Biologische Systeme beruhen auf der Interaktion von biolo- gisch aktiven Makromolekülen, die andere Moleküle über ihre dreidimensionale Oberflächenstruktur sowie eine spezifische elektronische Ladungsverteilung in der Regel reversibel bin- den. Neben reversiblen Bindungen sind kovalente Bindungen zwischen Molekülen bekannt, die genutzt werden, um Moleküle mittels chemischer Methoden an Oberflächen zu binden. Mole- küle, die Bindungsaffinitäten für andere Molekülen besitzen, werden zusammenfassend als Rezeptoren bezeichnet, die eine entscheidende Rolle bei der Wechselwirkung und dem Zusammen- spiel biologischer Systeme spielen. Beispiele für in der Na- tur vorkommende Rezeptoren sind Enzyme, welche die Umsetzung eines bestimmten Substrates katalysieren, Proteine, die den Transport von geladenen Molekülen über eine Biomembran ermög- lichen, durch Zucker modifizierte Proteine (= Glykoproteine), die den Kontakt zu anderen Zellen erlauben, Antikörper, die im Blut zirkulieren und Bestandteile von Krankheitserregern wie Bakterien oder Viren erkennen, binden und inaktivieren.

Im Rahmen biologisch aktiver Systeme wird auch DNA, der Trä- ger der Erbinformation als Rezeptor verstanden. DNA besteht grundsätzlich aus zwei zueinander komplementären Strängen, die über Basenpaarungen und Wasserstoffbrückenbindungen eine Doppelhelix bilden. Jeder einzelne DNA Strang wirkt dabei als Rezeptor für seinen komplementären DNA Strang, der seiner- seits die Funktion des Liganden wahrnimmt.

Alle Moleküle, die von einem Rezeptor spezifisch gebunden werden, werden zusammenfassend als Liganden bezeichnet, wobei von vielen biologisch aktiven Molekülen bekannt ist, dass sie einerseits selbst andere Moleküle binden, anderseits aber auch von Molekülen gebunden werden. Sie sind daher, abhängig von ihrem jeweiligen Bindungspartner, sowohl Liganden als auch Rezeptoren.

Zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Rezeptoren und Liganden wurden eine Vielzahl von Testsystemen (Assays) ent- wickelt, mit deren Hilfe die Konzentration des Liganden in einer Probenlösung qualitativ und/oder quantitativ bestimmt wird. Solche Testsysteme werden aufgrund der großen Spezifi- tät von Rezeptor-Liganden-Komplexen in der Kriminalistik bei der Überprüfung Tatverdächtiger, beim Vaterschaftstest, in der Krebsvorsorge, in der pränatalen Diagnostik, bei der Er- stellung von Stammbäumen in der Wissenschaft und Forschung sowie für die Überprüfung von erfolgreichen Schutzimpfungen verwendet.

Nachdem die vollständigen genomischen DNA-Sequenzen wichtiger Modell-und Forschungsorganismen wie Bakterien (Bacillus sub- tilis, Escherichia coli) und Hefen (Saccharomyces cerevisiae) bereits seit Jahren in Datenbanken vorliegen, wurde zwischen- zeitlich auch die Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des Humangenomprojektes abgeschlossen. Da die Zahl der identifizierten menschlichen Gene sehr viel geringer als ver- mutet ist, gewinnt die Erforschung der Funktion der einzelnen Gene, die in verschiedenen Geweben und Organen unterschied- lich aktiv sind, seither zunehmend an Bedeutung.

Neben der detaillierten Erforschung der DNA ist in der jünge- ren Vergangenheit die Untersuchung des Proteinanteils der Zelle, die auch als Proteomanalyse bezeichnet wird, immer wichtiger geworden. Die meisten pharmazeutisch aktiven Stof- fe, die als Arzneimittel eingesetzt werden, wirken über die Beeinflussung von Proteinen. Solche Interaktionen können

durch DNA Analysen nicht oder nur unzureichend analysiert werden.

