Titel

Verfahren zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit- Polymerase-

Ketenreaktion mit einer Schmelzkurvenanalyse

Stand der Technik

Mikrofluidische Systeme, auch als Lab-on-a-Chip-Systeme bekannt, erlauben das Analysieren von kleinen Mengen biologischer Proben mit einer hohen Sensitivität. Dabei erlauben Automation, Miniaturisierung und Parallelisierung von Laborprozessen eine Reduktion von händischen Schritten und führen zu einer Verminderung von Prozessfehlern.

Mikrofluidische Systeme, welche fluidische Vorgänge und analytische Schlüsse via ein optisches System ziehen, werden der Optofluidik zugeordnet. Eine solche optofluidische Anwendung ist die Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (qPCR).

Bei diesem Verfahren wird die Vervielfältigung von DNA-Abschnitten in-situ über Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Diese Methode ist sehr sensitiv und erlaubt das Quantifizieren von solchen DNA-Abschnitten in Proben.

Insbesondere können damit Krankheitserreger in biologischen Proben, beispielsweise in Blut von Patienten, nachgewiesen werden, was auch als Test bezeichnet wird. Für einen Qualitätsnachweis der Methode muss die Spezifität, also die zuverlässige Vervielfältigung der gewünschten DNA-Abschnitte, in der Regel mit einer qualitativen Methode wie einer Gelelektrophorese oder einer Schmelzkurve überprüft werden, wie beispielsweise in US 6,664,064 Bl beschrieben, insbesondere wenn mehrere DNA-Abschnitte gleichzeitig über qPCR vervielfältigt werden (sogenannte Multiplexreaktion). Bei einer

Schmelzkurvenanalyse wird dabei die DNA aufgeschmolzen, indem die

Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C— > 95 °C). Bei einer für den DNA-Abschnitt spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der DNA- Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein im DNA- Abschnitt eingefügter Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR™ Green I) freigesetzt und eine Änderung der Fluoreszenz registriert. Die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur eines DNA-Abschnitts sind im Wesentlichen abhängig von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Abschnitts. Die

Schmelzkurvenanalyse kann somit eingesetzt werden, um Auskunft über die Spezifität der q PCR- Reaktion zu erhalten.

Ein unerwünschtes Phänomen bei Durchführung einer qPCR ist die sogenannte Photobleichung, auch als Lichtbleichung oder Photobleaching bezeichnet, und beispielsweise in WO 2015/189297 Al angesprochen. Dabei ist die Abnahme und der Verfall der strukturellen Stabilität der Farbstoffe durch den andauernden Einfall der Strahlung zur Anregung der Fluoreszenz der Farbstoffe zu verstehen, wodurch die Qualität der Fluoreszenzauslese und somit die Qualität der qPCR insgesamt abnimmt.

Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion mit einer

Schmelzkurvenanalyse. Das Verfahren umfasst die Durchführung der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion gefolgt von der Schmelzkurvenanalyse zum

Bestimmen der Spezifität, wobei vor Beginn der Schmelzkurvenanalyse

Farbstoffe der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion deaktiviert werden.

Unter einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (kurz Echtzeit-PCR) kann insbesondere eine quantitative Echtzeit-PCR (kurz qPCR) verstanden werden. Unter den Farbstoffen sind insbesondere Fluorophore zu verstehen, bevorzugt typischerweise in einer qPCR verwendete Fluorophore.

Unter Farbstoffe sind insbesondere mehrere Partikel oder Moleküle eines Typs oder einer Art Farbstoff zu verstehen. Unter einer Deaktivierung der Farbstoffe ist insbesondere eine Veränderung der Farbstoffe dahingehend zu verstehen, dass die Farbstoffe nicht länger zur Fluoreszenz fähig sind. Somit kann unter einer Deaktivierung der Farbstoffe eine optische Deaktivierung der Farbstoffe verstanden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass ein störender Einfluss von Farbstoffen der qPCR in der Schmelzkurvenanalyse verringert und vorzugsweise vollständig eliminiert wird. Dies verringert somit vorteilhafterweise das Risiko, dass ein Fluoreszenzsignal von einem Farbstoff der qPCR mit einem Fluoreszenzsignal von einem Farbstoff der Schmelzkurvenanalyse verwechselt wird und insbesondere zu Falsch- Positiv- Resultaten führt. Es wird daher vorteilhafterweise eine störungsfreiere Schmelzkurvenanalyse zur

