Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt ein Verfahren zur exponentiellen Vermehrung von spezifischen DNA-Abschnitten dar.

Zur Automatisierung der Detektion von Produkten einer Polymerase- Kettenreaktion wurden bisher drei Verfahren entwickelt, die eine fluoreszenzoptische Detektion der Reaktionsprodukte während der laufenden Reaktion in quantitativer Hinsicht ermöglichen und so die Anzahl von Molekülen der Zielsequenz, die im PCR-Ansatz vor Beginn der Reaktion vorhanden waren zu ermitteln helfen.

Das erste Verfahren betrifft die TaqManT""-Technologie der Firma Applied Biosystems/Perkin Elmer, die das ABI-PRISM"-Sequenzdetektionssystem einschließt. Das TaqMan-System nutzt die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq- DNA-Polymerase, wobei ein Oligonukleotid verwendet wird, das am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzmolekül und am 3'-Ende mit einem Quenchermolekül markiert ist, wobei die Taq-DNA-Polymerase durch ihre 5'- Exonukleaseaktivität das Fluoreszenzmolekül freisetzt, dessen Signal im ABI- PRISM-Sequenzdetektionssystem nachgewiesen wird. Ais

Fluoreszenzfarbstoffe stehen die Moleküle 6-FAM, TET, JOE, VIC"und HEX zur Verfügung, die mit dem Quenchermotekü ! TAMRA kombiniert werden können. Zusätzlich können sogenannte"dark quencher eingesetzt werden, die im Infrarotbereich emittieren, wodurch auch TAMRA als Reporterfarbstoff eingesetzt werden kann. Die Synthese von TaqManlM- Sonden wird von verschiedenen Herstellern angeboten.

Das zweite System betrifft das Light-Cycler"-System der Firmen Boehringer Mannheim/Hoffmann La Roche. Hierbei sind die Fluoreszenzfarbstoffe auf zwei verschiedene Oligonukleotide verteilt. Am 3'-Ende des ersten Oligonukleotids befindet sich der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, während das sich stromabwärts vom ersten Oligonukleotid anlagernde zweite Oligonukleotid an seinem 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 aufweist. Das Fluorescein wird von einer LED als Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, das über Fluoreszenzresonanzenergietransfer das zweite Fluoreszenzmolekül (LC Red 640 oder LC Red 705) anregt. Das von dem zweiten Farbstoff emittierte Licht wird über einen entsprechenden Filter detektiert. Eine Anregung des zweiten Farbstoffs kann nur dann erfolgen, wenn sich durch die Anlagerung der beiden Oligonukleotide an ihren Komplementärstrang die beiden Farbstoffmoleküle in räumlicher Nähe (Distanz von 1 bis 5 Nukleotiden) befinden, erfolgen. Das Prinzip des Systems beruht also auf der sekundären Anregung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, die erst durch die Generation von PCR-Produkt ermögticht wird. Beim bereits beschriebenen TaqMan"-System dagegen wird vom Fluoreszenzfarbstoffmolekül emittiertes Licht vom Quenchermolekül absorbiert, weswegen erst nach der Hydrolyse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls vom Oligonukleotid durch die 5'-3'- Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Quencherwirkung aufgehoben und emittiertes Licht gemessen werden kann.

Eine dritte Technik zur fluoreszenzoptischen Detektion der PCR- Produktgeneration verwendet sogenannte"Molecular Beacons"."Molecuiar

Beacons"sind aus drei Domänen aufgebaute, als Sonden eingesetzte Oligonukleotide. Ein zentraler Sequenzabschnitt ist zu einer Zielsequenz im PCR-Produkt komplementär. 5'-und 3'-wärts davon befinden sich zwei zueinander komplementäre Sequenzabschnitte. Am äußersten 5'-und 3'- Ende befinden sich der Reporterfarbstoff bzw. der Quencher. Ist diese Sonde nicht mit ihrem zentralen Abschnitt an die komplementäre Zielsequenz gebunden, so formen die beiden zueinander komplementären endständigen Abschnitte einen intramolekularen Doppelstrang. Hierdurch kommen der Reporterfarbstoff an einem Ende und der Quencher am anderen Ende in enge Nachbarschaft, wodurch der Quencher das vom Reporterfarbstoff emittierte Lichtsignal neutralisiert. Durch die Synthese von PCR-Produkt können zunehmend mehr"Molecular Beacons"mit ihrer zentralen Domäne an die Zielsequenz binden, wodurch Reporterfarbstoff und Quencher räumlich voneinander getrennt werden. Das vom Reporterfarbstoff emittierte Licht ist in einer zur Menge der Zielsequenz proportionalen Intensität detektierbar. Verschiedene Reporterfarbstoffe stehen zur Verfügung (z. B. 6-FAM, TAMRA, TET, Cy3, Cy5, Texas Red'", HEX). Als Quencher wird in der Regel DABCYL verwendet. Molecular Beacons können in verschiedenen Geräten eingesetzt werden, die zur Detektion der entstehenden Fluoreszenzsignale geeignet sind, wie z. B. den Sequence Detection Systeme T"7700,7200 und 5700 der Firma PE Biosystems, dem Rotor-Gene RG2000 Real-Time Cycler der Firma Corbett Research oder dem FMBIO IIT"Fluorescence Imaging System der Firma Hitachi.

Diese auf Detektion der durch die PCR-Reaktion generierten Fluoreszenzsignale basierenden Systeme ermöglichen eine hochempfindliche Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz und machen eine aufwendige Produktanalyse, wie z. B. durch gelelektrophoretische Auftrennung nach der eigentlichen PCR-Reaktion überflüssig. Ein großer Nachteil der herkömmlichen Systeme ist, daß für jede zu erfassende Zielsequenz eine spezifische Sonde benötigt wird, entweder ein an beiden

Enden fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid wie beim TaqMan T"-System, oder zwei einfach fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide wie beim Light- CyclerTM-System oder der Einsatz von Molecular Beacons.

Die oben genannten Systeme sind zwar grundsätzlich einsetzbar für Multiplexanwendungen, d. h. es können mehrere Zielsequenzen hierbei gleichzeitig amplifiziert werden. Ein Nachteil dieser Anwendungsart bei diesen bekannten Verfahren ist jedoch, daß zur Detektion für jede einzelne Zielsequenz eine eigene Sonde bzw. ein eigenes Sondenpaar benötigt wird, die/das spezifisch an einen internen Bereich der durch die Amplifikation entstandenen Zielsequenz binden muß. Sollen viele verschiedene Zielsequenzen nebeneinander nachgewiesen werden, so wird der Reaktionsansatz wegen der steigenden Anzahl verschiedener Detektionssonden relativ teuer und die zunehmende Zahl der Sonden kann die RCR-Amplifikation beeinträchtigen.