Die Aufklärung der differentiellen Genexpression gilt als entscheidend für das Verständnis der Entwicklung vieler Krankheiten. Seit vielen Jahren werden daher vielfältige Ver- suche unternommen, eine möglichst große Zahl von biologisch aktiven Molekülen auf kleinstem Raum künstlich zu syntheti- sieren und anzuordnen, um sie bezüglich ihrer Interaktion mit anderen Molekülen untersuchen zu können. Für den quantitati- ven und qualitativen Nachweis von Interaktionspartnern bzw.

Liganden in einer zu analysierenden Probe, beispielsweise ei- ner Speichel-oder Blutprobe, werden planare Systeme verwen- det, die als Biochips bzw. Biosensoren bezeichnet werden. Die Biosensoren bilden einen Träger, auf dessen Oberfläche eine Vielzahl von rasterartig angeordneten Nachweisbereichen aus- gebildet ist. Bei der Herstellung solcher Biosensoren wurden zunächst die einzelnen Monomere über Mikrodosierung auf die Vielzahl der Einzelbereiche des Rasters aufgetragen, an denen ein Polymer gebildet werden sollte. Dieses Verfahren ist für breit angelegte Screening-Studien nicht geeignet, so dass Systeme zur lichtgesteuerten Polymersynthese unter Verwendung individueller Maskensätze wie aus der Halbleiterindustrie be- kannt, zur Herstellung von Biosensoren verwendet wurden (Pea- se et al. (1994), PNAS, USA, Vol. 91, S. 5022-5026).

Bei den bekannten Testsystemen, die zum Nachweis von Liganden in zu analysierenden Proben verwendet werden, spielt der Nachweis eines auf der Oberfläche eines Biosensors gebildeten Rezeptor-Liganden-Komplexes die entscheidende Rolle. Bei her- kömmlichen Systemen muss für die Konzentrationsberechnung des Liganden eine Kalibrierungskurve erstellt werden, aus der sich indirekt die Zahl der Ligandenmoleküle bzw. deren Kon- zentration bestimmen lässt.

Besonders häufig werden auch Systeme verwendet, bei denen versucht wird, die Liganden in der zu analysierenden Probe

selbst zu markieren. Daran ist insbesondere nachteilig, dass die Reaktion des Liganden mit einem Marker, beispielsweise einem Farbstoff zu einer Konfigurations-oder Konformations- änderung des Liganden und somit zu einer Veränderung seiner Oberflächenstruktur führen kann. Da aber gerade die dreidi- mensionale Oberfläche für die Bindung des Liganden an den auf der Oberfläche des Biosensors fixierten Rezeptor von ent- scheidender Bedeutung ist, liefert die direkte Markierung von Liganden in der Regel keine zufriedenstellenden Ergebnisse.

Als Marker wurden darüber hinaus molekulare Beacons entwi- ckelt, die von Schonfield et al., (1997), Applied and Envi- ronmental Microbiology, Vol. 63, S. 1143-1147 sowie von Ty- agi und Kramer (1996), Nature Biotech., Vol. 14, S. 303-308 beschrieben wurden. Molekulare Beacons sind DNA-Sonden, die eine kurze komplementäre Sequenz von Nukleotiden aufweisen, die an den 5'-und 3'-Enden der Probensequenz angeordnet sind, so dass sich eine Stammstruktur ("Stem-Loop-Struktur") in Lösung bildet. Ein Farbstoff, insbesondere ein Fluorochrom und ein geeigneter Dämpfer ("Quencher") sind über Linker an den Enden des Stem-Loops angeordnet. Diese Stem-Loop-Struktur bildet den Rezeptor, in dem in Abwesenheit eines Liganden das Fluorochrom und der Quencher über die Stammstruktur nahe bei- einander gehalten werden, so dass die Fluoreszenz unterdrückt ist. Wenn jedoch der einzelsträngige Loop mit einer komple- mentären Zielsequenz (= Ligand) interagiert und stabil hybri- disiert, denaturiert die Stem-Loop-Struktur. Dadurch tritt Fluoreszenz auf, weil sich ein stabilerer Hybrid aus Loop und Zielsequenz (= Rezeptor-Liganden-Komplex) ausbildet, der nicht mit der weniger stabilen internen Basenpaarung des Stammhybriden koexistieren kann. Da diese Sonden nur in Anwe- senheit einer Zielsequenz (eines spezifischen Liganden) stark fluoreszieren, können sie in Lösung verwendet werden, ohne dass nicht-hybridisierte Sonde entfernt werden muss. Moleku- lare Beacons sind hochspezifisch, so dass Fluoreszenz voll- ständig unterdrückt wird, wenn die Zielsequenz eine einzige falsche Base in der Oligonukleotidkette aufweist. Nachteilig

