Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen des Volumens einer Flüssig keit. Die Erfindung betrifft weiter einen Pipettierroboter, der zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung eingerichtet ist.

Hintergrund der Erfindung

Die präzise Übertragung eines festgelegten Volumens einer Flüssigkeit aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß ist ein wesentlicher Bestandteil von molekularbiologischen und chemischen Verfahren, wie sie beispielsweise in der Forschung, der Diagnostik und der pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Hierzu werden beispielsweise Pipetten verwendet, die dafür eingerichtet sind, ein festgelegtes Volumen einer Flüssigkeit aus einem ersten Gefäß aufzunehmen und dieses in ein zweites Gefäß abzugeben.

Pipetten ermöglichen die Automatisierung der Flüssigkeitsübertragung mit einer hohen Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, insbesondere bei kleinen zu übertragenden Volumina wie beispielsweise wenigen Mikrolitern. Bei einer wiederholten Verwendung tritt bei Pipetten Verschleiß auf, wodurch das tatsächlich abgegebene Volumen von dem eingestellten Zielvolumen abweichen kann. Derartige Ab weichungen verfälschen die gewünschte Zusammensetzung eines Gemischs und können zu verfälschten Ergebnissen führen. Um dies zu vermeiden ist es notwendig, Pipetten und andere Abgabeeinrichtungen regelmäßig zu kalibrieren, das heißt ihre Genauigkeit zu überprüfen, indem das Volumen der abgegebenen Flüssigkeit quantitativ genau erfasst wird, und, falls eine Abweichung von dem eingestellten Zielvolumen festgestellt wird, entsprechende Korrekturmaßnahmen ergrif fen werden.

Bekannte Verfahren, mit denen bei der Kalibrierung einer Pipette das Volumen einer abgegebenen Flüssigkeit bestimmt wird, sind beispielsweise die Gravimetrie oder die Kolorimetrie. Diese Verfahren sind jedoch relativ kostenintensiv, weil sie teure und empfindliche Messinstrumente wie beispielsweise Präzisionswaagen erfordern.

Es besteht daher ein Bedarf an einem kostengünstigen Verfahren zur Bestimmung des Volumens einer Flüssigkeit, das eine zuverlässige, schnelle und automatisierbare Kalibrierung einer Pipette oder einer anderen Abgabeeinrichtung ermöglicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen des Volumens einer Flüssigkeit, das Verfahren umfasst die Schritte:

a) Bereitstellen einer Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die eine Oberfläche aufweist,

b) Abgeben eines gewünschten Volumens der Flüssigkeit aus einer Abgabe einrichtung auf die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht, wobei durch ein Adsorbieren der Flüssigkeit von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht ein Fleck auf der Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht entsteht, wobei der Fleck unterschiedliche optische Eigenschaften als von der Flüssigkeit freie Bereiche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht hat,

c) Aufnehmen eines Bildes des Flecks,

d) Bestimmen des Flächeninhalts des Flecks, und

e) Rückschließen aus dem Flächeninhalt des Flecks auf das tatsächliche Volumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit.

Die Erfindung betrifft weiter einen Pipettierroboter mit mindestens einer Abgabeeinrichtung, einer Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die eine Oberfläche aufweist, einer Bildgebungsvorrichtung, einer Auswerteeinheit, und einer Steuereinheit, wobei der Pipettierroboter zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung eingerichtet ist. Kurzbeschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform von Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein gewünschtes Volumen einer Flüssigkeit aus einer Handpipette auf die Oberfläche einer Chromato- grafieschicht abgegeben wird und durch Adsorption der Flüssigkeit von der Chro- matografieschicht ein Fleck auf der Oberfläche der Chromatografieschicht ent steht.

Figur 2 zeigt eine beispielhafte Bestimmung einer Kalibrierkurve. Figur 2a zeigt die Auswertung der von einem Flachbettscanner erfassten Draufsicht auf die Oberflä che einer Kalibrierchromatografieschicht mit Flecken, die nach Abgeben von jeweils 0,5 mI, 1 ,0 mI, 1 ,5 mI, 2,0 mI und 2,5 mI einer farbigen Flüssigkeit aus einem Kalibrierpipettierkopf mit 8 Pipettierkanälen mittels eines Pipettierroboters auf der Oberfläche der Kalibrierchromatografieschicht entstanden sind. Eine Bildauswer tungssoftware erkennt die einzelnen Flecken und bestimmt jeweils deren Flächeninhalt. Figur 2b zeigt die Kalibrierkurve, die durch Aufträgen der jeweiligen Mittelwerte der bestimmten Flächeninhalte in Abhängigkeit der abgegebenen Volumina der farbigen Flüssigkeit erhalten wurde.

Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf die Oberfläche einer Chromatografieschicht mit Flecken, die nach Abgeben von jeweils 30 mI einer farbigen Flüssigkeit aus einem Pipettierkopf mit 96 Pipettierkanälen mittels eines Pipettierroboters auf der Oberfläche der Chromatografieschicht entstanden sind.