Oualitätsüberprüfung der qPCR ermöglicht. Vorteilhafterweise kann auf zusätzliche Schritte zur Eliminierung oder Deaktivierung der qPCR- Farbstoffe wie beispielsweise Filtrierung, Spülung oder Aufreinigung verzichtet werden. Dies erleichtert oder gar ermöglicht vorteilhafterweise die automatisierte Durchführung dieses Verfahrens in einem mikrofluidischen System in automatisierter Weise. Das Verfahren kann vollständig in-situ durchgeführt werden. Ferner ist von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren in bereits bekannten qPCR- Systemen ohne Hardwareänderungen angewendet werden kann, es muss vorteilhafterweise lediglich der Prozessablauf um den Schritt der Deaktivierung der q PCR- Farbstoffe ergänzt werden. Darüber hinaus kann das Verfahren vorteilhafterweise auch benutzt werden, um die Invalidität einer Analyse oder eines Tests zu evaluieren. Ist während der qPCR keine Vervielfältigung gemessen worden, aber in der Schmelzkurve ein Fluoreszenzsignal zu sehen, dann kann durch die Lage des Signals festgestellt werden, ob unspezifische Produkte entstanden sind oder ein Fehler in der Fluoreszenzsonde vorlag.

Außerdem kann das Verfahren im Bereich der Predictive Maintenance eingesetzt werden. So muss die Schmelzkurve nicht bei jedem Test oder bei jeder Analyse durchgeführt werden, sondern kann in gewissen Intervallen eingesetzt werden, um die Testperformance auf dem Feld zu charakterisieren und Daten zu sammeln.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erfolgt die Deaktivierung der Farbstoffe durch eine Photobleichung, auch als Lichtbleichung oder Photobleaching bezeichnet. Durch eine Bestrahlung mit ausreichend intensivem Licht wird dabei die Struktur der Farbstoffe derart geändert, dass die Farbstoffe nicht länger zur Fluoreszenz fähig sind. Hierdurch wird der oben beschriebene Nachteil der qPCR vorteilhafterweise ausgenutzt, um auf einfache und zuverlässige Weise die Farbstoffe zu deaktivieren. Vorzugsweise wird für die Photobleichung Licht im selben Wellenlängenbereich wie für die Durchführung der qPCR verwendet. Dies erleichtert weiters die bereits oben ausgeführte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in bekannten qPCR-Systemen. Alternativ kann auch weißes Licht oder Licht mit ausreichender Intensität und/oder ausreichend kurzen Wellenlängen zur Deaktivierung der Farbstoffe verwendet. Der Schritt zur Deaktivierung kann vorteilhafterweise in der Regel ohne bauliche Veränderungen mit der bereits in dem qPCR-System vorhandenen Fluoreszenzlichtquelle durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Photobleichung so lange durchgeführt, bis die gemessene

Fluoreszenzintensität unter einen vorgegebenen Schwellwert sinkt,

beispielsweise bis die Fluoreszenzintensität auf unter 10% der ursprünglichen Fluoreszenzintensität oder auf unter 10% über der Nachweisgrenze sinkt.

Ergänzend oder alternativ wird die Photobleichung durchgeführt, bis eine

Änderung der gemessenen Fluoreszenzintensität einen vorgegebenen

Schwellwert erreicht, beispielsweise bis sich die gemessene

Fluoreszenzintensität nicht mehr ändert. So wird die Photobleichung

vorteilhafterweise so lange durchgeführt, so lange sie einen direkten Effekt erzielt.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Zugabe von zweiten Farbstoffen für die Schmelzkurvenanalyse nach der Deaktivierung der Farbstoffe. Dies hat den Vorteil, dass die zweiten Farbstoffe nicht durch die Deaktivierung beeinflusst werden. Ferner ist von besonderem Vorteil, dass die zweiten

Farbstoffe nicht durch den PCR-Prozess mitgeführt werden müssen und dabei eventuell eine Wirksamkeit der PCR durch Interaktionen mit den PCR- Komponenten beeinträchtigt. Unter zweiten Farbstoffen sind insbesondere mehrere Partikel oder Moleküle eines Typs oder einer Art Farbstoff zu verstehen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung werden Produkte der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion für eine Denaturierung von DNA-Abschnitten der Produkte erhitzt. Dabei kann auch die gesamte Probe oder das Reaktionsgemisch, welche die qPCR-Produkte umfassen, erhitzt werden.

Die Denaturierung ermöglicht vorteilhafterweise die Aufnahme von zweiten Farbstoffen in die DNA-Produkte für die nachfolgende Schmelzkurvenanalyse.