Ein weiteres Problem, das sich bei der Polymerase-Kettenreaktion stellt, ist die relativ häufige Bildung von Primer-Dimeren. Primer-Dimere sind doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die entstehen, wenn zwei Primer über einige Nukleotide direkt miteinander hybridisieren und anschließend entlang dem Komplementärstrang elongieren. Diese Produkte können wiederum mit weiteren Primern hybridisieren, was zu einem Verlust an Primermaterial unter Bildung der unerwünschten Primer-Dimere führt. Zur Lösung dieses Problems wurde die Verwendung von Homo-Tail-Sequenzen an den 5'-Enden der Primer vorgeschlagen (Brownie et al. (1997), Nucleic Acids Research 25,3235-3241). Diese Primer enthalten somit einen für die zu amplifizierende Sequenz spezifischen Abschnitt am 3'-Ende und einen Homo-Tail-Abschnitt am 5'-Ende. Die Homo-Tail-Sequenz ist eine Sequenz, die für die eingesetzten Vorwärts-und Rückwärts-Primer identisch ist. Bei der Bildung von Primer-Dimeren entstehen somit nach der Aufschmelzung der enlongierten Dopplestränge Einzelstränge mit komplementären 5'-und 3'-Enden, die miteinander hybridisieren und sogenannte"Panhandle"-

Strukturen bilden. Diese Strukturen stehen für weitere Hybridisierungen mit Primern nicht mehr zur Verfügung und verhindern die Amplifikation der Primer-Dimere. Brownie et al. verwendeten weiterhin Tail-spezische Primer (Tags), die nach einigen Amplifikationszyklen, nämlich nachdem die Homo- Tail-Sequenz in den zu amplifizierenden Abschnitt eingefügt worden ist, zum Primen verwendet werden können. Die Tags haben den Vorteil, daß sie kürzer sind sind und die Bildung von Primer-Dimeren um mehrere Zehnerpotenzen reduzieren. Das System wurde nicht für eine fluoreszenzgekoppelte Detektion der entstehenden PCR-Produkte entwickelt.

Dies wäre zwar möglich, allerdings auch hier wiederum mit dem Nachteil, daß für jede zu amplifizierende Sequenz eine eigene spezifische Sonde notwendig wäre. Darüber hinaus wird die der Amplifikation über die Homo- Tail-Sequenzen vorangeschaltete spezifische Reaktion bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt, als die Reaktion mit den Tags. Grundsätzlich läßt sich die Spezifität der PCR-Reaktion steigern, indem eine möglichst hohe Primerbindungstemperatur gewählt wird, die wiederum relativ lange Primer erfordert, die bei solchen Temperaturen noch binden können. Die Temperaturbegrenzung nach oben auf etwa 74°C resultiert aus dem Aktivitätsoptimum des verwendeten Polmeraseenzyms. Da dieser Temperaturbereich mit optimaler Spezifität für die Reaktion mit den Tags reserviert ist, folgt zwangsläufig, daß die bei niedrigerer Temperatur durchgeführte Amplifikation über die sequenzspezifischen Primer nicht unter optimalen Spezifitätsbedingungen abläuft. Es besteht die Gefahr, daß die zusätzlich zu den an die Zielsequenzen bindenden Primerabschnitten noch vorhandenen Bereiche (Tails, Reportersequenzen) unspezifische Bindungen verursachen.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit darin, durch geeignete Veränderungen der Primer-Strukturen bei Anwendung von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken, indbesondere desTaqManTM-und des Light CyclerTM-Systems, sowie anderer Systeme zur

fluoreszenzoptischen Detektion von PCR-Produkten, die Zahl parallel zu detektierender Zielsequenzen zu erhöhen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, umfassend die Schritte : i) Bereitstellen von zu amplifizierenden Nukleinsäuren, ii) Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Primern, iii) Detektieren der in ii) gebildeten Amplifikationsprodukte unter Verwendung einer oder mehrerer dafür spezifischer Sonden, dadurch gekennzeichnet, daß a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst : eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer- integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst : eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, und c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.

Durch den Einsatz von Primern mit primer-integrierten Reportersequenzen (PIRS-Primern) istbei Multiplex-PCR-Anwendungen mitfluoreszenzoptischer Produktdetektion nur mehr eine Sondenoligonukleotidsequenz pro PIRS notwendig. Eine Markierung jedes einzelnen spezifischen Primers mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen entfällt, so daß das erfindungsgemäße

Verfahren einen großen Vorteil gegenüber herkömmlichen Detektionsverfahren von Produkten einer Amplifikationsreaktion, insbesondere bei Multiplex-PCR darstellt.

Hierbei können den verschiedenen parallel einsetzbaren Fluoreszenzfarbstoffen nicht nur einzelne Zielsequenzen sondern ganze Gruppe von Zielsequenzen zugeordnet werden, die dann in multiplex- Reaktionen gleichzeitig detektiert und anhand der charakteristischen Fluoreszenz voneinander diskriminiert werden können. Neben der Ausweitung der Zahl in einer PCR-Reaktion parallel detektierbarer Zielsequenzen lassen sich durch die Möglichkeit des Nachweises mehrerer Zielsequenzen mit einem einzelnen Sondenkonstrukt Kosten einparen, da die Herstellung fluoreszenzmarkierter Sonden relativ teurer ist. Hierbei sollte die Multiplex-Anwendung, die für die heutige Diagnostik immer wichtiger wird, nicht beeinträchtigt werden.

Die Erfindung basiert auf einem neuartigen Primer-Design, das in einem ersten Aspekt der Erfindung Primer mit primer-integrierten Reportersequenzen ("PIRS-Primer") vorsieht. Die PIRS-Primer (mit integrierter Sondenbindungssequenz/Reportersequenz) haben dabei folgenden aligemeinen Aufbau 5'-Homo-Tail-Sondenbindungssequenz/PIRS-Spezifische Sequenz-3' Der in der PCR zu verwendende zweite Primer mit entgegengesetzter Polarität muß keine PIRS enthalten und hat damit den folgenden schematischen Aufbau : 5'-Homo-Tail-Spezifische Sequenz-3' Es ist jedoch auch möglich, zwischen diesen beiden Domänen eine zusätzliche primerintegrierte Domäne einzufügen, die nicht der

fluoreszenzbasierenden Produktdetektion dient, sondern bestimmte post- PCR Produktanalysen ermöglicht. Diese muß sich in ihrer Sequenz von der zur fluoreszenzoptischen PCR-Produktdetektion verwendeten PlRS-Domäne unterscheiden und kann z. B. als Anlagerungsstelle für einen Sequenzierprimer dienen, mit dem nach der PCR-Reaktion die Nukleinsäuresequenz des PCR-Produkts ermittelt wird.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, daß beide PCR-Primer an ihrem 5'-Ende eine als"5'-Homo-Tail"bezeichnete zusätzlich angefügte Sequenz aufweisen. Diese"5'-Homo-Tail"-Sequenz kann frei gewählt werden, sie ist jedoch vorzugsweise auch bei einer Kombination mehrerer Primersätze zu einer Multiplex-PCR bei allen Primern identisch und sollte in ihrer Schmelztemperatur etwas höher liegen als der die"spezifische Sequenz" definierende Primerabschnitt. Das zugrundeliegende Prinzip entspricht der "HANDS"-PCR-Technologie (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al., siehe obern ; EP-0 731 177 ; EP-0 332 435). Durch die Verwendung des"HANDS"-PCR-Prinzips wird die unerwünschte Bildung von Primer-Dimeren während der PCR-Reaktion um mehrere Zehnerpotenzen verringert.