Figur 4 zeigt eine Draufsicht auf die Oberfläche einer Chromatografieschicht mit Flecken, die nach Abgeben von jeweils 1000 mI einer farbigen Flüssigkeit aus einem Pipettierkopf mit 8 Pipettierkanälen mittels eines Pipettierroboters auf der Oberfläche der Chromatografieschicht entstanden sind.

Figur 5 zeigt eine Draufsicht auf die Oberfläche einer Chromatografieschicht mit Flecken, die nach Abgeben von 10 mI, 50 mI, 100 mI, 300 mI, 600 mI, und 1000 mI (von rechts nach links in der ersten Reihe und in der dritten Reihe von oben, von links nach rechts in der zweiten Reihe von oben) einer farbigen Flüssigkeit aus einer Handpipette auf der Oberfläche der Chromatografieschicht entstanden sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen des Volumens einer Flüssigkeit, das Verfahren umfasst die Schritte:

a) Bereitstellen einer Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die eine Oberfläche aufweist,

b) Abgeben eines gewünschten Volumens der Flüssigkeit aus einer Abgabeeinrichtung auf die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht, wobei durch ein Adsorbieren der Flüssigkeit von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht ein Fleck auf der Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht entsteht, wobei der Fleck unterschiedliche optische Eigenschaften als von der Flüssigkeit freie Bereiche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht hat,

c) Aufnehmen eines Bildes des Flecks,

d) Bestimmen des Flächeninhalts des Flecks, und

e) Rückschließen aus dem Flächeninhalt des Flecks auf das tatsächliche Vo lumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Volumen einer Flüssigkeit bestimmt. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Verwendung bei der Kalibrierung einer Abgabeeinrichtung.

Der Begriff „Abgabeeinrichtung“ wie hier verwendet bezeichnet eine Vorrichtung zur gesteuerten Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeit. Die Abgabeeinrichtung ist vorzugsweise eine Pipette. Die Pipette kann zur Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeit vorzugsweise mit einer abnehmbaren Pipettenspitze verwendet werden. Die Pipette kann beispielsweise eine Handpipette sein. Die Pipette kann auch eine Multikanalpipette sein. Die Pipette kann auch Teil eines Pipettierkopfs mit ei nem oder mehreren Pipettierkanälen, vorzugsweise mit 96, 384 oder 1536 Pipettierkanälen, sein. Der Pipettierkopf ist vorzugsweise Teil eines Pipettierroboters und wird mittels des Pipettierroboters gesteuert. Die Abgabeeinrichtung kann auch ein Dispenser oder ein Dosierspender, wie beispielsweise eine Dosierpumpe, sein.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst die Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die die Oberfläche aufweist, bereitgestellt. Der Begriff „Flüssigkeitsaufnahmeschicht“ wie hier verwendet bezeichnet eine Schicht, die eingerichtet ist, eine Flüssigkeit zu adsorbieren. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist vorzugsweise eine dünne Schicht, die auch für eine Verwendung in der Dünnschichtchromato- grafie geeignet ist. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist aus einem festen Material, so dass die Schicht mechanisch stabil ist. Die Schichtdicke der Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist einheitlich, so dass die Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine ebene Schicht ist. Die Schichtdicke beträgt beispielsweise zwischen 20 pm und 2 mm, vorzugsweise zwischen 200 pm und 2 mm. Das Material der Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist ebenfalls einheitlich, so dass die Flüssigkeitsaufnahmeschicht in jedem Bereich die gleichen Eigenschaften in Bezug auf die Adsorption der Flüssigkeit aufweist. Während der Durchführung des Verfahrens ist die Flüssigkeits aufnahmeschicht waagerecht angeordnet.

Die Flüssigkeit kann jede Flüssigkeit sein, die geeignete Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich Viskosität, Oberflächenspannung, Flüchtigkeit und chemi scher Stabilität, aufweist, um mittels der Abgabeeinrichtung abgegeben und von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht adsorbiert zu werden. Die Flüssigkeit ist vorzugsweise eine nicht-flüchtige Flüssigkeit. Die Flüssigkeit ist vorzugsweise eine wässrige Lösung, das heißt das vorherrschende oder einzige Lösungsmittel ist Wasser. Wässrige Lösungen werden üblicherweise zum Kalibrieren von Abgabeeinrichtungen verwendet und sind für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut geeignet.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend das gewünschte Volumen der Flüssigkeit aus der Abgabeeinrichtung auf die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht abgegeben, wobei durch das Adsorbieren der Flüssigkeit von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht der Fleck auf der Oberfläche der Flüssig- keitsaufnahmeschicht entsteht. Der Fleck ist im Wesentlichen kreisförmig, da die Flüssigkeit von der waagerecht angeordneten Flüssigkeitsaufnahmeschicht ausgehend von der Stelle auf der Oberfläche, auf die die Flüssigkeit auftrifft, gleichmäßig in alle Richtungen adsorbiert wird. Das gewünschte Volumen kann manuell, halbautomatisch oder automatisch aus der Abgabeeinrichtung abgegeben werden. Das gewünschte Volumen wird vorzugsweise mindestens zweifach oder drei fach aus der Abgabeeinrichtung abgegeben, so dass die Bestimmung des Volumens der Flüssigkeit in mindestens zwei- oder dreifacher Ausführung erfolgt.