Vorzugweise wird während der nachfolgenden Abkühlung der Produkte eine Messung einer Änderung einer Fluoreszenz von zweiten Farbstoffen der

Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Statt einer üblichen Messung der

Fluoreszenzsignale der Schmelzkurve werden somit die Fluoreszenzsignale einer Abkühlkurve gemessen. Die Schmelzkurvenanalyse entspricht hier somit einer Durchführung in inverser Reihenfolge, was auch als inverse

Schmelzkurvenanalyse bezeichnet werden kann. Dies hat den Vorteil, dass auf eine erneute Erhitzung für die Durchführung der Schmelzkurvenanalyse verzichtet werden kann, was vorteilhafterweise Zeit und andere Ressourcen einspart und somit das erfindungsgemäße Verfahren vereinfacht und

beschleunigt. Gegenstand der Erfindung ist auch eine mikrofluidische Vorrichtung zur

Durchführung einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion, wobei die Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche eingerichtet ist. Wie oben ausgeführt, kann auch eine bekannte mikrofluidische Vorrichtung in einfacher Weise für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet, insbesondere programmiert, werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.

Es zeigen

Figur 1 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des

erfindungsgemäßen Verfahrens und

Figur 2 ein Ausführungsbeispiel der zur Ausführung des Verfahrens eingerichteten erfindungsgemäßen Einrichtung.

Ausführungsformen der Erfindung

Figur 1 zeigt ein Ablaufdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des

erfindungsgemäßen Verfahrens 500. In einem ersten Schritt 501 des Verfahrens 500 wird eine Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (qPCR) zur Vervielfältigung eines oder mehrerer DNA-Abschnitte aus einer biologischen Probe durchgeführt. Beispielsweise dient dies zur Vervielfältigung charakteristischer DNA-Sequenzen von Krankheitserregern in einer Probe einer Körperflüssigkeit, beispielsweise Blut oder Speichel, für einen anschließenden Nachweis der Krankheitserreger. Wie bei qPCR üblich, wird die Anzahl der vervielfältigten DNA-Abschnitte mittels Fluoroszenzspektroskopie in Echtzeit verfolgt. Dazu enthält der PCR-Ansatz in der Reaktionskammer für die Fluoroszenzspektroskopie geeignete Farbstoffe, beispielsweise in der qPCR typischerweise eingesetzte Fluorophore. Die

Reaktionskammer umfasst somit ein Reaktionsgemisch mit der Probe und dem PCR-Ansatz für die qPCR.

Wenn beispielsweise eine vorgegebene Mindestmenge an vervielfältigten DNA- Abschnitten vorliegt, werden in einem darauffolgenden zweiten Schritt 502 die Farbstoffe deaktiviert. Da die Fluorophore chemisch keinen Einfluss auf das weitere Verfahren haben, genügt es, die Fähigkeit der Fluorophore zur

Fluoreszenz abzustellen. Dies erfolgt vorzugsweise durch Photobleichung, auch als Photobleaching bezeichnet, wobei beispielsweise die Fluoreszenzlichtquelle der qPCR mit einer ausreichend hohen Intensität für eine ausreichend lange Zeit eingesetzt wird. Die ausreichend hohe Intensität und die ausreichend lange Zeit bestimmen sich dabei durch die Art der Fluorophore und das gewünschte Ausmaß an Reduktion der Fluoreszenz. Vorzugsweise wird für die

Photobleichung Licht im selben Wellenlängenbereich wie für die Durchführung der qPCR verwendet Dann kann die Photobleichung beispielsweise so lange durchgeführt werden, bis die gemessene Fluoreszenz unter einen vorgegebenen Schwellwert sinkt.

Nach dem Entfernen oder der Verringerung des Fluoreszenzsignals wird im dritten Schritt 503 ein zweiter Farbstoff für die nachfolgende

Schmelzkurvenanalyse beigegeben, welcher sich in die doppelsträngige DNA der vervielfältigten DNA-Abschnitte einbaut und dadurch bei Anregung ein stärkeres Signal emittiert. Beispielsweise handelt es sich bei dem Farbstoff um einen für eine Schmelzkurvenanalyse typischen asymmetrischen Cyanin- Farbstoff wie SYBR™ Green I oder PicoGreen®. Dazu wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur zwischen 90 und 98 °C erwärmt, um die Doppelstränge der DNA- Abschnitte zu denaturieren. Dies bewirkt nicht nur das Aufschmelzen der Doppelstränge, sondern auch ein schnelleres Verteilen des zweiten Farbstoffs im Reaktionsgemisch. Die Zugabe der zweiten Farbstoffe kann dabei auch erst dann erfolgen, wenn die erhöhte Temperatur erreicht ist. Wenn nötig oder gewünscht, kann dieser dritte Schritt 503 auch benutzt werden, das

Reaktionsgemisch zu verdünnen. In einem vierten Schritt 504 erfolgt dann die Schmelzkurvenanalyse. Diese kann in der üblichen Weise durchgeführt werden. Alternativ kann während der Abkühlung nach der oben beschriebenen Erwärmung bereits eine Messung einer Änderung der Fluoreszenz der zweiten Farbstoffe erfolgen, um damit eine Abkühlkurve zu vermitteln, was einer inversen Schmelzkurvenanalyse entspricht.