Die primerintegrierte Sequenz (PIRS) ist eine Sequenz, die für die eingesetzten Sonden spezifisch ist, d. h. daß die Amplifikationsprodukte anhand dieser Sequenzen mit den verwendeten Sonden hybridisieren können.

Die spezische Sequenz ist spezifisch für die zu amplifizierenden Nukleinsäureabschnitt, mit dem sie hybridisiert und die Elongierung ab diesem hybridisierten Abschnitt initiiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Primer verwendet, in denen bis auf den Homo-Tail-Abschnitt mindestens eine der Thymidinbasen durch Uracil ersetzt wurde. In diesem Fall wird dann dem

Amplifikations-Reaktionsgemisch ein Enzym zugesetzt, welches in der Lage ist, Nukleinsäuren mit Uracilbasen zu degradieren, bevorzugt ist Uracil-N- Glykosylase.

Werden in allen Bereichen der verwendeten PCR-Primer bis auf den"Homo- Tail"-Abschnitt eine oder mehrere Thymidinbasen durch Uracil ersetzt (Grace et al., 1998, Degradable dUMP outer primers in merged tandem (M/T)-nested PCR : Low and single target amplification, Analytical Biochemistry 263 : 85-92), so kann die Generation von Primer-Dimeren zusätzlich reduziert werden. Hierbei wird dem PCR-Ansatz nach den ersten drei bis fünf Zyklen, während der die sequenzspezifischen 3'-Enden der Mehrdomänen-Primer (Spezifische Sequenz + Homo-Tail + PIRS) sich an ihre jeweiligen Zielsequenzen anlagern und PCR-Produkte mit dem universelien 5'-"Homo-Tail"generiert werden, ein Verdau mit dem Enzym Uracil-N-Glykosylase zwischengeschaltet. Durch Entfernung der Uracil- Basenreste aus der DNA-Kette und anschließender Hydrolyse bei 95 °C werden alle Primerdomänen zerstört, die für die weitere ausschließlich über die"Homo-Tails"vermittelte Amplifikation nicht mehr benötigt werden und nur noch zur Generation unerwünschter Produkte, wie Primer-Dimeren beitragen. Auch eventuell schon entstandene Primer-Dimere werden weitgehend zerstört, da die in ihnen enthaltenen Primeranteile mit den Uracilresten abgebaut werden. Außerdem wird durch Elimination der in den Mehrdomänen-Primern enthaltenen PIRS deren Kompetition mit den fluoreszenzmarkierten Reportersonden aufgehoben, was zu einer effizienteren Signalgeneration während der PCR beiträgt.

Es müssen nicht sämtliche Thymindin-Basen durch Uracil ersetzt werdem, um die genannte Ausführungsform zu verwirklichen. Es ist jedoch bevorzugt, daß der Verdau zu Primerfragmenten führt, die nicht länger als 8 bis 10 Nukleotide sind.

In einer erfindungsgemäßen Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lassen sich mit den oben beschriebenen Verfahren mehrere Primersätze kombinieren, die aufgrund unterschiedlicher"spezifischer Sequenzen"am 3'-Ende des ersten Primertyps die Detektion mehrerer Zielsequenzen in einem einzigen Reaktionsansatz erlauben. Bei der Bildung von PCR-Produkten entsteht eine zur Sondenbindungsstelle/Reportersequenz komplementäre Sequenz, mit der die Sondenoligonukleotide hybridisieren müssen. Durch den Einsatz mehrerer Sonden mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen z. B. nach dem TaqMan Tll _System lassen sich verschiedene Gruppen von Zielsequenzen unterscheiden. Dies wird anhand der unten dargestellten Beispiele verdeutlicht.

Der Einsatz der erfindungsgemäßen PIRS-Primer in Kombination mit den beschriebenen Maßnahmen zur Vermeidung der unerwünschten Bildung von Primer-Dimeren (HANDS-PCR), erlaubt es mit Hilfe der oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme, wie z. B. TaqMan"und Light Cycier mit einer einzelnen Sonde bzw. einem Sondenpaar, die/das mit einem der zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, eine große Zahl verschiedener Zielsequenzen in einem Reaktionsansatz zu detektieren. Zusätzlich können alle zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe parallel mit Hilfe spezifischer Sonden eingesetzt werden. Somit ist es mögtich, verschiedene Gruppen von Zielsequenzen einer Sonde bzw. einer dazugehörenden Fluoreszenzfarbe, zuzuordnen. Die Zielsequenzen der einzelnen Gruppen können in einer einzigen PCR-Reaktion parallel detektiert werden und in ihrer Gruppenzugehörigkeit anhand der zugeordneten Farbe der eingesetzten Sonde identifiziert werden, wodurch ein sehr hoher Automatisierungsgrad der PCR-Diagnose erreicht wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, der die erfindungsgemäßen PIRS-Primer enthält und zum Einsatz in der Diagnose von 1) Leukämien,

2) Meningitis oder Enzephalitis und 3) Zytokin-Antworten geeignet ist, wie in den Beispielen verdeutlicht wird.

Der Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäureamplifikationsprodukten umfaßt : a) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst : eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungsequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, b) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst : eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, c) mindestens eine Sonde, die aufgrund von Markierungsgruppen detektierbar ist, und die für den Komplementärstrang der Nukleinsäure gemäß a) spezifisch ist, d) Desoxyribonukleotide, e) ein zur Extension der Nukleinsäure-Primer nach a) und b) geeignetes Enzym, und f) einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe.

Zusätzlich kann der Kit Nukleinsäuren mit der Homo-Tail-Sequenz umfassen, oder er kann Primer umfassen, in denen mindestens eine Thymidinbase durch Uracil ersetzt ist, wobei dann der Kit weiterhin das Enzym Uracil-N- Glykosylase enthält.

Das für die Extension geeignete Enzym ist bevorzugt eine thermostabile DNA-Polymerase, die eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist.

Die Sonde trägt bevorzugt als detektierbare Markierungsgruppen an ihrem 5'-Ende die Farbstoffmoleküle 6-FAM, TET, JOE, HEX, VICTI, Fluorescein, LCRed 640 oder LCRed 705 und an ihrem 3'-Ende das Quenchermolekül TAMRA oder DABCYL. Besonders bevorzugt ist die Sonde ein"Molecular Beacon".

