Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen Technisches Gebiet;

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quanti¬ tativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Anti¬ körpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszie¬ renden Markierungssubstanz und einem Anregungsmittel hier- für unter Anwendung an sich bekannter heterogener Assays.

Zugrundeliegender Stand der Technik

Es ist von großer Bedeutung, Antigene, Antikörper oder deren Komplexe in Sekreten _/ Exkreten und Körperflüssig- keiten von Wirbeltierorganismen sowie von Menschen zu messen. Auf diese Weise können u.a. diagnostische Aussa¬ gen gemacht werden.

Es ist bekannt, eine serologische Reaktion durch Markie- rung einer oder mehrerer Reaktionskomponenten mit einem radioaktiven Isotop, durch Konjugierung mit einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer chemolumineszieren¬ den Substanz, wie Luminol oder Luciferin, nachzuweisen.

Das Radioimmunoassay wird in Journal Clinical Endocrino- logy 21_ (1967), S. 973 und Ibid 2 (1968), S. 343, be¬ schrieben. Der wesentliche Nachteil dieses Assays liegt in dem notwendigen Umgang mit strahlenemittierenden Iso¬ topen und in der erforderlichen aufwendigen Ausrüstung zur Durchführung eines solchen Assays.

Bei der Markierung einer Reaktionskomponente mit einem Enzym besteht der Nachteil darin, daß diese Markierung

1 kompliziert durchzuführen und das hergestellte Reaktions- produkt schwierig aufzubewahren und zu gebrauchen ist. Darüber hinaus handelt es sich bei den einzusetzenden Enzy¬ men um biologisch-aktive Substanzen extrem komplexer Natur,

5 auf die die erwähnten Schwierigkeiten zurückgehen. Die schließlich zum Nachweis des gebundenen Enzyms einzusetzen¬ den Substrate sind darüber hinaus noch kanzerogen. Das ist nachteilig. Das Enzym-Assay der beschriebenen Art wird in Bull. World Health Organ 53 _^ (1976) abgehandelt. 10

Bei der Fluoreszenztechnik wird ein Antigene und Antikörper enthaltendes Reaktionsprodukt durch Fluoreszenz unter Bestrahlung mit kurzwelligem Licht nachgewiesen. Hierbei muß das Anregungslicht vom emittierten Licht nachteiliger- 15 weise mit großem.apparativem Aufwand abgetrennt werden.

Bei den bisher zur Chemolumineszenz herangezogenen chemo¬ lumineszierenden Substanzen handelt es sich um solche, die nur sehr schwer an die Reaktionspartner einer serologi-

² 0 sehen Reaktion zu binden sind und darüber hinaus bis zu 99,3 % ihrer ursprünglichen Lumineszenz nach- er Bindung verlieren. Das ergibt sich z.B. aus Nature, Vol. 299 (1979), S. 646-647. Des weiteren wird in Journal of Immunological Methods 2 Λ_ (1978), S. 178-184, darüber berichtet, daß das

^•ώ ° chemolumineszierende Luminol aus diesem Grunde für kli¬ nische Routinelabortests ungeeignet ist.

Dem stehen Angaben in der US-PS 4 193 983 entgegen. Dort wird gerade Luminol als eine besonders geeignete Verbindung 30 für diesen Zweck angegeben. Als Anregungsmittel für die Chemolumineszenz sollen Wasserstoffperoxid oder Caicium¬ hypochlorit in Betracht kommen. Des weiteren wird in die¬ ser US-Patentschrif Fluoreszeinisothiocyanat für ein homo¬ genes Fluoreszenz-Assay erwähnt.

35

Trotz intensiver Bemühungen war es bisher nicht möglich,

ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art bezüglich Aufwand und Effizienz zufriedenstellend durchzuführen. Das gilt zum Beispiel auch für das in der US-PS 4 238 195 beschriebene Assay. Dort werden Markierungssubstanzen in Form von Fluoreszein und dessen Derivaten vorgeschlagen,di mittels besonders energiereicher Produkte angeregt werden sollen. Diese Produkte werden durch eine sehr komplexe Reaktion zwischen Oxalsäurederivaten, u.a. Oxalylchlorid, und Wasserstoffperoxid hergestellt. Ihre Herstellung er- fordert einen hohen Arbeitsaufwand. Darüber hinaus sind derartige Produkte nicht unbedenklich, da sie unter Umstän¬ den das giftige Phosgen entwickeln können.