an der Verwendung molekularer Beacons ist jedoch, dass sie aufgrund ihres Wirkmechanismus auf den Nachweis von Nuklein- säuren beschränkt sind. Sie können nicht für den Nachweis von anderen Rezeptor-Liganden-Komplexen eingesetzt werden.

Zur Bestimmung anderer Rezeptor-Liganden-Komplexe, insbeson- dere zum Nachweis von Antigen-Antikörperreaktionen werden bisher Biosensoren verwendet, auf denen Rezeptoren immobili- siert sind. Die Menge an gebundenem Rezeptor kann bisher nur unzureichend bestimmt werden. Die Mengenbestimmung beruht in der Regel auf der Messung, wie viel Flüssigkeit beim Druck- prozess des Sensors abgegeben wird. Außerdem kann mit Hilfe verschiedener bekannter Färbetechniken bei einzelnen gedruck- ten Sensoren stichprobenhaft die Rezeptordichte ermittelt werden. Als besonders nachteilig wird dabei empfunden, dass zum Zeitpunkt der Messung der Interaktion zwischen Rezeptor und Ligand keine Aussage über die Menge des immobilisierten Rezeptors auf der Oberfläche des Biosensors möglich ist. Au- ßerdem erlauben herkömmliche Biosensoren keine Messung der Rezeptordichte auf jedem individuellen Sensor und an jedem Messpunkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Zahl von Rezep- toren auf einer Trägeroberfläche vorzuschlagen, bei dem die Menge des tatsächlich immobilisierten Rezeptors exakt be- stimmt werden kann. Darüber hinaus soll der Nachweis eines gebildeten Rezeptor-Liganden-Komplexes spezifisch erfolgen und nicht durch die Wahl des Markers beeinflusst werden.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Bestimmung der Zahl von Rezeptoren auf einem Träger gelöst, bei dem die Re- zeptor-Marker-Komplexe unabhängig von den Rezeptor-Liganden- Komplexen nachgewiesen werden. In dem Verfahren wird zunächst ein Träger bereitgestellt. Auf dem Träger wird wenigstens ein Rezeptor immobilisiert, wobei der Rezeptor die Fähigkeit be-

sitzt mit einem Liganden zu interagieren und einen spezifi- schen Rezeptor-Liganden-Komplex zu bilden.

Unter"Immobilisieren"wird jede dauerhafte Verbindung des Rezeptors mit der Oberfläche bzw. der Struktur des Trägers verstanden. Diese Interaktion kann beispielsweise auf wenigs- tens einer kovalenten Bindung oder wenigstens einer Disul- fidbrücke beruhen. Darüber hinaus sind auch lösbare Verbin- dungen zwischen Rezeptor und Trägeroberfläche denkbar und ge- eignet, wobei ionische Wechselwirkungen vorteilhaft sind, die einfach durch pH-Wert Veränderungen gelöst werden können. Un- ter"Rezeptor-Liganden-Komplex"wird jede Art von Verbindung bzw. Interaktion von Rezeptor und Ligand verstanden. Somit ist der Begriff"Rezeptor-Liganden-Komplex"nicht auf die chemische Definition des Begriffs"Komplex"beschränkt.

