PROCEDE DE DETECTION ET/OU D'IDENTIFICATION DES INFEC¬ TIONS A LYSSAVIRUS, CLONAGE ET EXPRESSION DE GENES CODANT POUR DES PEPTIDES ET/OU DES FRAGMENTS DE PEPTIDES DU LYSSAVIRUS MOKOLA, VACCIN CONTRE LE VIRUS MOKOLA ET/OU L'ENSEMBLE DES LYSSAVIRUS AINSI QUE PROCEDE D'OBTENTION DUDIT VACCIN PAR GENIE GENETIQUE.

La présente invention est relative à un pro¬ cédé de détection et d'identification des infections à Lyssavirus, au clonage et à l' expression de gènes codant pour des peptides et/ou des fragments de peptides du Lyssavirus Mokola, à un vaccin contre le virus Mokola et/ou l'ensemble des Lyssavirus ainsi qu'à son procédé d'obtention par génie génétique.

Au cours des vingt dernières années, ont été isolés de part le Monde des Rhabdovirus apparentés au virus rabique, dont la classification a été établie sur la base d'expériences de séroneutralisation croisée et de fixation du complément. Ainsi, le genre Lyssavirus s'est vu séparé en quatre sérotypes différents représentés res- pectivement pas le virus rabique (serotype 1) , le virus Lagos bat (serotype 2 ; Afrique) , le virus Mokola (serotype 3 ; Afrique) et le virus Duven age (serotype 4 ; Afrique du Sud) . Les souches de Lyssavirus isolées des chauve-souris d'Europe du Nord et d'Espagne sont actuellement en cours de classement. Ces virus bien qu'actuellement uniquement isolés de chauve-souris posent le problème de la protection de la population humaine et des autres espèces animales, et notamment le problème de la protection vaccinale contre ces virus. Le virus Mokola est également préoccupant, puisqu'il a été rendu respon¬ sable en Afrique de cas isolés d'encéphalites rabiformes fatales chez de nombreuses espèces, dont l'Homme, et sur¬ tout d'une épidémie chez des carnivores domestiques du Zimbabwe, dont un chien qui était pourtant vacciné contre la rage.

Un certain nombre de documents décrivent des séquences nucléotidiques du virus rabique et des vaccins en découlant.

Le Brevet français THE WISTAR INSTITUTE 2 515 685 propose un ADN synthétique complémentaire qui code pour la glycoprotéine du virus rabique de souche ERA, qui est défini par sa séquence en nucléotides, son codon d'initiation ATG et son codon de terminaison TGA, qui est une copie de l'ARNm de ladite glycoprotéine et qui est un ADNc monocaténaire.

Les fragments de polypeptides de cet ADNc entre deux sites de coupure ne peuvent pas être supé¬ rieurs à 50 acides aminés.

La séquence déduite en acides aminés de la glycoprotéine comprend 524 acides aminés avec un peptide- signal de 19 acides aminés non-polaires précédant le résidu lysine amino-ter inal et clivé dans la protéine mature.

Son poids moléculaire est d'environ 67 000. L'ADNc du virus rabique et l'ARNm de la glyco¬ protéine peuvent être utilisés pour transformer une bactérie dans le but de produire un polypeptide en quan¬ tités suffisantes pour réaliser une immunisation.

La Demande de Brevet européen TRANSGENE 94 887 concerne un vecteur, tel qu'un phage ou un plasmide, d'expression d'une protéine antigénique de la rage, et plus particulièrement la glycoprotéine, qui comporte au moins une séquence d'ADN efficace qui code pour ladite protéine et un promoteur de l'expression de cette sé- quence dans une bactérie, la séquence d'ADN efficace co¬ dante pouvant être une séquence d'ADN efficace totale ou une séquence partielle comprise entre deux sites de cou¬ pures déterminés. Ce vecteur est utilisé pour transformer ou transfecter -selon qu'il s'agit d'un plasmide ou d'un phage- une bactérie par culture de laquelle on obtient la protéine antigénique de la rage recherchée, qui est défi-

nie par sa séquence en acides aminés et qui est utilisée comme constituant actif d'un vaccin antirabique.

La Demande de Brevet européen INSTITUT PASTEUR et CNRS 237 686 du 18 mars 1986 -qui reproduit les don- nées essentielles d'un Article paru dans Nucleic Acids Res., 1986, l , β, 2671-2683 et d'un Article paru dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 3914-3918 -donne la séquence partielle (jusqu'en position 5500) de l'ARN monocaténaire négatif non segmenté du virus rabique qu'elle revendique, tout comme l'ADNc qui en est dérivé.

Cependant les revendications de cette Demande portent essentiellement sur la séquence polynucléotidique partielle 71-1 421 qui code pour la nucléoprotéine, sur la séquence partielle 1 514- 2 404 qui code pour la pro- téine Ml, sur la séquence partielle 2 496-3 102 qui code pour la protéine M2, sur la séquence partielle 5 417-5 500 qui code pour la partie N-terminale de la protéine L.

Ces séquences nucléotidiques et leurs frag¬ ments et d'autres encore suggérées dans cette Demande, insérées dans des vecteurs, modifient ces derniers qui, lorsqu'ils sont introduits dans une cellule-hôte appro¬ priée, l'obligent à transcrire et traduire les séquences d'ADN susdites pour produire les protéines correspon¬ dantes qui peuvent alors être isolées des extraits cellu- laires de ladite cellule-hôte.

Cette Demande couvre également les ADN recombinants qui contiennent l'un des inserts précités placés sous le contrôle d'un promoteur dérivé du génome du virus SV40, qui sont des vecteurs pouvant être utili- ses pour transformer des cellules eucaryotes (telles que les cellules Vero) et produire des protéines douées de propriétés immunologiques, le promoteur pouvant, de façon plus générale, être un promoteur viral ou eucaryote reconnu par les polymérases des cellules choisies et qui comporte en outre des sites de polyadénylation conve¬ nables en aval de 1'insert. Cette Demande de Brevet men-

tionne, en outre, que l'un des avantages majeur de l'invention est de pourvoir à des séquences d'ADN dérivés de l'ARN génomique du virus de la rage qui, contrairement au génome lui-même, peuvent être isolées sous une forme dépourvue de nucléoprotéines. Les ADNc selon cette Demande de Brevet peuvent être utilisés en tant que sondes, par exemple pour la détection de la présence dans un fluide biologique, du virus de la rage, par hybrida¬ tion. Les polypeptides N, Ml, M2 tels que définis dans cette Demande de Brevet et les Articles précités, par leurs structures peptidiques, peuvent être utilisés pour produire des anticorps correspondants qui peuvent être eux-mêmes utilisés pour ^" le diagnostic in vitro de la présence de polypeptides viraux dans un fluide biolo¬ gique, la protéine Ml présentant un intérêt tout particu¬ lier, notamment en tant que composition immunogène en association avec un véhicule utilisé dans la production de vaccins. N. TORDO et al., décrivent dans un Article paru dans Virol., 1988, 165, 565-576, la détermination de la séquence complète du génome du virus rabique et ont trouvé qu'il existe des domaines hautement conservés dans les protéines L (polymérase) des virus à ARN non seg- mente négatif.

L'Article au nom de 0. POCH et al. paru dans Biochimie, 1988, 70, 1019-1029 décrit des fragments d'ADNc du génome d'une souche avirulente (AVOl) du virus rabique. La séquence de 3 386 nucléotides à partir de l'extrémité 3' couvre les gènes codant pour l'ARN leader, la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine Ml et la protéine matrice M2, ainsi que les régions intergéniques. La com¬ paraison de la séquence AVOl avec celle d'autres souches du virus de la rage révèle une conservation importante aussi bien au niveau des- nucléotides que des acides ami¬ nés.

La comparaison du génome rabique avec ceux d'autres virus à ARN monocaténaire négatif non segmentés (rhabdovirus et paramyxovirus) indique que les signaux d'initiation et d'arrêt de transcription, localisés aux extrémités de chaque gène codant pour une protéine, et les régions de la phosphoprotéine et des protéines matrices qui pourraient être impliquées dans le processus de transcription conservent une structure globale simi¬ laire. Les résultats énoncés dans cet Article suggè¬ rent que les caractéristiques distinctives de la transcription du virus de la rage se trouvent dans les régions intergéniques nettement variables.

Le virus Mokola ^" est un virus rabique dit "apparenté" : les vaccins rabiques ne confèrent qu'une très faible protection à l'égard de l'infection par le virus Mokola.

Les échecs des vaccinations ont été reproduits au laboratoire : des souris vaccinées par les trois vac- cins disponibles sur le marché (souche PV (Pasteur) ; souche PM (Mérieux) ; souche Flury LEP (Behring) ) ne ré¬ sistent pas à une épreuve par le virus Mokola. De fait, leur sérum ne contient que peu d'anticorps capables de neutraliser le virus Mokola in vitro, et leurs lympho- cytes présentent une faible cytotoxicité vis-à-vis de cellules cibles infectées par le virus Mokola.

On peut citer notamment l'Article au nom de T.J. WIKTOR et al., paru dans Develop. Biol. Stand., 1984, _57, 199-211, qui décrit l'analyse antigénique du virus de la rage et du virus Mokola par l'utilisation d'anticorps monoclonaux et qui précise que contrairement à d'autres virus proches du virus rabique, le virus Mokola est peu neutralisé par le sérum de personnes vac¬ cinées contre la rage. On peut citer également l'Article de E. CELIS et al., paru dans J. Virol., 1988, 3 128-3 134 qui pré-

cise que les cellules mononucléées du sang périphérique humain, et les clones T d'individus immunisés par un vac¬ cin antirabique PM ont été testées pour leur capacité à reconnaître les déterminants antigéniques des virus de la rage et des virus apparentés à la rage, dans un test de prolifération induit par l'antigène (AIPA) . Quelques cel¬ lules T mais pas toutes présentent des réactions croisées avec différentes souches de laboratoire du virus rabique et avec des virus apparentés tels que Duvenhage et Mokola. Ces cellules T réagissent avec des epitopes soit de la ribonucléoprotéine, soit de la glycoprotéine vi¬ rale.

Aucune de ces publications ne concerne la pro¬ duction de clones d'ADNc du génome d'un virus apparenté au virus rabique, tel que le virus Mokola, ni leur utili¬ sation en tant qu'agent de prévention, de traitement ou de diagnostic.

De plus, certains de ces Articles montrent que, bien qu'il existe une réactivité croisée entre le virus rabique et des virus apparentés au virus rabique, le vaccin anti-rabique ne protège pas contre les virus apparentés tels que le virus Mokola.

Il apparaît donc nécessaire de proposer un vaccin contre ce virus à usage humain et/ou vétérinaire, tant pour prévenir 1'infection des populations à risque

(vétérinaires, éleveurs, travailleurs de laboratoire) et les animaux domestiques, que pour traiter les personnes après exposition au risque d'infection.

Il ne semble pas qu'un vaccin inactivé puisse actuellement être réalisé à l'échelle industrielle, en raison du faible titre viral obtenu en culture cellu¬ laire, de l'ordre de 10 ⁷ -10 ⁸ .

C'est pourquoi la préparation d'un vaccin anti-Mokola par génie génétique présente un intérêt majeur.

En ce qui concerne le diagnostic de la rage, deux types de méthodes sont actuellement utilisés pour mettre en évidence la présence du virus rabique dans un prélèvement suspect : - on peut citer notamment la méthode qui uti¬ lise des anticorps pour la recherche d'antigène rabique, soit par immunofluorescence (IF) , soit par un test immu- noenzymatique (RREID) ; et

- la mise en évidence du virus, soit par inoculation à la souris, soit par son isolement sur cul¬ ture cellulaire (CC) .

On dispose actuellement d'une batterie d'anticorps monoclonaux qui permettent d'identifier les différentes souches de ragé. Certains de ^' ces anticorps monoclonaux sont spécifiques de certains serotypes au sein des Lyssavirus et même plus précisément d'isolats au sein d'un même serotype. Ces anticorps monoclonaux per¬ mettent donc une caractérisation précise des différentes souches de Lyssavirus qui est applicable dans les enquêtes épidémiologiques. Néanmoins l'identification des souches permise par cette technique est longue car elle nécessite généralement une adaptation préalable de ces souches à la culture cellulaire. D'autre part chaque nou¬ vel isolât appelle la mise en oeuvre de fusions pour la production de nouveaux anticorps monoclonaux spécifiques.

A. ERMINE et al. dans un Article paru dans Mol. Cell. Probes, 1988, 2, 75-82 décrivent une méthode de diagnostic rapide de 1'infection rabique par une mé¬ thode d'hybridation. Cette méthode d'hybridation est utilisée pour détecter les transcrits rabiques dans le cerveau. Des sondes d'ADNc marquées au ^ p provenant du génome de la souche rabique PV (serotype 1) sont utilisées pour identifier des quantités très faibles d'ARN viral spéci- fique. L'ARN viral purifié est obtenu après extraction phénolique. L'ARN est fixé sur des membranes en nylon et

hybride avec un pool d'inserts M13 complémentaires à 200- 400 nucléotides de chaque gène rabique et de chaque ARNm. Les sondes marquées hybridées sont détectées par auto¬ radiographie. Une hybridation a été observée avec des prélèvements de cerveau d'animaux inoculés par des souches vulpines de virus rabiques (serotype 1) . Une ré¬ ponse positive a été obtenue pour des quantités d'ARN total de 80 ng. La détection des transcrits viraux est restée possible sur des cerveaux prélevés une semaine après la mort de l'animal. Une corrélation totale est ob¬ servée en comparaison avec d'autres techniques telles que la détection d'antigènes rabiques par l'utilisation d'un anticorps antirabique fluorescent ou 1'isolement du virus sur cellules de neuroblastomè murin. Cependant ces méthodes ne permettent pas d'une part, la détection rapide d'une infection à Lyssavirus à partir d'un prélèvement de salive ou d'organe et en par¬ ticulier, la détection et 1'identification du virus Mokola, directement dans un échantillon biologique. Lors de la 7ème Rencontre Internationale sur les virus monocaténaires négatifs, qui a eu lieu à Dinard, FRANCE, du 18 au 23 septembre 1988, les Inven¬ teurs ont présenté une communication dans laquelle ils ont fait état de leurs travaux de clonage du génome du virus Mokola, dans le but de pouvoir produire un vaccin par génie génétique. L'abstract de cette Communication indique que des virus Mokola recueillis dans le surna¬ geant de cellules BHK21 infectées, ont été purifiés et l'ARN géno ique en a été extrait. La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à un vaccin spécifique contre le virus Mokola obtenu en exprimant des antigènes viraux majoritairement impliqués dans la réponse immunitaire ainsi qu'un vaccin polyvalent dirigé contre tous les serotypes de Lysεavi- rus, 1'obtention par génie génétique ayant pour avantage de résoudre les problèmes de production de virus et de

fournir un agent de diagnostic spécifique et très sen¬ sible à l'égard des infections à Lyssavirus .

C'est également un but de l'invention de pour¬ voir à un procédé de détection rapide d'une infection à Lyssavirus à partir d'un prélèvement de salive ou d'organe.