Der Kit kann auch drei verschiedene Sonden umfassen, die mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz wechselwirken, wobei die erste der drei Sonden an ihrem 3'-Ende das Farbstoffmolekül Fluorescein trägt, die zweite der drei Sonden an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 640 trägt und die dritte Sonde an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 705 trägt.

Vorzugsweise enthält der Kit Primer, die mit m-BCR-cDNA oder/und M-BCR- cDNA oder/und TEL/AML-cDNA oder/und AML/ETO-cDNA hybridisieren.

Besonders bevorzugt hybridisieren die Primer und PIRS-Primer mit genomischer Herpesvirus-DNA oder/und mit für die 16S rRNA codierender genomischer DNA aus Haemophilus influenzae oder/und Neisseria meningitidis oder/und Streptococcus pneumoniae, noch stärker bevorzugt mit Interleukin-2-cDNA oder/und Interleukin-4-cDNA oder/und Interleukin-5- cDNA oder/und Interleukin-10-cDNA oder/und Interferon-y-cDNA.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenzienkits erzeugter 50 pi-Reaktionsansatz : 2 ul der zu untersuchenden Probe 10xPCR-Puffer5µl 4, ul 25 mM MgCl2 2 ul dNTP-Mix (jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP) 5, ul"Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) thermostabileDNA-Polymerase0,125µl 0,5 ul PIRS-Primer und Rückprimer (10 nM Endkonzentration)

5 pI Sondenoligonukleotid A mit Fluoreszenzfarbstoff 1 (200 nM Endkonzentration) 5 ul Sondenoligonukleotid B mit Fluoreszenzfarbstoff 2 (200 nM Endkonzentration) steriles Aqua bidest. ad 50 ul.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit umfasst mindestens eine Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst : eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.

Oligonukleotid-Primer der oben beschrieben Art (PIRS-Primer) stellen einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.

Die folgenden erfindungsgemäßen PIRS-Primer sind Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Ausführungsform der beanspruchten Reagenzienkits, deren Durchführung in den Beispielen 1,3,4,5 und 6 beschrieben wird. ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll wiedergegeben.

SEQ ID No. 1 : ABL intern Hands NPY antisense, SEQ ID No. 2 : TEL intern Hands HNNO sense, SEQ ID No. 3 : ETO intern Hands HNNO antisense, SEQ ID No. 4 : HSV1 intern Hands HNNO sense, SEQ ID No. 5 : HSV2 intern Hands HNNO sense, SEQ ID No. 6 : Men intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 7 : Hae intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 8 : Pneu intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 9 : IL-2 intern Hands HNNP sense,

SEQ ID No. 10 : IF-g intern Hands HNNO sense, SEQ ID No. 11 : IL-4 intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 12 : IL-5 intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 13 : IL-10 intern Hands NPY Rec sense.

SEQ ID No. 14 : *ABLrvinBeideHanNPY+ SEQ ID No. 15 : *TELfwinREHHANHNNO+ SEQ ID No. 16 : *ETOrvinKasuHANHNNO + SEQ ID No. 17 : *ABLrvinBeideHanNPY+-U SEQ ID No. 18 : *TELfwinREHHANHNNO+-U SEQ ID No. 19 : *ETOrvinKasuHANHNNO+-U Die Zeichnung besteht aus den Figuren 1 und 2, die das Ergebnis der Durchführung von Beispiel 1 zeigen.

Fig. 1 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM"Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abbildung 1 werden nur die FAM-Signale sichtbar. Die Proben (amples) sind wie folgt bezeichnet : A4 = m-BRC (Baddy), A5 = M-BCR (Baddy), A6 = TEL/AML (Goody), A7 = AML/ETO (Goody) ; B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelilinie HL60 ohne Translokation) ; C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template).

Fig. 2 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM"Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist

die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abbildung 2 werden nur die VIC-Signale sichtbar. Die Proben (amples) sind wie folgt bezeichnet : A4 = m-BRC (Baddy), A5 = M-BCR (Baddy), A6 = TEL/AML (Goody), A7 = AML/ETO (Goody) ; B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation) ; C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template).

Beisniele Beispiel 1 Unter Einsatz von PIRS-Primern wurde ein Verfahren entwickelt, das es mit einer einzigen PCR-Reaktion ermöglicht, in Leukämiezellen zwischen mehreren genetischen Markern zu unterscheiden, die mit einer besonders guten oder schlechten Prognose der Erkrankung verbunden sind. Die Ergebnisse eines solchen Tests können direkt zur Therapiefestlegung verwendet werden. Als Marker mit schlechter Prognose (im Weiteren bezeichnet als"Baddies") wurden zwei Splicingvarianten des BCR/ABL- Rearrangements (als m-BCR bzw. M-BCR bezeichnet) einbezogen, das zytogenetisch derTranslokationt (9 ; 22) entspricht, die auch als Philadelphia- Chromosom bekannt ist. Die entsprechende TaqMan"-Sonde wurde 5'- VIC/TAMRA-3'markiert. Als chromosomale Translokation mit guter Prognose bei Leukämien des Kindesalters wurden die chromosomalen Translokationen t (12 ; 21) und t (8 ; 21) einbezogen. Die hierdurch entstehenden chimären mRNAs werden als"TEL/AML"-bzw. als "AML/ETO"-Fusionsgene bezeichnet. Die entsprechende Sonde wurde 5'- FAM/TAMRA-3'markiert.

Als Ausgangsmaterial wurde RNA aus Leukämiezelilinien verwendet, die jeweils eine der zu detektierenden chromosomalen Translokationen aufweisen, bzw. als Negativkontrolle eine Zelllinie (HL60), die keine solche genetische Veränderung besitzt. Da chimäre mRNA-Moleküle nachgewiesen werden sollen (diese resultieren aus einer Fusion von zwei unterschiedlichen Genfragmenten, die durch die chromosomale Translokation hervorgerufen wurde), muß vor der eigentlichen PCR die RNA nach üblichen Verfahren in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben werden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit wurde noch ein normaler PCR-Lauf vorgeschaltet, bevor die eigentliche PCR-Reaktion unter fluoreszenzoptischer Produktdetektion angeschlossen wurde. Die entscheidende PCR-Reaktion im TaqMan""- Verfahren wurde als zweiter Lauf einer nested-PCR durchgeführt. Die nested-PCR (ursprünglich von Chamberlain et al. beschrieben) stellt ein bekanntes und breit angewandtes Verfahren zur Erhöhung der PCR- Sensitivität und-Spezifität dar. Im ersten Lauf der nested-PCR werden die Zielsequenzen voramplifiziert. In der Regel wird ein Mikroliter des Reaktionsprodukts des ersten Laufs als Ausgangsmaterial für den zweiten Lauf der nested-PCR übertragen. Die im zweiten Lauf eingesetzten Primer binden innerhalb der voramplifizierten DNA Abschnitte. Die Durchführung einer nested-PCR ist bei dem vorgeschlagenen Verfahren mit PIRS-Primern grundsätzlich nicht erforderlich. Es sollte nur demonstriert werden, daß das Verfahren auch in einer nested-PCR eingesetzt werden kann. Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach ganz normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (-) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR :

"Baddies" : Baddy 1 und 2 t (9 ; 22) (mBCR Positivzelllinie : SD1 ; MBCR Positivzelilinie : K562) -m-BCRupmRNA 5'-CAGCTCCAATGAGAACCTCACCTCCAGCG #M-BCRupmRNA 5'-AGAGAAGAGGGCGAACAAGGGCAGCAAGG -ABLdomRNA 5'-CTCAGCGGATACTCAGCGGCATTGCGG "Goodies" : Goody 1 t (12 ; 21) (verwendete Positivzelllinie : REH) NTELupmRNA 5'-GGCACTCCGTGGATTTCAAACAG -AMLdomRNA 5'-AACGCCTCGCTCATCTTGCCTGG Goody 2 t (8 ; 21) (verwendete Positivzelllinie : Kasumi) eAML1 upmRNA 5'-TTCACAAACCCACCGCAAGTCG -ETOdomRNA 5'-TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCTTG Primersequenzen : 5'-Homo-Tail = 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle (PIRS) zwei Basen zusätzlich : GA

FAM-Sonde HNNO* (für Goodies) : 5'-(FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-(TAMRA) VIC-Sonde NPY-Rec* (für Baddies) : 5'-(VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA) * Die Bezeichnungen"HNNO"und"NPY-Rec"stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt : (5'-Homo-Tail = kursiv ; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt ; Spezifische Sequenz = unterstrichen).

"Baddies" : m-BCR intern Hands sense : <BR> <BR> 5'-G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T- CCAATGAGAACCTCACCTCCAGCG M-BCR intern Hands sense : <BR> 5'-G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T- AGAGGGCGAACAAGGGCAGCAAGG ABL-intern Hands NPY antisense (SEQ ID No. 1) : (Dies ist der Gegenprimer für beide obengenannten Primer, sowohl für M- BCR als auch für mBCR) : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA-5' <BR> TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-GCGGATACTCAGCGGCATTGCGG "Goodies" : TEL intern Hands HNNO sense (SEQ ID No. 2) : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA-5' <BR> <BR> TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CGGCACTCCGTGGATTTCAAACAG

AML1 intern Hands antisense <BR> 5'-G C G T A C T A G C G T A C C A C G T G T C G A C T- AACGCCTCGCTCATCTTGCCTGG AML1 intern Hands sense 5'-G C G T A C T A G C G T A C C A C G T G T C G A C T- CTTCACAAACCCACCGCAAGTCG ETO intern Hands HNNO antisense (SEQ ID No. 3) : <BR> <BR> 5'-G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T-G A-<BR> TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-TGAACTG GTTCTTG GAG CTCCTTG PCR-Bedingungen für diesen Ansatz : Ein 50 pi Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten : 5 lil 1 Ox PCR-Puffer 4, ul 25 nM MgCl2 2, ul dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP) 5, ul"Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration) 5 ul VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration) 0, 25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen) 0,125, ul AmpliTaq Gold Polymerase 0,5 NI von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration) 2 µl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50, ul PCR-Cycler Bedingungen : 50 °C-2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C-10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)

danach 5 Zyklen zu 95 °C-15 s min danach 35 Zyklen zu 95 °C - 15 s # 68 °C - 1 min # 72 °C - 1 min Die Resultate des Anwendungsbeispiels sind in den Figuren 1 und 2 gezeigt.

Man sieht, daß nur die"Baddies"ein positives VIC-Signal aufweisen, während nur die"Goodies"ein positives FAM-Signal zeigen. Alle anderen Proben sind negativ. Es liegen somit keine falsch positiven Resultate vor.

Beispiel 2 Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann genutzt werden, um mehrere genetisch heterogene Erkrankungen gleichzeitig nachzuweisen. Für jede zu berücksichtigende Erkrankung wird eine Sondenfarbe reserviert. Die einzelnen PCR-Primer erhalten aufgrund unterschiedlicher 3'-Enden die Spezifität für eine einzige Punktmutation. Aufgrund identischer PIRS können die entsprechenden Gruppen von Primern jeweils einer in Frage kommenden Erkrankung zugeordnet werden. So könnte zur Ursachenklärung bei Kindern mit einer Lungenerkrankung eine Fluoreszenzfarbe für den Nachweis verschiedener Punktmutationen im CFTR-Gen reserviert werden, um eine Mukoviszidose zu erkennen. Eine zweite PIRS könnte bei einem PCR- Primersatz eingebaut werden, um in der gleichen PCR-Reaktion Mutationen im PIZ-Gen zu detektieren, die beim alpha-1-Antitrypsinmangel vorliegen.

Beispiel 3 Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann auch eingesetzt werden, um verschiedene Gruppen von Infektionserregern in einem einzigen PCR-Ansatz nachzuweisen. Für klinische Fragestellungen kann dies besonders hilfreich sein, wenn die einzelnen Gruppen ein unterschiedliches therapeutisches Vorgehen erfordern. So können bei Patienten mit klinischem Verdacht auf eine Meningitis oder Enzephalitis in einer einzigen Multiplex-PCR sowohl bakterielle als auch virale Erkrankungen nachgewiesen werden. Wird eine Sondenfarbe für alle bakteriellen-und eine andere Sondenfarbe für alle

viralen Erreger reserviert, so ließe sich anhand des PCR-Ergebnisses sofort die notwendige Therapie ableiten : Breitspektrumantibiotika (z. B. Cefotaxim) bei bakteriellen Erregern oder Virostatika (z. B. Acyclovir) bei Herpesvirusinfektionen. Im ersten Lauf der nested-PCR werden nur zwei Primersätze eingesetzt. Einer detektiert beide Typen des Herpes simplex Virus. (Die Primersequenzen sind der folgenden Arbeit entnommen : Casas et al, Detection of both Herpes simplex and Varicella-Zoster Viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J. Med. Virol. Vol. 50 : 82-92,1996). Der zweite bindet an hochkonservierte bakterielle DNA- Regionen, die für Abschnitte der 16S rRNA von Bakterien (Eubacteriae) codieren. Mit ihm können die entsprechenden Genombereiche einer Vielzahl von Bakterien detektiert und amplifiziert werden (siehe Radström et al., J.

