Bedingt durch die Zunahme an Wissen und Fertigkeiten in der in vitro-Fertilisationstechnik ist der Bedarf an verlässlichen und auch kostengünstigen Fertilisationsbestimmungsmethoden stark ge- stiegen. Dabei geht es aber nicht nur um die prinzipielle Diag- nose von Fertilisationsstörungen, sondern in zunehmendem Maße auch um die Detektion von Fertilisationsgraden und die Bestimmung der Befruchtung und/oder Einnistung der befruchteten Oozyten.

Leptin wurde 1994 als zentrales, hungerregulierendes Stoffwech- selhormon entdeckt und mit weiteren multiplen Funktionen verbun- den. So konnte in einer Reihe von Untersuchungen die Bedeutung dieses Hormons für die Reproduktion bei Tier und Mensch gezeigt werden, wobei Funktion und Regulation von Leptin im Rahmen der Reproduktion noch nicht im Detail geklärt sind.

Leptin ist ein 16 kD-Protein aus der Zytokinfamilie (Zhang Y. et al., Nature 1994,372, S. 425-432) und wird von Adipocyten syn- thetisiert und sezerniert (R. V. Considine et al., J. Clin. Invest 1995,95,2986-2988). Leptin zirkuliert im Blut und ist gebunden an seinen löslichen Rezeptor (G. H. Lee et al., Nature 1996, 379, 632-635). Ein weiterer Rezeptor OB-Rs ist für den Transport von Leptin über die Blut-Hirnschranke verantwortlich (L. A. Tartaglia, Cell 1995,83,1263-1271). Im Hungerzentrum des Hypothalamus bindet Leptin an seinen langen, signalübertragenden Rezeptor OB- RL (H. Chen et al., Cell 1996,84,491-495), wodurch hier die Produktion des Neuropeptids Y (NPY) gehemmt wird (T. W. Stephens et al., Nature 1995,377,530-532). Dadurch sinkt das Hungerge- fühl und steigt der Grundumsatz im Körper. Letztendlich kommt es zu einem Gewichtsverlust, vor allem zu einer Abnahme des Körper- fettanteils (M. A. Pelleymounter et al., Science 1995,269, 540- 543, und J. L. Halaas et al., Science 1995,269, 543-546).

Seit der Entdeckung von Leptin 1994 wurde diesem Hormon stets auch eine Bedeutung für die Fortpflanzung zugeschrieben. Im Maus- modell sind weibliche Tiere, die kein Leptin produzieren, un- fruchtbar (A. M. Ingalls et al., J. Hered 1950,41,317-318). Wird ihnen jedoch Leptin zugeführt, entwickeln diese anatomisch und funktionell normale Fortpflanzungsorgane (F. F. Chehab et al., Nature Genet. 1996,12,318-320, und K. Mounzih et al., Endocri- nol. 1997,138,1190-1193). Ein normaler Zyklus stellt sich ein, sodass es regelmäßig zu Eisprung und Befruchtung kommen kann.

Schwangerschaften werden wieder problemlos ausgetragen. Bis heute ist nicht bekannt, inwieweit Leptin direkt oder indirekt über die hypothalamo-hypophysäre Achse die Reproduktionsorgane beeinflu$t.

Die Bedeutung von Leptin für die Reproduktion beim Menschen ist ebenfalls noch völlig unklar. Rezeptor OB-R für Leptin wurde erstmals 1996 durch Northern-Blot-Analyse im Ovar nachgewiesen (J. A. Cioffi et al., Nature Med. 1996,2,585-589), woraufhin eine mögliche Bedeutung dieses Hormons für die Fortpflanzung beim Menschen postuliert wurde. In weiterer Folge wurde der kurze Leptin-Rezeptor OB-Rs in Granulosa-und Cumuluszellen gefunden.

Sowohl Leptin als auch Leptin-m-RNA konnten in Granulosa-und Cumuluszellen des Ovars mittels RT-PCR-Analyse und Immunfluores- zenz nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde in reifen menschlichen Eizellen nur Leptin, nicht jedoch Leptin-m-RNA ge- funden (J. A. Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997,3, 467-472).