La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification rapide de faibles quantités de Lyssavirus présents dans un échantillon biologique, caractérisé en ce ^' que ledit échantillon convenablement traité pour extraire l'ARN viral et/ou les produits de transcription des Lyssavirus éventuellement présents est :

(1) mis en contact avec au moins une amorce appropriée des Lyssavirus, pour obtenir l'ADNc de l'ARN géno ique ou de l'ARNm ;

(2) puis la séquence d'ADNc est mise en contact avec une paire d'amorces appropriées des Lyssa¬ virus pour amplifier au moins un fragment dudit ADNc, l'une desdites amorces étant différente de celle de l'étape (1) et l'autre amorce étant identique à ou diffé¬ rente de celle de l'étape (1) ;

(3) après quoi, la séquence d'ADNc amplifiée est détectée par un moyen approprié. La méthode PCR est notamment décrite par SAIKI et al. dans Science, 1988,239, 487 ainsi que dans les Demandes de Brevet Européen CETUS N ^β 200 362 et 201 184. Cependant le procédé de la présente invention permet de manière inattendue de détecter rapidement (moins de 12 heures) une infection à Lyssavirus à partir d'un prélève¬ ment de salive ou d'organe et par la suite d'identifier le Lyssavirus.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du¬ dit procédé de détection, les amorces sont choisies dans le groupe qui comprend les amorces spécifiques d'une souche, pour un serotype de Lyssavirus, les amorces spé-

cifiques d'un serotype de Lyssavirus et les amorces constituées d'une séquence conservée d'un gène commune à tous les Lyssavirus et ci-après dénommées amorces poly¬ valentes. Parmi les amorces polyvalentes elles-mêmes, on peut distinguer au sens de la présente invention, les amorces de diagnostic ou de détection d'un Lyssavirus (infection à Lyssavirus : réponse du type Oui/Non) et les amorces de diagnostic différentiel ou typage (infection à Lyssavirus : précision sur le type) .

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce rabique 3', localisée en position 1-18 des génomes rabiques et Mokola. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce rabique M2, localisée en position 2901-2918 du génome rabique.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce rabique constituée de 23 nucléotides, localisée en position 4665- 4687 du génome rabique et en position 4675-4697 du génome Mokola, ci-après dénommée amorce G.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce rabique constituée de 24 nucléotides, localisée en position 5520- 5543 du génome rabique et en position 5545-5568 du génome Mokola, ci-après dénommée amorce L.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce Mokola ou rabique constituée de 18 nucléotides localisée en position 587-605 des génomes rabiques et Mokola, ci- après dénommée amorce Na.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce est une amorce Mokola ou rabique constituée de 16 nucléotides localisée

en position 1013-1029 des génomes rabiques et Mokola, ci- après dénommée amorce Nb.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la détection de la séquence nucléotidique amplifiée est réalisée par hybridation au moyen d'une sonde ou d'une batterie de sondes appropriées aux diffé¬ rents Lyssavirus .

Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux dudit procédé, la détection de la séquence nucléoti- dique amplifiée est réalisée par clivage de ladite séquence avec au moins une batterie d'enzymes de restric¬ tion appropriées suivie de la séparation par électropho- rèse des fragments obtenus.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la batterie d'enzymes comprend BamH I, Hind II, Hind III, Pst I.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la batterie d'enzymes comprend Rsa I, Taq I, BstX I, Fnu4H I. L'analyse des homologies de séquence entre les serotypes 1 et 3, qui sont actuellement les plus diver¬ gents parmi les Lyssavirus, permet de définir des zones conservées ou variables, orientant le choix respective¬ ment vers les amorces spécifiques ou polyvalentes. Dans le cas où les amorces polyvalentes choi¬ sies permettent l'amplification d'une zone conservée d'un Lyssavirus, le procédé de détection rapide, conforme à l'invention, de faibles quantités de Lyssavirus dans un échantillon , a l'avantage de permettre de porter un dia- gnostic d'infection à Lyssavirus sur des infections débu¬ tantes ou sur des prélèvements de salive effectués chez les animaux domestiques suspects d'être responsables d'une contamination humaine, plusieurs jours avant leur mort, contrairement à la pratique actuelle ; en effet, par exemple, la paire d'amorces, amorce Na et amorce Nb telles que définies dans l'invention, situées sur le gène

N et peu distantes l'une de l'autre (400 pb) permet la détection (réponse Oui/Non) d'un Lyssavirus même présent en très petites quantités et ce, même si l'échantillon est très dégradé. En effet, la sensibilité des techniques habituelles est relativement faible par rapport à la méthode conforme à l'invention, qui est rapide et permet de porter un diagnostic en moins de 12 heures.

Dans le cas où les amorces choisies permettent la synthèse et l'amplification d'une zone variable (par exemple, pseudogène psi ou certaines régions du gène Ml) d'un Lyssavirus, le procédé conforme à l'invention permet une identification et un typage du Lyssavirus impliqué dans l'infection à détecter. En effet, la paire d'amorces, amorce rabique G ^" et amorce rabique L telles que définies ci-dessus, associée à une batterie d'enzymes de restriction appropriées, permet de typer aussi bien les différentes souches de virus de la rage, le virus Mokola, que les souches de Lyssavirus isolées de chauve- souris ; les deux amorces précitées sont choisies de manière à correspondre à des zones conservées chez les Lyssavirus, l'une dans la partie distale du gène G, l'autre dans la partie proximale du gène L, pour per¬ mettre l'amplification de la région qui les sépare, d'environ 860 nucléotides (pseudogène psi), sur toutes- les souches rabiques ainsi que sur Mokola. La bande am¬ plifiée est détectée soit par hybridation avec une sonde plus ou moins spécifique de souche appropriée, soit par hydrolyse en présence d'enzymes de restriction plus ou moins spécifiques de souche. On peut en outre appliquer directement sur le morceau d'agarose contenant la bande amplifiée, une tech¬ nique de séquençage directe.

La présente invention a également pour objet les séquences spécifiques du virus Mokola, lesquelles sé- quences ont permis de mettre en évidence les zones conservées et les zones variables dans le genre Lyssa-

virus et par comparaison entre les génomes rabiques et Mokola, d'apprécier la variabilité de chaque région geno¬ mique et de mettre au point le procédé de détection et/ou d'identification de Lyssavirus ci-dessus. La séquence nucleotidique de l'ADNc de l'ARN genomique du virus Mokola, est caractérisée en ce qu'elle comprend environ 12 000 nucléotides.

Ladite séquence d'ADNc de l'ARN genomique est, en outre, caractérisée en ce que les extrémités 3' et 5' sont complémentaires, en ce que les 12 nucléotides de l'extrémité 5' sont identiques à ceux de la souche PV du virus rabique, et en ce qu'elle présente successivement de 3' en 5' le gène codant pour l'ARN "leader" puis les gènes codant pour les protéines N, Ml, M2, G et L.

Selon un mode de réalisation avantageux de la¬ dite séquence de l'ADNc de l'ARN genomique du virus Mokola, celle-ci comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides suivante (I) : leader.ARN

ACGCTTAACA ACCAGATCAA AGAAGACACA GATAGTATCA GTGACCTAAA 50

[N ARNm N r- Met-Glu-Ser-Asp-Lys-Ile-Val-Phe CAAAATGTAA CACTCCTJACA ATG GAG TCT GAC AAG ATT GTG TTC 94 Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Val-Val-Ser-Leu-Lys-Pro-Glu-Val-Ile-

AAG GTG AAT AAC CAA GTT GTT TCT TTG AAG CCT GAG GTC ATA 136

Ser-Asp-Gln-Tyr-Glu-Tyr-Lys-Tyr-Pro-Ala-Ile-Leu-Asp-Gly

TCA GAT CAA TAT GAG TAT AAA TAT CCC GCC ATT CTA GAT GGG 178

Lys-Lys-Pro-Gly-Ile-Thr-Leu-Gly.-Lys-Ala-Pro-Asp-Leu-Asn-

AAG AAA CCA GGG ATC ACC TTG GGG AAG GCA CCT GAT CTA AAC 220

Thr-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ile-Leu-Ser-Gly-Met-Lys-Ala-Ala-Lys-

ACT GCA TAC AAA TCC ATC CTA TCA GGT ATG AAG GCT GCA AAG 262

Leu-Asp-Pro-Asp-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ala-Met- CTT GAC CCA GAC GAT GTT TGC TCT TAC TTA GCA GCT GCT ATG 304

His- eu-Phe-Glu-Gly-Val-Cys-Pro-Glu-Asp-Trp-Val-Ser-Tyr- CAT CTA TTC GAG GGG GTC TGT CCC GAG GAC TGG GTT AGT TAT 346

Gly-Ile-Val-Ile-Ala-Lys-Lys-Gly-Glu-Lys-Ile-Asn-Pro-Ser- GGG ATT GTC ATT GCG AAG AAG GGA GAG AAA ATC AAC CCC AGC 388

Val-Ile-Val-Asp-Ile-Val-Arg-Thr-Asn-Val-Glu-Gly-Asn-Trp- GTG ATC GTC GAT ATA GTT CGC ACT AAC GTT GAG GGG AAT TGG 430

Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Thr-Asp-Val-Ile-Arg-Asp-Pro-Thr-Met- GCT CAA GCG GGA GGA ACT GAT GTG ATT AGA GAT CCT ACA ATG 472

Ala-Glu-His-Ala-Ser-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Leu-Cys-Leu-Tyr- GCA GAG CAT GCT TCA TTG GTC GGA CTG TTA TTA TGT CTG TAT 514

Arg- eu-Ser-Lys-Ile-Val-Gly-Gln-Asn-Thr-Ala-Asn-Tyr-Lys-

CGA TTG AGC AAG ATA GTC GGT CAG AAC ACA GCA AAC TAT AAA 556

Thr-Asn-Val-Ala-Asp-Arg-Met-Glu-Gln-Ile-Phe-Glu-Thr-Ala-

ACC AAT GTA GCA GAC AGA ATG GAA CAA ATA TTT GAG ACT GCT 598

Pro-Phe-Ala-Lys-Val-Val-Glu-His-His-Thr-Leu-Met-Thr-Thr-

CCT TTT GCG AAG GTG GTG GAA CAT CAC ACA TTG ATG ACT ACT 640

His-Lys-Met-Cys-Ala-Asn-Trp-Ser-Thr-Ile-Pro-Asn-Phe-Arg-

CAT AAG ATG TGC GCT AAC TGG AGC ACT ATA CCT AAC TTC AGA 682

Phe-Leu-Val-Gly-Thr-Tyr-Asp-Met-Phe-Phe-Ala-Arg-Val-Glu- TTC CTG GTG GGC ACA TAT GAT ATG TTC TTT GCA AGA GTC GAG 724

His-Ile-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Val-Gly-Thr-Val-Val-Thr-Ala-

CAT ATA TAT TCG GCT CTC AGA GTC GGA ACA GTC GTG ACA GCC 766

Tyr-Glu-Asp-Cys-Ser-Gly-Leu-Val-Ser-Phe-Thr-Gly-Phe-Ile-

TAC GAG GAT TGC TCA GGC TTG GTC TCC TTT ACC GGG TTT ATC 808

Lys-Gln-Ile-Asn-Leu-Ser-Pro-Arg-Asp-Ala-Leu-Leu-Tyr-Phe-

AAA CAA ATC AAT CTA TCT CCT AGA GAT GCA CTG CTA TAT TTC 850

Phe-His-Lys-Asn-Phe-Glu-Gly-Glu-Ile-Lys-Arg-Met-Phe-Glu-

TTC CAT AAA AAC TTT GAA GGG GAG ATT AAG AGA ATG TTT GAG 892

Pro-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Pro-His-Ser-Tyr-Phe-Ile-His- CCG GGG CAA GAA ACA GCA GTT CCC CAC TCA TAC TTC ATT CAT 934

Phe-Arg-Ala-Leu-Gly-Leu-Ser-Gly-Lys-Ser-Pro-Tyr-Ser-Ser-

TTT AGA GCA CTT GGC CTG AGT GGC AAG TCC CCG TAC TCG TCC 976 Asn-Ala-Val-Gly-His-Thr-Phe-Asn-Leu-Ile-His-Phe-Val-Gly-

AAT GCT GTA GGT CAT ACT TTC AAT TTA ATC CAC TTT GTA GGA 1018

Cys-Tyr-Met-Gly-Gln-Ile-Arg-Ser-Leu-Asn-Ala-Thr-Val-Ile-

TGC TAT ATG GGT CAG ATC AGG TCT CTA AAT GCA ACT GTG ATC 1060

Gln-Thr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Gly-Ala-Phe-Ser-Gln-Arg-Tyr-

CAA ACA TGT GCA CCT CTC AAA GGT GCC TTT TCC CAA AGA TAT 1102

Leu-Gly-Glu-Glu-Phe-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr-Phe-Glu-Arg-Arg-

CTT GGA GAA GAG TTC TTT GGG AAA GGC ACC TTT GAG AGG AGG 1144

Phe-Phe-Arg-Asp-Glu-Lys-Glu-Met-Gln-Asp-Tyr-Thr-Glu-Leu-

TTC TTT AGG GAT GAA AAA GAG ATG CAA GAT TAT ACA GAG CTT 1186 Glu-Glu-Ala-Arg-Val-Glu-Ala-Ser-Leu-Ala-Asp-Asp-Gly-Thr-

GAG GAG GCC AGA GTA GAG GCT TCG CTC GCT GAT GAC GGG ACT 1228

Val-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Asp-Phe-Phe-Ser-Gly-Glu-Thr-Arg-

GTA GAC TCA GAT GAG GAG GAC TTC TTC TCT GGA GAA ACC AGA 1270

Ser-Pro-Glu-Ala-Val-Tyr-Ser-Arg-Ile-Met-Met-Asn-Asn-Gly-

AGT CCT GAA GCA GTT TAC AGT AGG ATA ATG ATG AAC AAC GGT 1312

Lys-Leu-Lys-Lys-Val-His-Ile-Arg-Arg-Tyr-Ile-Ala-Val-Ser-

AAA TTG AAG AAA GTT CAC ATA CGT AGG TAT ATT GCG GTG AGT 1354

Ser-Asn-His-Gln-Ala-Arg-Pro-Asn-Ser-Phe-Ala-Glu-Phe-Leu-

TCT AAT CAT CAA GCG AGG CCG AAC TCT TTT GCA GAA TTC TTA 1396 Asn-Lys-Val-Tyr-Ala-Asp-Gly-Ser

AAC AAG GTG TAT GCA GAT GGA TCA TAATCAGAGA GCTTCTTGGA 1440

to ARNm— > AGACGATGAT CTATAGAGGG GTATTATTGT GAGACAGATT CCjRGAAAAAA 1490

Ml ARNm Ml *+ ^• Met-Ser-Lys-Asp-Leu-

1CTTAACACC ACTCCTCGAT TCGTGGTGTC AA ATG AGC AAA GAT TTG 1537

Val-His-Pro-Ser-Leu-Ile-Arg-Ala-Gly-Ile-Val-Glu-Leu-Glu-

GTG CAT CCT AGT CTT ATC AGG GCA GGG ATA GTA GAA CTG GAA 1580

Met-Ala-Glu-Glu-Thr-Thr-Asp-Leu-Ile-Asn-Arg-Thr-Ile-Glu-

ATG GCA GAA GAG ACT ACT GAT CTG ATT AAC AGG ACC ATA GAG 1622

Ser-Asn-Gln-Ala-His-Leu-Gln-Gly-Glu-Pro-Leu-Tyr-Val-Asp-

AGC AAC CAA GCT CAC CTT CAG GGG GAG CCG CTT TAT GTT GAT 1664

Ser-Leu-Pro-Glu-Asp-Met-Ser-Arg-Leu-Arg-Ile-Glu-Asp-Lys-

TCA TTG CCG GAA GAT ATG AGC AGA TTG AGA ATA GAG GAC AAA 1706

Ser-Arg-Arg-T r-Lys-Thr-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Asp-Glu-Gly- TCT CGT AGG ACT AAA ACA GAA GAA GAA GAA AGA GAT GAA GGT 1748

Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-Asn-Tyr-Leu-Ser-Glu-Gly-Gln-Asp-Pro- AGT TCT GAG GAG GAT AAC TAT TTG TCT GAG GGA CAA GAT CCA 1790

Leu-Ile-Pro-Phe-Gln-Asn-Phe-Leu-Asp-Glu-Ile-Gly-Ala-Arg-

TTA ATC CCC TTT CAG AAT TTC CTT GAT GAA ATT GGG GCC AGA 1832

Ala-Val-Lys-Arg-Leu-Lys-Thr-Gly-Glu-Gly-Phe-Phe-Arg-Val- GCG GTC AAG AGA TTG AAG ACT GGC GAG GGA TTC TTC AGG GTG 1874

