CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo del análisis de especies químicas nucleoSlicas en disolución, concretamente a nuevos reactivos derivados de sales de pirilio, así como al procedimiento para su preparación, a su uso para la detección de especies químicas con carácter nucleofRico en medio acuoso y al método de detección/cuantificación de dichas especies nucleoflicas mediante los citados reactivos. El método de detección se basa en la reacción de estas especies nucleofuicas o nucleófilos con los reactivos de la invención que tienen en común el disponer de centros deficientes en carga electrónica y que, por lo tanto, son especialmente electrofílicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Aniones como el cianuro, así como otras especies o grupos neutros con un excedente en densidad electrónica presentan carácter nucleofílico. La detección de determinadas especies nucleófilas puede ser de interés. Así, por ejemplo, el anión cianuro es probablemente uno de los aniones inorgánicos más tóxicos que existen.

A pesar de su elevada toxicidad, este anión es utilizado bien en su forma aniónica, bien en su forma protonada, en un gran número de aplicaciones como, por ejemplo, en la fabricación de fibras y resinas, en la obtención de herbicidas y en la extracción minera de oro. Debido a su gran toxicidad y a su amplia utilización es muy importante el desarrollo de nuevos métodos para la detección y determinación de este anión.

El anión sulfuro es un anión inorgánico usado en una gran variedad de aplicaciones, por ejemplo, para su conversión en azufre o ácido sulfúrico, para la fabricación de tintes y cosméticos, para la producción de pasta de madera etc.

Como consecuencia, es fácil encontrar el anión sulfuro disuelto en agua debido a procesos industriales, pero también debido a la reducción microbiana del sulfato por bacterias anaerobias o por su formación a partir de los aminoácidos azufrados contenidos en las proteínas de la carne. Hay importantes razones que propician la necesidad de detectar estos aniones en disolución, ya que se trata de un anión

tóxico para el ser humano. Tiene la capacidad de irritar las mucosas, así como de provocar la pérdida de conocimiento y parálisis respiratoria.

Las aminas son un grupo importante de compuestos ya que forman parte de los aminoácidos y además muchas de ellas tienen actividades fisiológicas muy potentes como la histamina o los alcaloides. Por otra parte, las aminas tienen tarnbién una importancia industrial, por ejemplo la anilina es uno de los products de la industria química de mayor consumo, pero otras aminas aromáticas se usan como intermediarios en la fabricación de colorantes, otras en la fabricación de fibras sintéticas.. . Las aminas alifáticas primarias de cadena larga, usadas en gran número de procesos industriales, son altamente tóxicas para especies acuáticas, de ahí la importancia de poder detectarlas en solución acuosa Durante los últimos años, se ha puesto de manifiesto un creciente interés en el estudio y desarrollo de nuevos sensores químicos para aniones o especies neutras, con capacidad de emitir una señal macroscópica de tipo óptico. En presencia de los aniones a detectar, estos sensores espectroscópicos responden mediante una variación de la fluorescencia (fluoroionóforos) o mediante un cambio en la absorbancia (cromoionóforos). Ejemplos de sensores de aniones de tipo fluorescente son : D. H. Vance et al. J. Am. Cla. em. Soc., 116 (1994) pág. 9397-9398 ; G. D. Santis et al., Angew. Chem. Int Ed. Engl., 35 (1996) pág. 202; M. T. Albelda et al., J. Chem. Soc. Perk-in Trans. 2 (1999) pág. 2545-2549; R. Prohens et al., Chez. Commun., 2001 pág. 1456; M. E. Padilla-Tosta et al, Eur. J. Inorg. Chem., 2001 pág. 1221-1226; y de sensores colorimétricos de aniones : S. Watanabe et al., J. Am. Chem. Soc., 120 (1998) pág. 229-230; K. Niikura et al., J. Afro. Chem. Soc., 120 (1998) pág. 8533-8534; J. J. Lavigne, E. V. Anslyn, Anges. Chesn. Int. Ed., 38 (1999) pág. 3666-3669; P. Anzenbacher, Jr. et al., Am. Chenl. Soc., 122 (2000) pág.

10268-10272; F. Sancenón et al., Angew. Chefn. Irat. Ed., 40 (2001) pág. 2640-2643.

Entre todos los sensores desanollados, son de especial interés los basados en cambios de absorbancia puesto que, de esta forma, la presencia de las especies aniónicas a detectar puede ser fácilmente reconocible a través de un simple cambio de color.