Anschließend wird ein Signalmolekül bzw. ein Marker mit dem Rezeptor in Kontakt gebracht, wodurch sich ein Rezeptor- Marker-Komplex bildet. Danach wird die Zahl der Rezeptoren auf dem Träger ermittelt, indem die Rezeptor-Marker-Komplexe nachgewiesen werden.

Dadurch, dass die Rezeptor-Marker-Komplexe unabhängig von den Rezeptor-Liganden-Komplexen nachgewiesen werden, kann die Konzentration des Rezeptors direkt bestimmt werden. Da für gewöhnlich die Bindungskonstante, d. h. die Affinität des Li- ganden zu seinem Rezeptor bekannt ist, kann über die Rezep- torkonzentration und die Bindungskonstante die Konzentration des Liganden in einer zu analysierenden Probe berechnet wer- den. Darüber hinaus kann mit Hilfe dieses Verfahrens der Her- stellungsprozess von Biosensoren überwacht werden, weil feh- lerhaft gedruckte oder immobilisierte Sensoren einfach er- kannt und aussortiert werden können.

Das Immobilisieren des Rezeptors auf dem Träger und das in Kontakt bringen des Markers mit dem Rezeptor kann auch gleichzeitig in einem einzigen Schritt erfolgen. So kann das

Verfahren besonders einfach und schnell durchgeführt werden, was insbesondere bei diagnostischen Routineuntersuchungen und sogenannten Schnelltests, die innerhalb kürzester Zeit ein zuverlässiges Ergebnis liefern müssen, von besonderer Bedeu- tung ist.

Außerdem kann der Marker zunächst mit dem Rezeptor zur Aus- bildung des Rezeptor-Marker-Komplexes in Kontakt gebracht werden. Diese bereits gebildeten Rezeptor-Marker-Komplexe werden anschließend über den Rezeptor auf dem Träger immobi- lisiert. Eine solche Vorgehensweise ist dann vorteilhaft, wenn der Rezeptor-Marker-Komplex besonders stabil ist und durch eine nachträgliche Bindung des Rezeptors an die Träger- oberfläche nicht behindert wird.

Zusätzlich zu den oben genannten Verfahrensschritten kann der Rezeptor mit einer Testprobe in Kontakt gebracht werden, die auf ihren Gehalt an Liganden untersucht werden soll. Die In- kubation des Rezeptors mit der Testprobe kann nach dem Immo- bilisieren des Rezeptors auf dem Träger, aber auch nach dem in Kontakt bringen des Markers mit dem Rezeptor oder nach der Ermittlung der Zahl der Rezeptoren auf dem Träger erfolgen.

Falls der Rezeptor mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird, die auf ihren Gehalt an Liganden untersucht werden soll, ist es vorteilhaft, die gebildeten Rezeptor-Liganden- Komplexe direkt und unabhängig von den gebildeten Rezeptor- Marker-Komplexen nachzuweisen.

Der Träger kann ein Halbleiter sein. Seine Oberfläche kann aus Silizium bzw. Halbmetalloxiden bestehen. Besonders vor- teilhaft sind dabei SiOx oder Aluminiumoxid.

Der im Rahmen der Erfindung verwendete Rezeptor kann jedes Molekül mit einer Bindungsaffinität für einen bestimmten Li- ganden sein. Rezeptoren können natürlich vorkommend oder künstlich erzeugt sein. Sie können ebenso in ihrem natürli-

chen Zustand oder als Aggregate mit anderen Molekülen vorlie- gen. Rezeptoren binden direkt oder indirekt über spezifische Bindungssubstanzen oder Bindungsmoleküle kovalent oder nicht kovalent an den Liganden. Beispiele für Rezeptoren sind Enzy- me, Antikörper, insbesondere monoklonale oder polyklonale An- tikörper sowie funktionellen Fragmenten davon, Antiseren, Proteine, Oligo-und Polypeptide, Zellmembranrezeptoren, Nuk- leinsäuren, insbesondere DNA, RNA, cDNA, PNA, Oligo-und Po- lynukleotide, Zuckerbestandteile wie Saccharide, insbesondere Mono-, Di-, Tri-, Oligo-und Polysaccharide sowie Lecithin, Kofaktoren, zelluläre Membrane, Organelle, sowie Lipide und deren Derivate.