Clin. Microbiology, Vol. 32 : 2738-2744,1994). Die Abgrenzung der klinisch relevanten pathogenen Bakterien (Meningokokken, Hämophilus influenza und Pneumokokken) erfolgt erst im zweiten Lauf der nested-PCR unter Verwendung spezifischer Primersätze mit PIRS-Primern auf einem fluoreszenzoptischen System zur Detektion der PCR-Produkte. Die bakterienspezifischen Primersequenzen sind der Arbeit von Radström et al. entnommen (s. o.) ; die herpesvirusspezifischen Primersequenzen stammen aus der Arbeit von Casas et al. (s. o.). Eine weitere Besonderheit ist die Ausführung des bakterienspezifischen Primersatzes als"semi-nested-PCR".

Der universelle Antisense-Primer zum Nachweis von Bakterien wird auch im zweiten Lauf als Gegenprimer zu den Bakterienspezies-spezifischen PIRS- Primern eingesetzt. Die Speziesspezifität wird alleine durch die Sense-Primer erreicht. Aus diesem Grund muß der Primer bereits im ersten Lauf die "HANDS-Sequenz"5'-wärts von dem zielsequenzspezifischen Abschnitt tragen. Hätte der Primer im ersten Lauf noch nicht die"HANDS-Sequenz", so würden im zweiten Lauf Primer mit und Primer ohne"HANDS-Sequenz" miteinander kompetieren, was bei der geringen Konzentration der zielsequenzspezifischen Primer im entscheidenden zweiten Lauf der nested- PCR zu einem ineffizienten Einbau der"HANDS-Sequenz"führen könnte, mit der Folge einer deutlich beeinträchtigen Sensitivität.

Primersequenzen : Außer dem Primer"Eubac-exdo"bzw."Eubac-Hands-antisense", wie oben erwähnt, entsprechen alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil vor dem Bezeichnungskürzel versehen.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR : "Bakterien (Eubacteriae)" : -Eubac-exup 5'-AACT (C/A) CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA Eubac-exdo = Eubac-Hands-antisense : <BR> <BR> 5'-G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T- AAGGAGGTGATCCA (G/A) CCGCA (G/C) (G/C) TTC "Herpesvirus" : -Herpes-exup 5'-AGCGAATGCGATGAATTTCGATT -Herpes-exdo 5'-GAGGCGGAGCTTCACCAGGC Primersequenzen : 5'-Homo-Tail = 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle zwei Basen zusätzlich : GA

FAM-Sonde HNNO* (für die beiden Herpesvirustypen) : 5'- (FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC- (TAMRA) VIC-Sonde NPY-Rec* (für die drei oben erwähnten pathogenen Bakterien) : 5'-(VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA) * Die Bezeichnungen"HNNO"und"NPY-Rec"stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt : (5'-Homo-Tail = kursiv, Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt ; Spezifische Sequenz = unterstrichen).

"Herpesviren" : Herpesvirus Typ 1 : HSV1-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 4) : <BR> <BR> 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA<BR> TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTCGGGTCGGGC HSV 1-intern-Hands-antisense : <BR> <BR> 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-TCGCACTACTGCCAGGGGCAG Herpesvirus Typ 2 : HSV2-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 5) : <BR> <BR> 5'-GCGTA CTA GCGTA CCA CGTGTCGA CT-GA-<BR> TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTGGGCCCGGAG HSV2-intern-Hands-antisense : <BR> <BR> 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-TCGCACTACTGCCAGGGCCGC "Bakterien" : Neisseria meningitidis (Meningokokken) : Men-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 6) :

5'-GCGTA CTA GCG TA C CA CG TG TCGA CT-G A- TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-TGTTGGGCAACCTGATTG Haemophilus influenzae : Hae-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 7) : 5'-G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T-G A- TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-CCTAAGAAGAGCTCAGAG Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) : Pneu-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 8) : 5'-GCGTA CTA GCGTA CCA CGTCTCGAC. T-GA- TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-GTACAACGAGTCGCAAGC Eubac-Hands-antisense : 5'-G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T- AAGGAGGTGATCCA (G/A) CCGCA (G/C) (G/C) TTC PCR-Reaktionsbedingungen : (Im Vergleich zu den im vorherigen Anwendungsbeispiel beschriebenen PCR-Bedingungen ergeben sich keine Unterschiede außer einer von 60 auf 55 °C reduzierten Annealingtemperatur in den ersten fünf Zyklen der multiplex-PCR mit PIRS-Primern).

Ein 50 pI Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten : 5 ul 10x PCR-Puffer 4, ul 25 mM MgC'2 2, ul dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP) 5 pl"Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 5 ul FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration) 5, ul VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration) 0,25 NI UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen) 0,125 NI AmpliTaq Gold Polymerase

0,5 ul von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration) 2 µl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 µl PCR-Cycler Bedingungen : 50 °C-2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C-10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danch 5 Zyklen zu 95 °C - 15 s # 55 °C - 1 min # 72 °C - 1 min danach 35 Zyklen zu 95 OC-15 s-68 OC-1 min-72 OC-1 min Beispiel 4 In einer Multiplex-PCR mit PlRS-Primern lässt sich auch die Fähigkeit zur quantitativen Erfassung der PCR-Produktmenge nutzen, die die oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme besitzen. Die jeweilige Gesamtmenge mehrere Gruppen von Nukleinsäure-Zielsequenzen kann so mit einer einzigen PCR-Reaktion ermittelt werden. So ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zytokin-mRNAs jeweils einer Sonde zuzuordnen, um dann mit einer einzigen PCR-Reaktion zu ermitteln, ob z. B. in einer bestimmen Probe ein Tri-odeur TH2-Zytokinantwort überwiegt. Viele infektiöse Agentien oder Allergene polarisieren zu einem der beiden Zytokinmuster TH1 und TH2, was zum Schutz des Organismus vor dem entsprechenden Agens oder aber zu einem immunpathologischen Prozess führen kann (siehe Arbeit von Lanzavecchia, Identifying strategies for immune intervention, Science Vol. 260 : 937-944,1993).

Eine PIRS wurde zum Nachweis der Zytokine Interleukin-2 und Interferon- gamma eingesetzt. Die entsprechende Sonde trägt das Fluoreszenzsignal FAM. Die Intensität des FAM-Signals ist somit proportional zu der Summe der beiden Zielsequenzen Interleukin-2 und Interferon-gamma als Marker einer TH1-Antwort. Die zweite PIRS generiert die Bindungsstelle für eine VIC-

markierte Sonde. Die PlRS-PCR-Primersätze dienen dem Nachweis von undInterleukin-10alsReprässentanteneinerTH2-Interleukin-4,I nterleukin-5 Antwort.

Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen in Leukämiezellen wird zur Steigerung der Empfindlichkeit eine nested-PCR durchgeführt.

Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (#) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR : "T"-<BR> -LHI- Interleukin-2 : bIL-2exup 5'-CAAGAATCCCAAACTCACCAGG -IL-2-exdo 5'-CCATCTGTTCAGAAATTCTACAATG Interferon-gamma : -IF-G-exup 5'-CCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGG oI F-G-exdo 5'-CCATTACTGGGATGCTCTTCG "TH2": Interleukin-4 : #IL-4-exup

5'-GAACAGCCTCACAGAGCAGAAG -IL-4-exdo 5'-CGTTTCAGGAATCGGATCAG Interleukin-5 : #IL-5-exup 5'-TCAGGGAATAGGCACACTGGAG IL-5-exdo 5'-ACTCGGTGTTCATTACACCAAG Interleukin-10 : #IL-10-exup 5'-CCAAGACCCAGACATCAAGG #IL-10-exdo 5'-ACCCTGATGTCTCAGTTTCG Primersequenzen : 5'-Homo-Tail = 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle zwei Basen zusätzlich : GA FAM-Sonde HNNO (fur TH1) : 5'- (FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC- (TAMRA) für(TH2):VIC-SondeNPY-Rec* 5'-(VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA)

*Die Bezeichnungen"HNNO"und"NPY-Rec"stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt : (5'-Homo-Tail = kursiv ; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt ; Spezifische Sequenz = unterstrichen) "TH1" Interleukin-2 : IL-2-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 9) : 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT- GA-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CCCAAGAAGGCCACAGAACTG IL-2-intern-Hands-antisense : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-5' TTGATATTGCTGATTAAGTCCCTG Interferon-gamma : IF-g-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 10) : 5'-GCGTA CTA GCGTA CCA CGT GT CGA CT-GA-<BR> TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGG IF-g-intern-Hands-antisense : 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-AAATTCAAATATTGCAGGCAGG<BR&g t; "T"<BR> -lu2- Interleukin-4 : IL-4-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 11) : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA-5' TGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-TG CTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAG IL-4-intern-Hands-antisense : <BR> <BR> 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GAGTGTCCTTCTCATGGTGG

Interleukin-5 : IL-5-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 12) : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA-5' TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-ACTCGGTGTTCATTACACCAAG IL-5-intern-Hands-antisense: <BR> <BR> 5'-GCGTA CTA GCGTA CCA CGTGTCGA CT-TTGCAGGTAGTCTAGGAATTGG Interleukin-1 0 : IL-10-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 13) : -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA-5' TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-AAGACCCTCAGGCTGAGGCTACG IL-1 0-intern-Hands-antisense : 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-CTTTGTAGATGCCTTTCTCTTGG PCR-Bedingungen : Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten : 10xPCR-Puffer5µl 4 25 25 mM MgC12 2, ul dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP) 5 µl "Homo-Trail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 5, ul FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration) 5, ul VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration) 0,25 NI UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen) 0,125, ul AmpliTaq Gold Polymerase 0,5 NI von jedlem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, Endkonzentration)nM 2 pI der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 NI

PCR-Cycler Bedingungen : 50 °C-2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C-10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95 °C - 15 s # 60 °C - 1 min # 72 °C - 1 min danach zu95°C-15s#68°C-1min#72°C-1minZyklen Beispiel 5 : Beispiel 5 dient dem gleichen Ziel wie Beispiel 1. Als Ausgangsmaterial wurden die gleichen Leukämiezettinien verwendet. Im Unterschied zu Beispiel 1 wurde eine modifizierte Primer/Sondenkombination gewählt, die eine Amplifikation bei höheren Temperaturen erlaubt.

Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR (1. Lauf ist im PCR-Protokoll nicht aufgeführt) : "Baddies" : Bady 1 und 2 t (9 ; 22) (mBCR Positivzellinie : SD1 ; MBCR Positivzellinie : K562) <BR> <BR> m-BCRfwexSD1<BR> *-5'-GCTATACCCCGGACTGCAGCTCCAATGAG<BR> * M-BCRfwexK562 5'-AGAGGCTGAAGAAGAAGCTGTCGGAGCAGG *-ABLrvexBeide 5'-GAGTGTTTCTCCAGACTGTTGACTGGCGTGATG "Goodies" : Goody 1 t (12 ; 21) (verwendete Positivzellinie : REH) *~TELfwexREH 5'-TCTCCGAGGACGGGCTGCATAGGGAAGG

*-AML1 rvexREH 5'-GCCACCACCTTGAAAGCGATGGGCAGG Goody 2 t (8 ; 21) (verwendete Positivzellinie : Kasumi) *#AML1fwexKasumi 5'-TACGCACTGGCGCTGCAACAAGACCCTG *-ETOrvexKasumi 5'-GCCCATTGCTGAAGCCATTGGGTGGTGAG Primersequenzen und PCR-Cvclerbedinqunaen, die im entscheidenden PCR- Lauf nach dem TaqManTM-Verfahren unter Einsatz von"PIRS"verwendet wurden : 5'-Homo-Tail= 5'-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT FAM-Sonde HNNOplus&num (für Goodies) : 5'- (FAM)-CCCTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCgC- (TAMRA) VIC-Sonde NPYRECplus# (für Badies) : 5'-(VIC)-CCCgTgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC-(TAMRA) &num Die Bezeichnungen"HNNOplus"und"NPYRECplus"stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt : (5'-Homo-Tail = kursiv ; Sondenbindungsstelle = fett gedruckt ; Spezifische Sequenz = unterstrichen) "Badies" : *mBCRfwinSD1HAN: -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-T-5' CCCTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCG *MBCRfwinK562HAN :

5'-g C g T A" C TA g C g TA C C A C g Tg T C g A C T- TGCAGAGTGGAGGGAGAACATCCGGGAG *ABLrvinBeideHanNPY*ABLrvinBeideHanNPY+ (SEQ ID No. 14) -gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-T-5' C C C G Tg Tg gTAg CATTTg CAg TCTg CTg g C-T- GTGCAACGAAAAGGTTGGGGTCATTTTCACTGG "Goodies" : (SEQIDNo.15)*TELfwinREHHANHNNO+ -gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-T-5' CTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCGC-T-CC GCCTGAAGAGCACGCCATGCCCATTGG *AML1 rvinHANREH -gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-5' CGGCAACGCCTCGCTCATCTTGCCTG *AML1 fwinHANKasumi 5'-g C g TA C TA g C g TA C C A C g Tg T C g A C T - GCTGAGCTGAGAAATGCTACCGCAGCCATG *ETOrvinKasuHANHNNO*ETOrvinKasuHANHNNO+ (SEQ ID No. 16) -gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-T-5' C C C T C C T g C T g C g A T g C A A T g C T T T T C C G C-T- GGTGGCATTGTTGGAGGAGTCAGCCTAGATTG PCR-Bedingungen für diesen Ansatz : Ein 50, ul Reaktionsansatz enhält folgende Komponenten : 10xPCR-Puffer5µl 4, ul 25 mM MgCI2 2 µl dNTP-Mix (ATP, CTP, GTP und TTP) 5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 5, ul FAM-Sonde HNNO (400 nM Endkonzentration) 5, ul VIC-Sonde NPY-Rec (400 nM Endkonzentration) 0,25 NI UNG (Substanz zur Elimination von Kontaminationen) 0,125, ul AmpliTaq Gold Polymerase

0,5, u1 von jedem spezifischen Primer (SIRS-modifizierte Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration) 2 ul der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50, ul PCR-Cycler Bedingungen : 50 °C-2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C-10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 40 Zyklen zu 95 °C 15 s # 70 °C - 1 min Beispiel 6 Beispiel 6 dient dem gleichen Ziel wie Beispiel 1. Als Ausgangsmaterial wurden die gleichen Leukämiezeliinien eingesetzt. Verwendet wurden die Primersequenzen aus Beipiel 5, jedoch mit der entscheidenden Modifikation, daß Ts (Desoxythymidinreste) durch Us (Desoxyuracilreste) ersetzt wurden.