Trp-Ser-Ala-Leu-Ser-Asp-Asp-Ile-Lys-Gly-Tyr-Val-Ser-Thr-

TGG TCT GCT CTG TCA GAT GAC ATA AAG GGG TAT GTA TCT ACC 1916

Asn-Ile-Met-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg-Asp-Thr-Lys-Ser-Ile-Gln-

AAT ATA ATG ACA TCT GGG GAG AGA GAT ACT AAG AGC ATA CAA 1958

Ile-Gln-Thr-Glu-Pro-Thr-Ala-Ser-Val-Ser-Ser-Gly-Asn-Glu- ATT CAG ACA GAA CCA ACC GCT TCA GTT AGC TCT GGA AAC GAG 2000

Ser-Arg-His-Asp-Ser-Glu-Ser-Met-His-Asp-Pro-Asn-Asp-Lys-

AGT CGG CAT GAT TCT GAG AGC ATG CAT GAT CCA AAT GAC AAG 2042

Lys-Asp-His-Thr-Pro-Asp-His-Asp-Val-Val-Pro-Asp-Ile-Glu-

AAA GAT CAC ACA CCC GAT CAC GAT GTG GTC CCG GAC ATT GAG 2084

Ser-Ser-Thr-Asp-Lys-Gly-Glu-Ile-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Glu-

TCT TCT ACT GAC AAA GGA GAG ATT CGA GAT ATA GAA GGA GAA 2126

Val-Ala-His-Gln-Val-Ala-Glu-Ser-Phe-Ser-Lys-Lys-Tyr-Lys-

GTT GCC CAT CAG GTA GCA GAA AGC TTT TCA AAG AAA TAC AAG 2168

Phe-Pro-Ser-Arg-Ser-Ser-Gly-Ile-Phe-Leu-Trp-Asn-Phe-Glu- TTC CCT TCT AGA TCC TCG GGA ATA TTC TTG TGG AAC TTT GAG 2210

Gln-Leu-Lys-Met-Asn-Leu-Asp-Asp-Ile-Val-Lys-Ala-Ala-Met-

CAG CTT AAA ATG AAT CTA GAT GAT ATT GTG AAA GCA GCC ATG 2252

Asn-Val-Pro-Gly-Val-Glu-Arg-Ile-Ala-Glu-Lys-Gly-Gly-Lys-

AAT GTA CCA GGG GTT GAA AGG ATC GCC GAA AAG GGA GGG AAG 2294

Leu-Pro-Leu-Arg-Cys-Ile-Leu-Gly-Phe-Val-Ala-Leu-Asp-Ser-

CTT CCC CTG AGA TGT ATT TTG GGG TTT GTG GCA TTG GAC TCT 2336

Ser-Lys-Arg-Phe-Arg-Leu-Leu-Ala-Asp-Asn-Asp-L s-Val-Ala-

TCA AAG AGA TTT AGA CTT CTT GCA GAC AAT GAC AAG GTG GCA 2378

Arg-Leu-Ile-Gln-Glu-Asp-Ile-Asn-Ser-Tyr-Met-Ala-Arg-Leu-

AGA CTC ATC CAA GAA GAT ATC AAC AGT TAC ATG GCC CGG CTC 2420

Glu-Glu-Ala-Glu

M2^ Met-Asn-Phe-Leu-Lys-Lys-Mët-Ile-Lys-Ser-Cys-Lys-Asp- AAG ATG AAT TTC CTC AAG AAA ATG ATC AAG AGC TGT AAG GAT 2554

Glu-Glu-Thr-Gln-Lys-Tyr-Pro-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Pro-Asp-

GAA GAG ACT CAG AAG TAT CCA TCA GCA TCT GCG CCT CCA GAC 2596

Asp-Asp-Asp-Ile-Trp-Met-Pro-Pro-Pro-Glu-Tyr-Val-Pro-Leu-

GAT GAT GAC ATT TGG ATG CCC CCG CCT GAG TAT GTC CCC TTA 2638

Thr-Gln-Val-Lys-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Arg-Asn-Phe-Cys-Ile-

ACC CAG GTC AAG GGC AAG GCC AGT GTG AGA AAC TTT TGC ATT 2680

Ser-Gly-Glu-Val-Lys-Ile-Cys-Ser-Pro-Asn-Gly-Tyr-Ser-Phe-

AGT GGA GAG GTC AAG ATA TGT AGT CCA AAC GGG TAC TCC TTC 2722

Lys-Ile-Leu-Arg-His-Ile-Leu-Lys-Ser-Phe-Asp-Asn-Val-Tyr-

AAG ATA CTC AGG CAT ATT TTG AAG TCG TTT GAT AAT GTT TAC 2764

Ser-Gly-Asn-Arg-Arg-Met-Ile-Gly-Leu-Val-Lys-Val-Val-Ile-

TCT GGG AAC AGG AGG ATG ATC GGG TTA GTC AAA GTG GTT ATC 2806

Gly-Leu-Val-Leu-Ser-Gly-Ser-Pro-Val-Pro-Glu-Gly-Met-Asn-

GGG CTT GTA CTT TCA GGA TCT CCA GTC CCG GAG GGC ATG AAC 2848

Trp-Val-Tyr-Lys-Leu-Arg-Arg-Thr-Leu-Ile-Phe-Gln-Trp-Ala-

TGG GTT TAT AAA CTT CGT AGG ACC TTA ATA TTT CAG TGG GCA 2890

Glu-Ser-His-Gly-Pro-Leu-Glu-Gly-Glu-Glu-Leu-Glu-Tyr-Ser-

GAG TCT CAT GGA CCG TTG GAA GGA GAA GAG CTT GAG TAC TCA 2932

Gln-Glu-Ile-Thr-Trp-Asp-Asp-Glu-Ala-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-

CAA GAA ATT ACA TGG GAT GAT GAG GCA GAG TTT GTA GGC CTC 2974

Gln-Ile-Arg-Val-Ser-Ala-Arg-Gln-Cys-His-Ile-Gln-Gly-Arg- CAA ATC AGA GTG AGC GCC AGA CAA TGT CAC ATC CAG GGT CGT 3016

Leu-Trp-Cys-Ile-Asn-Met-Asn-Ser-Arg-Ala-Cys-Gln-Leu-Trp-

CTC TGG TGC ATT AAC ATG AAC TCA AGA GCA TGT CAA TTA TGG 3058

Ala-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Thr-Gln-Gln-Ser-Pro-Asp-Asp-Glu-

GCC GAT ATG ATC TTG CAG ACC CAA CAG TCC CCG GAT GAT GAA 3100

Asn-Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Glu

AAC ACC TCA CTT TTA TTA GAG TAGACTCTAG CCTGTAGCTT 3141

TGCCTCTTAA TTGTTACCTC TGTTTGGAGT AGAGAAAAAC CGCGAGCAAT 3191

AGAACAATTA CCGCAACGGT GCCCGCTTTC AGCACAATAC ATATAAGCTA 3241

M2 ARNπT J ACCACTGGTT TGTCTTCCTA TTCAGGGTCG AGCGAAAACG TGAAAAAA C 3291

[G ARNm G**- Met-Asn-Ile-Pro-

TACATAAAAA GGCAOAACAG CCCTCTCCCT GCCATC ATG AAT ATA CCT 3339 Cys-Phe-Val-Val-Ile-Leu-Ser-Leu-Ala-Thr-Thr-His-Ser-Leu-

TGC TTT GTT GTG ATT CTC AGC TTA GCC ACT ACA CAT TCT CTG 3381

Gly-Glu-Phe-Pro-Leu-Tyr-Thr-Ile-Pro-Glu-Lys-Ile-Glu-Lys-

GGA GAA TTC CCC TTG TAC ACA ATT CCT GAG AAG ATA GAG AAA 3423

Trp-Thr-Pro-Ile-Asp-Met-Ile-His-Leu-Ser-Cys-Pro-Asn-Asn-

TGG ACT CCC ATA GAC ATG ATC CAT CTG AGT TGC CCC AAC AAC 3465

Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Glu-Gly-Cys-Asn-Ala-Glu-Ser-Ser-Phe-

CTA TTA TCT GAG GAA GAA GGT TGC AAT GCA GAG TCA TCC TTT 3507

Thr-Tyr-Phe-Glu-Leu-Lys-Ser-Gly-Tyr-Leu-Ala-His-Gln-Lys-

ACT TAC TTT GAG CTC AAG AGT GGT TAC CTA GCT CAT CAG AAG 3549 Val-Pro-Gly-Phe-Thr-Cys-Thr-Gly-Val-Val-Asn-Glu-Ala-Glu-

GTT CCA GGG TTT ACC TGT ACC GGG GTC GTG AAC GAG GCA GAG 3591

Thr-Tyr-Thr-Asn-Phe-Val-Gly-Tyr-Val-Thr-Thr-Thr-Phe-Lys-

ACA TAT ACA AAC TTC GTC GGG TAC GTC ACC ACA ACC TTC AAA 3633

Arg-Lys-His-Phe-Arg-Pro-Thr-Val-Ala-Ala-Cys-Arg-Asp-Ala-

AGG AAG CAC TTT AGG CCT ACA GTA GCC GCC TGT CGT GAT GCC 3675

Tyr-Asn-Trp-Lys-Val-Ser-Gly-Asp-Pro-Arg-Tyr-Glu-Glu-Ser-

TAC AAC TGG AAA GTG TCA GGA GAC CCC AGG TAC GAA GAG TCA 3717

Leu-His-Thr-Pro-Tyr-Pro-Asp-Ser-Ser-Trp-Leu-Arg-Thr-Val-

CTC CAC ACT CCT TAT CCT GAC AGC AGT TGG TTG AGG ACT GTG 3759 Thr-Thr-Thr-Lys-Glu-Ser-Leu-Leu-Ile-Ile-Ser-Pro-Ser-Ile-

ACT ACA ACC AAA GAA TCA CTT CTC ATA ATA TCG CCC AGC ATC 3801

Val-Glu-Met-Asp-Ile-Tyr-Gly-Arg-Thr-Leu-His-Ser-Pro-Met-

GTG GAA ATG GAT ATT TAC GGC AGG ACT CTC CAT TCC CCC ATG 3843

Phe-Pro-Ser-Gly-Val-Cys-Ser-Asn-Val-Tyr-Pro-Ser-Val-Pro-

TTT CCT TCA GGA GTA TGT TCC AAC GTA TAT CCC TCT GTC CCA 3885

Ser-Cys-Glu-Thr-Asn-His-Asp-Tyr-Thr-Leu-Trp-Leu-Pro-Glu-

TCC TGT GAG ACT AAT CAT GAT TAC ACA TTA TGG CTG CCT GAA 3927

Asp-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Val-Cys-Asp-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-

GAT CCT AGT TTG AGT TTG GTC TGT GAT ATC TTT ACT TCC AGC 3969

Asn-Gly-Lys-Lys-Ala-Met-Asn-Gly-Ser-Arg-Ile-Cys-Gly-Phe- AAC GGA AAG AAG GCC ATG AAC GGG TCA CGC ATC TGC GGA TTC 4011

Lys-Asp-Glu-Arg-Gly-Phe-Tyr-Arg-Ser-Leu-Lys-Gly-Ala-Cys-

AAG GAT GAA AGG GGA TTC TAC AGA TCT TTA AAG GGC GCT TGC 4053

Lys-Leu-Thr-Leu-Cys-Gly-Arg-Pro-Gly-Ile-Arg-Leu-Phe-Asp-

AAG CTG ACA TTG TGT GGA AGA CCT GGA ATT AGG TTA TTC GAC 4095 Gly-Thr-Trp-Val-Ser-Phe-Thr-Lys-Pro-Asp-Val-His-Val-Trp-

GGA ACT TGG GTC TCT TTT ACA AAG CCG GAC GTG CAC GTA TGG 4137

Cys-Thr-Pro-Asn-Gln-Leu-Ile-Asn-Ile-His-Asn-Asp-Arg-Leu-

TGC ACT CCC AAC CAA TTG ATC AAT ATA CAC AAT GAC AGA CTA 4179

Asp-Glu-Ile-Glu-His-Leu-Ile-Val-Glu-Asp-Ile-Ile-Lys-Lys-

GAT GAG ATA GAA CAC CTG ATC GTG GAA GAC ATC ATA AAG AAA 4221

Arg-Glu-Glu-Cys-Leu-Asp-Thr-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Met-Ser-

AGA GAA GAG TGC TTA GAC ACC CTG GAA ACA ATA CTT ATG TCT 4263

Gln-Ser-Val-Ser-Phe-Arg-Arg-Leu-Ser-His-Phe-Arg-Lys- eu-

CAA TCT GTT AGC TTT AGA AGG TTG AGC CAT TTC CGA AAG TTA 4305 Val-Pro-Gly-Tyr-Gly-Lys-Ala-Tyr-Thr-Ile-Leu-Asn-Gly-Ser-

GTT CCA GGA TAT GGG AAG GCC TAC ACT ATT TTA AAC GGC AGC 4347

Leu-Met-Glu-Thr-Asn-Val-Tyr-Tyr-Lys-Arg-Val-Asp-Lys-Trp-

CTG ATG GAA ACA AAT GTC TAC TAC AAA AGG GTC GAC AAG TGG 4389

Ala-Asp-Ile-Leu-Pro-Ser-Lys-Gly-Cys-Leu-Lys-Val-Gly-Gln-

GCT GAC ATC TTA CCC TCT AAG GGA TGT CTG AAA GTC GGG CAA 4431

Gln-Cys-Met-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Val-Leu-Phe-Asn-Gly-Ile-

CAA TGC ATG GAA CCT GTC AAA GGA GTC CTC TTC AAT GGG ATT 4473

Ile-Lys-Gly-Pro-Asp-Gly-Gln-Ile-Leu-Ile-Pro-Glu-Met-Gln-

ATC AAG GGC CCG GAT GGC CAA ATT TTG ATC CCC GAG ATG CAG 4515 Ser-Glu-Gln-Leu-Lys-Gln-His-Met-Asp-Leu-Leu-Lys-Ala-Ala-

TCA GAG CAG CTA AAG CAG CAT ATG GAC CTG TTG AAG GCG GCT 4557

Val-Phe-Pro-Leu-Arg-His-Pro-Leu-Ile-Ser-Arg-Glu-Ala-Val- GTG TTT CCT CTC CGA CAC CCT TTA ATC AGC CGG GAG GCA GTC 4599

Phe-Lys-Lys-Asp-Gly-Asp-Ala-Asp-Asp-Phe-Val-Asp-Leu-His-

TTT AAG AAA GAC GGG GAT GCC GAT GAT TTT GTG GAT CTC CAT 4641

Met-Pro-Asp-Val-His-Lys-Ser-Val-Ser-Asp-Val-Asp-Leu-Gly-

ATG CCT GAT GTC CAC AAG TCT GTG TCA GAT GTC GAC CTG GGT 4683

Leu-Pro-His-Trp-Gly-Phe-Trp-Met-Leu-Ile-Gly-Ala-Thr-Ile-

CTG CCT CAT TGG GGT TTC TGG ATG TTG ATC GGG GCA ACA ATA 4725

Val-Ala-Phe-Val-Val-Leu-Val-Cys-Leu-Leu-Arg-Val-Cys-Cys-

GTA GCA TTT GTG GTC TTG GTA TGT TTA CTC CGT GTA TGT TGT 4767

Lys-Arg-Val-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Gly-Arg-Ala-Thr-Gln-Glu-

AAG AGA GTG AGG AGG AGA AGA TCA GGA CGT GCA ACT CAG GAG 4809

Ile-Pro-Leu-Ser-Phe-Pro-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Arg-Ala-Lys-

ATC CCC CTG AGC TTT CCC TCT GGC CCT GTT CCT CGA GCC AAA 4851 Val-Val-Ser-Ser-Trp-Glu-Ser-Tyr-Lys-Gly-Leu-Pro-Gly-Thr