El diseño de nuevos sensores químicos se ha abordado desde diferentes

enfoqucs. En la mayoría de los casos, el proceso implica la unión de una molécula capaz de enlazar con el/los aniones a detectar, con otra molécula que genera la correspondiente señal macroscópica, bien sea por fluorescencia o por cambio de absorción. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la señal óptica es solamente observable en disolventes no acuosos como por ejemplo cloroformo o acetonitrilo, y son menos los ejemplos de sensores químicos para aniones que scan capaces de trabajar en medio acuoso. Un enfoque alternativo es la utilización de reacciones específicas producidas por las especies que se desea detectar, convenientemente acopladas con un proceso simultáneo que dé lugar a una señal macroscópicamente medible. Por ejemplo, de entre los avances más recientes Y. H. Kim en Chem. Commun1., 2002,512 y P. Anzenbacher en J. An1,. Cllem. Soc., 2002, 124, 6232, proponen dos métodos para la detección de cianuro, sin embargo, en ambos el cambio de color solamente se obtiene utilizando como disolvente diclorometano o mezclas de diclorometano y acetonitrilo.

Así pues, la invención se enfrenta, en general, con el problema de proporcionar un método alternativo para la detección de determinados nucleófilos como cianuro, sulfures o aminas primarias.

La solución proporcionada por esta invención se basa en la observación por parte de los inventores de que, una vez se ha conseguido la solubilización en agua de los reactivos derivados de las sales de pirilio de la invención (a partir de ahora reactivos de la invención), estos son capaces de sufrir un cambio de color en presencia de determinados nucleófilos debido a que contienen un anillo cargado positivamente. Los autores también han observado que modificando el pH del medio se puede seleccionar o modular la respuesta hacia un determinado nucleófilo.

Las sales de pirilio se han utilizado en numerosas aplicaciones pero nunca como reactivos para la detección y determinación de aniones debido a su baja solubilidad en agua. Para evitar este gran inconveniente en la presente invención se plantea la disolución previa en dioxano o acetonitrilo, admitiendo posteriormente esta disolución hasta un 80% de agua. Mediante el uso de los mencionados reactivos se evitan las interferencias propias de otros métodos de detección como

son las que producen la presencia de los aniones nitrato, nitrit, cloruro e isocianato.

OBJETO DE LA INVENCIÓN En primer lugar, la presente invención tiene por objeto proporcionar unos reactivos (reactivos de la invención) derivados de sales de pirilio con fórmula general (I) : m así como el procedimiento para su preparación.

Dentro del objeto de la presente solicitud se encuentra también el uso de los mencionados compuestos de fórmula general I para la detección y/o cuantificación de especies nucleofílicas o nucleófilos en general y en particular, nucleófilos como el cianuro, sulfuro o aminas primarias.

Otro objeto adicional, de la presente solicitud es proporcionar un método para detectar especies de carácter nucleófilo como cianuro, sulfuro o aminas primarias en un medio acuoso, que comprende poner en contacto la disolución del nucleófilo a detectar con una disolución de alguno de los reactivos de la invención que, al reaccionar, tienen la capacidad de proporcionar una señal o evento macroscópicamente observable y medible en disolución (cambio de color). La aparición de dicho evento es indicativa de la presencia de cianuro o de otros

ciertos nucleófilos como sulfuro o aminas primarias en dicha disolución ensayada.

Opcionalmente, el método de la invención permite, por medio de un sistema óptico, calcular la concentración del citado nucleófilo en dicha disolución ensayada por interpolación en una curva de calibrado. Un método como el proporcionado por esta invención permite detectar y si se desea, cuantificar, la presencia de determinados nucleófilos en un medio acuoso, de forma rápida, sencilla y reproducible.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la respuesta obtenida mediante la utilización de una disolución 5 x 10-5 M del reactivo II descrito en el Ejemplo 1 en función de la concentración de lisina según el método descnto en el Ejemplo 2, medida como la absorbancia en el máximo de la banda 540 nm) que presenta la disolución final resultante.

La Figura 2 muestra la respuesta obtenida por una disolución 5 x 10-5 M del reactivo II descrito en el ejemplo 1 en función de la concentración de sulfuro según el método descrito en el ejemplo 4 medida como el logalitmo de la absorbancia en el máximo de la banda (# = 610 nm) que presenta la disolución resultante.