Es wurde postuliert, dass Leptin, das in den Granulosazellen des Ovars produziert wird, in die Eizelle pinocytotisch aufgenommen und darin in bestimmten Bereichen peripher und polarisiert ange- reichert wird. Nach der Befruchtung und weiteren Entwicklung fin- det sich Leptin in einigen Zellen des Präimplantationsembryos ge- meinsam lokalisiert mit STAT 3, einem Schlüsselprotein der intra- zellulären Signalübertragung und Transkription. Man nimmt an, dass Leptin an der Aktivierung dieses Transkriptionsfaktor betei- ligt ist und damit die embryonale Genexpression beeinflußt (M.

Antzcak et al., Mol. Hum. Reprod. 1997,3,1067-1086). Eine wei- tere wichtige physiologische Funktion von Leptin beruht auf sei- ner Wirkung auf die Steroidhormonsynthese des Ovars, wobei hohe Konzentrationen an Leptin eine Hemmung der 17ß-Östradiolsynthese in Granulosazellen verursachen, und damit die normale Funktion des Ovars beeinträchtigen können (R. J. Zachow et al., Endocrinol.

1997,138 (2), 847-850). Bei Patienten mit polycystischem Ovarial- syndrom (PCO) sind Interfertilität und Übergewicht in funktionel- lem und kausalem Zusammenhang mit erhöhten Leptinwerten gebracht worden (D. Micic et al., Gynecol. Endocrinol. 1997,11 (5), 315- 320).

In der WO 98/33865 werden Screening-Verfahren für Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, durch Messung von aus Nicht- Fettgewebe stammendem Leptin vorgeschlagen. Weiters wurde in dieser WO-Schrift auch erkannt, dass die Leptinmenge im Plasma von schwangeren Frauen im Vergleich zu der Menge, die auf Grund des Körpermasseindex (BMI) von nicht schwangeren Frauen zu erwar- ten wäre, deutlich erhöht ist und Werte aufweist, die etwa der Leptinmenge im Plasma von Übergewichtigen entsprechen. Demgemäß wird ein Schwangerschaftstest vorgeschlagen, bei welchem Schwan- geren, die in der 8. bis 36. Schwangerschaftswoche sind, Proben aus Nicht-Fettgewebe entnommen und die enthaltene Leptinmenge be- stimmt wird. Der ermittelte Leptingehalt wird dann mit dem Lep- tingehalt einer Nicht-Schwangeren, die das gleiche Alter und den gleichen Körpermasseindex hat, verglichen, um das-Vorhandensein einer Schwangerschaft festzustellen.

Gerade in der Reproduktionsmedizin ist es aber erforderlich, noch vor der eigentlichen Schwangerschaft Anhaltspunkte für die Ferti- lität, z. B. fü die Chancen bzw. Erfolgsaussichten eines Embryo- transfers, zu erhalten. Weiters besteht Bedarf nach einer Metho- de, mit der der Zeitraum im Rahmen einer assistierten reproduk- tionsmedizinischen Behandlung überwacht werden kann.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher im Zurverfü- gungstellen einer völlig neuartigen Fertilitätsbestimmungsmetho- de, mit der-neben einer"natürlichen"Fertilitätsbestimmung im Rahmen eines normalen Zyklus-u. a. diese Anhaltspunkte gegeben und diese Überwachung gewährleistet werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, welches sich dadurch auszeichnet, dass -einem Säugetier Körper-oder Organflüssigkeit entnommen wird, -der Leptingehalt in dieser Körper-oder Organflüssigkeit be- stimmt wird und -der ermittelte Leptingehalt mit einem Referenzwert zur Be- stimmung der Fertilität verglichen wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkennt- nis, dass die Leptinkonzentration in den verschiedenen Körper- oder Organflüssigkeiten, wo Leptin vorhanden ist, direkt mit Fer- tilitätseigenschaften korreliert. Diese Korrelation beschränkt sich nicht nur auf das Vorhandensein von Fertilitätsstörungen, sondern ist auch zur Diagnose von Fertilitätsschwankungen oder zur Kontrolle des Ereignisses der Einnistung eines Embryos im Zuge einer in-vitro-Fertilisierung möglich. Erfindungsgemäß hat sich sogar gezeigt, dass neben der Detektion von Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten aber die erfindungsgemäße Methodologie zur Bestimmung des Leptingehaltes sogar eine Aussage hinsichtlich des Reifungsgrades von Oozyten möglich ist.