GTG GTG TCA TCT TGG GAG TCC TAT AAA GGG CTT CCA GGT ACA 4893

TGAAACCTTC ATCAGATTGC CTAACATATC CCCCACAACC GGATTACCTG 4943

CCTCGGCAAG ACACAACTTG ATCACATGGT GTCAAATCTC CTTTCAAACC 4993

CTCCAGTGTA TAATGATTAG AGGAGGGTTG CTTGTCAATC AGGGGGTGGT 5043

GTTGTCTC T ACATTCCGTT ACTCGTAAGT TGAAATCTCT CCTTTCTCAT 5093

TGTCTAAATA CTTCTGAACA CAATCTCTCA ACGATTAGGT CTTCTGGTTT 5143

TTATAAAGAG TTGCCTTCTA AAATGGGCAC TCTATAGAGC CTTCAATCTT 5193 TTTGAGGTGC GGCAATATTA GCTTGAAATA ACCTTAAGGT CTAATTTCTC 5243

CTGTTTCCCA ATAATATCAC AGGAGTATCT AATTGTTCTG TGTGATGACA 5293

GGACGCAATA TGATGTCTCT 5343 GTCACCCTAG ACTGTCACAT 5393 CCTTGGTCAA AGTCAACGCC 5442

Met-Met-Asp-Val-Thr-Glu-Val-Tyr-Asp-Asp-Pro-Ile-Asp-Pro-

ATG ATG GAC GTT ACG GAG GTG TAT GAC GAC CCG ATA GAC CCT 5484

Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Glu-Trp-Asn-Ser-Ser-Pro-Val-Val-Pro-

GTT GAG CCA GAA GGA GAA TGG AAT AGC AGT CCC GTA GTT CCA 5526

AA 55 ₈₀

8

21

Met-Ile-Gln-Trp-Leu-Thr-Ser-Gly-Asn-Arg-Pro- -TA ATG ATT CAG TGG CTA ACA TCC GGG AAT AGA CCC 5622

Ser-Arg-Met-...-Val-Thr-Glu-Asn-Thr-Thr-Arg-Ser-Tyr-Lys-

TCG AGA ATG AA- GTC ACA GAG AAC ACA ACC AGG TCT TAC AAA 5664

Val-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Lys-Gly-Val-Asp-Ile-Ala-Thr-Ile-

GTC TTG AGA GCA CTT TTC AAG GGA GTG GAT ATA GCA ACA ATA 5706

Lys-Ile-Gly-Gly-Val-Gly-Ala-Gln-Ala-Met-Met-Gly-Leu-Trp-

AAA ATA GGG GGT GTG GGA GCT CAG GCA ATG ATG GGG CTG TGG 5748

Val-Leu-Gly-Ser-His-Ser-Glu-Ser-Ser-Arg-Ser-Arg-Lys-Cys-

GTC TTG GGG TCT CAC TCA GAA TCG TCT CGA AGC AGA AAG TGT 5790

Leu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-Phe-Tyr-Gln-Arg-Thr-Leu-Pro-Ile-

CTA GCT GAC TTG TCT GCA TTT TAT CAG AGG ACC CTA CCT ATA 5832

Glu-Ser-Ile-Leu-Asn-Gln-His-Leu-Asn-Glu-Gln-Arg-Thr-Thr-

GAG TCC ATC TTG AAC CAA CAC CTT AAT GAA CAG AGG ACT ACA 5874 Asp-Pro-Arg-Glu-Gly-Val-Leu-Ser-Gly-Leu-Asn-Arg-Val-Ser- GAC CCT AGA GAA GGA GTT TTA TCC GGA TTG AAT AGA GTT AGC 5916

Tyr-Asp-Gln-Ser-Phe-Gly-Arg-Tyr-Leu-Gly-Asn-Leu-Tyr-Ser TAT GAT CAG TCC TTT GGC CGG TAT TTA GGC AAT TTG TAC TCC 5958

Ser-Tyr-Leu-Leu-Phe-His-Val-Ile-Ile-Leu-Tyr-Met-Asn-Ala-

TCT TAT CTC CTC TTT CAC GTC ATC ATA TTG TAC ATG AAT GCG 6000

Leu-Asp-Trp-Glu-Glu- - -Thr-Ile-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-

TTG GAT TGG GAA GAG GA AG ACC ATT CTG GCC CTG TGG AGA 6042

Asp-Ile-Thr-Ser-Ile-Asp-Ile-Lys-Asn-Asp-Arg-Val-Tyr-Phe-

GAC ATA ACA TCT ATA GAT ATC AAA AAT GAC CGA GTC TAC TTT 6084 Lys-Asp-Pro-Leu-Trp-Gly-Lys-Leu-Leu-Val-Thr-Lys-Asp-Phe-

AAG GAC CCT TTG TGG GGG AAA CTC TTA GTA ACA AAA GAT TTT 6126

Val-Tyr-Ala-His-Asn-Ser-Asn-Cys-Leu-Phe-Asp-Lys-Asn-Tyr-

GTA TAT GCA CAC AAT AGC AAC TGT TTA TTT GAC AAA AAT TAC 6168

Thr-Leu-Met-Leu-Lys-Asp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Phe-Asn-Ser-

ACA CTG ATG CTA AAA GAC TTG TTC CGT GCA AGA TTC AAC TCA 6210

Leu-Leu-Ile-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Asp-Ser-Arg-Tyr-Ser-Asp-

TTG CTC ATA CTT GTG TCC CCG CCG GAC TCC CGT TAC TCA GAT 6252

Asp-Leu-Ala-Ala-Asn-Leu-Cys-Arg-Leu-Tyr-Ile-Ser-Gly-Asp-

GAT CTG GCT GCC AAC CTG TGT CGA CTT TAC ATC TCA GGG GAT 6294 Arg-Leu-Leu-Ser-Ser-C s-Gly-Asn-Ala-Gly-Tyr-Asp-Val-Ile-

AGG CTT CTC TCC AGT TGT GGG AAT GCA GGA TAT GAT GTC ATC 6336

Lys-Met-Leu-Glu-Pro-Cys-Val-Val-Asp-Leu-Leu-Val-Gln-Arg-

AAA ATG TTA GAG CCT TGT GTG GTG GAT CTA CTG GTT CAA AGA 6378

Ala-Glu-Thr-Phe-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Gly-Glu-Phe-

GCT GAG ACG TTC CGT CCT TTA ATT CAC TCA CTG GGG GAG TTC 6420

Pro-Ala-Phe-Ile-Lys-Asp-Lys-Thr-Thr-Gln-Leu-Ile-Gly- CCT GCT TTC ATA AAA GAC AAA ACA ACT CAA CTG ATA GGC A-T 6462

Phe-Gly-Pro-Cys-Asp-Tyr-Asn-Phe-Phe-Ser-Met-Leu-Gln-Asn-

TTT GGA CCA TGC GAC TAC AAT TTC TTC TCG ATG CTC CAG AAT 6504

Phe-Asp-Asn-Ile-His-Asp-Leu-Val-Phe-Ile-Tyr-Gly-Cys-Tyr-

TTC GAC AAT ATT CAT GAT TTG GTA TTT ATT TAC GGA TGT TAC 6546

Arg-His-Trp-Gly-His-Pro-Tyr-Ile-Asp-Tyr-Arg-Lys-Gly-Leu-

CGG CAC TGG GGG CAT CCC TAC ATA GAC TAT AGA AAA GGG CTT 6588

Ser-Lys-Leu-Phe-Asp-Gln-Val-His-Met-Lys-Lys-Thr-Ile-Asp-

TCC AAG CTC TTT GAT CAA GTC CAT ATG AAG AAG ACT ATA GAT 6630 Gln-Gln-Tyr-Gln-Glu-Arg-Leu-Ala-Ser-Asp-Leu-Ala-Arg-Lys-

CAG CAA TAT CAA GAG CGT CTG GCT AGC GAT CTA GCC AGG AAG 6672

Ile-Leu-Arg-Trp-Gly-Phe-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Trp-Tyr-Leu-

ATT CTG CGT TGG GGG TTC GAA AAG TAC TCC AAA TGG TAT CTA 6714

Asp-Thr-Gly-Val-Ile-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Ala-Pro-Tyr-

GAT ACA GGT GTC ATT CCC AAA GAC CAT CCC CTG GCT CCT TAT 6756

Ile-Ala-Thr-Gln-Thr-Trp-Pro-Pro-Lys-His-Val-Val-Asp-Leu-

ATT GCA ACA CAG ACA TGG CCC CCG AAA CAT GTG GTG GAT CTC 6798

Leu-Gly-Asp-Ser-Trp-His-Thr-Leu-Pro-Met-Thr-

CTG GGA GAT TCT TGG CAC ACT CTC CCG ATG ACT 6840 6900 ₆ 9 ₆ 0 7020 7080 _{; 7140} 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920

7980 8040 ₈₁₀ o 8160 8220 8280 8340 8400 ₈ 4 ₆₀ 8520 ₈₅₈₀ 8640 Glu-Ser-Phe-Leu-Asn-Ser-Glu-Ile-His-Gly-Ile-Asn-Arg-Val-

GAG TCT TTC CTT AAT TCC GAG ATC CAT GGG ATA AAC AGG GTG 8682

Thr-Gln-Thr-Pro-Gln-Arg-Leu

ACA CAA ACC CCT CAA CGA CTC 8760

Val-Asp-Leu-Gly-Pro- GT- GAC CTT GGT CCC 8820

Lys-Ser-Ser-Val-Ala-Cys-Gly-Cys-Tyr-Thr-Arg-Glu-Val-Gly-

AAG TCC TCA GTG GCT TGT GGG TGT TAT ACC AGG GAG GTT GGA 8862

Asn-Pro-Arg-Ile-Ser-Val-Ser-Val-Leu-Pro-Ser-Phe-Asp-Pro-

AAC CCC CGG ATC TCT GTC TCA GTG TTG CCT TCC TTT GAC CCT 8904

Ser-Phe-Leu-Ser-Arg-Gly-Pro-Leu-Lys-Gly-Tyr-Leu-Gly-Ser-

TCT TTC CTC TCA AGG GGC CCT CTT AAG GGG TAC TTA GGA TCT 8946

Ser-Thr-Ser-Met-Ser-Thr-Gln-Leu-Phe-His-Ser-Trp-Glu-Lys-

TCC ACA TCT ATG TCC ACT CAG TTG TTC CAC TCA TGG GAG AAA 8988

Val-Thr-Asn-Val-His-Val-Val-Lys-Arg-Ala-Leu-Ser-Leu-Lys-

GTC ACA AAT GTT CAT GTG GTC AAG AGG GCT CTA TCA CTC AAA 9030

Glu-Ser-Ile-Asn-Trp-Phe-Val-Ser-Arg-Glu-Ser-Asn-Leu-Ala-

GAG TCC ATC AAC TGG TTT GTG TCT CGG GAG TCT AAC TTG GCA 9072 ys-Thr-Leu-Ile-Gly-Asn-Ile-Leu-Ser-Leu-Thr-Gly-Pro-Ile-

AAG ACT CTG ATA GGA AAC ATA CTG TCC CTA ACA GGA CCC ATC 9114

Phe-Ser-Ile-Glu-Glu-Ala-Pro-Val-Phe-Lys-Arg-Thr-Gly-Ser-

TTT TCC ATA GAG GAG GCT CCG GTT TTC AAG AGG ACC GGC TCA 9156

Ala-Leu-His-Arg-Phe-Lys-Ser-Ala-Arg-Tyr-Ser-Glu-Gly-Gly-

GCT TTA CAT CGA TTC AAA TCT GCT AGG TAT AGT GAG GGC GGT 9198

Tyr-Pro-Ala-Val-Cys-Pro-

TAT CCA GCC GTG TGT CCC A 9240 9300 9360 9420

9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11280 11340 11400 11460 11520 Leu-Tyr-Asn-Ser-Pro-Val-Thr-Tyr-Tyr-Phe-Gly-Lys- AG CTC TAC AAC TCT CCT GTG ACT TAT TAC TTT GGA AAG 11562

Gln-Thr-Ile-Lys-Gly-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ser-Trp-Ser-Trp-Ala-

CAG ACT ATC AAA GGG AGG AGG TAT CTA TCG TGG AGT TGG GCC 11604

Asn-Ser-Ser-Pro-Ile-Phe-Lys-Lys-Val-Ala-Cys-Asn-Ser-Ser- AAC TCA AGT CCA ATC TTC AAA AAG GTG GCA TGC AAC TCC TCT 11646

Ile-Ser-Leu-Ser-Ser-His-Trp-Ile-Arg-Leu-Ile-Tyr-Lys-Ile-

ATC AGT CTA .TCC TCT CAC TGG ATA AGG TTG ATA TAC AAG ATA 11688

Val-Lys-Thr-Thr-Arg-Leu-Asn-Cys-Ser-Pro-Arg-Asp-Met-Leu-

GTC AAA ACC ACT CGC CTG AAT TGC TCT CCT AGG GAC ATG TTA 11730 Arg-Glu-Thr-Glu-Ala-Cys-Leu-Arg-Thr-Tyr-Asn-Lys-Trp-Ile-

AGA GAG ACA GAA GCT TGC CTT AGA ACC TAT AAC AAG TGG ATC 11772

Asn-Ile-Arg-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Tyr- AAC ATA AGA GAC ACA AGA TCT AGA ACT TCG ATA TTG GAC TAC 11814

Cys-Cys-Leu L

TGC.TGT CTT TAGTCTAATC AATGGTGATA GACTTGGAGA GCATCATTGA 11863

ARNm

AAAAAA WPAGG TAGCAATTAC CTTATGCATT GTCCTGTGAT TATTTTTGAT 11913 TTTTATATGG TTTTTTTGTT AAGCGT 11939

(I)

L'invention a également pour objet, des frag¬ ments de ladite séquence codant pour un des peptides et/ou pour un fragment peptidique du virus Mokola ainsi que des fragments de ladite séquence non codants corres- pondant à une zone du génome Mokola variable, c'est-à- dire non conservée d'un gène commun à tous les Lyssa¬ virus .

Parmi lesdits fragments codants, elle englobe entre autres : - un fragment qui code pour la nucléoprotéine

N et correspond aux nucléotides 71-1420 de ladite séquence d'ADNc ;

- un fragment qui code pour la protéine Ml et correspond aux nucléotides ^' 1524-2432 de ladite séquence d'ADNc ;

- un fragment qui code pour la protéine M2 et correspond aux nucléotides 2516-3121 de ladite séquence d'ADNc ;

- un fragment qui code pour la protéine G et correspond aux nucléotides 3328-4893 de ladite séquence d'ADNc ;

- un fragment qui code pour 1*extrémité NH ₂ terminale de la protéine L et correspond aux nucléotides 5443-6831 de ladite séquence d'ADNc. Parmi lesdits fragments non-codants, elle en¬ globe entre autre un fragment qui correspond aux nucléo¬ tides 4897-5442 de ladite séquence, lequel fragment cor¬ respond au pseudogène psi rabique.

La présente invention a également pour objet la séquence de l'ARN genomique du virus Mokola, caracté¬ risée en ce qu'elle comprend environ 12 000 nucléotides, en ce qu'il s'agit d'un ARN monocaténaire négatif non segmenté et non polyadénylé, en ce qu'elle présente suc¬ cessivement de 3' en 5' le gène codant pour l'ARN "leader" puis les gènes codant pour la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine Ml, la protéine de matrice M2, la gly-

coprotéine G et la protéine polymérase L et en ce que ledit génome est toujours associé à la nucléoprotéine N.

