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Title:
METHOD FOR DETERMINING THE QUALITY OR FUNCTIONAL CAPACITY OF A SURFACTANT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2004/015406
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for determining the quality or functional capacity of a surfactant. According to the invention, the electrokinetic potential or zeta potential of a polymer surface is determined after a surfactant has been adsorbed, enabling the quality or functional capacity of an especially pulmonary surfactant to be rapidly and easily determined, for example for therapeutic purposes.

Inventors:
STROHMAIER WOLFGANG (AT)
RIBITSCH VOLKER (AT)
SINITSCH-PFEILER CLAUDIA (AT)
Application Number:
PCT/AT2003/000229
Publication Date:
February 19, 2004
Filing Date:
August 08, 2003
Export Citation:
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Assignee:
STROHMAIER WOLFGANG (AT)
RIBITSCH VOLKER (AT)
SINITSCH-PFEILER CLAUDIA (AT)
International Classes:
F21V29/00; F21V29/505; G01N13/00; G01N27/60; H01L25/075; H01L33/00; F21V7/22; G01N13/02; (IPC1-7): G01N27/26; G01N13/00; G01N33/487
Foreign References:
US5452233A1995-09-19
DD235492A11986-05-07
DD288889A51991-04-11
DE19755183A11999-06-24
US4953389A1990-09-04
Other References:
DAVIES R J ET AL: "The behaviour of lung surfactant in electrolyte solutions", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 878, 1986, ISSN 0005-2760, pages 135 - 145, XP009022250
LIGHT W G ET AL: "Surface charge and hemolytic activity of asbestos", ENVIRONMENTAL RESEARCH, vol. 13, 1977, ISSN 0013-9351, pages 135 - 145, XP009022251
Attorney, Agent or Firm:
Miksovsky, Alexander (Währinger Strasse 3, Wien, AT)
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Claims:
P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähig keit von Surfaktant, dadurch gekennzeichnet, daß das elek trokinetische Potential bzw. ZetaPotential einer Polymer oberfläche nach einer Adsorption von Surfaktant bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Surfaktant natürlicher, synthetischer und/oder rekombi nanter, pulmonaler Surfaktant eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß das elektrokinetische Potential durch eine Bestim mung des Strömungspotentials bzw. Strömungstroms, durch Elektroosmose, Elektrophorese oder Mikroelektrophorese be stimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Surfaktant in eine mit einer makr oskopischen Polymeroberfläche und mit zwei Elektroden (2, 3) ausgestattete Meßzelle (1) eingebracht wird und das Strömungspotential bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die makroskopische Polymeroberfläche von Fasern, Folien bzw. Membranen, insbesondere aus Zelluloseacetat oder Zel lulosenitrat, gebildet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß natürlicher, pulmonaler Surfaktant vorgereinigt, insbeson dere physikalisch vorgereinigt, wird, wobei beispielsweise Eiweiß, Hämoglobin, Fibrin oder dgl., entfernt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß in der Meßzelle (1) ein Puffer, insbeson dere ein Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 7, eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß der Surfaktant auf Latexoder Pigment partikeln immobilisiert wird und die Wanderung bzw. Bewe gung der Latexoder Pigmentpartikel im elektrischen Feld der Meßzelle (1) bestimmt wird.
Description:
VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER GÜTE BZW.

FUNKTIONSFÄHIGKEIT VON SURFAKTANT Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfak- tant.

Die Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant ist beispielsweise im Zusammenhang mit der Behandlung der sogenannten Schocklunge bzw. dem so- genannten Atemnotsyndrom von wesentlichem Interesse, da es bereits vor einem Auftreten des voll ausgeprägten, kli- nischen Bilds eines ARDS (Acute Respiratory Distress Syn- drome, Atemnotsyndrom) bzw. ALi möglich ist, aus dem Zu- stand bzw. der Beschaffenheit des pulmonalen Surfaktants therapeutische Maßnahmen zu treffen und somit vor dem voll- ständigen Auftreten des klinischen Bilds des ARDS eine The- rapie zu beginnen. ARDS/ALI bzw. Atemnotsyndrom bezeichnet den rapiden Beginn einer progressiven Funktionsstörung der Lungen und ist im wesentlichen charakterisiert durch eine diffuse, mikrovaskuläre Lungenschädigung, die in einer er- höhten Permeabilität der kleinen Gefäße und Alveolarmembran resultiert und zu einem nicht-kardiogenen Lungenödem führt.