Im Gegensatz zum Schwangerschaftstest gemäß der WO 98/55865 be- ruht die vorliegende Erfindung daher auf der Erkenntnis, dass die Fertilitätseigenschaft (und nicht die Schwangerschaft) direkt mit dem Leptingehalt korreliert, also zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt, als die Methode gemäß der WO 88/55865, einsetzt : Wäh- rend die Schwangerschaftsbestimmung gemäß der WO 88/55865 ab der 8. Schwangerschaftswoche für möglich beschrieben wird, setzt der erfindungsgemäße Test bereits lange vor dem Eintritt der Schwan- gerschaft ein, z. B. im Rahmen einer normalen Zyklusüberwachung oder einer assistierten Reproduktionsmedikation, und schließt mit der erfolgreichen Embryoeinnistung ab (also 0., 1. oder 2.

Schwangerschaftswoche).

Die vorliegende Erfindung kann in der Humanmedizin, insbesondere bei der Überwachung von in vitro-Fertilisationen oder bei Ferti- lisationsdiagnosen und-gutachten, eingesetzt werden. Sie hat aber auch enorme Einsatzmöglichkeiten im Rahmen der modernen Tierzucht, da sie sich in einfacher Weise standardisieren lässt und keine komplizierten Laboreinrichtungen zur Durchführung des Tests erforderlich sind.

Leptin ist in vielen verschiedenen Körper-oder Organflüssigkei- ten vorhanden und es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass der Leptingehalt in all diesen Flüssigkeiten mit den Fertilitätsei- genschaften korreliert. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Leptingehalt aber vorwiegend in Körper-oder Organflüssigkeiten bestimmt, die sich durch einen hohen physiologischen Leptingehalt auszeichnen, wie z. B. Serum, Follikel-oder Samenflüssigkeit. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren mit anderen Körper- oder Organflüssigkeiten, wie etwa Cerebrospinalflüssigkeit, durchzuführen, da auch die Konzentration von Leptin in diesen anderen Flüssigkeiten in Bereichen liegt, die hinsichtlich der möglichen Leptin-Nachweisgrenze in der Regel keine Probleme mit sich bringt.

Die Art und Weise, wie das erfindungsgemäße Verfahren in der Pra- xis durchgeführt wird, ist vollkommen beliebig, vor allem, was die Art der Entnahme der Körper-oder Organflüssigkeit oder die Bestimmung des Leptingehaltes anbelangt. Beispielsweise kann der Leptingehalt immunologisch, elektrophoretisch oder chromatogra- phisch bestimmt werden. Immunologische Bestimmungsverfahren für Leptin werden erfindungsgemäß oft bevorzugt, da nicht nur eine Reihe verschiedener monoklonaler Antikörper gegen verschiedenste Epitope von Leptin zur Verfügung stehen, sondern weil sich gerade immunologische Tests, etwa in Form von Standard-ELISA-Tests leicht derart konzipieren lassen, dass sie auch ohne aufwendiges Laborinstrumentarium durchgeführt und ausgewertet werden können (etwa in Kombination mit kolorimetrischen Nachweisverfahren). Da- durch ist es möglich, das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren auch in einer für Laien durchführbaren Form zur Verfügung zu stellen. Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß freies Leptin in der Probe bestimmt.

Als Referenzwert wird üblicherweise ein Leptin-Normalwert fur die jeweilige Körper-oder Organflüssigkeit herangezogen. Dieser kann beispielsweise in Form von Vergleichswerten, Vergleichskurven oder Vergleichstabellen beim erfindungsgemäßen Verfahren heran- gezogen oder-was generell bevorzugt wird-durch gleichzeitige Bestimmung einer Referenzprobe (mit definiertem Leptingehalt) zu- sammen mit der Probe der entnommenen Körper-oder Organflüssig- keit erhalten werden. In letzterem Fall wird der wahrscheinlich nie ganz auszuschaltende systematische Fehler, den unterschied- liche Bestimmungsmethoden bzw. unterschiedliche Bestimmungsbedin- gungen mit sich bringen können, von vornherein hintangehalten.

Dies kann vor allem bei Bestimmungen, wo es nur um graduelle Un- terschiede im Leptingehalt geht (etwa bei Bestimmung des Rei- fungsgrades von Oozyten), wichtig sein.

Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäß vermessene Probe nicht nur mit einem Referenzwert, sondern mit zwei oder mehreren Refe- renzwerten verglichen. So kann man beispielsweise neben einem "Normalwert"auch einen anderen Referenzwert bzw. eine Referenz- probe vorsehen, wie etwa eine"pathologische"Referenz oder eine "Schwangerschafts"-Referenz, usw.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist aber jedenfalls das Vorsehen eines Referenzwertes für den Leptingehalt in der entsprechenden Körper- oder Organflüssigkeit, die dem Leptinwert eines Normalpatienten (oder im Falle der Tierzucht der Probe des normalen Tieres) ent- spricht.

Dieser Referenzwert wird bei der Durchführung des erfindungsge- mäßen Verfahrens bevorzugterweise dadurch erhalten, dass parallel zur Fertilitätsbestimmung der Probe der Leptingehalt einer Refe- renzprobe ermittelt wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Bestimmung des Leptingehaltes mittels immunologischer Methoden, insbesondere unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, da hiedurch die Standardisierung sehr effizient zu erreichen ist und auch für verschiedenste Char- gen eines Bestimmungskits die Kompatibilität der ermittelten Da- ten zueinander gegeben ist.

Im Gegensatz zu Schwangerschaftstests, wie auch gemäß der WO 98/55865, bei welchen eine Präimplantationsentwicklung nicht überprüft oder verifiziert werden kann, sondern erst nach rund 3 Wochen (wobei der Schwangerschaftsbeginn nur auf Grund des Aus- bleibens der letzten Regelblutung abgeschätzt wird) kann mit dem erfindungsgemäßen Test bereits in einem früheren Stadium der er- folgreiche Einnistungsprozess verifiziert werden, also bereits in der 0., 1. oder 2. Woche. Diese Verifizierung erfolgt erfindungs- gemäß bereits exakt, während mit einem Schwangerschaftstest auf Grund der oben erwähnten Schätzung immer eine Woche zu spät ge- schätzt wird (dies wird dann durch Ultraschalluntersuchungen kor- rigiert). Eine derartige Korrektur ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr erforderlich, da hierbei der Zeitpunkt der Einnistung des Embryos bzw. des Embryotransfers bekannt ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Leptin zur Bestimmung der Fertilitätseigen- schaft von Säugetieren.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zur Bestimmung der Fertilität von Säugetieren, welche -eine Probe einer Körper-oder Organflüssigkeit eines Sauge- tieres oder ein Gefäß zur Aufnahme der Körper-oder Organ- flüssigkeit, -ein Reagens zur Detektion des Leptingehaltes in der Probe, und -Leptin-Referenzmittel, umfasst.

Wie oben erwähnt, ist die Wahl des Reagens zur Detektion des Lep- tingehaltes selbstverständlich abhängig von der jeweiligen Detek- tionsmethodik. Beispielsweise umfasst das Reagens zur Detektion des Leptingehaltes vorzugsweise einen Antikörper gegen Leptin, insbesondere einen monoklonalen Leptin-Antikörper. Bevorzugter- weise weist dieser Leptin-Antikörper auch weitere Nachweismit- tel, wie etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Grup- pen auf, oder kann durch anderen Detektionsmittel gebunden werden (z. B. durch Sekundär-Antikörper).

Das Leptin-Referenzmittel umfasst bevorzugterweise eine standar- disierte Menge an Leptin, etwa eine Referenzprobe der jeweiligen Körper-oder Organflüssigkeit. Andererseits kann das Leptin-Re- ferenzmittel aber auch aus einem einfachen Vergleichswert oder einer Vergleichstabelle bzw. einer Vergleichskurve bestehen, die bevorzugterweise für die jeweilige Körper-oder Organflüssigkeit und die jeweilige Nachweismethodik standardisiert ist.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer Kit, welcher eine ganze Reihe von standardisierten Leptinproben aufweist, die z. B. eine Eichgerade definieren oder für bestimmte Fertilisationsmerk- male repräsentativ sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäß Kit wer- den bevorzugterweise zur Überwachung von Patienten im Rahmen von Fertilisierungsverfahren, insbesondere bei in vitro-Fertilisie- rung und intrazytoplasmischer Spermien-Injektion, verwendet.