Offenbarung der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus der Vielzahl der bekannten chemolumineszierenden Markierungssubstanzen , und Anregungsmitteln solche Kombinationen derselben aufzu¬ finden, die es gestatten, das eingangs beschriebene Ver¬ fahren so zu verbessern, daß es gefahrlos, einfach und mit hoher Effizienz durchführbar ist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine der folgenden Kombinationen aus Anregungsmittel und MarkierungsSubstanz

a) H_0--/Chloramin (bzw. -derivat) - Fluoreszein (bzw. -derivat) , Methylenblau (bzw. -derivat) oder Thionin (bzw. -derivat) und b) Caiciumhypochlorit - Fluoreszein (bzw. -derivat)

verwendet werden .

Wenn im Zusammenhang mit der Erf indung von Antigenen und

Antikörpern gesprochen wird, so sollen diese Begriffe weitestgehend verstanden werden . Bei Antigenen handelt es es sich um Stoffe , die nach . Einführung in den Organismus von J-ienschen und Tieren die Bildung von hervorrufen.

Als 7.rαtiσene wirken artfremde Eiweißstoffe tierischer und pflanzlicher

kunft, besonders diejenigen von Infektionserregern, sowie viele Stoffe komplizierter Natur mit fett-, saccharid (bzw. zucker)-, amin- und azoartiger Struktur. So kann es sich dabei um Substanzen, z.N. Proteide, Proteine, Polysaccharide, Lipide oder Nucleinsäuren handeln, die im Organismus von Wirbeltieren sowie von Menschen die Bil¬ dung von Antikörpern hervorrufen und spezifisch mit die¬ sen reagieren. Auch sollen hierzu ganz allgemein Haptene gezählt werden, zu denen man auch "unvollständige Anti- gene" sagt, die wegen ihrer geringen Größe allein keine Bildung von Antikörpern bewirken, jedoch mit den entspre¬ chenden Antikörpern eine spezifische Bindung eingehen können. Antigene können z.B.Viren, Bakterien oder Pilze oder Teile von diesen sein. Darüber hinaus sind z.B. auch bestimmte Hormone, Vitamine, Enzyme oder bestimmte

Medikamente dem Begriff "Antigen" unterzuordnen. Zur Defi¬ nition der Begriffe "Antigene" und "Antikörper" sei auf Kabat "Einführung in die Immunchemie und Immunologie", Springer Verlag, 1971, S. 9-25 und S.143-197 verwiesen.

Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Antikörpern um spezifische Produkte der Immunantwort, die im Wirbeltier¬ bzw, im menschlichen Organismus nach einem Antigenkontakt gebildet werden und spezifisch mit dem Antigen reagieren können. Neben die Antikörper sollen ausdrücklich bestimm¬ te Bindeproteine gestellt werden, die sich spezifisch an ein oder mehrere Substanzen, wie z.B. Antikörper, binden können. Ein Beispiel hierfür ist das Protein A. Von beson¬ derer Bedeutung sind die Antikörper, die den Immunglobuli- nen der Klasse IgG, IgM, IgA und IgE unterzuordnen sind. Diese werden im einzelnen in Kabat "Einführung in die Immunchemie und Immunologie", Springer Verlag, 1971, S. 143-197, beschrieben.

von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfah¬ ren zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern bei viralen

und bakteriellen Erkrankungen. Dabei ist der Nachweis des Oberflächenantigens des Hepatitis-B-Virus von ganz besonderer Bedeutung. Mit besonderem Vorteil gelingt auch der Nachweis von Antikörpern gegen die Herpeε- oder Toga- Vire ^* n.