La figura 3 muestra la respuesta obtenida por una disolución 5 x 10-5 M del reactivo I donde (X=O, Ri y R2 son grupos CH2CH3, R3 y R4 son hidrógenos) en función del logaritmo de la concentración de cianuro según el método descrito en el ejemplo 5 medida como el logaritmo de la absorbancia en el máximo de la banda (, = 540 nm) que presenta la disolución resultante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de compuestos derivados de las sales de pirilio capaces de detectar selectivamente la presencia de determinados nucleófilos en un medio acuoso. Concretamente, estos reactivos para la detección selectiva de determinadas especies químicas de carácter nucleofilico en agua o mezclas de agua/disolvente orgánico responden a la fórmula general I :

en donde X es un átomo de O o S y Rl, R2, R3 y R4 pueden ser un átomo de hidrógeno, cadenas alquílicas cerradas o abiertas C2-C6 que pueden contener o no heteroátomos como son O, N y S, grupos aromáticos o bien grupos- (CH2CH2O) nCH3, siendo n=1 a 5 caracterizados por sufrir un cambio de color en presencia de la especie química a detectar. La finalidad principal de los grupos RI, R2, R3 y R4 es aumentar la solubilidad en agua.

Los compuestos de fórmula general I tienen la particularidad de poseer grupos especialmente electrófilos (deficientes en carga electrónica) de forma que dan reacciones químicas en determinadas condiciones con ciertos nucleófilos como cianuro, sulfuro o aminas primarias produciendo cambios de color y en ocasiones aumento de la fluorescencia.

En una realización particular y preferida, uno de los reactivos de la invención responde a la formula II :

(n) en el que R1 y R2 representan radicales -(CH2CH2O)nCH3 siendo n=2.

Otro aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de los reactivos de formula general I que comprenden las siguientes etapas : a) hacer reaccionar una acetofenona con tlietilformiato en presencia de un ácido inorgánico, preferiblemente ácido perclórico o clorhídrico para obtener la correspondiente sal de pirilio b) disolver el producto de la etapa a) en un disolvente orgánico, preferiblemente dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, tolueno o etanol, y hacerlo reaccionar con una anilina, obteniéndose el compuesto de fórmula general I en el que X representa un átomo de oxigeno c) hacer reaccionar, opcionalmente, el producto de la etapa b) con sulfuro para obtener el compuesto de formula general I en el que X representa un átomo de azufre.

En una realización particular del procedimiento de obtención de los reactivos de fórmula general I comprende hacer reaccionar la N-dietil 2- [2- (metoxictoxi) etoxi] anilina en una proporción de un equivalente a uno con el 2,6- difenilpirilio, para obtener el compuesto soluble en agua de fórmula II.

Un tercer aspecto de la invención hace referencia al uso de los reactivos de la invención para la detección de especies nucleofilicas preferentemente cianuro, sulfuro o aminas primarias en disoluciones acuosas o mezclas agua/disolvente orgánico. Como ejemplos de aminas primarias se podría señalar la lisina o la arginina Una realización particular de la invención supone el uso de los reactivos de la invención incorporados sobre soportes sólidos que pueden ser materiales poliméricos o soportes inorgánicos y que en contacto con disoluciones acuosas que contienen el nucleófilo a detectar, dan una señal macroscópicamente observable y medible.

En un último aspecto la invención se relaciona con un método para la detección de nucleófilos en un medio acuoso o en mezclas disolvente orgánico- agua, en adelante método de la invención, que comprende las siguientes etapas : a) preparar una disolución de uno de los reactivos de la invención, b) selección del pH de trabajo

c) mezclar la disolución a ensayar que contiene el nucleófilo con la disolución preparada en la etapa a), d) detectar la señal macroscópica producida y, opcionalmente, cuantificar dicha señal por interpolación en una curva de calibrado.

La disolución de la etapa a) se obtiene preferiblemente solubilizando uno de los reactivos de la invención en un disolvente orgánico, preferiblemente acetonitrilo o dioxano seguido de una disolución en agua.