Hierdurch können vor der Amplifiaktion mit Hilfe der Homo-Tail-Sequenzen und der gleichzeitigen Generation von Fluoreszenzsignalen alle nicht mehr benötigten Primeroligonukleotide mit Hilfe des Enzyms Uracil-N-Glycosylase verdaut werden. Es resultiert eine teilweise Elimitation eventuell entstandener Primer-Dimere. Außerdem wird die Kompetition zwischen den Primern mit mehreren Domänen, die auch eine PtRS-Domäne tragen, und den floureszenzmarkierten Sonden aufgehoben. Auch die Kompetition mit den Homo-Tail-Primern wird aufgehoben. Eine solche Kompetition würde die PCR-Effizienz besonders dann reduzieren, wenn sehr viele Zielsequenzen gleichzeitig detektiert werden sollen und somit sehr viele verschiedene Primer mit mehreren Domänen in einem Reaktionsansatz eingesetzt werden müssen.

Primersequenzen für den ersten Lauf einer nested-PCR (erster Lauf ist im PCR-Protokoll nicht aufgeführt) :

"Baddies" : Bady 1 und 2 t (9 ; 22) (mBCR Positivzellinie : SD1 ; MBCR Positivzellinie : K562) m-BCRfwexSD 1-U <BR> * S'-GCUAUACCCCGGACUGCAGCUCCAAUGAG<BR> *-M-BCRfwexK562-U 5'-AGAGGCUGAAGAAGAAGCUGUCGGAGCAGG *#ABLrvexBeide-U 5'-GAGUGUUUCUCCAGACUGUUGACUGGCGUGAUG "Goodies" : Goody 1 t (12 ; 21) (verwendete Positivzellinie : REH) *#TELfwexREH-U 5'-UCUCCGAGGACGGGCUGCAUAGGGAAGG *-AML1 rvexREH-U 5'-GCCACCACCUUGAAAGCGAUGGGCAGG Goody 2 t (8 ; 21) (verwendete Positivzellinie : Kasumi) *-AML1 fwexKasumi-U 5'-UACGCACUGGCGCUGCAACAAGACCCUG *-ETOrvexKasumi-U 5'-GCCCAUUGCUGAAGCCAUUGGGUGGUGAG

Primersequenzen und PCR-Cyclerbedingungen, die im entscheidenden PCR- Lauf nach dem TagManTM-Verfahren unter Einsatz von"PIRS"verwendet wurden : 5'-Homo-Tail= 5'-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT ("Ts"als"Us"innerhalb von Primern mit mehreren Domanen) zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle eine Base zusätzlich :"U" FAM-Sonde HNNOplus&num (für Goodies) : 5'- (FAM)-CCCTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCgC- (TAMRA) VlC-Sonde NPYRECplus&num (für Badies) : 5'-(VIC)-CCCgTgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC- (TAMRA) &num Die Bezeichnungen"HNNOplus"und"NPYRECplus"stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.

Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt : (5'-Homo-Tail = kursiv ; Sondenbindungsstelle = fett gedruckt ; Spezifische Sequenz = unterstrichen) "Badies" : *mBCRfwinSD1HAN-U: <BR> 5'-G C G UA C UA G C G UA C CA C G U G U C GA C U-U- CCCUCGCAGAACUCGCAACAGUCCUUCG *MBCRfwinK562HAN-U :

5'-g Cg UA C UA g C g UA C CA C g Ug U C gA C U- UGCAGAGUGGAGGGAGAACAUCCGGGAG *ABLrvinBeideHanNPY+-U (SEQ ID No. 17) -gCgUACUAgCgUACCACgUgUCgACU-U-5' CCCGUgUggUAgCAUUUgCAgUCUgCUggC-U- GUGCAACGAAAAGGUUGGGGUCAUUUUCACUGG "Goodies" : *TELfwinREHHANHNNO+-U (SEQ ID No. 18) -gCgUACUAgCgUACCACgUgUCgACU-U-5' CCCUCCUgCUgCgAUgCAAUgCUUUUCCGC-U- GCCUGAAGAGCACGCCAUGCCCAUUGG <BR> <BR> *AML1 rvinHANREH-U<BR> -gCgUACUAgCgUACCACgUgUCgACU@5' CGGCAACGCCUCGCUCAUCUUGCCUG *AML1fwinHANKasumi-U 5'-g C g U A C U A g C g U A C C A C g U g U C g A C U GCUGAGCUGAGAAAUGCUACCGCAGCCAUG +-U(SEQIDNo.19)*ETOrvinKasuHANHNNO <BR> -gCgUACUAgCgUACCACgUgUCgACU-U@5'<BR> CCCUCCUgCUgCgAUgCAAUgCUUUUCCGC-U GGUGGCAUUGUUGGAGGAGUCAGCCUAGAUUG PCR-Bedingungen für diesen Ansatz :

Ein 50 ul Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten : 10xPCR-Puffer3,5µl 4, ul 25 mu MgC12 2 NI dNTP-Mix (ATP, CTP, GTP und TTP) 0,125 ul AmpliTaq Gold Polymerase 0,5, u1 von jedem spezifischen Primer (SIRS-modifizierte Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration) 2 NI der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 35 ul PCR-Cycler Bedingungen : Voramplifikation : 95 °C-10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95 °C - 15 s # 70 °C - 1 min 99 °C - 10 min (Zerstörung der Taq-Polmyerase) Zugabe von 2 Units Uracil-N-Glycosylase (UNG) + 0, 125 µl AmpliTaq Gold + 5µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) + 5 µl FAM-Sonde HNNOplus (400 nM Endkonzentration) + 5, ul VIC-Sonde NPYRECplus (400 nM Endkonzentration) + 1, 5 µl PCR- Puffer 10x 50 °C-1 Stunde (UNG-Verdau) danach 95 °C-10 min (Aktivierung der neu zugegebenen Polymerase und Hydrolyse der abasischen Nukleotide) 35 Zyklen zu 95 °C 15 s # 70 °C - 1 min