Wesentlich ist, dass Rezeptoren mit den korrespondierenden Liganden durch ihre molekulare Erkennung einen Rezeptor- Liganden-Komplex bilden. Demzufolge sind Liganden Moleküle, die durch einen bestimmten Rezeptor erkannt werden. Auch sie können natürlich vorkommen oder künstlich erzeugt sein. Bei- spiele für bekannte Liganden sind Agonisten und Antagonisten zelluläre Membranrezeptoren, Toxine, virale und bakterielle Epitope, insbesondere Antigene, Hormone (Opiate, Steroide, etc. ), Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate und Kofaktoren.

Obwohl die Bindung zwischen Rezeptor und Ligand im Rezeptor- Liganden-Komplex hochspezifisch ist, kann sie dennoch bei- spielsweise durch die Änderung der Temperatur, des pH-Wertes, der Ionenkonzentration, des Salzgehaltes des umgebenden Mi- lieus oder der Anwesenheit von konkurrierenden Molekülen, lösbar sein.

Falls das Fluorochrom des Liganden eine größere Fluoreszenz- lebensdauer als das Fluorochrom des Markers besitzt, können die Marker hochselektiv voneinander unterschieden werden. Ei- ne ähnliche Wirkung kann durch Verwendung von Farbstoffen mit unterschiedlichen Anregungs-und Emissionsspektren erzielt werden. Falls der Ligand und der Marker an dieselbe Stelle des Rezeptors binden und somit um diese Bindung miteinander

konkurrieren (sogenannter kompetitiver Antagonismus), ist es vorteilhaft wenn der Marker eine geringere Bindungsaffinität zu dem Rezeptor aufweist.

Die Bindung zwischen Rezeptor und Marker in dem Rezeptor- Marker-Komplex kann lösbar ausbildet sein, so dass der Marker durch geeignete kompetitive Substanzen von seiner Bindung an den Rezeptor verdrängt und durch andere Marker ersetzt werden kann.

Die Markierung der Rezeptoren mit Markern erfolgt statis- tisch, d. h. dass nicht jeder einzelne Rezeptor individuell markiert sein muss. Dennoch befinden sich durchschnittlich auf n-Rezeptoren n-Marker. Darüber hinaus kann die Markierung auch ein Vielfaches von n betragen. Wesentlich dabei ist, dass die Marker nicht mit dem Prinzip der Messung interferie- ren.

Die Marker können reaktive Gruppe aufweisen, wobei insbeson- dere chemisch reaktive Gruppen mit hoher Spezifität wie z. B.

Thiolgruppen als reaktive Gruppen geeignet sind. Durch solche chemisch reaktive Gruppen des Markers wird das Bindungsver- halten des Liganden an den Rezeptor nicht nennenswert beein- trächtigt.

Der Marker kann ein Farbstoff, insbesondere ein Lumineszenz- Farbstoff, vor allem ein Chemolumineszenz-, Photolumineszenz- oder Biolumineszenz-Farbstoff sein.

Wenn der Marker ein Fluoreszenz-Farbstoff ist, dann kann er ein Fluorochrom aufweisen. Hier sind insbesondere Rhodamin, vor allem Tetramethylrhodaminisothiocyanat (= TRITC) beson- ders geeignet. Solche Fluorochrome können als Maleinimide zur Konjugation verwendet werden. Wenn der Rezeptor ein Antikör- per ist, kann dieser mit reaktiven Farbstoffen konjugiert werden. Eine Reihe von Beispielen können hierzu aus der Pub-

likation von G. T. Herrmannson"Bioconjugate techniques", A- cademic Press 1996, entnommen werden.