Der Fleck hat unterschiedliche optische Eigenschaften als von der Flüssigkeit freie Bereiche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht. Der Begriff „optische Eigenschaften“ wie hier verwendet bezeichnet Eigenschaften im sichtbaren Bereich, im ultravioletten (UV)-Bereich und/oder im Infrarot (IR)-Bereich der elektromagnetischen Strahlung. Die optischen Eigenschaften sind vorzugsweise eine Farbe oder eine Fluo reszenzeigenschaft. Der Fleck hat beispielsweise eine andere Farbe als von der Flüssigkeit freie Bereiche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht. Aufgrund der unterschiedlichen optischen Eigenschaften des Flecks im Vergleich zu von der Flüssigkeit freien Bereichen der Flüssigkeitsaufnahmeschicht lässt sich der Flächeninhalt des Flecks in Schritt d) des Verfahrens bestimmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Aufnehmen eines Bildes des Flecks. Das Aufnehmen des Bildes kann mittels einer Bildgebungseinrichtung erfolgen. Die Bildgebungseinrichtung ist eingerichtet, ein scharfes und ausrei chend hoch aufgelöstes Bild des Flecks aufzunehmen. Die Bildgebungseinrich tung ist vorzugsweise so angeordnet, dass sie eine Draufsicht auf den Fleck aufnimmt. Die Bildgebungseinrichtung kann eine Kamera, wie beispielsweise eine digitale Kamera, oder ein Scanner, wie beispielsweise ein Flachbettscanner, sein. Die Kamera ist vorzugsweise eine hochauflösende CCD-Kamera.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Bestimmen des Flächeninhalts des Flecks. Der Flächeninhalt kann beispielsweise in mm ² bestimmt werden. Der Flächeninhalt wird anhand der unterschiedlichen optischen Eigenschaften des Flecks im Vergleich zu von der Flüssigkeit freien Bereichen der Flüssigkeitsaufnahmeschicht bestimmt. Der Flächeninhalt kann beispielsweise mittels einer Bildauswertungssoftware bestimmt werden. Dazu wird der Bildauswertungssoftware das im vorangegangenen Verfahrensschritt aufgenommene Bild, beispielsweise von der Bildgebungseinrichtung, bereitgestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Rückschließen aus dem Flächeninhalt des Flecks auf das tatsächliche Volumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit. Es besteht ein Zusammenhang zwischen dem Flächeninhalt des Flecks und dem tatsächlichen Volumen der auf die Flüssigkeitsaufnahmeschicht abgegebenen Flüssigkeit. Mithilfe dieses Zusammenhangs wird aus dem Flächeninhalt des Flecks auf das tatsächliche Volumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit zurück geschlossen. Auf diese Weise wird das tatsächliche Volumen der abgegebenen Flüssigkeit quantitativ genau erfasst. Das Rückschließen kann beispielsweise von der Bildauswertungssoftware automatisch durchgeführt werden. Die Bildauswertungssoftware weist hierzu einen entsprechenden Programmcode zum Auswerten des Flächeninhalts auf.

Durch das Ermitteln des in Schritt b) abgegebenen tatsächlichen Volumens der Flüssigkeit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Überprüfung der Genauigkeit von Pipetten und anderen Abgabeeinrichtungen. Das Verfahren kann daher bei der Kalibrierung von Pipetten und anderen Abgabeeinrichtungen eingesetzt werden. Falls eine Abweichung des tatsächlichen Volumens von dem gewünschten Volumen festgestellt wird, können entsprechende Korrek turmaßnahmen ergriffen werden, damit die verwendete Abgabeeinrichtung wieder die erforderliche Genauigkeit zeigt.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich das tatsächlich abgegebene Volumen verifizieren und die Genauigkeit der Abgabeeinrichtung validieren.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass das Verfahren einen geringen apparativen Aufwand hat. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist kommer- ziell zu geringen Kosten erhältlich. Dadurch ist das Verfahren einfach und kosten günstig durchführbar. Es werden keine teuren Hilfsmittel wie beispielsweise Präzisionswaagen benötigt.

Das Verfahren ist zudem zuverlässig, schnell durchführbar und automatisierbar.