Hierbei ist es erforderlich, bei Testpersonen sehr genau die An- wesenheit oder Abwesenheit von Oozyten sowie deren Qualität für eine erfolgreiche Befruchtung bzw. die Funktionalität von Sper- mien mit einem einfachen Test routinemäßig zu überwachen.

Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung im Rahmen einer assistierten reproduktionsmedizinischen Behandlung ist besonders die Überwachung des Zeitraums, beginnend mit der Niederregulie- rung bis zur Kontrolle der erfolgreichen Embryoeinnistung, we- sentlich. Dieser Zeitraum (Niederregulierung-Stimulation- Punktion-Embryokultur-Embryotransfer in den Uterus-Einnis- ten des Embryos) kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ver- lässlich und eindeutig kontrolliert und observiert werden (also rund 4 Wochen vor bis 2 Wochen nach dem Embryotransfer).

Damit ist erstmals eine prädiktive und prognostische Überwachung bzw. ein prädiktiver und prognostischer Marker für eine Diagnose im Verlauf eines in-vitro-Fertilisationsprogramms möglich bzw. zur Verfügung gestellt. Insbesondere können mit der vorliegenden Erfindung auch die Erfolgsaussichten bereits während der hormo- nellen Stimulation prognostiziert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren setzt demgemäß zu einem viel frü- heren Zeitpunkt an, als der in der WO 98/55865 beschriebene Schwangerschaftstest, und mit einem völlig anderen Ansatz, näm- lich dem des Fertilitätstests. Insbesondere ist auch im Rahmen der erfindungsgemäßen in vitro-Fertilisationsüberwachung auch ge- nau bekannt, wann der Embryo transferiert wird, während dies bei Schwangerschaftstests unbekannt ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt kann mit der vorliegenden Erfindung auch die Fruchtbarkeit bei Spontanzyklen bzw. bei unregelmäßigen Zyklen bestimmt werden. Bevorzugterweise geht man dabei bei der Befruchtung vor allem von den Daten vom normalen Zyklus aus.

Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Tests bzw. der erfindungsgemäßen Kits liegt in der Bestimmung des Rei- fegrades von Oozyten oder Spermien.

Weiters kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungs- gemäße Kit zur Untersuchung von Fertilitäts-und Reproduktions- störungen verwendet werden und ist insbesondere für breite Rei- hentests und zur systematischen Untersuchung von großen Personen- gruppen sehr gut geeignet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den the- rapeutischen Einsatz von Leptin zur Unterstützung der Fertili- tätseigenschaften. Dabei wird z. B. im Zuge von erfindungsgemäßen Überwachungen eines in vitro-Fertilisierungsprogrammes Leptin appliziert, wenn die gemessenen Leptin-Mengen als nicht ausrei- chend für einen erfolgversprechenden Verlauf des Programms ange- sehen werden (z. B. wenn sie, um mehr als 10 %, insbesondere mehr als 30 %, unter dem Normalwert für einen erfolgreichen Verlauf liegen).

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Leptin zur Herstellung eines Mittels zur Verbesserung der Fertilität. Dabei wird eine effektive Menge an Leptin an den Men- schen oder das Tier (Säugetier) verabreicht, um den Leptingehalt auf die erforderlichen Werte zu steigern. Dies ist selbstver- ständlich nicht nur bei in vitro-Fertilisationen möglich, sondern auch im Zuge der Überwachung natürlicher Befruchtungen und Schwangerschaften.

Die vorliegende Erfindung wird an Hand des nachfolgenden Bei- spiels und der Zeichungsfiguren näher erläutert. Es zeigen : Fig. 1 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten von Follikeln unterschiedlicher Größe ; Fig. 2 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten mit und ohne Eizelle ; Fig. 3 : die Korrelation zwischen der Konzentration von Leptin in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und im Serum von Patientin- nen am Tag der Follikelpunktion ; Fig. 4 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration und dem Proteingehalt von Follikelflüssigkeiten großer Follikel ; Fig. 5 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und dem FSH-Spiegel im Se- rum nach hormoneller Stimulation mit rekombinantem FSH ; und Fig. 6 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration Östra- diol (W), Progesteron (A) und Prolactin (A) in Follikelflüssig- keiten großer Follikel.

