии мида в 0,1 M 1-мeтилимидaзoлe, рн 7,0, наносили на поверхность стекла роботом (хрrеss Lапе, сша), объем капель составлял от 10 до 50 нл. стекла помещали в герметичную емкость и выдерживали при комнатной температуре в течение часа во влажной атмосфере для предотвращения высыхания капель. затем стекла промывали на шейкере 1 M раствором NaCI в течение 10 минут для удаления нековалентно связанных молекул олигонуклеотидов, обрабатывали дистиллированной водой и хранили при 4 0 C.
пример 2 проведение асимметричной пцр.
пцр-смесь состояла из 10 мм трис-нсl рн 8,8, 50 мм KCl, 0,8% Nопidеt P40, 2 мм MgCl 2 , 100 нr днк анализируемого образца, специфических олигонуклеотидных праймеров ID SEQ No: 1, 2, 19, 20, 88 и 89 и 8 ед. таq- полимеразы в объеме 20 мкл. олигонуклеотиды ID SEQ No: 1, 19 и 88
использовали в концентрации 0,05 мкм. олигонуклеотиды ID SEQ No: 2, 20 и 89, модифицированные биотином по 5 '-положению, использовали в концентрации 0,25 мкм. реакцию проводили на днк-амплификаторе маstеrсусlеr (еррепdоrf, германия) при условиях, приведенных в таблице 3.
таблица 3. условия проведения пцр.
пример 3. гибридизация.
к 21 мкл пцр смеси добавляли 3 мкл 5 х SSC, 3 мкл формамида, 3 мкл 10% SDS, наносили на рабочую зону подложки, накрывали предметным стеклом и инкубирули в течение 1 часа при 45 0 C. по окончании реакции гибридизации поверхность чипа промывали на орбитальном шейкере следующими растворами:
A) 0,5 χ SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут; б) 5 χ SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут;
B) 0,1 х SSC, 0.1% SDS - 2 раза по 5 минут; г) 0,1 х SSC - 3 раза по 1 минуте.
по окончании промывки микрочип высушивали при комнатной температуре 5-10 минут.
пример 4. проведение пероксидазной реакции. -
исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат ("имбио", россия) разбавляли последовательно в 200 раз Ix SSC, содержащим 1% BSA. конъюгат наносили на рабочую зону подложки, накрывали покровным стеклом и выдерживали во влажной атмосфере при комнатной температуре в течение 30
минут. отмывку несвязавшегося конъюгата проводили 2x SSC в течение 5 минут, Ix SSC - 5 минут и O 3 IxSSC в течение 1 минуты.
подложку заливали свежеприготовленным раствором субстрата - диметиламинобензидина. для этого, не более чем за полчаса до проведения реакции, растворяли lмг DAB в 1 мл 0.1 х SSC, добавляли 20 мкл 3%-нoгo раствора пероксида водорода и перемешивали. рабочую зону заливали приготовленным раствором субстрата, накрывали покровным стеклом и выдерживали от 10 до 30 минут при комнатной температуре. в случае положительной реакции появлялись коричневые пятна окисленного субстрата. затем стекло промывали дистиллированной водой и помещали в вертикальном положении в контейнер для осушки и дальнейшего хранения. пример 5. детекция хромогенного зонда.
для получения изображений гибридизационных микрозон использовали слайд сканер Nikоп сооlSсап 9000ED. затем проводили количественную обработку изображений с помощью оригинальной программы "апGепе". результат анализа изображений гибридизационной микрозоны на подложке из стекла дает усредненную интенсивность окраски в зонах, равную 43,9, и интенсивность фона - 1.2 (в условных единицах).
на фиг. 5 представлена картина гибридизации смеси образцов днк взятых из мазков пациентов инфицированных урогенитальными агентами. днк была выделена из смеси и проведен пцр анализ со смесью из 13 пар праймеров, специфичных к 12 патогенам входящих в группу, состоящую из: сhlатуdiа trасhотаtis, Nеissеriа gопоrrhоеае, тriсhотопаs vаgiпаlis, Urеарlаsта иrеаlуtiсит, сапdidа аlbiсапs, мусорlаsта gепitаliит, мусорlаsта hотiпis, Gаrdпеrеllа vаgiпаlis, Strерtососсиs аgаlасtiае, нитап hеrреsvirиs 1, нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4, нитап hеrреsvirиs 5 и к днк положительного контроля. после пцр проведена гибридизация на биочипе (структурная схема которого приведена на фиг. 6). видно, что для каждой днк характерна своя индивидуальная гибридизационная картина. в смеси образцов днк, взятых из мазков пациентов инфицированных урогенитальными агентами, не было обнаружено сhlатуdiа trасhотаtis, нитап hеrреsvirиs 1, нитап hеrреsvirиs 2, нитап hеrреsvirиs 4. кластер, соответствующий отрицательному контролю, не проявился.