Somit wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein kostengünstiges Verfahren zur Bestimmung des Volumens einer Flüssigkeit bereitgestellt, das eine zuverläs sige, schnelle und automatisierbare Kalibrierung einer Pipette oder einer anderen Abgabeeinrichtung ermöglicht.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass das Abgeben der Flüssigkeit auf die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht nicht einem bestimmten Raster folgen muss, wie dies zum Beispiel bei der Verwendung von Multititerplatten oder Kalibrierplatten der Fall ist. Bei dem erfindungsgemäßen Ver fahren sind beim Abgeben der Flüssigkeit keine vorgegebenen Positionen auf der Flüssigkeitsaufnahmeschicht zu erreichen. Dies ist eine große Erleichterung für die Volumenbestimmung.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die ge wünschten Volumina frei wählbar sind und über einen großen Volumenbereich verteilt sein können. Das Verfahren ist sowohl für kleine Volumina wie beispielsweise 1 pl als auch für größere Volumina wie beispielsweise 1 ml geeignet. Das gewünschte Volumen der Flüssigkeit kann beispielsweise von 0,5 bis 1500 pl betragen. Dabei ist das Verfahren insbesondere für ein gewünschtes Volumen von bis zu 1100 mI sowie für die Bestimmung von kleinen Volumina geeignet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zudem für jede Art von Abgabeeinrichtung eingesetzt werden. Dadurch ist das Verfahren vielseitig anwendbar.

Wenn die Dichte der Flüssigkeit bekannt ist, kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch die Masse der Flüssigkeit bestimmt werden, indem zunächst das Volumen der Flüssigkeit mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt und anschließend anhand des Volumens und der Dichte der Flüssigkeit die Masse der Flüssigkeit berechnet wird. ln einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter den Schritt: f) Vergleichen des in Schritt e) ermittelten tatsächlichen Volumens mit dem gewünschten Volumen.

Falls bei dem Vergleich eine Abweichung des tatsächlichen Volumens von dem gewünschten Volumen festgestellt wird, ist eine Kalibrierung der Abgabeeinrichtung erforderlich.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter:

i) Bereitstellen einer Kalibrierflüssigkeitsaufnahmeschicht, die baugleich mit der Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist,

ii) Abgeben von verschiedenen definierten Volumina der Flüssigkeit aus einer Kalibrierabgabeeinrichtung auf die Oberfläche der Kalibrierflüssigkeitsaufnahmeschicht, wodurch die Flecken auf der Oberfläche der Kalibrierflüssig keitsaufnahmeschicht entstehen,

iii) Aufnehmen mindestens eines Bildes der Flecken,

iv) Bestimmen des Flächeninhalts der Flecken, und

v) Bestimmen einer Kalibrierkurve unter Heranziehen der definierten Volumina und der Flächeninhalte,

wobei in Schritt e) die Kalibrierkurve verwendet wird.

Die Schritte i) bis v) sind vor Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführen, da die in Schritt v) bestimmte Kalibrierkurve in Schritt e) zu verwenden ist. Die Kalibrierkurve ermöglicht es, aus dem Flächeninhalt des Flecks auf das tatsächliche Volumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit zurück zu schlie ßen. Das Berechnen des tatsächlichen Volumens mittels der Kalibrierkurve kann manuell oder automatisch mithilfe eines Computers durchgeführt werden.

Die Kalibrierflüssigkeitsaufnahmeschicht ist baugleich mit der Flüssigkeitsaufnahmeschicht. Baugleich bedeutet, dass die Kalibrierflüssigkeitsaufnahmeschicht den gleichen Aufbau, das gleiche Material und die gleiche Schichtdicke wie die Flüssigkeitsaufnahmeschicht hat. Zudem ist in Schritt ii) die gleiche oder die gleiche Art von Flüssigkeit, wie in Schritt b) zu verwenden. Die Kalibrierkurve ist für jede Art von Flüssigkeit individuell zu bestimmen, da sich das Adsorptionsverhalten zwischen verschiedenen Arten von Flüssigkeiten unterscheiden kann. Üblicherweise wird für die Volumenbestimmung nur eine einzige Art von Flüssigkeit ver wendet, beispielsweise eine wässrige Lösung eines Farbstoffs. Vorzugsweise kommt auch nur eine Art von Flüssigkeitsaufnahmeschicht, beispielsweise Kieselgel 60, zum Einsatz, so dass die Bestimmung einer einzigen Kalibrierkurve ausreichen kann.

Ferner sind für die Schritte i) bis iv) in jeder Hinsicht möglichst die gleichen Bedingungen wie für die Schritte a) bis d) zu wählen, insbesondere eine gleiche oder nur um wenige °C abweichende Temperatur. Die Genauigkeit der Kalibrierabgabeeinrichtung ist beispielsweise mittels Gravimetrie oder einem anderen bekannten Verfahren zur Volumenbestimmung vor Schritt ii) überprüft worden.

Die Kalibrierkurve ist vorzugsweise eine Kalibrierfunktion. Die Kalibrierfunktion ist beispielsweise eine lineare Funktion. Die lineare Funktion hat eine Funktionsgleichung, in die in Schritt e) der Flächeninhalt des Flecks eingesetzt und dann mittels der Funktionsgleichung das tatsächliche Volumen ausgerechnet werden kann. Die Funktionsgleichung hat die Form:

tatsächliches Volumen = m x Flächeninhalt + b wobei m die Steigung der Geraden und b der Schnittpunkt der Geraden mit der y- Achse ist, wobei die Gerade dem Graphen der linearen Funktion entspricht.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zwischen Schritt b) und Schritt c) weiter:

b‘) T rocknen der Flüssigkeit auf der Flüssigkeitsaufnahmeschicht.