Bei der Verwendung von Fluoreszein oder Fluoreszeinderi- vaten hat es sich gezeigt, daß sie sich besonders gut an Proteine bzw. Proteide binden lassen. Das bedeutet, daß Fluoreszein mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die dessen Affinität im Hinblick auf die Kopplung mit den erwähnten Antigenen und Antikörpern begünstigen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei die Isothio- cyanat- und Isocyanatgruppe als die Kopplung vermittelnde bzw. begünstigende Substituenten erwiesen. Eine besonders bevorzugte Stellung der Isothiocyanatgruppe ergibt sich aus der nachfolgenden Formel (FITC) .

Die Kopplungsfähigkeit des Fluoreszeins, das gegebenen¬ falls neben den die Kopplung begünstigenden bzw. vermit¬ telnden Substituenten auch noch mit nicht koppelnden Sub- stituenten versehen sein kann, kann hervorgerufen bzw. verbessert werden, indem ein geeignetes Reagens hinzuge¬ geben wird, das eine Kopplungsreaktion bzw. eine Brücken¬ bildung zwischen dem Fluoreszeingrundkörper und dem je¬ weiligen Antigen bzw. Antikörper oder deren Äquivalente hervorruft.

₁ Der Vorteil bei der Verwendung von Methylenblau liegt da¬ rin, daß, insbesondere im basischen Medium, zur Kopplung mit Antigen, Antikörpern oder deren Komplexen keine zu¬ sätzliche koppelnde Gruppe erforderlich ist.

5

Im Falle der Verwendung von Thionin als MarkierungsSubstanz muß eine koppelnde Gruppe eingeführt werden. Zu dieser koppelnden Gruppe gilt das im Zusammenhang mit Fluoreszein

Gesagte entsprechend. In der Praxis hat es sich gezeigt,

I _Q daß Carbodiimidderivate hierzu besonders geeignet sind, so insbesondere (N-Äthyl-N'-(III-methylamino-propyl) - carbodiimid-Hydrochlorid.

Wenn im Sinne der Erfindung von "Kopplungsfähigkeit" ge- 15 sprochen wird, so soll auch diese Eigenschaft weitest- gehend verstanden werden. In keinem Fall soll damit aus¬ drücklich auf eine ganz bestimmte Bindungsart abgestellt werden. Vielmehr soll nur zum Ausdruck gebracht werden, daß durch eine Wechselwirkung zwischen der Markierungs- 0 Substanz und dem Partner einer serologischen Reaktion in irgendeiner Form ein bindender bzw. ein bindendes kom¬ plexartiges Gebilde entsteht.

In Einzelfällen ist es denkbar, daß das zu markierende 5 Antigen nicht oder nicht in ausreichendem Maße mit der jeweils herangezogenen chemolumineszierenden Markierungs- substanz reagieren kann. In solchen Fällen werden dem Fachmann geläufige Proteine oder Proteide verwendet,die zunächst an das Antigen gebunden werden, so daß nachfol- 0 gend die Markierungssubstanz an das Protein des entstan¬ denen Reaktionsproduktes gebunden wird. Hierbei kann auch umgekehrt verfahren werden, indem die Markierungssubstanz zunächst an das Protein bzw. Proteid gebunden wird und ein derartiges che olumineszierendes Ko jugat mit dem 5 fraglichen Antigen in Wechselwirkung gebracht wird.

Im übrigen hat es sich gezeigt, daß die Empfindlichkeit

der vorliegenden Assays ganz beachtlich gesteigert werden kann, wenn bei der Herstellung des chemolumineszierenden Konjugats die chemolumineszierende Markierungssubstanz in Form von Fluor-eszein bzw. dessen Derivaten an ein Protein, insbesondere ein Immunglobolin gebunden wird.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Anregungsmittel rea¬ gieren grundsätzlich mit der mit dem Antigen, dem Anti¬ körper oder deren Komplexen gekoppelten chemolumineszie- renden Markierungssubstanz in der Weise, daß letztere Photonen aussendet.