La elección del pH es una parte fundamental del método de la invención ya que, en primer lugar está relacionado con la estabilidad del reactivo y, por otra, puede permitir la detección selectiva de ciertos nucleófilos en disolución acuosa en presencia de otras especies químicas. En la siguiente tabla viene detallado el pH necesario para la detección selectiva de una serie de nucleófilos en disolución acuosa : Rangos de pH para detección selectiva Rango de estabilidad del reactivo pH = 9 Selectividad frente a cianuro 6-9 Selectividad frente a sulfuro 8-9 Selectividad frente a aminas primarias 8,5-9, 5 La mezcla resultante de poner en contacto la disolución acuosa que contiene el nucleófilo con la disolución que contiene el reactivo selectivo al nucleófilo se homogeneiza, se introduce en una celda de medida de un sistema óptico y se mide.

Para la elaboración de la curva de calibrado que relaciona la concentración de la especie química a detectar (nucleófilo) con el valor de la señal macroscópicamente observable y medible, la disolución del reactivo selectivo se distribuye en alícuotas y sobre ellas se añaden unas disoluciones patrón del nucleófilo, normalmente preparadas en agua aunque podría utilizarse otros medios

como disolventes orgánicos o mezclas de estos con agua. Las disoluciones patron del nucleófilo se preparan disolviendo cantidades conocidas del nucleófilo en volúmenes conocidos del disolvente correspondiente. La medida de la señal macroscópica que se produce en las disoluciones resultantes de adicionar las disoluciones patrón del nucleófilo sobre dichas alícuotas preparadas a partir de dicha disolución del reactivo selectivo proporciona los distintos puntos de calibrado.

En una realización concreta del método de la invención (véase el Ejemplo 4), este se basa en el cambio de color que produce el ataque nucleofílico del anión sulfuro sobre el derivado de pirilio (compuesto U). El color del pirilio funcionalizado se debe a una banda de transferencia de carga desde los grupos dadores anilina hasta el aceptor que es el grupo pirilio. Cuando el anión sulfuro está presente, el ataque de este anión sobre el carbono unido al oxígeno del grupo pirilio da lugar a la transformación del grupo piu-po en tiopirilio provocando el corrimiento de la banda en el visible desde 540 nm en el reactivo II hasta 610 nm en el caso del tiopililio correspondiente. Este colwimiento de la banda de absorción da como resultado un cambio de color apreciable a simple vista desde el magenta caractelístico del reactivo II hasta el azul del derivado de tiopirilio que se obtiene mediante la reacción del reactivo II con el anión sulfuro a determinar.

El método de la invención puede ser implementado en un equipo de medida rápida que comprende un dispositivo mecánico que permita la reacción entre el reactivo selectivo y la especie a determinar presente en la disolución problema y el cálculo de su concentración por comparación con un patrón de concentraciones. En una realización particular, el método de la invención se puede implementar en forma de tiras o bandas para ensayos analíticos soportando los reactivos en sólidos adecuados como polímeros o matrices silíceas.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Obtención del reactivo II En la primera etapa se sintetiza el perclorato de 2, 6-difenilpililio mezclando acetofenona y trietilortoformiato en relación molar 2 : 1, enfriándose en un baño de hielo y añadiendo gota a gota HC104 70%. Una vez adicionada la

cantidad necesaria de ácido se deja agitando la disolución a temperatura ambiente durante unas horas. Transcunido este tiempo se añade éter dietílico y el precipitado obtenido se filtra a vacío y se lava sucesivas veces con pequeñas porciones de éter dietílico.

En la etapa final se mezcla el producto obtenido en la etapa anterior y la N, N-di (2-etil-2-metoxietoxi)) anilina, que se ha obtenido como se indica en la etapa (i) del ejemplo 1, disolviéndolos en dimetilformamida y se calienta durante unas horas. Transcurrido ese tiempo se enfría la disolución, se añade éter dietílico y se filtra a vacío lavando el filtrado con pequeñas porciones de éter dietílico. El producto obtenido es consistente con los datos espectroscópicos de RMN de 1H y <BR> <BR> <BR> 13c<BR> C.

EJEMPLO 2 Determinación de lisina mediante colorimetría utilizando el reactivo selectivo H del Ejemplo 1 Se prepara una disolución de concentración 5 x 10-4 M del reactivo II en acetonitrilo.

Se mezcla una parte de la disolución del reactivo II con otra parte de acetonitrilo y ocho partes más de disolución acuosa de tampón TRIS (tris (hidroximetil) aminometano) en concentración 0. 01M a pH = 9 para cada uno de los puntos del calibrado. A continuación a cada punto del calibrado se le añade una cantidad creciente conocida de lisina abarcando el rango de concentraciones entre 0 y 8 x104 M. La respuesta obtenida para las diferentes concentraciones de lisina se muestra en la Figura 1.