Das Trocknen der Flüssigkeit kann beispielsweise für 5 bis 10 min bei Raumtemperatur (20 bis 23 °C) erfolgen. Durch das Trocknen kann sichergestellt werden, dass die Verteilung der Flüssigkeit in der Flüssigkeitsaufnahmeschicht vor Schritt c) abgeschlossen ist. Der zusätzliche Schritt des Trocknens kann daher vor allem bei größeren Flüssigkeitsvolumina von Vorteil sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn das gewünschte Volumen unter oder auf einer Volumenschwelle liegt, der Abstand der Abgabeeinrichtung zu der Oberfläche in Schritt b) maximal wie eine Abstandsschwelle gewählt. Der Abstand ist die Länge der kürzesten Verbindung zwischen der Abgabeeinrichtung und der Oberfläche. Die Abgabeeinrichtung weist eine Öffnung auf, via die in Schritt b) die Flüssigkeit abgegeben wird. Der Abstand der Abgabeeinrichtung zu der Oberfläche entspricht dem Abstand der Öffnung zu der Oberfläche. Bei Verwendung einer Pipette mit einer abnehmbaren Pipettenspitze befindet sich die Öffnung wäh rend des Abgebens der Flüssigkeit am unteren Längsende der Pipettenspitze. Bei kleinen Volumina, beispielsweise von 3 pl oder weniger, besteht das Risiko, dass sie beim Abgeben aus der Abgabeeinrichtung an oder auf der Abgabeeinrichtung, beispielsweise an der Pipettenspitze, hängen bleiben. Um dies zu vermeiden, kann die Abgabeeinrichtung soweit an die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht herangeführt werden, dass die abgegebene Flüssigkeit mit der Oberfläche in Kontakt kommt und sich dadurch von der Abgabeeinrichtung löst. Je kleiner das Volumen ist, desto näher ist die Pipettenspitze bzw. die Abgabeeinrichtung an die Oberfläche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht heranzuführen, das heißt umso kürzer ist die Abstandsschwelle zu wählen.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Volumenschwelle 1 pl und die Abstandsschwelle 0,2 mm. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Volumenschwelle 3 mI und die Abstandsschwelle 0,5 mm. Bei größeren Volumina kann ein längerer Abstand der Abgabeeinrichtung zu der Oberfläche gewählt werden. Beispielsweise kann die Volumenschwelle 1000 mI und die Abstandsschwelle 2 mm betragen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Abgabeeinrichtung eine Pipette. Die Pipette kann beispielsweise eine Handpipette, eine Multikanalpipette oder Teil eines Pipettierkopfs mit einem oder mehreren Pipettierkanälen, vorzugsweise mit 96, 384 oder 1536 Pipettierkanälen, sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Abgeben des gewünschten Volumens der Flüssigkeit aus der Abgabeeinrichtung mit einer Abgaberate von maximal 100 mI/s. Durch die Abgaberate von maximal 100 mI/s weist der Fleck, der durch das Adsorbieren der Flüssigkeit von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht entsteht, die Form eines runden Kreises auf, dessen Flächeninhalt auf einfache Wei se, beispielsweise durch eine Bildauswertungssoftware, bestimmt werden kann. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform beträgt die Abgaberate maximal 80 mI/s, weiter bevorzugt maximal 70 mI/s, weiter bevorzugt maximal 50 mI/s.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das gewünschte Volumen der Flüssigkeit von 0,1 bis 1000 mI, vorzugsweise von 0,5 bis 1000 mI.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeit eine farbige Flüssigkeit. Die Farbe der farbigen Flüssigkeit ist derart gewählt, dass sie sich von der Farbe der Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die üblicherweise weiß oder beige ist, unterscheidet. Dabei ist ein möglichst starker Kontrast zwischen der Farbe der Flüssigkeit und der Farbe der Flüssigkeitsaufnahmeschicht bevorzugt. Der Begriff„Farbe“ wie hier verwendet umfasst auch Grautöne. Die Verwendung der farbigen Flüssigkeit ermöglicht eine besonders einfache Bestimmung des Flächeninhalts des Flecks, da der Fleck im sichtbaren Licht ohne weiteres erkennbar ist. Die farbige Flüssigkeit kann beispielsweise destilliertes Wasser, in dem ein Farbstoff gelöst ist, sein. Der Farbstoff kann beispielsweise ein farbiges anorganisches Salz oder ein organischer Farbstoff sein. Das farbige anorganische Salz kann beispielsweise ein rotes Natriumsalz sein. Der organische Farbstoff kann beispielsweise Methylorange (Natrium-4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzolsulfonsäure), Kristallviolett ({4-[4,4'-Bis(dimethylaminophenyl)benzhydryliden]cyclohexa-2 ,5-dien-1- ylidenjdimethyl-ammoniumchlorid) oder Malachitgrün (4,4’-

Bis(dimethylamino)trityliumchlorid oder -oxalat) sein. ln einer bevorzugten Ausführungsform hat die farbige Flüssigkeit eine dunkle Far be. Dadurch wird ein höherer Kontrast zwischen dem Fleck und von der Flüssigkeit freien Bereichen der Flüssigkeitsaufnahmeschicht erreicht. Der höhere Kon trast erleichtert die exakte Bestimmung des Flächeninhalts des Flecks.