Für die erfindungsgemäß herangezogenen chemolumineszieren¬ den Markierungssubstanzen hat sich insbesondere die Kom- bination aus Wasserstoffperoxid und Chloramin bzw. seinen Derivaten als sehr geeignet erwiesen. Es muß verwundern, daß Wasserstoffperoxid, das in der Literatur häufig ganz allein als einziges Anregungsmittel genannt wird, für die Zwecke der Erfindung allein nicht geeignet ist. Entspre- chendes gilt auch für Chloramin bzw. seine Derivate, wenn sie allein eingesetzt werden. Es muß in hohem Maße über¬ raschen, daß die Kombination aus diesen beiden Ausgangsma¬ terialien zu einer besonders günstigen Lösung der gestell¬ ten Aufgabe führt. Unter den in Frage kommenden Chlora- minen wird das Chloramin T bevorzugt. Chloramin T ist der internationale Freiname für N-Chlor-4-toluolsulfonsäure- amid-Natrium bzw. Tosylchloramid-Natrium. Es handelt sich um eine sehr stabile Substanz, die, wie Caicium¬ hypochlorit, eine besonders gute Reproduzierbarkeit des jeweiligen Assays gewährleistet. Die im Einzelfall ein¬ gesetzte Menge des Chloramins (bzw. -derivats) ist mit der Wasserstoffperoxidmenge abzustimmen. Dabei spielt es auch eine Rolle, in welcher Konzentration die Wasserstoff¬ peroxidlösung gewählt wird. So hat es sich gezeigt, daß mit folgenden Konzentrationen vorzügliche Ergebnisse erzielbar sind, wenn gleiche Lösungsvolumina der beiden Reagenzien

zusammengegeben werden: eine 0,5 bis 30 volumenprozentuale Wasserstoffperoxidlösung und eine 0,1 bis 8 gewichtspro¬ zentuale Lösung an Chloramin T. In jedem Fall wird der Fachmann im Rahmen eines geringfügigen Arbeitsaufwandes und ohne erfinderisches Zutun die wirksame Zusammensetzung des Anregungsmittels aus Wasserstoffperoxid und Chloramin bzw. dessen Derivaten ermitteln können.

Caiciumhypochlorit, das als Anregungsmittel im Falle der Verwendung von Fluoreszeinisocyanat herangezogen wird, zeigt, insbesondere in wäßriger Lösung, verschie¬ dene beachtliche Vorteile. So läßt sich das Assay aus- sergewöhnlich exakt reprod zieren. Die im Einzelfall ge¬ wünschte exakte Konzentration des Anregungsmittels läßt sich ohne weiteres festlegen. Allgemein kann gesagt wer¬ den, daß eine etwa 0,1 bis 20 gew.-%ige und insbesondere eine 0,2 bis 10 gew.-%ige Calciumhypochloritlösung zu vor¬ teilhaften Ergebnissen führt. Ganz besonders bevorzugt wird eine etwa 1,0 bis 4,0 gew.-%ige Lösung, wobei sich eine 2 gew.-%ige Lösung als ganz besonders günstig er¬ weist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie bereits einlei¬ tend angedeutet, auf der Grundlage an sich bekannter heterogener Assays durchgeführt werden. Derartige Verfah¬ ren werden in vielfältiger Weise in der Literatur beschrie¬ ben. Hierzu soll zum Beispiel verwiesen werden auf die US-PS 4 238 195 (siehe insbesondere Spalten 7 bis 11, Zeile 15) .

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich demzufolge in vielfältiger Weise, was dem Fachmann ohne weiteres erkenn¬ bar ist, verwirklichen. Grundsätzlich muß zunächst, was in an sich bekannter Weise geschieht, der Antigen/Anti- körper-Komplex auf Grund einer serologischen Reaktion

- - - gebildet werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfol¬ gen, indem zunächst entweder das Antigen und der Anti¬ körper in Lösung vorliegen oder ein Partner, d.h. das Antigen oder der Antikörper an einer festen Phase gebun- den ^" ist. Hierbei spricht man entweder von einem Flüssig- phasen- oder einem Festphasen-Assay. Nach Abschluß der serologischen Reaktion wird in beiden Fällen der Antigen/ Antikörper-Komplex von dem verbleibenden Reaktionsmedium abgetrennt. Bei dem Festphasen-Assay kann das in einfacher Weise dadurch geschehen, daß die überstehende Flüssig¬ keit, gegebenenfalls nach Zentrifugieren, dekantiert wird. Beim Flüssigphasen-Assay erfolgt die Trennung zum Beispiel durch Zentrifugieren mit anschließendem Dekan¬ tieren bzw. Filtrieren, insbesondere durch Ultrafiltra- tion, Chromatographieren und dergleichen. Der in der ge¬ schilderten oder einer ähnlichen Weise isolierte Antigen/Antikörper-Komplex wird anschließend mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches das damit in Wechselwirkung zu bringende chemolumineszierende Kon- jugat enthält.