La présente invention a également pour objet les produits de transcription du virus Mokola, ca- ractérisés en ce qu'ils sont constitués de 5 fragments monocistroniques successifs codant à partir de l'extrémité 3' pour les protéines N, Ml, M2, G et L, à savoir :

- un fragment correspondant aux nucléotides 59-1484 de la séquence de formule I, associé à un poly

A ;

- un fragment correspondant aux nucléotides 1495-2489 de la séquence de formule I, associé à un poly A ; - un fragment correspondant aux nucléotides

2501-3283 de la séquence de formule I, associé à un poly A ;

- un fragment correspondant aux nucléotides 3307-5380 de la séquence de formule I, associée à un poly A et codant pour la protéine G,

- un fragment de grande taille codant pour la protéine L ;

- ainsi qu'un fragment bicistronique M1-M2.

La présente invention a également pour objet des clones d'ADNc de l'ARN genomique du virus Mokola, caractérisés en ce qu'ils correspondent à l'ensemble du génome, de l'extrémité 3' à l'extrémité 5', à savoir :

- un fragment qui mesure 4 150 nucléotides, dénommé ci-après pMDIO et correspondant à la séquence co- dant pour l'ARN "leader" pour la nucléoprotéine N, la protéine Ml, la protéine M2 et un fragment de la séquence codant pour la protéine G ;

- un fragment qui mesure 2 850 nucléotides, dénommé ci-après pMAlO et correspondant à un fragment de la séquence codant pour la protéine G et à un fragment codant pour la protéine L ;

- un fragment, réalisé par la jonction des in- serts pMDIO et pMAlO, au niveau d'un site BglII, qui, à partir de l'extrémité 3', comprend 6 830 nucléotides et contient la séquence codante pour l'ARN leader, les pro- téines N, Ml, M2 et G ainsi que les 1 420 premiers nucléotides du gène L et ci-après dénommé pM7 ; .

- un fragment d'environ 3 300 nucléotides, dé¬ nommé pMB5 et correspondant à un fragment de la séquence codant pour la protéine L ; - un fragment d'environ 2 800 nucléotides, ci- après dénommé pM12, correspondant à un fragment de la sé¬ quence codant pour la protéine L ;

- un fragment d'environ 700 nucléotides, ci- après dénommé pMR15a et correspondant à un fragment de la séquence codant pour la protéine L ainsi qu'à l'extrémité 5' non transcrite du génome ; lesquels fragments, pris séparément, présentent chacun une aptitude à s'hybrider de manière spécifique à un fragment d'ARN provenant de la transcription ou de la replication du génome Mokola ou à un fragment d'ADNc.

Conformément à l'invention, le clone pM7 a été déposé sous le numéro 1-847 en date du 22 mars 1989 au¬ près de la Collection Nationale de cultures de micro¬ organismes tenue par l'Institut Pasteur. Conformément à l'invention, le clone pMB5 a été déposé sous le numéro 1-848 en date du 22 mars 1989 auprès de la Collection Nationale de cultures de micro¬ organismes tenue par l'Institut Pasteur.

Conformément à l'invention, le clone pM12 a été déposé sous le numéro 1-849 en date du 22 mars 1989 auprès de la Collection Nationale de cultures de micro¬ organismes tenue par l'Institut Pasteur.

Conformément à l'invention, le clone pMR15a a été déposé sous le numéro 1-850 en date du 22 mars 1989 auprès de la Collection Nationale de cultures de micro¬ organismes tenue par l'Institut Pasteur.

La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, -caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucleotidique telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.

Selon un mode de réalisation desdites sondes, on peut citer la séquence 4675-5568 ou un fragment de celle-ci et notamment le fragment 4897-5442 ou leurs brins complémentaires.

De telles sondes sont spécifiques du virus Mokola.

La présente invention a également pour objet des peptides ou fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont codés par au moins un fragment tel que défini ci-dessus ou une portion de fragment ou une combinaison de plusieurs fragments tels que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la nucléoprotéine N et présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule II ci-après :

Met-Glu-Ser-Asp-Lys-Ile-Val-Phe-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Val- Val-Ser-Leu-Lys-Pro-Glu-Val-Ile-Ser-Asp-Gln-Tyr-Glu-Tyr- Lys-Tyr-Pro-Ala-Ile-Leu-Asp-Gly-Lys-Lys-Pro-Gly-Ile-Thr- Leu-Gly-Lys-Ala-Pro-Asp-Leu-Asn-Thr-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ile- Leu-Ser-Gly-Met-Lys-Ala-Ala-Lys-Leu-Asp-Pro-Asp-Asp-Val- Cys-Ser-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-His-Leu-Phe-Glu-Gly-Val- Cys-Pro-Glu-Asp-Trp-Val-Ser-Tyr-Gly-Ile-Val-Ile-Ala-Lys- Lys-Gly-Glu-Lys-Ile-Asn-Pro-Ser-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Val- Arg-Thr-Asn-Val-Glu-Gly-Asn-Trp-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Thr- Asp-Val-Ile-Arg-Asp-Pro-Thr-Met-Ala-Glu-His-Ala-Ser-Leu- Val-Gly-Leu-Leu-Leu-Cys-Leu-Tyr-Arg-Leu-Ser-Lys-Ile-Val- Gly-Gln-Asn-Thr-Ala-Asn-Tyr-Lys-Thr-Asn-Val-Ala-Asp-Arg- Met-Glu-Gln-Ile-Phe-Glu-Thr-Ala-Pro-Phe-Ala-Lys-Val-Val- Glu-His-His-Thr-Leu-Met-Thr-Thr-His-Lys-Met-Cys-Ala-Asn- Trp-Ser-Thr-Ile-Pro-Asn-Phe-Arg-Phe-Leu-Val-Gly-Thr-Tyr- Asp-Met-Phe-Phe-Ala-Arg-Val-Glu-His-Ile-Tyr-Ser-Ala-Leu- Arg-Val-Gly-Thr-Val-Val-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Cys-Ser-Gly- Leu-Val-Ser-Phe-Thr-Gly-Phe-Ile-Lys-Gln-Ile-Asn-Leu-Ser- Pro-Arg-Asp-Ala-Leu-Leu-Tyr-Phe-Phe-His-Lys-Asn-Phe-Glu- Gly-Glu-Ile-Lys-Arg-Met-Phe-Glu-Pro-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala- Val-Pro-His-Ser-Tyr-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ala-Leu-Gly-Leu-

Ser-Gly-Lys-Ser-Prσ-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ala-Val-Gly-His-Thr- Phe-Asn-Leu-Ile-His-Phe-Val-Gly-Cys-Tyr-Met-Gly-Gln-Ile- Arg-Ser-Leu-Asn-Ala-Thr-Val-Ile-Gln-Thr-Cys-Ala-Pro-Leu- Lys-Gly-Ala-Phe-Ser-Gln-Arg-Tyr-Leu-Gly-Glu-Glu-Phe-Phe- Gly-Lys-Gly-Thr-Phe-Glu-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Asp-Glu-Lys- Glu-Met-Gln-Asp-Tyr-Thr-Glu-Leu-Glu-Glu-Ala-Arg-Val-Glu- Ala-Ser-Leu-Ala-Asp-Asp-Gly-Thr-Val-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu- Asp-Phe-P e-Ser-Gly-Glu-Thr-Arg-Ser-Pro-Glu-Ala-Val-Tyr- Ser-Arg-Ile-Met-Met-Asn-Asn-Gly-Lys-Leu-Lys-Lys-Val-His- Ile-Arg-Arg-Tyr-Ile-Ala-Val-Ser-Ser-Asn-His-Gln-Ala-Arg- Pro-Asn-Ser-Phe-Ala-Glu-Phe-Leu-Asn-Lys-Val-Tyr-Ala-Asp- Gly-Ser-

(II)

Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la protéine Ml et présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule III ci-après :

Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Val-His-Pro-Ser-Leu-Ile-Arg-Ala-Gly- Ile-Val-Glu-Leu-Glu-Met-Ala-Glu-Glu-Thr-Thr-Asp-Leu-Ile- Asn-Arg-Thr-Ile-Glu-Ser-Asn-Gln-Ala-His-Leu-Gln-Gly-Glu- Pro-Leu-Tyr-Val-Asp-Ser-Leu-Pro-Glu-Asp-Met-Ser-Arg-Leu- Arg-Ile-Glu-Asp-Lys-Ser-Arg-Arg-Thr-Lys-Thr-Glu-Glu-Glu- Glu-Arg-Asp-Glu-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-Asn-Tyr-Leu-Ser- Glu-Gly-Gln-Asp-Pro-Leu-Ile-Pro-Phe-Gln-Asn-Phe-Leu-Asp- Glu-Ile-Gly-Ala-Arg-Ala-Val-Lys-Arg-Leu-Lys-Thr-Gly-Glu- Gly-Phe-Phe-Arg-Val-Trp-Ser-Ala-Leu-Ser-Asp-Asp-Ile-Lys- Gly-Tyr-Val-Ser-Thr-Asn-Ile-Met-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg-Asp- Thr-Lys-Ser-Ile-Gln-Ile-Gln-Thr-Glu-Pro-Thr-Ala-Ser-Val- Ser-Ser-Gly-Asn-Glu-Ser-Arg-His-Asp-Ser-Glu-Ser-Met-His- Asp-Pro-Asn-Asp-Lys-Lys-Asp-His-Thr-Pro-Asp-His-Asp-Val- Val-Pro-Asp-Ile-Glu-Ser-Ser-Thr-Asp-Lys-Gly-Glu-Ile-Arg- Asp-Ile-Glu-Gly-Glu-Val-Ala-His-Gln-Val-Ala-Glu-Ser-Phe- Ser-Lys-Lys-Tyr-Lys-Phe-Pro-Ser-Arg-Ser-Ser-Gly-Ile-Phe- Leu-Trp-Asn-Phe-Glu-Gln-Leu-Lys-Met-Asn-Leu-Asp-Asp-Ile- Val-Lys-Ala-Ala-Met-Asn-Val-Pro-Gly-Val-Glu-Arg-Ile-Ala- Glu-Lys-Gly-Gly-Lys-Leu-Pro-Leu-Arg-Cys-Ile-Leu-Gly-Phe- Val-Ala-Leu-Asp-Ser-Ser-Lys-Arg-Phe-Arg-Leu-Leu-Ala-Asp- Asn-Asp-Lys-Val-Ala-Arg-Leu-Ile-Gln-Glu-Asp-Ile-Asn-Ser- Tyr-Met-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Ala-Glu- ⁽ IID

Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la protéine M2 et présente une composition en acides aminés qui répond à la formule IV ci-après :

Met-Asn-Phe-Leu-Lys-Lys-Met-Ile-Lys-Ser-Cys-Lys-Asp-Glu- Glu-Thr-Gln-Lys-Tyr-Pro-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Pro-Asp-Asp-

Asp- ^• Asp ^• Ile- Trp-Met- Pro- Pro- ^• Pro -Glu- Tyr-Val- Pro -Leu-Thr- Gln- ^• Val -Lys- Gly-Lys- Ala- Ser- ^• Val -Arg- Asn-Phe- Cys ^• Ile-Ser- Gly- Glu -Val- Lys-Ile- Cys- Ser- ^• Pro -Asn- Gly-Tyr- Ser -Phe-Lys- Ile- ^• Le -Arg- His-Ile- ^• Leu- Lys- Ser -Phe- ^• Asp-Asn- Val -Tyr-Ser- Gly- ^• Asn -Arg- Arg-Met -Ile- Gly- ^• Leu -Val- Lys-Val- ^• Val -Ile-Gly- Leu- ^• Val -Leu- ^• Ser-Gly ^• Ser- Pro- -Val -Pro- ^• Glu-Gly- ^• Met -Asn-Trp- Val- ^• Tyr -Lys- Leu-Arg -Arg- ^• Thr- ^• Leu -Ile- ^• Phe-Gln- ^• Trp -Ala-Glu- Ser- ^• His -Gly- Pro-Leu -Glu- Gly- ^• Glu -Glu- ^• Leu-Glu- Tyr -Ser-Gln- Glu- -Ile -Thr- Trp-Asp -Asp- ^• Glu- -Al a -Glu- ^• Phe-Val- ^• Gly -Leu-Gln- Ile- -Arg -Val- ^• Ser-Ala -Arg- ^• Gln- ^• Cys -His- ^• Ile-Gln- ^• Gly -Arg-Leu- Trp- -Cys -Ile- -Asn -Met -Asn- •Ser- -Arg -Ala- •Cys-Gln- ^• Leu -Trp-Ala- Asp- -Met -Ile- ^• Leu-Gln -Thr- ^• Gin- -Gin -Ser- -Pro-Asp- -Asp-Glu-Asn- Thr- -Ser -Leu- ^• Leu-Leu -Glu-

(IV)

Selon un mode de réalisation avantageux ledit peptide est codé par le gène de la glycoprotéine G et est caractérisé par une séquence en amino acides qui répond à la formule V ci-après :

Met- Asn- Ile- Pro- Cys- Phe- Val- Val- Ile- Leu- Ser- Leu- Ala- Thr-

Thr- His- Ser--Leu- Gly Glu- Phe- Pro- Leu- Tyr- Thr-Ile- Pro-Glu-

Lys- Ile- Glu--Lys- Trp- Thr Pro- Ile- Asp- Met- Ile-His- Leu-Ser-

Cys- Pro- Asn--Asn- Leu- Leu Ser- Glu- Glu Glu- Gly-Cys- Asn-Ala-

Glu- Ser- Ser--Phe- Thr- Tyr Phe- Glu- Leu Lys- Ser Gly Tyr-Leu-

Ala- His- Gln--Lys- Val- Pro Gly- Phe- Thr Cys- Thr-Gly Val-Val-

Asn- Glu- Ala--Glu- Thr Tyr Thr Asn Phe Val- Gly--Tyr Val-Thr-

Thr Thr- Phe--Lys Arg Lys His Phe ^• Arg ^• Pro- Thr--Val ^• Ala-Ala-

Cys Arg- Asp--Ala Tyr Asn Trp ^• Lys Val Ser- Gly--Asp Pro-Arg-

Tyr Glu- Glu--Ser Leu His Thr Pro ^• Tyr ^• Pro- Asp--Ser •Ser-Trp-

Leu ^• Arg- Thr--Val Thr Thr Thr ^• Lys ^• Glu •Ser- Leu--Leu ^• Ile-Ile-

Ser ^• Pro Ser--Ile ^• Val Glu Met ^• Asp ^• Ile ^• Tyr- Gly-Arg ^• Thr-Leu-

His Ser Pro--Met ^• Phe Pro Ser ^• Gly ^• Val ^• Cys- Ser--Asn ^• Val-Tyr-

Pro ^• Ser ^• Val'-Pro ^• Ser Cys Glu ^• Thr ^• Asn -His- ^• Asp--Tyr ^• Thr-Leu-