Die Flüssigkeit kann auch ein Fluoreszenzfarbstoff aufweisen, der mittels UV- Bestrahlung der Flüssigkeitsaufnahmeschicht sichtbar wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht einen Marker auf, der bei einem Kontakt mit der Flüssigkeit einen Farbumschlag zeigt oder zu einer UV-Markierung führt. Der Marker kann beispielsweise eine flu oreszierende Substanz sein, deren Fluoreszenz durch die Adsorption der Flüssigkeit teilweise oder vollständig verloren geht. In diesem Fall ist die UV-Markierung derart, dass unter UV-Bestrahlung der Flüssigkeitsaufnahmeschicht die von der Flüssigkeit freien Bereiche der Flüssigkeitsaufnahmeschicht fluoreszieren, während der Fleck weniger oder gar nicht fluoresziert. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht mit dem Marker ermöglicht die Verwendung einer ungefärbten Flüssigkeit.

Die Marker kann beispielsweise manganaktiviertes Zinksilikat mit einem Absorptionsmaximum bei 254 nm sein. Das manganaktivierte Zinksilikat ist eine fluoreszierende Substanz, die eine grüne Fluoreszenz aufweist. Durch den Marker fluoresziert die Flüssigkeitsaufnahmeschicht. Bei Verwendung einer Flüssigkeit, die eine im passenden Wellenlängenbereich absorbierende Verbindung, beispiels weise eine aromatische Verbindung, aufweist, bewirkt die Adsorption der Flüssigkeit von der Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine Fluoreszenzlöschung, so dass der Fleck unter UV-Bestrahlung der Flüssigkeitsaufnahmeschicht mit Licht von 254 nm als dunkler Fleck auf der fluoreszierenden Flüssigkeitsaufnahmeschicht erscheint.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht auf einen T räger aufgebracht, wobei der Träger auf der von der Oberfläche abgewandten Seite der Flüssigkeitsaufnahmeschicht angeordnet ist. Der Träger ist eingerichtet, keine Flüssigkeit aufzunehmen. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht kann zusammen mit dem Träger eine Chromatografieplatte bilden. Der Träger ist eben, so dass die Chromatografieplatte ebenfalls eben ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der T räger eine Glasplatte oder eine Kunststoffplatte. Bei Verwendung der Glasplatte oder der Kunststoffplatte kann die Ebenheit des T rägers besonders einfach gewährleistet werden. Der Träger kann auch eine Aluminiumfolie oder ein Aluminiumblech sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht Kieselgel, Aluminiumoxid, Magnesiumsilikat, Cellulose, Papier, Fließpapier, Tonerde, eine Tonplatte und/oder Stoff auf. Die Zusammensetzung der Flüssigkeitsauf nahmeschicht wird so gewählt, dass die Flüssigkeitsaufnahmeschicht in der Lage ist, die Flüssigkeit zu adsorbieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine Chromatografieschicht. Dabei sind Chromatografieschichten, die in der Dünn- schichtchromatografie Anwendung finden, für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugt. Derartige Flüssigkeitsaufnahmeschichten sind üblicher weise dünne Schichten eines sehr feinkörnigen Materials wie beispielsweise Kie selgel, Aluminiumoxid oder Cellulose. Das Material ist gleichmäßig auf einen Träger aus Kunststoff, Aluminiumblech oder Glas aufgetragen und kommerziell in unterschiedlichen Schichtdicken erhältlich. Kieselgel, auch Silicagel genannt, ist das am weitesten verbreitete Material. Kieselgel dient aufgrund der freien endständigen Hydroxygruppen als polares Adsorbens für die Flüssigkeit. Der mittlere Porendurchmesser der Kieselgele beträgt meist 4 bis 100 nm, wobei der Porendurchmesser von 6 nm (Kieselgel 60, Merck) am gebräuchlichsten ist. Da Kieselgel auf den häufig als T räger verwendeten Glasplatten nur schlecht haftet, ist das Kieselgel oftmals mit Gips (CaS04) als„Kleber“ versetzt. ln einer bevorzugten Ausführungsform hat die Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine Schichtdicke von weniger als 2 mm, beispielsweise von 200 miti, 600 pm, 1 mm oder 1 ,5 mm.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht Poren auf, wobei die Poren vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 1 bis 20 nm haben.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht Partikel auf, die die Poren ausbilden, wobei die Partikel vorzugsweise eine Größe von 1 bis 100 miti, weiter bevorzugt von 10 bis 12 pm, haben.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden sämtliche Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens manuell oder automatisiert durchgeführt. Die automatisierte Durchführung ermöglicht es, eine Vielzahl von Pipetten gleichzeitig zu kalibrieren.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung einen Pipettierroboter mit mindestens einer Abgabeeinrichtung, einer Flüssigkeitsaufnahmeschicht, die eine Oberfläche aufweist, einer Bildgebungsvorrichtung, einer Auswerteeinheit, und einer Steuereinheit, wobei der Pipettierroboter zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung eingerichtet ist.