Es ist derzeit bekannt, mit Hilfe einer sogenannten Broncho Alveolar Lavage (BAL) pulmonalen Surfaktant der Lunge eines Patienten zu entnehmen, worauf beispielsweise in einem auf- wendigen Verfahren zur Bestimmung der Oberflächenspannung die Güte bzw. der Zustand des pulmonalen Surfaktants be- stimmt wird. Diese derzeit bekannten Verfahren sind nicht nur äußerst zeitaufwendig und erfordern eine komplizierte Apparatur, sondern erfordern zum Teil auch eine vergleichs- weise große Menge an zu überprüfendem Surfaktant und bedeu-

ten insbesondere aufgrund ihres Zeitaufwands die Gefahr, daß Therapievorschläge zu spät aus derartigen Messungen ab- geleitet werden. Daher werden diese Methoden in der Routine nicht angewendet.

Die vorliegende Erfindung zielt daher darauf ab, ein Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant, insbesondere pulmonalem Surfaktant, zur Verfügung zu stellen, mit welchem eine rasche und genaue Bestimmung des Zustands des Surfaktants möglich wird. Im Zusammenhang mit der Untersuchung von pulmonalem Surfaktant soll möglichst frühzeitig eine Therapie insbesondere für die Behandlung eines ARDS und/oder ALi, beispielsweise durch Bestimmung einer Gabe von exogenem Surfaktant ermög- licht werden.

Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemäße Verfah- ren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß das elektrokinetische Potential bzw. Zeta-Potential einer Poly- meroberfläche nach einer Adsorption von Surfaktant bestimmt wird. Da Surfaktant fähig ist, beispielsweise auf Polymer- oberflächen zu absorbieren und damit deren Oberflächeneigenschaften zu verändern, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das elektronkinetische Potential bzw. daraus abgeleitet das Zeta-Potential einer Polymeroberfläche nach Adsorption des Surfaktants zu bestimmen, um daraus Rück- schlüsse betreffend den Zustand bzw. die Güte bzw. Funk- tionsfähigkeit eines zu untersuchenden Surfaktants zu er- möglichen. Es läßt sich somit mit einem einfachen und kurzen Verfahren selbst bei geringen Mengen von zur Verfü- gung stehendem Surfaktant dessen Zustand bzw. Eigenschaften bestimmen, so daß beispielsweise bei einer Veränderung des

Zustands des pulmonalen Surfaktants unmittelbar entspre- chende Maßnahmen bzw. Therapien, beispielsweise durch Verabreichung einer individuell abgestimmten Gabe von exo- genem Surfaktant, an einen Patienten bzw. in einer Probe eingeleitet werden können. Neben einer raschen Ermittlung des Zustands bzw. der Güte von Surfaktant ergibt sich durch das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren der Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. des Zeta-Potentials auch die Möglichkeit, eine gegebenenfalls benötigte Surfak- tantgabe genau abzustimmen, so daß eine Kostenoptimierung bei Einsatz von exogenem Surfaktant möglich wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, daß natürlicher, synthe- tischer und/oder rekombinanter, pulmonaler Surfaktant ein- gesetzt wird. Neben den oben bereits angedeuteten Möglich- keiten der Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von natürlichem Surfaktant insbesondere zur Unterstützung von Therapien, beispielsweise zur Behandlung von ARDS und/oder ALI, ist es mit. dem erfindungsgemäßen Verfahren auch mög- lich, synthetischen und/oder rekombinanten, pulmonalen Sur- faktant auf seine Funktionsfähigkeit und Güte dahingehend zu überprüfen, inwieweit beispielsweise neu entwickelte Surfaktants tatsächlich für bestimmte, vorgegebene Einsatz- zwecke verwendbar sind. Es müssen somit nicht teure und aufwendige Untersuchungsverfahren durchgeführt werden, son- dern es kann unmittelbar die Qualität bzw. Einsatzfähigkeit eines beispielsweise neu entwickelten, synthetischen Sur- faktants durch Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials überprüft bzw. ermittelt werden. Wei- ters ist es beispielsweise möglich, nach Festlegung bzw.