Darüber hinaus können als Rezeptoren sogenannte chimäre Pro- teine, die künstlich aus Proteinbestandteilen unterschiedli- chen, z. B. biologischen und künstlichen Ursprungs zusammenge- setzt sind, verwendet werden. So kann beispielsweise ein An- tikörper, bei dem die konstante Region (Fab-Region) durch ein fluoreszierendes Protein ersetzt wurde, so dass nur die vari- ablen Regionen zur Antigenerkennung erhalten bleiben, als Re- zeptor verwendet werden. Das fluoreszierende Protein kann insbesondere ein green fluorescent protein (GFP) oder ein blue fluorescent protein (BFP) sein.

Der Rezeptor kann darüber hinaus eine Eigenfluoreszenz auf- weisen. Eine solche Eigenfluoreszenz ist insbesondere von der natürlich vorkommenden Aminosäure Tryptophan bekannt, die in nahezu allen größeren Proteinen vorkommt. Wenn demnach der Rezeptor ein Antikörper, Protein oder Oligopeptid ist, in dem mindestens ein Tryptophan vorkommt, kann die Eigenfluoreszenz dieser Aminosäure für den Nachweis verwendet werden.

Die Bindung zwischen Rezeptor und Marker in dem Rezeptor- Marker-Komplex weist eine Fluoreszenzhalbwertszeit im Bereich von Nanosekunden auf.

Der Rezeptor-Marker-Komplex kann einen"fluorescence resonan- ce energy transfer" (= FRET) aufweisen. Bei diesem System kommt es zu einem Energietransfer zwischen einem Donor, der die Energie abgibt und einem Akzeptor, der die Energie auf- nimmt.

Die Fluoreszenz des FRET kann durch die Interaktion des Li- ganden mit dem Rezeptor verändert werden. Der Donor und der Akzeptor des FRET können auf dem Rezeptor immobilisiert sein.

Durch Bindung des Liganden an den Rezeptor werden der Donor und der Akzeptor räumlich voneinander getrennt, so dass eine

Fluoreszenzauslöschung beim Akzeptor erfolgt, wobei der Ak- zeptor ein Fluorochrom ist. Andererseits kann auch eine Fluo- reszenzentstehung beim Donor erfolgen, wobei der Akzeptor als Fluoreszenzquencher bezeichnet wird. Darüber hinaus kann der Ligand selbst als Donor wirken, so dass er entweder fluores- ziert oder quencht. Außerdem ist denkbar, dass der Ligand durch seine Bindung an den Rezeptor unter Ausbildung des Re- zeptor-Liganden-Komplexes den FRET-Donor und-Akzeptor in un- mittelbaren direkten Kontakt zueinander bringt.

Darüber hinaus kann FRET sowohl mit einem Quencher als auch einem Fluorochrom als Akzeptor funktionieren. Ist der Akzep- tor ein Quencher, so wird die Fluoreszenz ausgelöscht. Ist der Akzeptor ein Fluorochrom, so wird die Energie des Donors von dem Akzeptor als Fluoreszenzlicht wieder abgegeben.

Ebenso können Liganden verwendet werden, die selbst fluores- zenzmarkiert sind. Auf diese Weise wird unter Verwendung ei- nes ebenfalls markierten Kompetitors, der beispielsweise ein fluoreszenzmarkierter Ligand sein kann, ein kompetitiver As- say möglich. Der Kompetitor erzeugt (oder löscht) ein Fluo- reszenzsignal auf dem Rezeptor. Dabei ist vor allem das Er- zeugen eines Signals vorteilhaft, weil eine unspezifische Bindung des Liganden/des Kompetitors an Bereiche der Oberflä- che außerhalb des Rezeptors nicht signalbildend ist.

Der Marker kann jede beliebige nachweisbare Form annehmen, wobei der Marker insbesondere ein Mikropartikel sein kann.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Bio- sensor, insbesondere einen Proteinsensor, der nach dem erfin- dungsgemäßen Verfahren herstellbar ist.