на фиг.6 представлена структурная схема медицинского чипа. на схеме приведено расположение кластеров на рабочей зоне биочипа. данный вариант включает, ноне ограничивает других вариантов расположения кластеров.
промышленная применимость способ видовой идентификации инфекционных агентов, преимущественно урогенитальной области, на биологическом микрочипе выгодно отличается быстротой проведения анализа, простотой используемой методики подготовки образца днк для гибридизации, возможностью одновременного выявления до 15 наиболее широко распространенных патогенов, возможностью проведения анализа в лабораторных или полевых условиях, а также относительной дешевизной.
тексты патентов и патентных заявок рассматриваются в тексте данного описания в качестве ссылок.
литература
1. агатова JI. а. и др. способ диагностики поражения организма инфекциями. заявка на патент RU 2001133477 (2003.08.20).
2. юрьев с. ю. способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. патент RU 2272293 (2006.03.20). 3. шипулин г. а. питательная среда для выявления Urеарlаsта Urеаlуtiсит и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов. патент RU 2265656 (2005.12.10).
4. александрова H. в. и др. способ диагностики инфекций, вызванной вирусом эпштейн-барр. патент RU 2247390 (2005.02.27). 5. кошкин с. в. и др. способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выражением экссудативным воспалением. патент RU 2274449 (2006.04.20).
6. ротман P. э. и др. количественный анализ, позволяющий одновременно обнаружить и идентифицировать бактериальные инфекции. патент RU 2004128442 (2005.05.27).
7. Ghаrizаdеh, в. таrgеt-sресifiс multiрlе sеquепсiпg рrimеr рооl fоr miсrоbiаl tурiпg апd sеquепсiпg аррliсаtiопs iп DNа-sеquепсiпg tесhпоlоgiеs. US раtепt аррliс. 20050202436 (Sерtеmbеr 15, 2005).
8. Sheiness D. к. еt аl. меthоds fоr sеlесtivеlу dеtесtiпg miсrооrgапisms аssосiаtеd with vаgiпаl iпfесtiопs iп соmрlех biоlоgiсаl sаmрlеs. US раtепt 5,700,636 (Dесеmbеr 23,1997)
9. Wеisburg W. G. еt аl. Nuсlеiс асid рrоbеs fоr thе dеtесtiоп fоr gепitаl mусорlаsmаs. US раtепt 5,843,667 (Dесеmbеr 1, 1998).
10. Rоssаu R. еt аl. нуbridizаtiоп рrоbеs dеrivеd frоm thе sрасеr rеgiоп bеtwееп thе lбs апd 23s RRNA gепеs fоr thе dеtесtiоп оf поп-virаl miсrооrgапisms. US раtепt 6,277,577 (аugust 21, 2001).
11. Jаппеs , еt аl. Dеtесtiоп апd idепtifiсаtiоп оf рsеudоmопаs sресiеs usiпg thе 16S-23S rRNа sрасеr. US раtепt 6,811,978 (Nоvеmbеr 2, 2004).
12. Rоthmап R.е. ; еt аl. Quапtitаtivе аssау fоr thе simultапеоus dеtесtiоп апd sресiаtiоп оf bасtеriаl iпfесtiопs. US раtепt аррliс. 20030124545 (My 3, 2003).
13. веrgеrоп, мiсhеl G. ; еt аl. Sресiеs-sресifiс, gепus-sресifiс апd uпivеrsаl DNA рrоbеs апd аmрlifiсаtiоп рrimеrs tо rарidlу dеtесt апd idепtifу соmmоп bасtеriаl апd fuпgаl раthоgепs апd аssосiаtеd апtibiоtiс rеsistапсе gепеs frоm сliпiсаl sресimепs fоr diаgпоsis iп miсюbiоlоgу lаbоrаtоriеs. US раtепt аррliс. 20040185478 (September 23, 2004 ).
14. Sсhепа, M. а. мiсrоаrrау теthоd оf gепоtурiпg тultiрlе sаmрlеs аt тultiрlе lосi. US раtепt аррliс. 20050153318 (JuIy 14, 2005). 15. Rаvа R.P. еt аl. меthоds fоr сопсurrепtlу рrосеssiпg тultiрlе biоlоgiсаl сhiр аssауs. US раtепt 6,720,149 (арril 13, 2004).