Das chemolumineszierende Konjugat enthält eine der vor¬ genannten chemolumineszierenden Markierungssubstanzen neben dem Antigen oder Antikörper (bzw. Protein) . Aus dem chemolumineszierenden Konjugat und dem Antigen/An¬ tikörper-Komplex bildet sich ein neuer chemolunineszieren- der Komplex, der zum Beispiel anhand einer oder mehrerer der vorgenannten Separationsmethoden isoliert wird. Dabei kann er bereits in der Meßküvette vorliegen bzw. darin entstanden sein oder wird in eine solche überführt. In jedem Fall wird vor Durchführung der Messung das je¬ weilige Anregungsmittel hinzugegeben, bei dem es nicht wesentlich ist, in welcher Art von Lösungsmittel, sofern erforderlich, es vorliegt. Bevorzugt wird ein wäßriges Medium, insbesondere ein alkalisches, in dem das Anre¬ gungsmittel enthalten ist.

Oben wurde ein Vorgehen geschildert, bei dem "indirekt" die chemolumineszierende Markierungssubstanz an den je¬ weiligen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion gebunden wird. Daneben besteht aber auch noch die Möglich- keit, ein "direktes" Assay anzuwenden. Dabei wird entweder ein Antigen oder ein Antikörper vorgegeben. In Abhängig¬ keit vom Vorgabematerial wird ein Antikörper- bzw. Anti- gen-Konjugat (mit der chemolumineszierenden Markierungs¬ substanz) hinzugegeben und ein chemolumineszierender Komplex gebildet, der anschließend isoliert wird. Danach folgt die Chemolumineszenzmessung nach Zugabe des Anre¬ gungsmittels.

Mit großem Vorteil läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf der Grundlage eines Sandwich-Asεays durchführen. Ein Sandwich-Assay kann grundsätzlich sowohl im Rahmen eines Flüssigphasen- als auch eines Festphasenassays ange¬ wandt werden. Das wesentliche Kennzeichen eines im Verlau¬ fe eines Sandwich-Assays gebildeten chemolumineszierenden Konjugats ist darin zu sehen, daß in dem bezüglich der Chemolumineszenz gemessenen Komplex der nachzuweisende Reaktionspartner in Form eines Antigens oder eines Anti¬ körpers sowohl mit seinem konjugierten als auch mit sei¬ nem nicht-konjugierten Reaktionspartner reagiert hat. Bei Außerachtlassen der gekoppelten Markierungssubstanz handelt es sich also um einen symmetrisch aufgebauten Komplex, bei dem die zentrale Reaktionskomponente das Antigen oder der Antikörper ist, die nachzuweisen ist. Der vorgegebene Reaktionspartner bzw. die vorgegebene Reaktionskomponente tritt an zwei Seiten dieser zen¬ tralen Reaktionskomponenten damit in Wechselwirkung.

Dem erfindungsgemäßen Gedanken sollen jedoch auch übliche kompetitive Bindungsassays untergeordnet werden. Bei ei- nem derartigen Assay liegt ein Reaktionspartner einer serologischen Reaktion einerseits markiert und anderer-

O PI

- 1 1 - ^' . ^{' •} . seits nicht markiert vor. Diese beiden Reaktionspartner treten mit einem entsprechenden anderen Reaktionspartner in Wechselwirkung. So kann es sich bei dem ersten Reak¬ tionspartner (markiert oder unmarkiert) um ein Antigen handeln. Dann ist der zweite Reaktionspartner ein Anti¬ körper, /.rster markierter Reaktionspartner und zweiter Reaktionspartner (Antigen bzw. Antikörper) sind mengen¬ mäßig vorgegeben. Nach Ablauf der serologischen Reaktion wird entweder der nicht gebundene Teil des markierten ersten Reaktionspartners oder der gebildete Komplex in üblicher Weise nach Zugabe des Anregungsmittels gemessen. Diese Technik ist allgemein bekannt (siehe US-PS 4 238 195 a.a.O.). Ihre Variationen sind demzufolge dem Fachmann ge¬ läufig.

