Es ist notwendig, die Wirkung von in der Umwelt vor ^¬ handenen Chemikalien auf Lebewesen, insbesondere auf Wirbel ^¬ tiere, regelmäßig zu untersuchen. Dabei kann unter anderem un ^¬ tersucht werden, ob Chemikalien und/oder deren Abbauprodukte beispielsweise eine Wirkung auf das endokrine System haben.

Zahlreiche Untersuchungen haben in diesem Zusammen ^¬ hang bereits gezeigt, dass insbesondere Östrogeneffekte durch eine Interaktion von Chemikalien mit den Östrogenrezeptoren bei Wirbeltieren, im Speziellen bei Fischen, vorgetäuscht wer ^¬ den, so dass es z.B. zu Reproduktionsstörungen bei männlichen Fischen nach Exposition mit Abwässern kommt.

Im Rahmen dieses Umweltmonitorings, welches nach ge ^¬ nauen Vorgaben von OECD Testguidelines erfolgt, wird zur Zeit nach gängigen Testverfahren eine immunologische Erfassung des Vitellogenins mittels Antikörpern durchgeführt, wobei aus Ganzkörperhomogenaten oder im Blutserum/-plasma von Testfi ^¬ schen die paradoxe Induktion von Dotterproteinen (Vitel ^¬ logenin) bestimmt wird. Dieses Verfahren wird z.B. beschrieben in dem Abschlussbericht BMBF-Förderkennzeichen 02WA9981/9 des Hessischen Landesamtes für Umwelt und Geologie, Februar 2003. Bei eierlegenden Tieren ist Vitellogenin ein Eidot ^¬ ter-Vorläuferprotein, welches durch Östrogene Induktion wäh ^¬ rend der Hauptphase des Oozytenwachstums in der Leber gebildet wird. Dieses Dotterprotein wandert im Blutstrom der weiblichen Fische zu den Ovarien, zerfällt dort in andere Dotterproteine, die später als Nahrungsvorrat für die sich entwickelnden Fi ^¬ schembryos im Ei dienen. Kommt es nun durch Xenoöstrogene in Gewässern zu einer künstlich induzierten Vitellogenin-Synthese in männlichen und jungen Fischen, z.B. durch Verunreinigung des Gewässers mit Klärschlämmen, dann sind Reproduktionsstö ^¬ rungen bei diesen Fischen die Folge.

Mit Hilfe der bislang verwandten Vitellogenin-Tests kann bei Fischen der Östrogenstatus bestimmt werden, der Sta ^¬ tus der sexuellen Entwicklung, die Identifizierung der Ge ^¬ schlechter, wenn kein Geschlechtsdimorphismus vorhanden ist, es kann der Nachweis von östrogener Wirkung bei natürlichen oder anthropogenen Substanzen oder Chemikalien geführt werden sowie eine Untersuchung von Gewässern oder Abwässern auf öst- rogenwirksame Substanzen erfolgen. Die bislang bekannten Testverfahren sind jedoch für die in der Chemikalientestung oder im Umweltmonitoring ge ^¬ bräuchlichen Testfische destruktiv.

Außerdem bedingen die konventionellen Tests immer eine gesonderte Durchführung und erfordern damit einen erhöh- ten Tierverbrauch in der Chemikalientestung.

Zudem kann die gewünschte paradoxe Induktion von Vi ^¬ tellogenin nach längerer Exposition über Rückkopplungsmecha ^¬ nismen gehemmt werden, so dass die konventionellen Tests wenig sensitiv sind. Ferner ist die Erfassung der Östrogenen Wirksamkeit aufgrund der Destruktivität der herkömmlichen Verfahren nur durch eine Vitellogenin-Bestimmung am Ende der Expositionszeit eines subletalen Langzeittests möglich. Dies erschwert die Kopplung von Langzeittests zur Erfassung der allgemeinen chro ^¬ nischen Toxizität mit der Bestimmung dieses wirkungsspezifi- sehen Endpunktes.