16. Dеlliпgеr DJ. еt аl. Quаlitу сопtrоl теthоd fоr аrrау тапufасturе. US раt. аррliс. 20050186580 (аugust 25, 2005).
17. Rетасlе J. еt аl. Dеtесtiоп апd/оr quапtifiсаtiоп теthоd оf а tаrgеt тоlесulе bу а biпdiпg with а сарturе тоlесulе fiхеd оп thе surfасе оf а disс. US раt. аррliс.
20020177144 (Nоvетbег 28, 2002).
18. Zеlепу R. еt аl. аutотаtiс iтаgiпg апd апаlуsis оf тiсrоаrrау biосhiрs. US раtепt 6,215,894 (арril 10, 2001).
19.Cattell н.F. сhеmiсаl аrrау fаbriсаtiоп апd usе. US раt. 6,879,915(April 12, 2005).
20. барский в.е. флуоресцентный микроскоп. патент RU 2182328 (2002.05.10).
21. белецкий и.п. и др. набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале
и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. патент RU2265668 2005.12.10 22. мирзабеков а. д. и др. способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. патент RU 2270254 (2006.02.20).
23. Wоlfе, Dаvid M. Dеtесtiоп оf hеrреs simрlех viшs tуреs 1 апd 2 bу пuсlеiс асid аmрlifюаtiоп. 20050042601 (Fеbшаrу 24, 2005).
24. маtsumоtо T. еt аl. меthоd оf tуре-sресifiс dеtесtiоп оf hеrреs simрlех virus. 5,354,653 (осtоbеr 11, 1994).
25. Grоеп P. еt аl. Quапtitаtivе ерstеiп bаrr virus PCR rарid аssау. 6,790,952 (Sерtеmbеr 14, 2004).
26. наrris R. еt аl. DETECTION AND QUаNтIFIсатюN OF HUMAN HеRреS VIRUSES. PCT аррl. WO/2002/034953 (02.05.2002).
27. Smith T. NUCLEIC ACID PROBES AND METHODS FOR DETECTING сLINIсаLLY. PCT аррl. WO/2000/073499 (07.12.2000). 28. Fаrrаr G. GENETIC SUррRеSSюN AND RерLасемеNт. PCT
Apρl.WO/2004/020631 (11.03.2004)
29. Liпdпеr H. VARIANTS OF амINоасYLаSе, NUCLEIC ACIDS CODING SAME, AND USES THEREOF. PCT аррl. WO/2004/113524 (29.12.2004).
30. Grаu о. оLIGоNUсLеотIDе SEQUENCES FOR THE SPECIFIC DETECTION OF моLLIсUтеS BY амрLIFIсатюN OF PRESERVED GENES.
PCT аррl. WO/1994/003634 (17.02.1994).
31. нirаi к. DETECTION OF HUMAN с YTOMEG ALO VIRUS. JP2000032992 (2000-02-02).
32.Yoshida T. Rарid dеtесtiоп оf мусорlаsmа gепitаlium, мусорlаsmа hоmiпis, Urеарlаsmа раrvum, апd Urеарlаsmа urеаlуtiсum оrgапisms iп gепitоuriпаrу sаmрlеs bу рсR-miсrоtitеr рlаtе hуbridizаtiоп аssау. J сliп мiсrоbiоl. 2003 May;41(5):1850-5.
33. рurоhit а. еt аl. меthоd, rеаgепts апd kits fоr thе dеtесtiоп оf Nеissеriа gопоrrhоеае. US раtепt 5,550,040 (аugust 27, 1996).
34. моrrisоп с. еt аl. меthоds апd соmроsitiопs fоr thе dеtесtiоп оf сапdidа sрр. US раtепt 6,235,890 (мау 22, 2001).
.
35. Lott T. еt аl. Nuсlеiс асid рrоbеs fоr dеtесtiпg сапdidа sресiеs. US раtепt 6,242,178 (Juпе 5, 2001). •
36. Hammond P. еt аl. Nuсlеiс асid hуbridizаtiоп аssау рrоbеs, hеlреr рrоbеs апd аmрlifiсаtiоп oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae пuсlеiс асid. US раtепt 5,656,427 (аugust 12, 1997).
37. Smith T. еt аl. Dеtесtiоп оf hеrреs simрlех virus. US раtепt аррl. 20020164586 (Nоvеmbеr 7, 2002).
38. дидковский H. а . и др. герпес-вирусная инфекция: клиническое значение и принципы терапии. нии физико-химической медицины мз рф, москва MMA имени и.м. сеченова
(http://www.medpeterburg.m/news/812317O6.html).