Die Chemolumineszenz kann mit handelsüblichen Photometern gemessen werden. Dabei läßt sich so vorgehen, daß mit vor¬ gegebenen bekannten Mengen an Antigen und Antikörper eine Eichkurve ermittelt wird. Mit einer unbekannten Substanz (sei es ein Antigen oder ein Antikörper) ermittelte Werte werden dann quantitativ unter Zugrundelegung der Eich¬ kurve ausgewertet.

Des weiteren ist es auch möglich, wenngleich dieses unter halbquantitativen Gesichtspunkten zu sehen ist, einen Vergleich bezüglich der Empfindlichkeit mit anderen be¬ kannten Assays zu ziehen. Das bisher als besonders nach- weisempfindlich angesehene Radioimmunoassay, mit den vor¬ stehend geschilderten Nachteilen behaftet, liegt in der Mehrzahl der Anwendungsgebiete bezüglich der Empfindlich¬ keit weit unter derjenigen des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens. So wurde zum Beispiel der Antikörpertiter eines Hyperi munserums gegen Rinderserumalbumin, hergestellt im Kaninchen, mit 1:4069 im Radioimmunoassay ermittelt, während erfindungsgemäß (H ₂ 0„/Chloramin - FITC) eine Empfindlichkeit von 1:32788 (!) erzielbar ist. Hierbei

QMPI

handelt es sich also um eine nahezu 8 mal so große

Empfindlichkeit. Andere übliche Assays waren weitaus weni¬ ger empfindlich als die oben verglichenen. So wurden folgende Antikörp.ertiter mit bekannten Assays ermittelt:

im Nephelometer 1 : 16 beim Immunodiffusionstest 1 : 64 in der Komplementbindungsreaktion 1 . 128 und im ELISA 1 : 51 2 .

Die mit der Erfindung erzielbaren Vorteile sind insbe¬ sondere darin zu sehen, daß die jeweils verwendete chemo¬ lumineszierende Markierungssubstanz außerordentlich ein¬ fach an einen Reaktionspartner einer serologischen Re- aktion, nämlich in Form von Antigenen und Antikörpern bzw. Bindeproteinen, zu binden ist. Zudem sind die er¬ findungsgemäß in Betracht kommenden Markierungssubstanzen wie auch das Anregungsmittel einfach aufgebaut und für das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren befaßte Personal, insbesondere bezüglich der Freisetzung von giftigen Ver¬ bindungen, unbedenklich. Die damit hergestellten Konjugate beziehungsweise Komplexe sind relativ stabil, was für die Verfahrensführung von Vorteil ist.

Der mit der Erfindung erzielbare technische Erfolg muß als außergewöhnlich überraschend angesehen werden. So zeigt zum Beispiel das Fluoreszein beziehungsweise dessen Deriva¬ te nach der Bindung an einen der Reaktionspartner einer serologischen Reaktion eine wesentlich höhere Empfindlich¬ keit als die entsprechende ungebundene Verbindung. Die Zahl der ausgesandten Photonen des chemoloumineszierenden Konjugats bzw. des chemolumineszierenden Komplexes ist etwa 1000 mal höher als die Zahl der Photonen, die von der jeweils ungebundenen Substanz ausgesandt werden. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, daß in Journal of Physical Chemistry, Vol. 78 _. / Nr. 17, S.1681- 1683 (1979) ausdrücklich darauf hingewiesen wird, daß

OMFI

zur Erzielung einer meßbaren Photonenausbeute eine un¬ verhältnismäßig große Menge an Fluoreszein oder Fluores- zeinisothiocyanat eingesetzt werden muß. Dieses hat die Fachwelt bisher davon abgehalten, Fluoreszein bzw. seine g Derivate im praktischen Rahmen zur Durchführung serologi¬ scher Assays auf der Grundlage einer Che olumineszenz- messung heranzuziehen.