Trp ^• Leu ^• Prθ'-Gl ^• Asp Pro Ser ^• Leu -Ser ^• Leu- ^• Val--Cys ^• Asp-Ile-

Phe ^• Thr ^• Ser'-Ser ^• Asn Gly Lys -Lys -Ala ^• Met- ^• Asn--Gly -Ser-Arg-

Ile ^• Cys ^• Gly-Phe ^• Lys Asp Glu •Arg -Gly -Phe- ^• Tyr--Arg -Ser-Leu-

Lys ^• Gly ^• Ala'-Cys ^• Lys Leu Thr ^• Leu -Cys -Gly- ^• Arg--Pro -Gly-Ile-

Arg ^• Leu ^• Phe'-Asp ^• Gly Thr Trp ^• Val -Ser -Phe- ^• Thr'-Lys -Pro-Asp-

Val -His ^• Val-Trp -Cys Thr Pro -Asn -Gin -Leu- ^• Ile-Asn -Ile-His-

Asn -Asp ^• Arg-Leu -Asp Glu Ile -Glu -His -Leu- -Ile-Val -Glu -Asp-

Ile -Ile ^• Lys-Lys -Arg Glu Glu -Cys -Leu -Asp' ^• Thr-Leu -Glu -Thr-

Ile -Leu -Met-Ser -Gin Ser Val -Ser -Phe -Arg' -Arg-Leu -Ser-His-

Phe -Arg -Lys-Leu -Val -Pro Gly -Tyr -Gly -Lys' -Ala-Tyr -Thr-Ile-

Leu -Asn -Gly-Ser -Leu -Met Glu -Thr -Asn -Val' -Tyr-Tyr -Lys-Arg-

Val -Asp -Lys-Trp -Ala -Asp -Ile -Leu -Pro -Ser -Lys-Gly -Cys-Leu-

Lys -Val -Gly-Gin -Gin -Cys -Met -Glu -Pro -Val -Lys-Gly -Val-Leu-

Phe -Asn -Gly-Ile -Ile -Lys -Gly -Pro -Asp -Gly -Gin-Ile -Leu-Ile-

Pro -Glu -Met-Gin -Ser -Glu -Gin -Leu -Lys -Gin -His-Met -Asp-Leu-

Leu -Lys -Ala-Ala -Val -Phe -Pro -Leu -Arg -His -Pro-Leu -Ile-Ser-

Arg -Glu -Ala-Val -Phe -Lys -Lys -Asp -Gly -Asp -Ala Asp -Asp Phe-

Val -Asp -Leu-His -Met -Pro -Asp -Val -His -Lys -Ser-Val -Ser Asp-

Val-Asp-Leu-Gly-Leu-Pro-His-Trp-Gly-Phe-Trp-Met-Leu-Ile-

Gly-Ala-Thr-Ile-Val-Ala-Phe-Val-Val-Leu-Val-Cys-Leu-Leu-

Arg-Val-Cys-Cys-Lys-Arg-Val-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Gly-Arg-

Ala-Thr-Gln-Glu-Ile-Pro-Leu-Ser-Phe-Pro-Ser-Ala-Pro-Val-

Pro-Arg-Ala-Lys- Val-Val-Ser-Ser-Trp-Glu-Ser-Tyr-Lys-

Gly-Leu-Pro-Gly-Thr-

(V)

Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la protéine L et présente l'une des séquences en acides aminés suivante :

- la séquence de formule VI ci-après :

Met-Met-Asp-Val-Thr-Glu-Val-Tyr-Asp-Asp-Pro-Ile-Asp-Pro- Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Glu-Trp-Asn-Ser-Ser-Pro-Val-Val-Pro-

Met-Ile-Gln-Trp-Leu-Thr-Ser-Gly-Asn-Arg-Pro- Ser-Arg-Met-...-Val-Thr-Glu-Asn-Thr-Thr-Arg-Ser-Tyr-Lys- Val-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Lys-Gly-Val-Asp-Ile-Ala-Thr-Ile- Lys-Ile-Gly-Gly-Val-Gly-Ala-Gln-Ala-Met-Met-Gly-Leu-Trp- Val-Leu-Gly-Ser-His-Ser-Glu-Ser-Ser-Arg-Ser-Arg-Lys-Cys- Leu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-Phe-Tyr-Gln-Arg-Thr-Leu-Pro-Ile- Glu-Ser-Ile-Leu-Asn-Gln-His-Leu-Asn-Glu-Gln-Arg-Thr-Thr- Asp-Pro-Arg-Glu-Gly-Val-Leu-Ser-Gly-Leu-Asn-Arg-Val-Ser- Tyr-Asp-Gln-Ser-Phe-Gly-Arg-Tyr-Leu-Gly-Asn-Leu-Tyr-Ser- Ser-Tyr-Leu-Leu-Phe-His-Val-Ile-Ile-Leu-Tyr-Met-Asn-Ala- Leu-Asp-Trp-Glu-Glu- - -Thr-Ile-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- Asp-Ile-Thr-Ser-Ile-Asp-Ile-Lys-Asn-Asp-Arg-Val-Tyr-Phe- Lys-Asp-Pro-Leu-Trp-Gly-Lys-Leu-Leu-Val-Thr-Lys-Asp-Phe- Val-Tyr-Ala-His-Asn-Ser-Asn-Cys-Leu-Phe-Asp-Lys-Asn-Tyr- Thr-Leu-Met-Leu-Lys-Asp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Phe-Asn-Ser- Leu-Leu-Ile-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Asp-Ser-Arg-Tyr-Ser-Asp- Asp-Leu-Ala-Ala-Asn-Leu-Cys-Arg-Leu-Tyr-Ile-Ser-Gly-Asp- Arg-Leu-Leu-Ser-Ser-Cys-Gly-Asn-Ala-Gly-Tyr-Asp-Val-Ile- Lys-Met-Leu-Glu-Pro-Cys-Val-Val-Asp-Leu-Leu-Val-Gln-Arg- Ala-Glu-Thr-Phe-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Gly-Glu-Phe- Pro-Ala-Phe-Ile-Lys-Asp-Lys-Thr-Thr-Gln-Leu-Ile-Gly- Phe-Gly-Pro-Cys-Asp-Tyr-Asn-Phe-Phe-Ser-Met-Leu-Gln-Asn- Phe-Asp-Asn-Ile-His-Asp-Leu-Val-Phe-Ile-Tyr-Gly-Cys-Tyr- Arg-His-Trp-Gly-His-Pro-Tyr-Ile-Asp-Tyr-Arg-Lys-Gly-Leu- Ser-Lys-Leu-Phe-Asp-Gln-Val-His-Met-Lys-Lys-Thr-Ile-Asp- Gln-Gln-Tyr-Gln-Glu-Arg-Leu-Ala-Ser-Asp-Leu-Ala-Arg-Lys- Ile-Leu-Arg-Trp-Gly-Phe-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Trp-Tyr-Leu- Asp-Thr-Gly-Val-Ile-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Ala-Pro-Tyr- Ile-Ala-Thr-Gln-Thr-Trp-Pro-Pro-Lys-His-Val-Val-Asp-Leu- Leu-Gly-Asp-Ser-Trp-His-Thr-Leu-Pro-Met-Thr-

(VI) - la séquence de formule VII ci-après :

Glu-Ser-Phe-Leu-Asn-Ser-Glu-Ile-His-Gly-Ile-Asn-Arg-Val-

Thr-Gln-Thr-Pro-Gln-Arg-Leu

(VII) - la séquence de formule VIII ci-après :

Val-Asp-Leu-Gly-Pro- Lys-Ser-Ser-Val-Ala-Cys-Gly-Cys-Tyr-Thr-Arg-Glu-Val-Gly- Asn-Pro-Arg-Ile-Ser-Val-Ser-Val-Leu-Pro-Ser-Phe-Asp-Pro- Ser-Phe-Leu-Ser-Arg-Gly-Pro-Leu-Lys-Gly-Tyr-Leu-Gly-Ser- Ser-Thr-Ser-Met-Ser-Thr-Gln-Leu-Phe-His-Ser-Trp-Glu-Lys- Val-Thr-Asn-Val-His-Val-Val- ys-Arg-Ala-Leu-Ser-Leu-Lys- Glu-Ser-Ile-Asn-Trp-Phe-Val-Ser-Arg-Glu-Ser-Asn-Leu-Ala- Lys-Thr-Leu-Ile-Gly-Asn-Ile-Leu-Ser-Leu-Thr-Gly-Pro-Ile- Phe-Ser-Ile-Glu-Glu-Ala-Pro-Val-Phe-L s-Arg-Thr-Gly-Ser- Ala-Leu-His-Arg-Phe-Lys-Ser-Ala-Arg-Tyr-Ser-Glu-Gly-Gly- Tyr-Pro-Ala-Val-Cys-Pro

(VIII)

- et la séquence de formule IX ci-après

Leu-Tyr-Asn-Ser-Pro-Val-Thr-Tyr-Tyr-Phe-Gly-Lys- Gln-Thr-Ile-Lys-Gly-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ser-Trp-Ser-Trp-Ala- Asn-Ser-Ser-Pro-Ile-Phe-Lys-Lys-Val-Ala-Cys-Asn-Ser-Ser- Ile-Ser-Leu-Ser-Ser-His-Trp-Ile-Arg-Leu-Ile-Tyr-Lys-Ile- Val-Lys-Thr-Thr-Arg-Leu-Asn-Cys-Ser-Pro-Arg-Asp-Met-Leu- Arg-Glu-Thr-Glu-Ala-Cys-Leu-Arg-Thr-Tyr-Asn-Lys-Trp-Ile- Asn-Ile-Arg-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Tyr- Cys-Cys-Leu

(IX)

Selon un mode de réalisation avantageux des peptides et/ou fragments peptidiques conformes à l'invention, ceux-ci sont obtenus par synthèse.

La présente invention a également pour objet un vecteur, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence nucleotidique ou une portion de cette séquence telle que définie ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un peptide ou d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptides du virus Mokola, caractérisé en ce qu'il est obtenu par recombinaison homologue entre un baculovirus de souche sauvage et un vecteur navette approprié comprenant au

moins :

(1) des séquences régulatrices de l'expression du baculovirus ;

(2) un polylinker approprié à l'insertion d'un gène ou d'au moins un fragment de gène du virus Mokola.

Selon un mode de réalisation avantageux du vecteur d'expression conforme à l'invention, ledit vec¬ teur navette comprend :

(1) un fragment de génome d'un baculovirus, comportant la région de contrôle en 5' du gène de la polyédrine ;

(2) un polylinker approprié à l'insertion d'un gène ou d'au moins un fragment de gène du virus Mokola ;

(3) les séquences de contrôle en 3' avec notamment le site de polyadénylation de la polyédrine, ledit vecteur navette permettant la multiplication de la construction.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le gène ou un fragment du gène de la glycoprotéine G du virus Mokola est inséré au niveau du polylinker, de manière à obtenir un vecteur d'expression dit chargé de ladite glycoprotéine, sous contrôle du pro¬ moteur du gène de la polyédrine.

Conformément à l'invention, ledit vecteur d'expression a été déposé sous le numéro 1-851 en date du 22 mars 1989 auprès de la Collection Nationale de Cultures de micro-organismes tenue par 1'Institut Pasteur.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le gène ou un fragment du gène de la nucléoprotéine N est inséré au niveau du polylinker, de manière à obtenir un vecteur d'expression dit chargé de ladite nucléoprotéine, sous contrôle du promoteur du gène de la polyédrine. Le processus d'expression d'au moins un pep¬ tide, un fragment de peptide ou une combinaison de frag-

ments de peptides du virus Mokola, met en oeuvre un vec¬ teur d'expression conforme à l'invention, dans des cel¬ lules de lépidoptère appropriées, notamment la chenille Spodoptera frugiperda, Sf9 en présence de baculovirus de type sauvage, pour l'obtention de baculovirus recombi¬ nants exprimant le polypeptide désiré.

La sélection des baculovirus recombinants se fera sur la morphologie des plages obtenues. En effet, la présence de la polyédrine donne aux plages de virus sau- vage un aspect réfringeant en microscopie optique lorsqu'on les éclaire par épiluminescence. A l'inverse, l'aspect terne des plages de virus recombinants, dû à l'absence de cristal, permet de les distinguer facile¬ ment. Les avantages présentés par ce système d'expression sont multiples :

- les baculovirus sont aisément capables de glycosyler, phophoryler, palmityler, etc... Ceci permet d'envisager l'expression de nombreuses protéines ayant des modifications post-traductionnelles comme c'est le cas pour la glycoprotéine G ;

- le taux d'expression peut être extrêmement élevé, de l'ordre de 1 à 10 mg par litre de culture ;

- la culture en suspension des cellules de lé- pidoptères est possible ;

- le fait que la polyédrine soit un gène tar¬ dif s'exprimant après que la réplication virale et la formation des nucléocapsides aient eu lieu, permet même d'exprimer des protéines toxiques pour la multiplication du virus.

La présente invention a également pour objet un vaccin contre le virus Mokola, à usage humain et/ou vétérinaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide et/ou un fragment de peptide conforme à l'invention, éventuellement associé à au moins un véhi¬ cule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit vaccin, il comprend la glycoprotéine G et/ou un fragment de celle-ci et/ou la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci. L'association de ces deux peptides viraux pré¬ sente les avantages suivants : ils interviennent à des niveaux différents de la réponse immune ; en effet la glycoprotéine G induit préférentiellement la formation d'anticorps neutralisants alors que la nucléoprotéine N intervient surtout dans l'immunité à médiation cellu¬ laire.

La présente invention a également pour objet un vaccin polyvalent des Lyssavirus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide et/ou fragment pepti- dique conforme à l'invention, éventuellement associé à au moins un peptide et/ou un fragment peptidique d'.au moins un autre serotype de Lyssavirus.

On peut citer notamment les Lyssavirus de serotype 1 (virus rabique) , les Lyssavirus de serotype 2 (virus Lagos bat) , les Lyssavirus de serotype 4 (virus Duvenhage) , et les Lyssavirus isolés sur les chauves-sou¬ ris d'Europe, proches du serotype 4.

Conformément à l'invention lesdits peptides et/ou fragments peptidiques sont avantageusement associés à un support approprié et/ou un adjuvant acceptable, notamment les adjuvants classiques des vaccins humains et vétérinaires.

La présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux spécifiques des peptides et/ou fragments peptidiques du virus Mokola, caractérisés en ce qu'ils résultent de l'immunisation de mammifères, notam¬ ment de rongeurs, et plus particulièrement de souris, par des peptides et/ou fragments peptidiques conformes à l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé immunologique de détection d'anticorps anti-

peptides et/ou fragments peptidiques du virus Mokola, qui consiste à détecter les anticorps anti-Mokola éventuelle¬ ment présents dans un échantillon biologique à l'aide d'un peptide ou d'un fragment de peptide conforme à l'invention, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptide, auxquels se lient les anticorps anti-Mokola si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon bio¬ logique à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié notamment EIA, RIA, fluorescence.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit procédé, lesdits peptides ou fragments peptidiques sont fixés sur un support solide approprié.

Ledit procédé immunologique peut être avanta- geusement de type direct, de type indirect ou mettre en oeuvre une méthode sandwich ou bi-site.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé, lorsque l'on met en oeuvre une méthode de type sandwich, la révélation est réalisée au moyen d'un deuxième anticorps dirigé contre l'anticorps à doser et marqué de manière appropriée.

Ce procédé permet le titrage en anticorps du sérum et permet notamment de vérifier la séroconversion des individus vaccinés ou de procéder à des enquêtes sérologiques à visée épidé iologique.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection rapide et spécifique du virus Mokola qui consiste à détecter un virus Mokola, éventuel¬ lement présent dans un échantillon biologique à l'aide d'au moins une sonde nucleotidique conforme à l'invention, en mettant en présence ledit échantillon biologique traité de manière appropriée avec ladite/lesdites sondes nucléotidiques, à la¬ quelle/auxquelles se lie l'ARN genomique et/ou les pro- duits de transcription du virus Mokola, si de tels pro-

duits sont présents dans l'échantillon, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.

La présente invention a également pour objet un kit prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention de détection et/ou d'identi¬ fication d'au moins un Lyssavirus, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins deux amorces convenables, des doses appropriées d'au moins une sonde nucleotidique et des doses appropriées d'au moins une enzyme de restriction.

La présente invention a également pour objet un kit prêt à l'emploi pour ^" la mise en oeuvre du procédé de détermination dans un échantillon biologique, d'anticorps anti-Mokola, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :

- des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidique conforme à l'invention ; et - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit kit, le peptide est de la glycoprotéine G ou un fragment de celle-ci, fixée sur un support solide approprié. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit kit, le peptide est de la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci, fixée sur un support solide appro¬ prié.

Ce kit peut comprendre en outre des doses appropriées d'un deuxième anticorps dirigé contre l'anticorps à doser marqué à l'aide d'une enzyme, d'une substance fluorescente ou d'un isotope radioactif.

La présente invention a, de plus, pour objet un kit prêt à 1'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'un virus Mokola conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :

- des doses appropriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucleotidique conforme à l'invention ; et

- des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1 : clonage et séquençage de l'ADN complémentaire de l'ARN genomique du virus Mokola. a) Culture du virus

La souche Mokola étudiée a été isolée chez un chat au Zimbabwe.