Ermittlung von Kalibrier-bzw. Eichkurven bzw.-meßwerten für das elektrokinetische Potential bzw. Zeta-Potential von

gesundem, pulmonalem Surfaktant dadurch das Auslangen zu finden, daß zu überprüfender, natürlicher, synthetischer und/oder rekombinanter, pulmonaler Surfaktant mit derarti- gen kalibrierten Meßwerten verglichen wird und daß daraus eine relative Güte bzw. Funktionsfähigkeit abgeleitet wird, während gegebenenfalls schwieriger zu ermittelnde, absolute Werte hiefür derart nicht unbedingt erforderlich sind. Die Wiederholung dieser Messungen kann auch zu einer Überprü- fung des Therapieerfolges herangezogen werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Verfahrensführung wird vorgeschlagen, daß das elektrokinetische Potential durch eine Bestimmung des Strömungspotentials bzw. Strömungstroms durch Elektroosmose, Elektrophorese oder Mikroelektropho- rese bestimmt wird. In Abhängigkeit von dem Einsatz bzw.

Verwendungszweck kann somit das elektrokinetische Potential bzw. daraus abgeleitet das Zeta-Potential des Surfaktants, insbesondere des pulmonalen Surfaktants, bei einer Adsorp- tion auf einer Polymeroberfläche auf unterschiedliche Arten bestimmt werden.

In diesem Zusammenhang wird gemäß einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Surfaktant in eine mit einer makroskopischen Polymeroberfläche und mit zwei Elektroden ausgestattete Meßzelle eingebracht wird und das Strömungspotential bestimmt wird, wobei es dadurch mög- lich wird, mit einer einfachen Vorrichtung zuverlässige Re- sultate zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant zu erhalten. Das Strömungspotential einer Flüs- sigkeit, beispielsweise enthaltend den Surfaktant, gegen- über einer mit einer Polymeroberfläche ausgestatteten Meß- zelle wird hiebei durch Anwenden bzw. Aufbringen von unter- schiedlichen Drücken auf die Flüssigkeit bei gleichzeitiger

Ermittlung des Potentials bzw. des Stroms an den Elektroden der Meßzelle bestimmt. Zur weiteren Verbesserung bzw. Ver- einfachung der Verfahrensführung kann das in der Meßzelle aufgenommene Flüssigkeitsvolumen einer oszillierenden bzw. sich periodisch ändernden Druckbeaufschlagung unterworfen werden.

Zur Erzielung eines entsprechend aussagekräftigen Resultats betreffend die Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant, insbesondere pulmonalem Surfaktant, wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgeschlagen, daß die makroskopische Polymer- oberfläche von Fasern, Folien bzw. Membranen, insbesondere aus Zelluloseacetat oder Zellulosenitrat, gebildet wird.

Eine derartige makroskopische Polymeroberfläche weist genau definierte bzw. definierbare Eigenschaften auf, so daß in Kenntnis der Beschaffenheit der Polymeroberfläche unmittel- bar Rückschlüsse auf den Zustand des Surfaktants in Kennt- nis des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials möglich sind.

Zur Vermeidung einer Verfälschung des Ergebnisses bei der Ermittlung der Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von natürlichem, pulmonalem Surfaktant wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß na- türlicher, pulmonaler Surfaktant vorgereinigt, insbesondere physikalisch vorgereinigt, wird, wobei beispielsweise Zel- len, Zellbestandteile oder dgl., entfernt werden. Eine der- artige Vorreinigung, insbesondere physikalische Reinigung, ist mit bekannten Methoden ebenfalls einfach und rasch durchführbar und ermöglicht eine zuverlässigere Ermittlung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials des

zu untersuchenden pulmonalen Surfaktants ohne gegebenen- falls erforderliche, aufwendige Korrekturen.

Zur weiteren Erleichterung der Feststellung der Güte bzw.

Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß in der Meßzelle ein Puffer, insbesondere ein Phosphat- puffer mit einem pH von etwa 7, eingesetzt wird, wobei durch eine derartige Pufferung ebenfalls aufwendige Korrek- turverfahren vermieden werden können.

Anstelle der Bestimmung des Strömungspotentials zur Ermitt- lung des Zeta-Potentials ist es weiters möglich, insbeson- dere verdünnten Surfaktant in eine Meßzelle einzubringen, welche Latex-oder Pigmentpartikel enthält, wobei in diesen Meßzellen durch zwei Elektroden ein elektrisches Feld er- zeugt wird, das die Wanderung der Latex-bzw. Pigmentarti- kel verursacht. Im Fall der Anwendung dieser Methode der sogenannten Mikroelektrophorese wird die Wanderungsge- schwindigkeit der Partikel bestimmt und daraus wiederum das Zeta-Potential abgeleitet, um die Güte bzw. Funktionsfähig- keit von insbesondere pulmonalem Surfaktant zu ermitteln.