Der Pipettierroboter ermöglicht eine Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Bildgebungsvorrichtung ist eingerichtet, das Bild des Flecks aufzunehmen und an die Auswerteeinheit weiterzugeben. Die Auswerteeinheit ist eingerichtet, den Flächeninhalt des Flecks zu bestimmen und auf das tatsächliche Volumen der in Schritt b) abgegebenen Flüssigkeit zurück zu schließen. Die Steuereinheit ist eingerichtet, die einzelnen Schritte des Verfahrens zu steuern.

Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht hat vorzugsweise die gleichen Abmessungen wie eine Standard-Mikrotiterplatte. Dadurch ist die Flüssigkeitsaufnahmeschicht besonders nutzerfreundlich. Außerdem weisen Pipettierroboter üblicherweise eine Trägervorrichtung für Standard-Mikrotiterplatten auf. Die Flüssigkeitsaufnahmeschicht ist vorzugsweise auf der T rägervorrichtung angeordnet.

Im Folgenden wird anhand der beigefügten schematischen Zeichnung die Erfin- düng näher erläutert.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform von Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Als Abgabeeinrichtung ist eine Handpipette 1 mit einer abnehmbaren Pipettenspitze 2 gezeigt. Am unteren Längsende der Pipettenspitze 2 befindet sich eine Öffnung zum Aufnehmen und Abgeben von Flüssigkeit 5. Des Weiteren ist als Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine Chromatografieschicht 3 gezeigt. Wie aus der Figur 1 ersichtlich ist, hat die Pipettenspitze 2 bereits eine Flüssigkeit 5 aufgenommen. Es wird ein gewünschtes Volumen der Flüssigkeit 5 aus der Handpipette 1 auf die Oberfläche 4 der Chroma- tografieschicht 3 abgegeben. Die Flüssigkeit 5 wird von der Chromatografieschicht 3 adsorbiert. Dadurch entsteht ein Fleck 6 auf der Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3. In der gezeigten beispielhaften Ausführungsform wird der Schritt des Abgebens des gewünschten Volumens der Flüssigkeit 5 mehrfach wiederholt.

Beispiele

Beispiel 1 - Bestimmung einer Kalibrierkurve für kleine Volumina

Zunächst wurde eine Kalibrier-Chromatografieplatte (Kieselgel 60, Merck) bereitgestellt. Die Kalibrier-Chromatografieplatte weist eine Kalibrierchromatografie- Schicht und einen Träger auf. Die Kalibrierchromatografieschicht weist Kiesel gel 60 auf. Der Träger ist ein Aluminiumblech. Die Kalibrier-Chromatografieplatte wurde auf einer Trägervorrichtung in einem Pipettierroboter angeordnet. Ein 50 ml Container wurde mit einer farbigen Flüssigkeit befüllt und ebenfalls in dem Pipettierroboter angeordnet. Als farbige Flüssigkeit wurde eine wässrige Lösung des Farbstoffs Methylorange verwendet. Ein Kalibrierpipettierkopf des Pipettierrobo ters mit 8 Pipettierkanälen wurde mit Pipettenspitzen bestückt. Danach wurde die farbige Flüssigkeit aus dem Container von den Pipettierkanälen in die Pipettenspitzen aufgenommen. Anschließend wurden definierte Volumina der Flüssigkeit, nämlich 0,5 mI, 1 ,0 mI, 1 ,5 mI, 2,0 mI und 2,5 mI, aus den Pipettenspitzen auf die Oberfläche der Kalibrierchromatografieschicht abgegeben. Dabei war der Abstand zwischen den Pipettenspitzen und der Oberfläche 0,2 mm. Die Flüssigkeit wurde von der Kalibrierchromatografieschicht adsorbiert. Dadurch sind farbige Flecken auf der Oberfläche der Kalibrierchromatografieschicht entstanden. Die Kalibrierchromatografieschicht wurde für 10 min getrocknet. Mittels eines Flachbett- Scanners wurde ein Bild der Flecken aufgenommen, indem eine Draufsicht auf die Oberfläche der Kalibrierchromatografieschicht mit den Flecken erfasst wurde. An schließend wurde mit Hilfe einer Bildauswertungssoftware (easyPick II Software, Hamilton Bonaduz AG) der Flächeninhalt der Flecken bestimmt (Figur 2a). Die Bildauswertungssoftware erkennt die Flecken aufgrund ihrer Farbe, die sich von der Farbe der Oberfläche der Kalibrierchromatografieschicht unterscheidet.