B e i s p i e Follikelflüssigkeit und Serum 31 Patientinnen für eine IVF. oder ICSI-Behandlung wurden mit Leuprorelinacetat (3,75 mg s. c. ; Enantone Gyn, Takeda) als GnRH- Analogon am 21. Zyklustag"downreguliert"und anschließend mit rekombinantem FSH (Gonal-F, Serono und Puregon, Organon) hormo- nell stimuliert. Die jeweils zu applizierende Dosis von FSH wurde aber Ultraschall und Östradiolbestimmung individuell angepaßt.

Wenn mindestens zwei Follikel einen Durchmesser von 20 mm er- reicht hatten, wurde die Ovulation durch intramuskuläre Gabe von hCG (10.000 IU ; Profasi, Serono) ausgelöst. Etwa 36 Stunden nach hCG-Applikation erfolgte transvaginal die sonographisch gesteuer- te Follikelpunktion mit anschließender mikroskopischer Untersu- chung auf das Vorhandensein von Eizellen in der aspirierten Fol- likelflüssigkeit. Nach Gewinnung der Eizellen wurden die indivi- duellen Follikelflüssigkeiten zentrifugiert und die Überstände bei-196°C für die weiteren Bestimmungen aufbewahrt. Für Serum- untersuchungen wurden die zum Zeitpunkt der Follikelpunktion ab- genommenen Blutproben zentrifugiert und die Seren ebenfalls bei -196°C gelagert.

Leptinbestimmung : Leptin-Konzentrationen wurden radioimmunometrisch bestimmt (Linco Research, St. Charles, MO, USA), wobei ein Antiserum ohne Kreuz- reaktionen mit menschlichem Insulin, Proinsulin, Ratteninsulin, C-Peptid, Glucagon, Pancreas-Propeptid oder Somatostatin zur An- wendung kam. Der Nachweisbereich liegt zwischen 0,5 ng/ml und 100 ng/ml.

Hormonbestimmungen : Östradiol wurde radioimmunometrisch bestimmt (Estradiol MAIA, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien). Follikelflüssigkeit wurde mit Serum postmenopausaler Frauen 1 : 100 verdünnt. Der Östradiol- spiegel dieser Seren wurde von der Konzentration in der Follikel- flüssigkeit abgezogen.

Progesteron wurde ebenfalls radioimmunometrisch bestimmt (Orion Diagnostica, Espoo, Finnland). Follikelflüssigkeit wurde mit dem oben erwähnten Serum 1 : 1000 verdünnt. Prolactin wurde radioimmu- nometrisch mittels RIA-Kit (Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien) bestimmt. Follikelflüssigkeiten wurden mit Null-Standard 1 : 5 verdünnt, um eine nahezu idente Matrix für Proben und Stan- dards zu haben. Messungen der Östradiol-, Progesteron-und Pro- lactin-Werte wurden entsprechend den Anleitungen der Produkther- steller durchgeführt. FSH wurde im Serum am Tag der Punktion radioimmunometrisch bestimmt (FSH Maioclon, Bio Chem Immuno Sys- tems, Bologna, Italien).

Proteinbestimmung : Die Proteinmenge in der Follikelflüssigkeit und im Serum wurde nach der Lowry-Methode (O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem. 1951, 193,265-275) bestimmt, wobei BSA von bekannter Konzentration (1 mg/ml) als Standard verwendet wurde. Alle Proben wurden in Phos- phat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und im Spectro- photometer (Beckman DU 62) bei einer Exzitationswellenlänge von 750 nm gegenüber dem Referenzwert gemessen.

Statistik : Statistische Berechnungen wurden mit Microsoft Excel Version 5. Oa und Origin V 4.1 erstellt. Parametrische Daten wurden mittels "two-tailed t test"bestimmt, Korrelationen mittels Pearson-Kor- relationskoeffizient festgelegt, wobei ein p-Wert <0,05 als sig- nifikant erachtet wurde.