In diesem Zusammenhang wird gemäß einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Surfaktant auf Latex-oder Pigmentpartikeln immobilisiert wird und die Wanderung bzw. Bewegung der Latex-oder Pigmentpartikel im elektrischen Feld der Meßzelle bestimmt wird.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer in der beilie- genden Zeichnung einer Vorrichtung zur Durchführung des er- findungsgemäßen Verfahrens sowie daraus ableitbarer Resul- tate und auf Basis der angeschlossenen Ausführungsbeispiele näher erläutert. In dieser zeigen :

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestim- mung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials von insbesondere pulmonalem Surfaktant ; Fig. 2 ein Diagramm des ermittelten Potentials für einen nicht-funktionsfähigen Surfaktant im Vergleich zu den theo- retisch angegebenen Ergebnissen für einen funktionsfähigen, insbesondere pulmonalen Surfaktant ; und Fig. 3 ein Diagramm des ermittelten Zeta-Potentials in Ab- hängigkeit vom pH-Wert für unterschiedliche Adsorptionsma- terialien.

In Fig. 1 ist allgemein mit 1 eine Meßzelle bezeichnet, welche beispielsweise aus Plexiglas besteht, wobei darüber hinaus zwei Elektroden 2 und 3 vorgesehen sind, welche das Volumen der Meßzelle 1 begrenzen. Über eine Zuleitung 4 er- folgt eine Zufuhr der zu untersuchenden Flüssigkeit, ent- haltend den zu überprüfenden, pulmonalen Surfaktant, in den Bereich der Meßzelle 1, wobei weiters ersichtlich ist, daß die in Fig. 1 dargestellte, untere Elektrode 3 über einen Exzenterantrieb 5 und einen damit verbundenen Kolben 6 zu einer hin-und hergehenden Bewegung antreibbar ist, wodurch das Volumen in der Meßzelle 1 einer oszillierenden bzw. sich periodisch ändernden Druckbeaufschlagung unterworfen wird.

Im Kolben 6 kann unmittelbar ein Drucksensor integriert sein, wie dies mit 7 angedeutet ist, oder es kann aus der bekannten Bewegung des Exzenterantriebs 5 und somit des Kolbens 6 in Relation zu dem bekannten Volumen der Meßzelle 1 der in der Meßzelle 1 herrschende, sich periodisch än- dernde bzw. oszillierende Druck unmittelbar ermittelt wer- den.

Der vom Drucksensor 7 ermittelte Druck wird über eine sche- matische Leitung 8 einer Auswerte-und Aufzeichnungseinheit 9 zugeführt, wobei dieser Auswerte-und Aufzeichnungsein- heit 9 darüber hinaus zumindest das an den Elektroden 2 und 3 vorliegende Potential bzw. der Strom über eine Leitung 10 zugeführt wird.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung läßt sich bei- spielsweise ein sich mit der Zeit änderndes Potential er- mitteln, aus welchem sich das Zeta-Potential unmittelbar ableiten läßt, wie dies in Fig. 2 dargestellt ist.

In Fig. 2 ist neben den Ergebnissen für einen nicht-funk- tionsfähigen, insbesondere pulmonalen Surfaktant auch eine Kurve einer theoretischen Berechnung der erwarteten Ände- rung des Potentials in Abhängigkeit von pH-Wert darge- stellt, wobei ersichtlich ist, daß mit der in Fig. 1 darge- stellten Vorrichtung rasch und in zuverlässiger Weise eine Bestimmung der Güte bzw. der Funktionsfähigkeit von insbe- sondere pulmonalem Surfaktant möglich ist, da aus dem sich periodisch ändernden Potential unmittelbar das elektrokine- tische Potential sowie das Zeta-Potential des pulmonalen Surfaktants ermittelbar ist.

Der pulmonale Surfaktant, welcher der in Fig. 2 dargestell- ten Untersuchung unterzogen wurde, wurde hiebei vorge- reinigt, wobei beispielsweise Zellen, Zellbestandteile und dgl. entfernt wurden, um eine Beeinflussung des Meßresul- tats weitgehend ausschließen zu können. Zur Vereinfachung der Auswertung wird weiters in der Meßzelle 1 ein Puffer, beispielsweise ein Phosphatpuffer, mit einem pH von etwa 7 eingesetzt.