Les virions sont purifiés à partir des plages de lyse obtenues sur une culture de cellules CER.

Le virus Mokola ainsi sélectionné est cultivé sur cellules BHK-21 et purifié selon la méthode décrite par IKTOR et al. (J. Virol., 1977, 21, 626-635) modi¬ fiée. b) Purification de l'ARN genomique

Pour isoler l'ARN genomique du virus Mokola, les virions purifiés sont incubés avec 100 μg/ml de protéinase K (Merck) dans du SDS 1,5 %, 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 M EDTA pendant 30 min à 37 ^* C, suivi de deux extractions phénol-chloroforme (vol/vol) et d'une précipitation à l'éthanol.

c) Caractérisation et isolement de clones d'ADNc représentant le gène L et l'extrémité 5' du génome Mokola l.c. Synthèse de l'ADNc On synthétise le premier brin d'ADNc en pré¬ sence de 1 μg de ARN genomique en utilisant un rapport molaire 10 fois supérieur en présence d'une amorce octodécamérique à la fois (l'amorce 3', localisée en po¬ sition 1-18 ou l'amorce M2, localisée en position 2 901- 2 918 sur le génome rabique, par exemple) en présence de 50 unités de transcriptase réverse, dans un tampon conte¬ nant 50 mM de Tris HC1 pH 8,3, 8 mM de MgCl ₂ , 100 mM de KC1, 0,8 mM de dATP, 0,8 mM de dGTP, 0,3 mM de dCTP, 0,3 mM de dTTP, 0,2 μM de ³² P dCTP, 0,2 μM de ³² P dTTP, 30 U/μl de RNasine pendant 2 heures à 42'C.

L'ADNc double brin est préparé selon la mé¬ thode de GUBLER et HOFFMAN et séparé selon sa taille sur une colonne Biogel A-50 m.

Les fractions (environ 15 à 20 ng d'ADNc) correspondant aux ADNc les plus grands sont insérées au niveau du site Pst I du plasmide pBR322 à l'aide de la méthode d'allongement au dC/dG.

Des souches d'E. Coli DH 5 compétentes sont transformées et les transformants contenant les inserts spécifiques de Mokola sont détectés par hybridation sur filtres de nitrocellulose.

2.c. Caractérisation des clones obtenus On détermine 3 clones spécifiques de Mokola sélectionnés avec une sonde rage , souche PV (serotype 1) dans la première banque d'ADNc initialisée avec l'amorce M2 : pMB5, pM12 et pMR15a qui couvrent la moitié 5' du génome de Mokola, comme visible sur la figure 1.

La banque d'ADNc obtenue avec l'amorce 3' per¬ met de sélectionner le clone pMAlO avec des sondes Mokola issues du premier clonage. A partir de celui-ci, le clone pMDIO est sélectionné.

Les inserts pMR15a et pMDIO ont été séquences et atteignent respectivement les extrémités 5' et 3' de l'ARN genomique, prouvant que les cinq clones ci-dessus mentionnés suffisent à couvrir la totalité du génome du virus Mokola.

La figure 2 compare les extrémités 3' et 5' du génome du virus Mokola avec celles de la souche PV du gé¬ nome rabique.

Les nucléotides complémentaires entre les deux extrémités sont spécifiées à l'aide de longues lignes verticales. Les séquences consensus spécifiant le début de l'ARNm du gène N, l'arrêt de l'ARNm du gène L et le signal de début de la protéine N sont indiquées.

Les nucléotides ^' des extrémités génomiques 3' et 5' du virus Mokola qui sont identiques à ceux de la souche PV sont spécifiés à l'aide de lignes verticales courtes. Les résidus sont numérotés à partir des extrémi¬ tés génomiques.

La figure 3 montre l'hybridation hétérologue et homologue de sondes rabiques localisées sur les gènes

N et L avec des Northern blots de cellules infectées par le virus Mokola ou le virus rabique respectivement. L'ARN cytoplasmique total, obtenu à partir de cellules BHK-21 est prélevé, 6, 12, 24 ou 48 heures après l'infection avec le virus Mokola (traces 1) ou l'infection avec le virus rabique (trace 2) ; la trace 3 correspondant à un témoin négatif (cellules non infectées) , puis est soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose 1,2 %- formaldéhyde. Les ARN séparés sont déposés sur des mem- branes en nylon et hybrides avec une sonde marquée au

³² P, constituée soit par la séquence 377-1039 de l'ADNc du génome rabique (sonde N : A) , soit par la séquence

7034-7134 (sonde L : B) de l'ADNc du génome rabique.

Exemple 2 : Caractérisation des ARNm de Mokola synthétisés in vivo.

Les sondes d'ADNc sont sélectionnées conformé¬ ment à la figure 1 pour caractériser les produits de transcription in vivo lors d'une infection par le virus Mokola de cellules BHK-21. Six différents transcrits sont observés par l'analyse en Northern blot, comme visible sur la figure 4 qui montre les ARNm du virus Mokola s'hybridant avec les ADNc N, N + Ml, Ml + M2, G et L du génome du virus Mokola.

L'ARN cytoplasmique total de virus Mokola, ob¬ tenu à partir de cellules BHK-21 infectées, est dénaturé en présence de formamide 50 % et des échantillons de 15 μg sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose 1 % contenant du formaldéhyde. L'ARN séparé est déposé sur des membranes de nylon avec des sondes d'ADNc marquées au ³² P (N, Ml + M2, N + Ml, G et L) . Les flèches indiquent les positions de l'ARN ribosomal 18 S et 28 S, révélés par une coloration au bromure d'éthidium et l'identité des différents ARNm est révélée par autoradiographie.

La caractérisation et la taille de ces trans¬ crits Mokola, montrent que la carte transcriptionnelle du virus Mokola est identique à celle du virus rabique. En fait 5 ARNm monocistroniques apparaissent successivement à partir de l'extrémité 3' du génome. Leur longueur est estimée, sur gel d'agarose, à 1750, 1250, 1000, 2400 nucléotides, y compris la queue polyadénylée. Ils codent pour les protéines N, Ml, M2 et G respectivement. Seul le cinquième, dont la longueur est estimée à 4800 nucléo- tides et codant pour la protéine L, est inférieur à la valeur prévue conformément à la longueur du génome. Un sixième produit transcriptionnel est visible et corres¬ pond à un ARNm M1-M2 bicistronique (ligne Ml + M2) . Sa longueur est estimée à 2200 nucléotides.

Exemple 3 Procédé de détermination de la glycoprotéine G de virus Mokola dans une préparation ou un liquide biologique en présence d'un anticorps anti- glycoprotéine 6 conforme à l'invention conjugué à la peroxydase de raifort.

La suspension est clarifiée par centrifugation à 1500 x g pendant 30 min à 4 ^* C. Les surnageants clari¬ fiés de chaque échantillon sont distribués en double dans les puits de plaques de microtitration sensibilisées avec des anticorps anti-glycoprotéine G conformes à l'invention (200 μl/puits) . Les microplaques sont alors incubées pendant une heure à 37 ^* C. Après des lavages répétés avec un tampon PBS-Tween, chaque puits reçoit 200 μl d'anticorps anti-glycoprôtéine G conjugué à la per- oxydase de raifort. Les microplaques sont alors incubées pendant une heure à 37 ^* C, puis à nouveau lavées. L'antigène viral est alors quantifié par l'apparition d'une coloration, lorsque le substrat de la peroxydase est ajouté ; le substrat est un mélange d'o-phénylène- diamine et peroxyde d'hydrogène (200 μl/puits) . Les microplaques sont laissées 20 min à la température ambiante pour permettre à la coloration de se développer. On arrête la réaction en ajoutant du H2SO4N (50 μl/puits) . On mesure la coloration au spectrophotomètre. Exemple 4 : Procédé de détermination de la glycoprotéine G de virus Mokola en présence d'un anti¬ corps anti-glycoprotéine 6 conforme à l'invention conju¬ gué à la 1'isothiocyanate de fluorescéine.

Des cultures cellulaires infectées par le virus Mokola sont fixées pendant 30 min dans l'acétone froide. La coloration est réalisée en couvrant les lames pendant 30 min à 37 ^* C avec des anticorps anti-glycopro¬ téine G de virus Mokola conjugués à l'isothiocyanate de fluorescéine. Le bleu Evans (1/5000) est utilisé comme contre-colorant. Les lames sont lavées par immersion dans du PBS à pH 7,6 pendant 5 min. Un milieu de montage à la

glycérine est utilisé et les lames sont examinées au microscope à épifluorescence.

Exemple 5 : Procédé de détection et de titrage des anticorps anti-glycoprotéine 6 du virus Mokola, dans le sang des individus vaccinés, avec des peptides et/ou fragments de peptides conformes à l'invention.

Ce test repose qur l'utilisation d'une phase solide, sur laquelle est fixée la glycoprotéine du virus, et d'un conjugué enzymatique, protéine A de Staphylococ- eus aureus couplée à la peroxydase.

On effectue des dilutions, de raison deux, des sérums de contrôle positifs et négatifs. Les sérums ou plasmas inconnus sont dilués au l/100è. 100 μl de ces différents sérums sont déposées dans chaque cupule. On couvre d'un film autocollant et on incube les plaques dans une étuve pour microplaque thermostatée, pendant 60 min à 37 ^* C.

On retire le film adhésif ; on aspire le contenu de chaque plaque, on effectue trois lavages sucessifs des cupules puis on sèche les plaques.

On distribue 100 μl de la solution de conjugué dans toutes les cupules et on incube les plaques, recou¬ vertes d'un film adhésif, pendant 60 min à 37 ^* C.

On aspire le contenu des cupules, on les lave quatre fois puis on sèche les plaques.

On distribue 100 μl de la solution de révéla¬ tion (tampon et substrat de la peroxydase) dans chaque cupule et on laisse la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 min à température ambiante. On ajoute 50 μl de la solution d'arrêt puis on lit la densité optique des cupules à 492 nm.

La comparaison des densités optiques des sérums inconnus, avec la courbe d'étallonage du contrôle positif titré en Unités Internationales par ml, permet d'affecter à chacun un titre en Unités Equivalentes par ml.

Exemple 6 Sonde nucleotidique conforme à 1'invention.

Il s'agit de sondes en simple brin de sens ge¬ nomique (sens -) ou antigénomique (sens +) clones dans le vecteur Ml3.

3,5 μl (environ 0,5 picomoles) de matrice M13 clonée sont mis en présence de 1 μl (0,5 picomoles) d'amorce universelle et de 0,5 μl d'un tampon comprenant lOmM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgCl ₂ , 50mM NaCl, ImM DTT. Le mélange, fermé hermétiquement, est plongé dans un bain- marie qui est amené à ébullition puis laissé à refroidir progressivement sur la paillasse. Au bout d'1/2 h, l'eau est à 40"C et l'hybridation est faite.

Les 5 μl de matrice hybridée sont alors complétée par :

- 2 X (4 μl d'un ³² P-α-dNTP) 4000Ci/mmole, lmCi/ml ;

- 1 μl d'un mélange des 4 dNTP à 125 pico¬ moles/μl chacun ; - 1 μl (environ 1 U) d'E. Coli polymérase

(fragment de Kleenow) .

La réaction se déroule pendant 20 min à +37"C, puis est stoppée par un chauffage de 3 min à + 65'C.

A ce moment de la manipulation, la matrice M13, copiée par la polymérase à partir de l'amorce uni¬ verselle, est en double brin sur une longueur dépendant de la quantité de mononucléotides introduite initialement dans le milieu. De plus, cette longueur varie statisti¬ quement d'un clone à l'autre. Pour homogénéiser la taille de la sonde, on choisit de couper au niveau d'un site de restriction unique situé dans une position suffisamment proche de l'amorce pour que le vecteur soit en double brin à son niveau.

Pour ce faire, le mélange réactionnel de syn- thèse (15 μl) est amené à une concentration saline adap¬ tée à l'enzyme de restriction choisie (MANIATIS et al..

1982) , et la coupure se déroule pendant 1 h, à la tempé¬ rature appropriée, dans un volume final de 20 μl. Un volume identique d'un tampon de dépôt dénaturant est alors ajouté. Après dénaturation thermique, le mélange est déposé sur un gel d'acrylamide-urée dénaturant à 6 % (0,5 mm d'épaisseur). La migration dure 1 heure à 1200 volts. La sonde radioactive est repérée par autoradiogra¬ phie puis découpée. Pour les sondes dont la taille n'excède pas 400 bases, une agitation durant 1 h 30 min dans un tampon adapté (NH ₄ COOH 0,5 M, MgCl ₂ lOmM, EDTA ImM) est suffisante pour éluer 80 % de la radioactivité. Au-delà de 400 bases, il est plus prudent de pratiquer une électroélution (MANIATIS et al., 1982). L'éluat est consécutivement extrait par un volume égal de phénol saturé avant que la sonde ne soit précipitée classique¬ ment à l'éthanol. Après deux lavages dans l'éthanol à 70 % et un séchage, le précipité est repris dans 20 μl d'eau. On obtient de manière routinière des sondes mar¬ quées de 4 000 à 10 000 cpm (cerenkof) /μl. Cette sonde peut alors être utilisée pour l'hybridation directe sur les blots ou pour la cartogra¬ phie à la nucléase SI. Les techniques que nous suivons sont classiques bien que légèrement modifiées. Voici quelques précisions : Exemple 7 : détection d'un ARN de virus Mokola à l'aide d'une sonde conforme à l'invention (Blots d'ARN) Un milieu d'hybridation qui comprend :

- un mélange Na ₁ H ₂ P0 ₄ -Na ₂ H ₁ P0 ₄ pH 7,4 0,5 M

- SDS 7 % - EDTA 1 mM

- sérum albumine bovine (BSA) 1 %, convient à la fois pour la préhybridation (au maximum 2 h) et pour l'hybridation (en général durant la nuit) qui se déroulent toutes deux à + 65"C. Le lavage des filtres est réalisé à la même température, en quatre bains suc

cessifs de 10 min chacun, dans le tampon suivant :

- un mélange Na ₁ H ₂ P0 ₄ -Na ₂ H ₁ P0 ₄ pH 7,4 40 mM

- SDS 1 %

- EDTA pH 7,5 1 mM Pour des hybridations de sondes strictement complémentaires aux transcrits recherchés, cette méthode donne de forts bons résultats, en particulier une très grande discrétion du bruit de fond.

Exemple 8 : Procédé d'identification rapide (typage) de faibles quantités de Lyssavirus .

Environ 1 μg d'ARN total provenant de cellules fibroblastiques BHK21 ou neuronales murines N2A infectées par un Lyssavirus (souches rabiques classiques Pasteur, PV, CVS, AvOl, PM, ERA, souches rabiques sauvages "chien du Gabon", "chauve-souris brésilienne", "renard d'Europe", Mokola, etc...), est hybridée avec environ 100 ng d'amorce "G", correspondant à un oligonucléotide long de 23 nucléotides, de sens (+) et s'étendant entre les positions 4665 et 4687 du génome rage PV, et un ADN de sens (+) complémentaire au génome est amorcé spécifique¬ ment et synthétisé comme décrit dans l'exemple 1. Le milieu réactionnel est extrait au phénol, précipité à l'éthanol, lavé deux fois avec de l'éthanol à 70 %, puis séché. Il est alors repris dans 50 μl comprenant :

- Amorce "L" 100 ng

- Tris HC1, pH 8,8 60 mM

- Ammonium sulfate 17 mM

- MgC12 6, 7 mM

- B-mercaptoéthanol 10 mM

- EDTA 5 μM

- BSA 170 μg/ml

- DMSO 10 % (vol/vol)

- dNTP's 25 mM

- Taq DNA polymérase 2 Unités ;

l'amorce "L" correspond à un oligonucléotide long de 24 nucléotides, de sens (-) et s'étendant entre les posi¬ tions 5520 et 5543 du génome rage PV.