Figur 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zur Durchführung einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion, wobei die Vorrichtung 100 beispielsweise zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens 500 gemäß Figur 1 eingerichtet ist. Figur 2a zeigt dabei die Vorrichtung 100 viermal in nachfolgend beschriebenen Zuständen, während Figur 2b die zu diesen Zuständen korrespondierenden Intensitäten 10 der gemessenen Fluoreszenz nach der Zeit 20 in einem Graphen 600 qualitativ darstellt.

Bei der Vorrichtung 100 kann es sich beispielsweise um ein mikrofluidisches System handeln, wobei eine Kartusche 200 des Systems 100 eine

Reaktionskammer 210 für die Durchführung der qPCR umfasst. Nach erfolgter qPCR im ersten Schritt des Verfahrens 501 enthält die Reaktionskammer 210 das Reaktionsgemisch 220 mit den Farbstoffen 221, welche zu einer insgesamt intensiven Fluoreszenz fähig sind. Wie in Figur 2b angedeutet, wird diese Fluoreszenzfähigkeit durch das Photobleaching 502 deutlich reduziert. Wie oben ausgeführt, kann die Dauer und die Intensität der Photobleichung 502 individuell abgestimmt auf die Reaktionsmischung festgelegt werden oder auch während der Photobleichung bis zu einer vorgegebenen Reduktion der

Fluoreszenzintensität dynamisch durchgeführt werden. Bei letzterem

dynamischen Ansatz wird ausgenutzt, dass die Photobleachingkurve ein doppeltes asymptotisches Verhalten aufweist. Wie nämlich in Figur 2b qualitativ dargestellt, umfasst der Graph 600 ein erstes Plateau 601 zeitlich vor der Photobleichung 502 und ein zweiten Plateau 602 zeitlich nach der Bleichung, welche über zwei Pseudoasymptoten den linear sinkenden Bereich der

Photobleichung 502 600 begrenzen. Die Photobleichung 502 kann also beispielsweise beendet werden, wenn die gemessene Fluoreszenzintensität der gebleichten Fluorophores einen vorgegebenen Mindestwert erreicht,

beispielsweise den Wert des zweiten Plateaus 602. Wie oben beschrieben kann der Mindestwert beispielsweise 10% der ursprünglichen Fluoreszenzintensität oder 10% über der Nachweisgrenze betragen. Alternativ kann die

Photobleichung 502 beispielsweise beendet werden, wenn sich die Steigung des Graphen 600, also die Änderung der Fluoreszenzintensität nicht mehr ändert, wie beispielsweise im Bereich des zweiten Plateaus 602.

Nach der Photobleichung 502 kann im dritten Schritt 503 der zweite Farbstoff 222 durch Pumpen in die Reaktionskammer 210 eingebracht werden, beispielsweise über eine Membranpumpe 110 oder eine peristaltische Pumpe 120 der Vorrichtung 100. Wenn die Reaktionskammer 210 zuvor vollständig mit dem Reaktionsgemisch gefüllt war, kann ein kleines Teilvolumen des

Reaktionsgemisches 220 durch den zweiten Farbstoff 222 ersetzt werden. Dabei steigt die mögliche Fluoreszenzintensität wieder an, wie in Figur 2b gezeigt. Der in Figur 2a ganz rechts gezeigte vierte Zustand der Reaktionskammer 210 zeigt eine vollständige Durchmischung des Reaktionsgemischs 220 mit dem zweiten Farbstoff 222. Wie oben beschrieben wird für den Einbau des zweiten Farbstoffs

222 in die doppelsträngige DNA-Abschnitte das Reaktionsgemisch 220 erhitzt, beispielsweise auf eine Temperatur zwischen 90 und 98 °C, was neben dem Aufschmelzen der DNA ein schnelleres Durchmischen des zweiten Farbstoffs bewirkt.

Wie oben beschrieben, kann im vierten Schritt 504 direkt die Abkühlkurve optisch aufgezeichnet werden, anstatt das Gemisch abzukühlen und dann die

Schmelzkurve zu starten, was einer Schmelzkurve in inverser Reihenfolge entspricht und Prozesszeit einspart.