Nachteilig ist ebenfalls bei den bisher verwendeten Testverfahren, dass die Matrix, aus der die Bestimmung er ^¬ folgt, nur schwer zu definieren ist und großen Schwankungen unterliegt. Gerade bei der Entnahme von Blutproben kommt es häufig zu Kontaminationen durch Gewebsflüssigkeit.

Auch sind die Probenvorbereitung wie die Serumgewin ^¬ nung oder Herstellung geeigneter Homogenate bislang sehr auf ^¬ wändig und kaum standardisierbar.

Vitellogenin ist ein sehr instabiles Protein. Sowohl das Protein als Zielanalyt in seiner biologischen Matrix (in der Probe) , als auch Standardlösungen mit definierten Protein ^¬ gehalten zerfallen. Konventionelle Tests eignen sich daher nicht für eine absolute Quantifizierung, da auch Bruchstücke immunologisch erfasst werden. Schließlich sind die bekannten konventionellen Tests in der Regel nur für eine geringe Zahl sehr nahe verwandter Spezies anwendbar.

Vor diesem Hintergrund ist die Aufgabe des offenbar ^¬ ten erfinderische Verfahren zur Bestimmung von Vitellogenin als Biomarker bzw. Endpunkt für eine exogene Östrogene Wirkung auf Fische ein nicht-destruktives Verfahren zu schaffen, bei welchem die Versuchstiere nicht getötet werden müssen. Das Verfahren soll hierbei auch keinen zusätzlichen Verbrauch von Versuchstieren zur Durchführung von Tests auf Östrogene, anti- Östrogene und endokrine Disruptoren erfordern. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Vitellogenin als Biomarker bzw. Endpunkt für eine exogene Öst ^¬ rogene Wirkung auf Fische umfasst die Verfahrensschritte der a) Abnahme einer Hautschleimprobe eines Fisches durch Ab ^¬ streichen, b) Überführung der Hautschleimprobe in ein Reaktionsge ^¬ fäß, c) Homogenisieren der Hautschleimprobe, d) Entnahme eines Aliquots der Hautschleimprobe zur Vi- tellogeninbestimmung mittels eines ELISA Nachweisver ^¬ fahrens .

Es handelt sich demnach um ein nicht-destruktives Verfahren, bei welchem die Versuchstiere nicht getötet werden müssen und auch kein zusätzlicher Verbrauch von Versuchstieren zur Durchführung von Tests auf Östrogene, antiÖstrogene und endokrine Disruptoren erforderlich ist.

Nach einer Expositionszeit von 4-7 Tagen kann die Wirksamkeit der exogenen Noxe (schädliche Substanzen) zum Zeitpunkt der maximalen Induktion von Vitellogenin und damit der optimalen speziesspezifischen Sensitivität erfasst werden.

Die Östrogene Wirksamkeit kann als zusätzlicher End ^¬ punkt, also gekoppelt an subchronische Langzeittests wie OECD 215, oder in subletalen Konzentrationen des Akuttests OECD 203 getestet werden. Es ist hierfür kein zusätzlicher experimen ^¬ teller Aufwand erforderlich.

Die im offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren of ^¬ fenbarte Matrix ist im Gegensatz zu konventionellen Tests gut definiert. Die Proben müssen nicht von Nicht-Zielgeweben wie Blut, Lymphe, Epithelien u.a. separiert werden.

Auch sind keine aufwändigen Probenvorbereitungen notwendig . Zweckmäßigerweise wird in einer Erweiterung des Ver ^¬ fahrens ein weiteres Aliquot der homogenisierten Hautschleim ^¬ probe als Parallelprobe entnommen und eine weitere Vitel- logeninbestimmung durch ein ELISA Nachweisverfahren durchge ^¬ führt. Auf diese weise wird der erste Nachweise an dieser Pa- rallelprobe überprüft und eine höhere Sicherheit in Bezug auf die Ergebnisse des Nachweisverfahrens erreicht.