L'amorce G s'hybride avec la région 4675-4697 de la séquence nucleotidique (I) ci-dessus, laquelle amorce G présente une homologie de l'ordre de 80 % avec la région 4675-4697 de la séquence (I) du virus Mokola.

L'amorce L s'hybride spécifiquement avec la région 5545-5568 de la séquence nucleotidique de formule (I) du virus Mokola.

Le milieu réactionnel est placé dans un tube eppendorf de 1,5 ml, recouvert de 100 μl d'huile minérale pour éviter 1'evaporation, et incubé dans une "machine à P.C.R." lui faisant subir les étapes suivantes : + 95°C 5 min pour dénaturer

+ 50 ^* C 2 min pour que les amorces s'hybrident + 72°C 2 min pour que la Taq polymérase allonge les brins d'ADNc. Cette étape est réalisée une fois, puis elle est répétée 40 fois de suite en limitant le temps de dénaturation à 2 min.

Enfin, elle est répétée une 1ème fois allon¬ geant le temps de synthèse des ADNc à 10 min pour complé- ter la réaction.

La bande d'ADNc amplifiée peut être observée après migration des produits réactionnels sur un gel d'agarose approprié. Après transfert, elle peut être caractérisée au moyen d'une sonde appropriée, provenant du clonage du génome de la souche analysée ou d'une autre souche de Lyssavirus .

Ces amorces ont été testées avec succès sur toutes les souches rabiques fixes ou sauvages disponibles ainsi que sur le virus Mokola comme le montre la figure 7 ; elles permettent notamment d'amplifier le pseudogène psi de n'importe quel Lyssavirus. La région amplifiée.

d'environ 860 nucléotides, peut être ensuite caractéri¬ sée :

- soit par hybridation avec une sonde radioac¬ tive plus ou moins spécifique de souche de Lyssavirus, - soit par hydrolyse avec des enzymes de res¬ triction, plus ou moins spécifiques de souches,

- soit encore par la séquence directe et la carte de restriction déduite de la région concernée, pour typer et identifier les souches de Lyssavirus pré- sentes dans un échantillon dans les 12 heures sans avoir recours à l'immunologie.

La figure 7 correspond à un gel d'électrophorèse et comporte les 16 traces suivantes :

I : Marqueur de taille 2 à 9 : Différentes souches rabiques : virus de la rage souche PM, virus de la rage souche AVOl, virus de la rage souche CVS, virus de la rage souche ERA, virus de la rage souche PV, virus de la rage souche Pasteur, virus rage Sauvage (ovin) , virus rage Sauvage (ovin) 10 : Virus Mokola

II à 15 : Divers témoins positifs et négatifs 16 : Marqueur de taille

La bande d'ADNc amplifiée peut en outre être hydrolysée par des enzymes de restriction sélectionnées capables de différencier rapidement :

- les différentes souches rabiques fixes ;

- les souches rabiques sauvages qui sont pré¬ sentent actuellement en France ;

- le virus Mokola. Les huit enzymes suivantes : BamH I, BstX I,

Fnu4H I, Hind II, Hind III, Pst I, Rsa I, Taq I permet¬ tent de typer les différentes souches comme suit :

Dans un premier temps, on utilise une série de 4 enzymes pour distinguer la provenance du fragment amplifié variable délimité par les amorces G et L préci¬ tées, comme visible sur le Tableau I ci-après.

TABLEAU I

Dans un deuxième temps, on peut affiner la distinction à l'aide des enzymes suivantes :

TABLEAU II

Il ressort de ce Tableau II que Rsa I sépare qualitativement PV de ERA-SAD et que Taq I sépare quanta- tivement ERA de SAD.

Les deux autres enzymes sont plus spécifiques de groupes :

. BstX I ne coupe que PV, ERA et SAD ;

. Fnu4H I ne coupe que les souches rabiques sauvages et le virus Mokola.

La figure 8 montre que les bandes amplifiées provenant des souches ERA et CVS sont respectivement et spécifiquement coupées par Bstx I et BamH I.

Exemple 9 : Procédé de détection rapide (réponse Oui/Non) de faibles quantités de Lyssavirus.

Les amorces Na et Nb telles que définies dans l'invention, permettent, par exemple, l'amplification de la zone 587-1029 de la séquence nucleotidique de formule (I) du virus Mokola qui est une zone conservée d'un Lyssavirus ; ce procédé de détection rapide de faibles quantités de Lyssavirus dans un échantillon conforme à l'invention, a l'avantage de ^' permettre de porter un dia- gnostic d'infection à Lyssavirus sur des infections débu¬ tantes ou sur des prélèvements de salive effectués chez les animaux domestiques suspects de contamination humaine, plusieurs jours avant leur mort, contrairement à la pratique actuelle ; en effet, les amorces Na et Nb telles que définies dans l'invention, situées sur le gène N et peu distantes l'une de l'autre (400 pb) permettent la détection (réponse Oui/Non) d'un Lyssavirus même pré¬ sent en très petites quantités et ce, même si l'échantillon est très dégradé. En effet, la sensibilité des techniques habituelles est relativement faible par rapport à la méthode conforme à l'invention, qui est rapide et permet de porter un diagnostic en moins de 12 heures.

Exemple 10 : Expression de la glycoprotéine du virus Mokola.

Les inserts pMDIO et pMAlO, issus du clonage du génome Mokola, couvrent chacun pour moitié le gène d la glycoprotéine G. Grâce au site de restriction BglI qu'ils ont en commun, on peut les rejoindre en un seu insert pM7 couvrant les 6 830 nucléotides 3' du génome. partir de celui-ci, on isole l'ADNc du gène de la glyco

protéine G par une double digestion combinant les enzymes de restriction FnuDII et Sspl, qui est inséré entre la région promotrice 5' du gène de la polyédrine du baculo¬ virus et sa région 3' correspondant notamment au signal de polyadénylation. Cette construction est réalisée dans un vecteur pUC, pour permettre sa multiplication. Elle est ensuite cotransfectée avec un baculovirus de type sauvage dans des cellules de chenille Spodoptera frugi- perda Sf9 se multipliant en suspension. Le gène de la glycoprotéine G s'insère en lieu et place de celui de la polyédrine du virus sauvage, par double recombinaison. Après clonage, les plages de baculovirus recombinants sont repérées par leur aspect terne en épiluminescence, qui se distingue aisément ^" de 1'aspect réfringent des plages de virus sauvage.

Quelques clones recombinants sélectionnés ont servi à réinfecter des cultures de cellules de chenille. Au bout de trois jours après l'infection, les extraits cellulaires protéiques totaux ont été préparé. Une bande protéique supplémentaire, de taille voisine de celle de la glycoprotéine Mokola a été observée uniquement dans les extraits provenant des clones recombinants. Afin de mieux étudier cette protéine supplémentaire, d'autres cultures ont été infectées dans un milieu carence en méthionine, puis complémenté avec de la méthionine radio¬ active. La glycoprotéine G est alors apparue de façon beaucoup plus intense, représentant sans aucun doute le polypeptide le plus fortement exprimé dans les cultures au moment du marquage (figure 5a) . La figure 5b correspond à un témoin négatif.

La mise en évidence de l'expression de la gly¬ coprotéine du virus Mokola à la surface des cellules infectées par le Baculovirus recombinant est effectuée sur des cellules de Spodoptera frugiperda, après in- fection par le baculovirus recombinant exprimant la glycoprotéine du virus Mokola. Les cellules sont fixées

dans l'acétone à - 20'C pendant 30 min. Elles sont ensuite incubées avec les Acm dirigés contre la glycopro¬ téine du virus Mokola.

Après lavage, la révélation se fait par incubation avec un anticorps anti-i munoglobuline de sou¬ ris couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (ITCF) .

L'observation après lavage se fait au micro¬ scope sous excitation ultra-violette (figures 5a et 5b) .

La glycoprotéine a été également clairement localisée à la surface des cellules infectées par le virus recombinant, au moyen d'anticorps monoclonaux fluo¬ rescents spécifiques de la glycoprotéine du virus Mokola (figure 6) . Sur cette figure 6, les traces 1, 2 et 3 cor¬ respondent à des cellules de Spodoptera frugiperda après infection par le baculovirus recombinant exprimant la glycoprotéine G du virus Mokola : la flèche montre l'emplacement de la glycoprotéine G sur le gel ; La trace T correspond à un témoin négatif.

Exemple 11 : Mise en évidence du pouvoir i mu- nogène de la glycoprotéine du virus Mokola (G.MOK) .

Des cellules de Spodoptera frugiperda (SF9) , sensibles au baculovirus, sont infectées avec un baculovirus exprimant la G.MOK ou avec un baculovirus sauvage n'exprimant pas le gène de la polyédrine (NPEV del) . Trois jours après l'infection, ces cellules sont lavées en tampon PBS. Différentes dilutions de ces cel¬ lules sont alors réalisées pour tester la valeur protec¬ trice de cette suspension cellulaire chez des souris par un test de HABEL modifié. Des lots de 10 souris sont vac- cinés par voie intrapéritonéale, deux fois à une semain d'intervalle et éprouvés par inoculation intracérébrale, avec différentes dilutions de virus, deux semaines aprè la première vaccination. Ces souris sont alors observée quatre semaines après l'épreuve. A l'issue de ce délai, un pourcentage de mortalité spécifique est calculé.

La figure 9 montre que les courbes de morta¬ lité de souris non vaccinées (NV) et vaccinées avec des cellules SF9 infectées avec NPEV del sont peu diffé¬ rentes. Les cellules SF9 infectées par NPEV del n'entraînent donc aucune protection non spécifique des souris.

La figure 10 montre qu'une dose vaccinale de 100 000 cellules SF9-G.MOK suffit pour protéger des sou¬ ris et 10 ⁶ cellules SF9-G.MOK suffisent pour obtenir un index de protection supérieur à 2,5.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon ^' plus explicite ; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

90 n o

Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en page . ligne de la description >

A. IDENTIFICATION DU DÉPÔT >

D'autres dépôts sont identifiés sur une feuille supplémentaire - fëj

Nom de l'institution de dépit *

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Adresse de l'institution de dépôt (y compris le code postal et la pays) *

28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15

Date du dépôt - N ^« d'ordre •

22 mars 1 989 1-847

B. INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES » (à ne remplir que si nécessaire). Une feuille séparée est jointe pour la auite de ces renseignements [~j

ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES » (si les Indications ne aont pas données pour tous les Etats désignés)

EUROPE

JAPON

ETATS-UNIS D'AMERIQUE

OAPI

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT » (a ne remplir que si nécessaire)

Les indications énumérées ci-aprèt seront soumises ultérieurement au Bureau international • (spécifier la nature généralo des indi¬ cations p. ex., « No d'ordre du dépôt»)

E. f ^" ] La présenta feuille a été

Fχj Date de réception (en provenance du déposant) par le Bureau international >"

0 7 M A I 199Q b. —

(Fonctionnaire autorisé)

Formulaire PCT/R0/13 (Janvier 1981)

Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en page 28 , ligne 26 de la description >

A. IDENTIFICATION DU DÉPÔT >

D'autres dépots sont identifiés sur une feuille supplémsntairβ - [K]

Nom de l'institution de dépôt «

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Adresse de l'institution de dépôt (y compris Is code postal et le pays) ⁴

28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15

Date du dépôt * N* d'ordre -

22 mars 1 989 1-848

B. INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ' (i ne remplir que si nécessaire). Une feuille séparée est jointe pour la suite de ces renseignements Q

C. ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES - (si les indications ne sont pas données pour tous les Etats désignés)

EUROPE

JAPON

ETATS-UNIS D'AMERIQUE

OAPI

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT • (à ne remplir que si nécessaire)

Les indications énumérées ci-aprés seront soumises ultérieurement au Bureau international • (spécifier la nature généralo des indi* cations p. ex., « No d'ordre du dépôt»)

E. [~] La présente feuille a été reçue avec la récepteur)

5ζ) Data de réception (en provenance du déposant) par le Bureau international '"

0 7 M A ! 1990 (Fonctionnaire & au~tor~isé)

Formulaire PCT/RO/13 (Janvier 1981)

0/11358

Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en psge * ^• " , ligne 30 de la description >

A. IDENTIFICATION DU DÉPÔT >

D'autres dépôts sont identifiés sur une feuille supplémentaire - Q

Nom de l'institution de dépôt *

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Adresse de l'institution de dépôt (y compris le code postal et le pays) ^• »

28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15

Date du dépôt - N ^a d'ordre •

22 mars 1 989 1-849

INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ' (i ne remplir que si néceaaaire). Une feuille séparée est Jointe pour la suite de ces renseignements ~\

C. ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES » (si les indications ne sont pas données pour tous les Etats désignés)

EUROPE

JAPON

ETATS-UNIS D'AMERIQUE

OAPI

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT » (à ne remplir que si nécessaire)

Les indications énumérées ci-après seront soumises ultérieurement au Bureau international * (spécifier la nature généralo des Indi¬ cations p. ex., «No d'ordre du dépôt»)

E. j~j La présente feuille a été reçue avec la demande internationale lorsquβ-celle-cl a été dépoaée (à vérifier par l'office récepteur)

(Fonctionnaire autorisé) — ^' |5ζ| Date de réception (en provenance du déposant) par le Bureau internatlonnl >"

0 7 M A I 1990 J>- βι—

(Fonctionnaire autorisé)

Formulaire PCT/R0/134 (Janvier 1981)

Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en page -- ° , ligne - ^ de la description -

A. IDENTIFICATION DU DÉPÔT >

D'autres dépôts sont identifiés sur une feuille supplémentaire - [

Nom de l'institution de dépôt *

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Adresse de l'institution de dépôt (y compris le code postal et le pays) ^• »

28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15

Date du dépôt * N* d'ordre *

22 mars 1 989 1-850

INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES » (4 ne remplir que si nécessaire). Une feuille séparée est jointe pour la suite de ces renseignements | |

ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES > (si les indieationa na aont pas données pour tous les Etats désignés)

EUROPE

JAPON

ETATS-UNIS D'AMERIQUE

OAPI

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT • (i ne remplir que si nécessaire)

Les Indications énumérées ci-après seront soumises ultérieurement au Bureau international > (apéclfler la nature généralo des indi¬ cations p. ex., « No d'ordre du dépôt»)

| [ La présente feuille a été reçue avec la demande internationale lorsque celle-ci a été déposée (à vérifier par l'office récepteur)

fin Date de réception (en provenance du déposant) par le Bureau international <"

0 7 A I 1990 (Fonctionnaire autorisé)

Formulaire PCT/R0/134 (Janvier 1961)

/11358

Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en page 4 , ligne 25 de la description

A. IDENTIFICATION DU D PÔT -

D'autres dépôts sont identifiés sur une feuille supplémentaire ³ f~]

Nom de l'institution de dépôt *

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Adresse de l'institution de dépôt (y compris le code postal et la pays) -*

28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15

Date du dépôt * N* d'ordre •>

22 mars 1989 1-851

B. INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ' (à ne remplir que si nécessaire). Une feuille séparée est jointe pour la aulte de ces renseignements Y~\

C. ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES 3 (si les indications ne sont pas données pour tous les Etats désignés)

EUROPE

JAPON

ETATS-UNIS D'AMERIQUE

OAPI

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT ⁸ (à ne remplir que si nécessaire)

Les indications énumérées ci-après seront soumises ultérieurement au Bureau international * (spécifier la nature généralo des indi¬ cations p. ex., « No d'ordre du dépôt»)

E. F] La présente feuille a été reçue avec la demande internationale lorsque ceHe-ci a été déposée (à vérifier par l'office récepteur)

[S Date de réception (en provenance du déposant) par le Bureau international "'

0 ? M A i 1990 (Fonctionnaire autorisé)

Formulaire PCT/R0/134 (Janvier 1981)