Beispielhaft sind die bestimmten Flächeninhalte der Flecken der Pipettierkanäle 5 und 6 in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Die jeweiligen Mittelwerte der Flächeninhalte wurden in Abhängigkeit der definierten Volumina graphisch aufgetragen, um eine Kalibrierkurve zu bestimmen (Figur 2b). Die Kalibrierkurve kann einer beispielhaften Ausführungsform von Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugrunde gelegt werden. Die Kalibrierkurve ist eine lineare Funktion. Somit zeigt die Auswertung der Flecken, dass ein linearer Zusammenhang zwischen dem Flächeninhalt eines Flecks und dem abgegebenen Volumen der farbigen Flüssigkeit besteht.

Beispiel 2 - Bestimmung des Volumens einer Flüssigkeit

Zunächst wurde eine Chromatografieplatte (Kieselgel 60, Merck) bereitgestellt. Die Chromatografieplatte weist als Flüssigkeitsaufnahmeschicht eine Chromato- grafieschicht 3 und als Träger ein Aluminiumblech auf. Die Chromatografieschicht 3 weist Kieselgel 60 auf. Die Chromatografieplatte wurde auf einer Trägervorrich- tung in einem Pipettierroboter angeordnet. Ein 50 ml Container wurde mit einer farbigen Flüssigkeit befüllt und ebenfalls in dem Pipettierroboter angeordnet. Als farbige Flüssigkeit wurde eine wässrige Lösung des Farbstoffs Methylorange verwendet. Ein Pipettierkopf des Pipettierroboters mit 96 Pipettierkanälen wurde mit Pipettenspitzen 2 bestückt. Danach wurde die farbige Flüssigkeit aus dem Container von den Pipettierkanälen in die Pipettenspitzen 2 aufgenommen. Anschließend wurden jeweils 30 pl der Flüssigkeit aus den Pipettenspitzen 2 auf die Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 abgegeben. Der Abstand zwischen den Pi- pettenspitzen 2 und der Oberfläche 4 war dabei 1 mm. Die Flüssigkeit wurde von der Chromatografieschicht 3 adsorbiert. Dadurch sind farbige Flecken 6 auf der Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 entstanden. Die Chromatografieschicht 3 wurde für 10 min getrocknet. Mittels eines Flachbettscanners wurde ein Bild der Flecken 6 aufgenommen, indem eine Draufsicht auf die Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 mit den Flecken 6 erfasst wurde. Das Bild ist in Figur 3 gezeigt. Anschließend wurde mit Hilfe einer Bildauswertungssoftware (CaliPlate Software, Hamilton Bonaduz AG) der Flächeninhalt der Flecken 6 bestimmt. Die Bildauswer tungssoftware erkennt die Flecken 6 aufgrund ihrer Farbe, die sich von der Farbe der Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 unterscheidet. Anhand der bestimmten Flächeninhalte konnte die Bildauswertungssoftware schließlich auf die tatsächlich abgegebenen Volumina der farbigen Flüssigkeit zurückschließen.

Beispiel 3 - Bestimmung des Volumens einer Flüssigkeit

Beispiel 3 wurde wie Beispiel 2 durchgeführt, außer dass in Beispiel 3 ein Pipettierkopf eines Pipettierroboters mit 8 Pipettierkanälen verwendet wurde, jeweils 1000 pl der Flüssigkeit aus den Pipettenspitzen 2 auf die Oberfläche 4 der Chro matografieschicht 3 abgegeben wurden und der Abstand zwischen den Pipettenspitzen 2 und der Oberfläche 4 dabei 2 mm war. Die Abgabe der Flüssigkeit wurde zweifach durchgeführt. Figur 4 zeigt die von dem Flachbettscanner aufgenommene Draufsicht auf die Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 mit den Fle cken 6.

Beispiel 4 wurde wie Beispiel 2 durchgeführt, außer dass in Beispiel 4 eine Hand pipette 1 mit einer abnehmbaren Pipettenspitze 2 verwendet wurde. Dementsprechend wurden die Chromatografieplatte und der Container nicht in einem Pipettierroboter, sondern auf einem Labortisch angeordnet. Es wurden jeweils 10 pl, 50 mI, 100 mI, 300 mI, 600 mI, und 1000 mI (von rechts nach links in der ersten Rei he und in der dritten Reihe von oben, von links nach rechts in der zweiten Reihe von oben) der Flüssigkeit aus der Pipettenspitze 2 auf die Oberfläche der Chromatografieschicht 3 abgegeben. Die Abgabe der Flüssigkeit wurde mehrfach durchgeführt. Der Abstand zwischen den Pipettenspitzen 2 und der Oberfläche 4 war dabei von 0,5 bis 2 mm. Figur 5 zeigt die von dem Flachbettscanner aufgenommene Draufsicht auf die Oberfläche 4 der Chromatografieschicht 3 mit den Flecken 6.

Bezugszeichenliste

1 Handpipette

2 Pipettenspitze

3 Chromatografieschicht

4 Oberfläche

5 Flüssigkeit

6 Fleck