ERGEBNISSE : Die klinischen Daten der Patientinnen sind der Tabelle 1 zu ent- nehmen. Follikelflüssigkeiten aus Follikeln unterschiedlicher Größe dieser Patientinnen wurden getrennt untersucht. Weiters wurde berücksichtigt, ob in der gewonnenen Follikelflüssigkeit eine Eizelle vorhanden war. Die Leptinkonzentration in großen Follikeln (0 >19mm) betrug im Mittel 9,03 +/-5, 15 ng/ml, in mittelgroßen Follikeln ( 16-19 mm) 4,67 +/-2, 96 ng/ml und in kleinen Follikeln ( <16 mm) 3,99 +/-2,19 ng/ml, wobei der Un- terschied in der Leptinkonzentration in großen zu mittleren Fol- likeln (p = 0,02) und kleinen Follikeln (p <0,01) statistisch signifikant war (Fig. 1). In großen Follikeln mit Eizelle war die Leptinkonzentration in der Follikelflüssigkeit höher als in gro- ßen Follikeln ohne Eizelle (10,12 +/-5,67 ng/ml v. s. 7,84 +/- 4,28 ng/ml, p = 0,07) (Fig. 2). Im Serum der Patientinnen war Leptin am Tag der Follikelpunktion etwa doppelt so hoch wie die üblicherweise für unstimulierte Frauen angegebenen Normwerte (12,68 +/-8,98 ng/ml v. s. 5,5 ng/ml, siehe C. Schubring et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1997,82,1480-1483). Im Vergleich von Leptin im Serum mit Leptin in der Follikelflüssigkeit wurde eine statistisch hoch signifikante Korrelation (r = 0,74, p <0,0001) zwischen beiden Parametern (Fig. 3) gefunden. Um festzu- stellen, ob der Leptingehalt in der Follikelflüssigkeit mögli- cherweise mit einer allgemein vermehrten Proteinbiosynthese in Zusammenhang steht, wurde der Gesamtproteingehalt der Follikel- flüssigkeiten bestimmt. Hierbei konnte keinerlei Korrelation zwi- schen Leptin und Proteinspiegel gefunden werden (r = 0,168, p = 0,165) (Fig. 4). Um eine mögliche hormonelle Regulation der Lep- tinproduktion unter Stimulationsbehandlung aufzudecken, wurde in einer Studie die applizierte Menge an rekombinantem FSH mit dem Leptinspiegel sowohl im Serum als auch in der Follikelflüssigkeit verglichen. Dabei zeigte sich, dass keinerlei Korrelation zwi- schen diesen beiden Parametern herzustellen war (Fig. 5). Weiters wurde Östradiol, Progesteron und Prolactin im Serum und in den Follikelflüssigkeiten bestimmt. Es wurde ein Anstieg der Konzen- trationen dieser drei Hormone mit steigendem Durchmesser der Fol- likel (Tabelle 1) festgestellt. Desweiteren wurde gefunden, dass in Follikeln mit Eizelle in der punktierten Follikelflüssigkeit die jeweiligen Hormonwerte höher lagen als in jenen ohne Eizelle (Tabelle 1). Die in den individuellen Follikelflüssigkeiten ge- messenen Hormonwerte korrelierten jedoch nicht mit den entspre- chenden Leptinkonzentrationen (Fig. 5). Ebenfalls konnte keine Korrelation zwischen Östradiol (r = 0,063, p = 0,60), Progesteron (r = 0,058, p = 0,63) und Prolactin (r = 0,172, p = 0,15) im Se- rum und den jeweiligen Leptinwerten in den Follikelflüssigkeiten gefunden werden.

Es konnte daher eindeutig gezeigt werden, dass Leptin in humaner Follikelflüssigkeit vorkommt und von Granulosazellen des Ovars produziert wird (J. A. Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472). Es wird angenommen, dass ein des Leptins von der Folli- kelflüssigkeit in die reifende Oozyte gelangt und dort peripher und polarisiert in das Cytoplasma eingelagert wird (M. Antczak et al., Mol. Hum. Reprod. 1997,3,1067-1086). Patientinnen während einer kontrollierten hormonellen Ovarialstimulation zeigen einen signifikanten Anstieg von Leptin im Serum von Tag drei bis neun des Stimulationszyklus, der bis zum Zeitpunkt der Ovulationsaus- lösung konstant erhöht bleibt (T. Strowitzki et al., Gynecol.

Endocrinol. 1998,12 (3), 167-169). Deutliche Schwankungen der Leptinmenge im Serum von Patientinnen während des normalen Mens- truationszyklus sowie Leptinmangel bei Oligo-und Amenorrhoe signalisieren eine weitere mögliche physiologische Rolle des Leptins für die humane Reproduktion (D. Macut et al., Gynecol.

Endocrinol. 1998,12 (5), 321-326).