Nachfolgend soll die Erfindung noch näher anhand von Bei- spielen erläutert werden.

B e i s p i e l 1

Bestimmung der Nachweisgrenzen von reinem Fluoreszein- isothiocyanat (FITC) und Bestimmung der Nachweisgrenze eines FITC-Konjugats

Um die Nachweisgrenze von reinem FITC zu bestimmen, wurde 1 mg FITC in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. An- schließend wurde die Extinktion einer 1 : 1OO-Verdünnung bei 495 nm im Photometer gemessen. Von der Ausgangslösung wurden weiterhin 10 Verdünnungen (5-er Schritte) angelegt und jeweils 20 μl davon in einem handelsüblichen Photo¬ meter gemessen. Zu Beginn der Messung wurden 100 μl ei- ner 2 gew.-%igen Calciumhypochloritlösung in die zu mes¬ sende Probe injiziert. Das Ergebnis der Meßreihen ergibt sich aus der folgenden Zahlenreihe.

Menge an FITC in ng/ml gemessene Photonen/sec

20 000 18 101

4 000 8 485

800 2 748

. 160 735

32 394

Der Leerwert des Geräts bei Messungen ohne FITC lag unter diesen Bedingungen im Höchstfall bei 380 Photonen/sec. Daher liegt die Nachweisgrenze für reines FITC bei 32 ng/ l.

Urn _^ die Nachweisgrenze von an Protein gebundenem FITC zu bestimmen, wurde das FITC an Immunglobolin G von der Zie¬ ge nach der Methode von B.T. Wood, S.H. Thomson und G. Goldstein, beschrieben in Journal of Immunology 9_5 (1964) , S. 225, gebunden. Von dem derartig hergestellten chemolumineszierenden Konjugat wurde ebenfalls die Ex¬ tinktion bei 495 nm im Photometer gemessen und so die Menge an gebundenem FITC bestimmt. Anschließend wurde ebenfalls eine Verdünnungsreihe von 10 Verdünnungen an- gelegt und die Chemolumineszenz einer 20 μl-Probe jeder Verdünnung gemessen. Das Ergebnis der Meßreihe ist in der folgenden Zahlenreihe dargestellt.

Menge an FITC in ng/ml gemessene Photonen/sec 1 000 547982

200 112895

40 34683

8 9914

1,6 3835 0,32 1 513

0,064 822

0,0128 378

Die Nachweisgrenze für das FITC-Protein-Konjugat lag dem¬ zufolge bei 0,064 ng/ml. Daraus ergibt es sich, daß die FITC-Ko jugate außergewöhnlich gut für den Nachweis von Antigenen, Antikörpern bzw. deren Komplexen über eine serologische Reaktion mittels Chemolumineszenz geeignet sind.

B e i s p i e l

Photonenausbeuten bei der Verwendung von Methylenblau oder Thionin als Markierungssubstanz.

Methylenblau und Thionin wurden .in einem Volumen von je¬ weils 20 μl in den aus der nachfolgenden Tabelle ersichtli¬ chen Mengen vorgegeben. Die Anregung von Methylenblau er¬ folgte durch eine Zugabe von jeweils 100 μl einer wäßrigen Chloramin T-Lösung (16 mg/ml) und 100 μl einer 10 vol.-%igen Wasserstoffperoxidlösung. Die Anregung von Thionin erfolgte durch eine Zugabe von 20 μl einer wäßrigen Chloramin T-Lö¬ sung (20 mg/ml) und 100 μl einer 5 vol.-%igen Wasserstoff¬ peroxidlösung. Dabei wurden bei einer Reaktionszeit von 30 Sekunden die aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlichen vorzüglichen Photonenausbeuten gemessen.

Markierungssubs .tanz Menge Photonen/30 sec

Methylenblau 20 ng 21 963

II 2 ng 1 237

II 0,2 ng - 0

Thionin - 2000 pg 990 000

II 200 pg 780 000

20 pg 210 000

II 2 pg 33 000

0,2 pg 10 000

Anmerkung: Der Leerwert betrug im Falle des Thionins 1700 Photonen.