De la misma forma, ocho partes de la disolución acuosa conteniendo lisina que se desea determinar se mezclan con una parte de la disolución del reactivo selectivo II y con otra parte de acetonitrilo. Se opera de la rnisma forma que para la preparación de los puntos de la recta de calibrado y se calcula la concentración en lisina buscada por interpolación en la recta de calibrado obtenida anteriormente.

EJEMPLO 3 Determinación de arginina mediante colorimetría utilizando el reactivo selectivo II del Ejemplo 1 Se prepara una disolución de concentración 5 x 104 M del reactivo II en acetonitrilo.

Se mezcla una parte de la disolución del reactivo II con otra parte de acetonitrilo y ocho partes más de disolución acuosa de tampón TRIS (trisglidroximetilBaminometano) en concentración 0. 01M a pH = 9 para cada uno de los puntos del calibrado. A continuación a cada punto del calibrado se le añade una cantidad creciente conocida de arginina abarcando el rango de concentraciones entre 0 y 8 x10 4 M.

De la misma forma, ocho partes de la disolución acuosa conteniendo lisina que se desea determinar se mezclan con una parte de la disolución del reactivo selectivo II y con otra parte de acetonitrilo. Se opera de la misma forma que para la preparación de los puntos de la recta de calibrado y se calcula la concentración en arginina buscada por intelpolación en la recta de calibrado obtenida anteriormente.

EJEMPLO 4 Determinación de sulfuro mediante colorimetría utilizando el reactivo selectivo II del Ejemplo 1 Se prepara una disolución de concentración 5 x 10-4 M del reactivo II en acetonitrilo.

Se mezcla una parte de la disolución del reactivo II con la cantidad adecuada de disolución acuosa de tampón TRIS (tris (hidroximetil) aminometano) en concentración 0. 01M a pH = 9 para que la concentración final del receptor en la mezcla agua-acetonitrilo sea de 5.0 x 10-5 M. Esta disolución se separa en volúmenes de 3 mL y a cada uno de ellos se le añaden cantidades crecientes de sulfuro. Se deja reaccionar la mezcla durante dos minutos y a continuación se añaden 30 microlitros de ácido sulfúrico al 30%. Seguidamente se lee la absorbancia de la disolución a 610 nm (banda azul) y se construe la curva de calibrado correspondiente. La respuesta obtenida para las diferentes concentraciones de sulfuro se muestra en la Figura 2.

Para la determinación de la concentración de sulfuro en la muestra se procede de la misma forma que para los puntos de la curva de calibrado. Así, se añade una alícuota de la muestra a determinar sobre 3 mL de la disolución acetonitrilo : agua tamponada a pH=9 que contiene el receptor II (5.0 x 10-5 M), se deja evolucionar la reacción durante dos minutos, se añaden 30 microlitros de ácido sulfúrico al 30% y se mide la absorbancia a 610 nm. La concentración de sulfuro en la muestra se obtiene por interpolación en la curva de calibrado correspondiente.

EJEMPLO 5 Determinación de cianuro mediante colorimetría utilizando el reactivo selectivo I Se prepara una disolución de concentración 5 x 104 M del reactivo I en acetonitrilo.

Se mezcla una parte de la disolución del reactivo I con la cantidad adecuada de agua para que la concentración final del receptor en la mezcla agua-acetonitrilo sea de 5.0 x 10-5 M. Esta disolución se separa en volúmenes de 3 mL y a cada uno de ellos se le añaden cantidades crecientes de cianuro. Se deja reaccionar la mezcla durante 30 minutos. Seguidamente se lee la absorbancia de la disolución a 540 nm y se construye la curva de calibrado correspondiente. La respuesta obtenida para las diferentes concentraciones de cianuro se muestra en la Figura 3.

Para la determinación de la concentración de cianuro en la muestra se procede de la misma forma que para los puntos de la curva de calibrado. Así, una alícuota de la muestra a determinar sobre 3 mL de la disolución acetonitrilo : agua que contiene el receptor II (5.0 x 10-5 M), se deja evolucionar la reacción durante 30 minutos y se mide la absorbancia a 540 nm. La concentración de sulfuro en la muestra se obtiene por interpolación en la curva de calibrado correspondiente.