Ein weiteres Aliquot der homogenisierten Haut ^¬ schleimprobe kann in einer vorteilhaften Verfahrenserweiterung entnommen und eine Gesamtproteinbestimmung durchgeführt wer- den, da so eine Bestimmung der Relation des Gesamtproteinge ^¬ haltes zum zuvor bestimmten Vitellogeningehalt der Haut ^¬ schleimprobe möglich wird, die weitere Aufschlüsse gibt. Diese Gesamtproteinbestimmung kann hierbei sowohl bei einem Verfah ^¬ ren nach dem Hauptanspruch wie auch bei einem Verfahren in Kombination mit der Parallelprobe nach Anspruch 2 erfolgen.

Die Abnahme der Hautschleimprobe des Fisches kann hierbei sinnvollerweise mittels eines forensischen Swabs mit Sollbruchstelle erfolgen. Die Verwendung des Swabs mit Soll ^¬ bruchstelle hat hierbei insbesondere in Kombination mit einem Verfahrensablauf Vorteile, bei dem der forensische Swab als Rührkörper im Reaktionsgefäß beim Homogenisieren der Haut ^¬ schleimprobe verbleibt. Hier kann zweckmäßigerweise ein

Microreaktionsgefäß Verwendung finden. Es hat sich zudem als für das Verfahren sehr vor ^¬ teilhaft ergeben, dass die Hautschleimprobe in ein Reaktions ^¬ gefäß mit proteinstabiliserendem Puffer überführt wird. Durch die Verwendung geeigneter Puffer wird dem Zerfall des Proteins vorgebeugt, wodurch der Test für eine größere Anzahl von Spe ^¬ zies (taxonomischen Gruppen) wie z.B. Karpfenartige, anwendbar ist .

Ein weiterer zweckmäßiger Aspekt des Verfahrens ist, dass die Abnahme der Hautschleimprobe auf der dorsalen Körper- region des Fisches erfolgt. Es hat sich ergeben, dass diese

Körperregion des Fisches für die Entnahme der Hautschleimprobe in besonderem Maße geeignet ist.

Für die Durchführung des Nachweisverfahrens nach der Homogenisierung der Probe hat sich als vorteilhaft erwiesen, das Aliquot zur weiteren Bestimmung auf eine Mikrot iterplatte zu überführen. So ist eine labortechnisch standardisierte Aus ^¬ wertung leicht möglich. Dies gilt insbesondere für das ange ^¬ sprochene ELISA Verfahren als antikörperbasiertes Nachweis ^¬ bzw. Immunassay-Verfahren basierend auf einer enzymatischen Farbreaktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist getestet und ge ^¬ eignet insbesondere für karpfenartige Fische, für barschartige Fische und für lachsartige Fische, wobei bei den karpfenarti ^¬ gen Fischen solche der Art Karpfen (Cyprinus carpio), Gold- fisch (Carrasius auratus) , Plötze (Rutilus rutilus) , Zebra ^¬ fisch (Danio rerio) , Dickkopfelrit ze (Pimephales promelas) o- der Reisfisch (Oryzias latipes) offenbart werden.

Für die barschartigen Fische wurden vorteilhafter ^¬ weise Fische der Art Flußbarsch (Perca fluviatilis ) , Tilapia (Oreochromis niloticus), Stichling (Gasterosteus aculeatus) oder australische Regenbogenfische (Melanotaenis spec.) einge- setzt und bei den lachsartigen Fischen kamen vorteilhafter ^¬ weise solche der Art Bachforelle (Salmo trutta forma fario) , Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) oder Saibling (Sal ^¬ velinus alpinus) als geeignete Versuchstiere zum Einsatz. Das offenbarte erfindungsgemäße Verfahren kann unter anderem eingesetzt werden für den Nachweis von Östrogenen Wir ^¬ kungen in Laborversuchen als zusätzlicher Endpunkt in Stan ^¬ dardverfahren, zur Bestimmung der Laichreife von weiblichen karpfenartigen Fischen und zur Erfassung der Exposition gegen- über Östrogen wirksamen Umweltnoxen im Freiland. Auch eine Er ^¬ fassung einer Störung der Geschlechtsreife durch antiÖstrogene Umweltnoxen im Freiland ist mit diesem Verfahren einfach mög ^¬ lich.