Es wurde gefunden, dass sowohl die Menge an Leptin als auch die Konzentration der gemessenen Hormone in der Follikelflüssigkeit mit der Größe und damit dem Reifegrad der Follikel zunimmt. Je- doch konnte keinerlei Korrelation zwischen Leptin und den jewei- ligen Hormonwerten (Stimulation mit rekombinantem FSH ; Konzentra- tion von Östradiol, Progesteron, Prolactin) hergestellt werden, woraus geschlossen werden kann, dass diese Hormone keinen direk- ten Einfluß auf die Leptinmenge in der Follikelflüssigkeit aus- üben. Auch im Serum der untersuchten Patientinnen stellt sich die Leptinmenge als unabhängig sowohl von der Menge an appliziertem, rekombinantem FSH als auch der Konzentration von Östradiol, Pro- gesteron und Prolactin heraus. Dies steht im Gegensatz zu Unter- suchungen an Frauen im Spontanzyklus, bei denen Leptin-und Pro- gesteronmengen im Serum korrelieren (L. Hardie et al., Clin. En- docrinol. 1997,47,101-106). Zusätzlich wurde in Übereinstimmung mit anderen Autoren (J. A. Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3,467-472) gefunden, dass nach kontrollierter hormoneller Sti- mulation bei den untersuchten Patientinnen keinerlei Korrelation zwischen Serumleptin und BMI vorliegt, welches ebenfalls gegen- sätzlich zu hormonell unstimulierten und nicht schwangeren Frauen steht, bei denen eine hoch signifikante Übereinstimmung dieser beiden Parameter besteht (L. Hardie et al., Clin. Endocrinol.

1997,47, 101-106).

Es wurde aber eine hoch signifikante Korrelation zwischen der Konzentration von Leptin in der Follikelflüssigkeit grogner Fol- likel und im Serum gefunden. Daraus kann geschlossen werden, dass unter hormoneller Stimulation sowohl die systemische als auch die ovarielle Produktion von Leptin angeregt wird. Wäre einerseits nur die systemische Produktion von Leptin für dessen Anreicherung verantwortlich, sollte in allen Follikeln ein und derselben Pa- tientin annähernd gleiche Leptinspiegel gefunden werden. Dies ist jedoch nicht der Fall. Würde es sich um eine vorwiegend auf das Ovar bezogene Leptinstimulation handeln, wäre in den Follikel- flüssigkeiten ein bedeutend höherer Leptinwert als im Serum zu erwarten. Auch diese Interpretation würde im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen stehen.

Es konnte eine deutliche Tendenz zu höheren Leptin-, Östradiol-, Progesteron-und Prolactinwerten in Follikeln mit Eizelle in der punktierten Follikelflüssigkeit beobachtet werden. Weiters ist für alle untersuchten Hormone eine kontinuierliche Zunahme der Konzentration mit dem Follikeldurchmesser erkennbar. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass sowohl Leptin, als auch Östradiol, Progesteron und Prolactin für Wachstum und Differen- zierung von Ovarialfollikeln von Bedeutung sind. Es ist jedoch kein direkter Einfluß von Östradiol, Progesteron oder Prolactin auf die Leptinsynthese zu erkennen. Tatsache ist, dass unter hor- moneller Stimulation die Leptinsynthese im Körper deutlich ist, jedoch einem anderen oder zusätzlichen Regulationsmechanismus unterliegt als im Spontanzyklus. Die erfindungsgemäSe Methodolo- gie ist somit als weiteres, unabhängiges und zuverlässiges In- strument zur Fertilitätsbestimmung universell einsetzbar.

T a b e 1 1 e 1 FOLLIKELDURCHMESSER Hormon klein mittel groß groß mit EZ groß ohne EZ (<16mm) (16-19mm) (>19mm) Östradiol 58+/-22 72+/-28 224+/-43 276+/-67 $192+/-46 (ng/ml) Progesteron 2575+/-568 2348+/-682 5718+/-1365 6618+/-1587 5139+/-890 (ng/ml) Prolactin 2,8+/-0,8 4,4+/-1,3 14,0+/-3,7 17,2+/-4,0 12,1+/-3,1 (ng/ml) Leptin 3,99+/-2,19 4,67+/- 9,03+/-5,15 10,12+/-5,67 7,84+/-4,28 (ng/ml) 2,96