Es wurde ferner die Photonenausbeute bei der Verwendung von Thionin, angeregt mit H-O-/Chloramin T, gemessen, wobei die Konzentration der beiden Bestandteile des kombinierten An¬ regungsmittels verändert wurde. Dabei wurden jeweils 2

1 pg Thionin in 20 μl destillierten Wassers vorgegeben. Die ermittelten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zu¬ sammengestellt. Der jeweilige Leerwert ist in Klammern ge¬ setzt.

5

20 mg/ml CT 40 mg/ml CT 60 mg/ml CT 80 mg/ml CT

30%iges 15 100 15500 21 000 25 400 ^~ °2 (2 000) (4 300) (8 000) (12 000)

10 20%iges 15600 23 300 29 000 36 000

^~ °2 (1 950) (6 800) (8300) (15 000)

10%iges 44 000 61 800 65 000 77 000

^~ > (1 700) (7 800) (18000) ( 26000)

5%iges ^• 76 000 103 000 101 000 121 000 (1 600) ( 9 100) (24 000) (45 000)

20

B e i s p i e l

Nachweis von Antikörpern gegen Rinderserumalbumin (BSA) in einem Kaninchenserum

25

An eine flexible Mikrotiterplatte wurde BSA absorbiert. Dazu wurde das BSA in einer Menge von 0,1 mg/ml in einer Lösung, die mit einem Natriumcarbonat-Puffer auf den pH-

30 Wert von 9,6 gepuffert worden war, gelöst. Davon wurden je 100 μ.1 in einem Napf der Mikrotiterplatte pipettiert.

35

Anschließend wurde die Platte 16 h lang bei .4 C inkubiert. Nach Absaugen und dreimaligem Waschen der Platte mit ei¬ ner Phosphat-gepufferten Salzlösung eines pH-Wertes von 7,4, die 1% Sorbimacrogollaurat (vgl..Römpp' s Chemielexi- kon, ^" 7. Auflage, 1967, Bd. 6, S. 3711, 1. Sp. unter T.20) enthält, wurde eine Verdünnungsreihe des Kaninchens.erums in die Näpfe gegeben und 90 min lang bei 37 C inkub'i'ert. Nach Absaugen und erneutem dreimaligen Waschen der Platte wurde jeder Napf mit 100 μl eines FITC-markierten Anti- Kaninchenserums inkubiert (90 min bei 37°C) . Nach erneu¬ tem dreimaligem Waschen wurden die einzelnen Näpfe aus¬ geschnitten und die Chemolumineszenz in einem handelsübli¬ chen Photometer gemessen. Dieses Mal wurde die Chemolu¬ mineszenz durch Zugabe von 100 μl H-O- (30%ig) und 100 μl Chloramin (79 mg/ml) ausgelöst. Das Ergebnis der Messung ergibt sich aus der anliegenden Figur. Die Zahlenwerte an der Ordinate geben die Anzahl der gemessenen Photonen an. Die Zahlenwerte an der Abszisse drücken den Verdün¬ nungsgrad des Kaninchenhyperimmunserums aus, während es sich bei dem Leerwert um einen Wert handelt, der in spe¬ zieller Weise ermittelt wurde. So wurden von mehreren Leerwerten die Durchschnittsleerwerte X ermittelt und zu diesem das Produkt aus 2,58 x 6 addiert, wobei der Faktor $' die Standardabwe ^' ichung darstellt. Die Figur zeigt, daß der Grenztiter des Kaninchenserums bei etwa 1:32788 liegt. Das gleiche Kaninchenserum hatte im Festphasenradioimmunoassay einen Grenztiter von 1:4096 und im ELISA einen Grenztiter von 1:512.

Gleichermaßen gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn das Anti-Kaninchenserum mit Methylenblau oder mit Thionin das mit Hilfe von (N-Äthyl-N* -(3-dimethylamino-propyl) - carbodiimid-Hydrochlorid gekoppelt ar^ markiert wurde.