Zur Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta- Potentials des insbesondere pulmonalen Surfaktants weist die Meßzelle 1 darüber hinaus eine makroskopische Polymer- oberfläche auf, welche beispielsweise aus Zelluloseacetat oder Zellulosenitrat gebildet wird.

Anstelle der Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials eines Surfaktants unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung kann das Potential auch unter Durchleitung des zu untersuchenden Surfaktants bei unterschiedlichem Druck durch eine mit der Meßzelle 1 ver- gleichbare Meßzelle erfolgen, wobei wiederum das Potential bzw. gegebenenfalls der Strom an Elektroden 2 und 3 festge- stellt bzw. ermittelt wird und daraus das elektrokinetische Potential sowie das Zeta-Potential abgeleitet wird.

Neben einer derartigen Potentialbestimmung kann der Surfak- tant auf Latex-oder Pigmentpartikeln immobilisiert werden, wobei in einer Meßzelle die Wanderung bzw. Bewegung der La- tex-oder Pigmentartikel in einem elektrischen Feld, bei- spielsweise wiederum zwischen zwei. Elektroden bestimmt wird, wobei aus der Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel wiederum unter Ermittlung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials die Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant ermittelbar ist.

Ausführungsbeispiel 1 Einem Patienten wird mit Hilfe einer Broncho Alveolar Lavage (BAL) eine Menge von 30 ml unter Einsatz von 50 ml physiologischer Kochsalzlösung aus den Lungen entnommen, wobei in weiterer Folge eine Reinigung durch Filtration

durch vier Lagen chirurgischer Gaze und anschließender Zentrifugation (5 min x 200 x g) zur Entfernung von Zellen, Zellbestandteilen und dgl. erfolgt.

Das nach der Reinigung gewonnene Material, welches unter anderem den zu prüfenden, pulmonalen Surfaktant enthält, wird in die Meßzelle eingebracht, worauf in der Vorrichtung gemäß Fig. 1 unter Einsatz einer makroskopischen Polymer- oberfläche, bestehend aus Latex, ein Meßergebnis erhalten wird, aus welchem das in Fig. 2 dargestellte Zeta-Potential ermittelbar ist.

Aus dem ermittelten Zeta-Potential sowie dem Unterschied gegenüber der in Fig. 2 ebenfalls dargestellten Kalibrier- bzw. Eichkurve läßt sich ableiten, daß die Funktionsfähig- keit des untersuchten, pulmonalen Surfaktants um 70 % redu- ziert ist.

In Kenntnis dieser Fehl-bzw. Minderfunktion des pulmonalen Surfaktants wird für eine unmittelbare Behandlung die Gabe von exogenem Surfaktant vorgeschlagen.

In Fig. 3 ist ähnlich dem Diagramm von Fig. 2 das Zeta-Po- tential in Abhängigkeit von dem pH-Wert für unterschied- liche Adsorptionsmaterialien dargestellt, woraus insbeson- dere bei Einsatz von unterschiedlichem Surfaktant ein zur Ermittlung des Zeta-Potentials des jeweils zu untersuchen- den Surfaktants entsprechender pH-Wert eingestellt werden kann. Weiters ist aus Fig. 3 ersichtlich, daß bei Verwen- dung einer kationischen Membran jeweils ein positives Zeta- Potential in einem weiten pH-Bereich erhältlich ist, wäh- rend bei Verwendung einer anionischen Membran für unter- schiedliche pH-Werte teils ein positives und teils ein ne-

gatives Zeta-Potential ermittelt wird, so daß in Kenntnis der Änderung des Zeta-Potentials eines zu untersuchenden Surfaktants jeweils eine entsprechende Membran und ein ent- sprechender pH-Wert ausgewählt wird, um ein möglichst sig- nifikantes Signal zu erhalten.

Es ist davon auszugehen, daß beispielsweise pulmonaler Sur- faktant, wie aus Fig. 2 ersichtlich, jeweils ein negatives Zeta-Potential aufweist, während andererseits Surfaktants existieren, welche ein positives Zeta-Potential ergeben, so daß für die Ermittlung der Güte desselben beispielsweise eine kationische Membran zu wählen wäre, um zwischen einem intakten und inhibierten Surfaktant entsprechend unter- schiedliche Signale zu erhalten.